專利名稱：腦蛋白水解物制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥品的制備方法，具體地說(shuō)是腦蛋白水解物制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
腦蛋白水解物作為健康、新鮮動(dòng)物大腦組織經(jīng)多酶酶解提取的一種活性腦多肽類物質(zhì)，含有多種人腦必需氨基酸及腦磷脂、卵磷脂、肽類神經(jīng)生長(zhǎng)因子等重要元素，能以多種方式作用于中樞神經(jīng)，調(diào)節(jié)和改善神經(jīng)元的代謝，促進(jìn)突觸的形成，誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化，并進(jìn)一步保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受各種缺血和神經(jīng)毒素的損害。它可通過(guò)血腦屏障，促進(jìn)腦內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，影響呼吸鏈，具有抗缺氧的保護(hù)能力，改善腦內(nèi)能量代謝。激活腺苷酸環(huán)化酶催化其他激素系統(tǒng)。提供神經(jīng)遞質(zhì)、肽類激素及輔酶前體。
腦蛋白水解物注射液適用于顱腦外傷及腦血管疾病(腦供血不全、腦梗塞)后遺癥伴有的記憶減退及注意力集中障礙的癥狀改善；適用于神經(jīng)血管性頭痛、智力發(fā)育不全、腦動(dòng)脈硬化、老年性癡呆、腦損傷后遺癥、腦血管病等腦神經(jīng)、血管性疾病引起的認(rèn)知、記憶、運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡等腦功能障礙的預(yù)防和治療，無(wú)明顯毒副作用。對(duì)帕金森、疲勞綜合征、亞健康狀態(tài)具有一定效果。
現(xiàn)有的腦蛋白水解物制劑的制備方法之一是新鮮豬腦去除表面的粘膜及血漬等，勻漿，加5倍體積的丙酮沉淀，沉淀分離后再加等量乙醚洗滌浸泡1小時(shí)，再過(guò)濾、真空干燥制成腦粉；腦粉用水溶解后，依次用胃蛋白酶、胰酶雙酶水解，水解液離心取上清液，加熱沸騰并迅速冷卻，然后經(jīng)板框過(guò)濾、超濾及減壓濃縮得水解液；水解液分批上Sephadex G-25凝膠層析柱層析，將活性峰收集液經(jīng)減壓濃縮、0.45um微孔過(guò)濾制成精品液；根據(jù)所需藥液量，按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2000年12月28日頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)WS1-XG-25-2000)計(jì)算氨基酸用量，添加相應(yīng)氨基酸配制成濃配液，然后稀配、灌裝成成品，經(jīng)蒸汽滅菌成無(wú)菌制劑。其缺點(diǎn)是(1)、設(shè)備投資大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低；用層析方法提純有效成分，每一過(guò)程需要30～48小時(shí)，生產(chǎn)周期長(zhǎng)；由于生產(chǎn)周期長(zhǎng)，為保證藥品質(zhì)量，要求在2～8℃冷庫(kù)車間進(jìn)行Sephadex G-25凝膠柱層析，而Sephadex G-25凝膠層析材料必須進(jìn)口，價(jià)格昂貴；按年生產(chǎn)100萬(wàn)支(10ml)腦蛋白水解物注射液計(jì)算，上述投入就達(dá)200萬(wàn)元人民幣以上；使用減壓濃縮和離心的步驟，生產(chǎn)效率低，不利于對(duì)藥品質(zhì)量的控制。(2)、使用大量的有機(jī)化學(xué)溶劑，丙酮和乙醚的沸點(diǎn)極低，是易燃、易爆、有毒的危險(xiǎn)化學(xué)品，乙醚還被用作麻醉劑，使用大量的丙酮和乙醚先將腦蛋白沉淀出來(lái)制成腦粉，此步驟非常危險(xiǎn)，必須在防爆車間內(nèi)生產(chǎn)，操作煩瑣，污染環(huán)境，危害生產(chǎn)操作人員的身體健康。
其次，中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種“腦蛋白水解物注射液生產(chǎn)工藝”，其內(nèi)容是新鮮豬腦去除表面的粘膜及血漬等，加2倍體積的水勻漿，用雙層紗布過(guò)濾，濾液先用胃蛋白酶水解，用鹽酸調(diào)pH到1.5-1.6，水浴溫度40-45℃，時(shí)間為6-8小時(shí)，再用氫氧化鈉調(diào)pH到7.6-7.7，加胰酶(胰酶先溶解于0.02N的氯化鈣溶液中于4℃下活化30分鐘)水解，40-45℃水浴水解4-6小時(shí)，得到水解液，加鹽酸調(diào)pH值2.5-3.0，-20～-10℃下靜置10-30小時(shí)；在室溫條件下，用雙層紗布過(guò)濾，再加入1/2體積的水，加氫氧化鈉調(diào)pH值到中性，用孔徑為0.5-1.0um的微孔濾膜過(guò)濾澄清，取澄清液，依次用截流分子量為7萬(wàn)和1萬(wàn)的超濾膜超濾，得到的超濾液再用截流分子量為1000的超濾膜進(jìn)行濃縮，得到的濃縮液加熱到100℃沸騰15分鐘，然后迅速冷卻到25℃以下，再依次經(jīng)過(guò)0.5-1um孔徑的微孔濾膜和截流分子量為7萬(wàn)和1萬(wàn)的超濾膜，得到的超濾液再經(jīng)121℃蒸汽滅菌30分鐘得到的除菌溶液稱為腦蛋白水解的混合多肽、氨基酸溶液精制品；根據(jù)所需藥液量，按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2000年12月28日頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)WS1-XG-25-2000)計(jì)算需要添加的氨基酸用量，與上述溶液配制成濃配液，然后稀配裝針成成品藥液，經(jīng)121℃蒸汽滅菌30分鐘成無(wú)菌制劑。其缺點(diǎn)是(1)使用超濾膜進(jìn)行超濾濃縮回收率低該工藝雖然采用了超濾技術(shù)，但使用的是截流分子量為1000的超濾膜進(jìn)行濃縮，使有效活性成分腦多肽不同程度的丟失，也就是在透過(guò)液中流失，大大降低了收率。(2)多次經(jīng)過(guò)0.5-1um孔徑的微孔濾膜和截流分子量為7萬(wàn)和1萬(wàn)的超濾膜，得到超濾液，使操作比較煩瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種不使用有機(jī)化學(xué)溶劑，以物理的方法取代化學(xué)試劑沉淀法來(lái)提取腦蛋白水解物生產(chǎn)制劑的制備方法，能達(dá)到現(xiàn)有工藝的分離效果。
本發(fā)明的腦蛋白水解物注射液的制備方法是用新鮮(或凍存)豬腦去除表面的包膜及血管等，加1～2倍體積的純化水勻漿，隔水蒸汽加熱至80～85℃，15分鐘，快速降溫至40～45℃時(shí)，用鹽酸調(diào)pH至1.5～2.0，用胃蛋白酶酶解3～12小時(shí)(或沉淀分離取上清)，調(diào)溫至40～42℃，用氫氧化納調(diào)pH至7.7～8.0，用胰酶多酶(包含胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶)，使用前加入0.04mol/L CaCl2活化胰酶多酶0.5～1小時(shí)，在38～42℃條件下，酶解2～4小時(shí)，然后再用鹽酸調(diào)pH值2.5～3.0，-20～-10℃下靜置冷凍12～48小時(shí)；在室溫條件下，用多層紗布過(guò)濾，加氫氧化鈉調(diào)pH值到中性，用孔徑為0.2～1.0um的微孔無(wú)機(jī)膜過(guò)濾澄清，取澄清液，用截流分子量為1萬(wàn)的超濾膜超濾，收集透過(guò)液，再用截流分子量為100～1000的納濾膜進(jìn)行納濾濃縮，棄透過(guò)液，得到的濃縮液經(jīng)121℃蒸汽滅菌30分鐘，該除菌溶液為腦蛋白水解物精制品；調(diào)配L-色氨酸、L-酪氨酸，根據(jù)所需藥液量，按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2000年12月28日頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)WS1-XG-25-2000)計(jì)算需要添加的各種氨基酸用量，調(diào)配肽圖，與上述溶液配制成濃配液，然后稀配、灌裝成半成品，再經(jīng)115～121℃蒸汽滅菌30分鐘，制成無(wú)菌制劑，達(dá)到國(guó)家藥品(WS1-XG-25-2000)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的腦蛋白水解物制劑為注射液和凍干粉針劑。
凍干粉針劑的制備方法與注射液的方法基本相同，只是在配制成濃配液后，加入賦型劑(例如甘露醇、右旋糖苷等)，用0.2um孔徑的微孔濾膜除菌過(guò)濾、分裝、低溫真空冷凍干燥成成品，制成無(wú)菌凍干粉針劑。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、舍棄了化學(xué)沉淀步驟，新鮮動(dòng)物腦組織直接經(jīng)多酶酶解，再用澄清方式去除水不溶物，經(jīng)澄清、超濾、納濾技術(shù)提純、濃縮，可除去雜蛋白，使雜質(zhì)峰面積小于5％，達(dá)到現(xiàn)有工藝的分離效果；再調(diào)配L-色氨酸、L-酪氨酸，按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2000年12月28日頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)WS1-XG-25-2000)計(jì)算需要添加的各種氨基酸用量，調(diào)配肽圖，與上述溶液配制成濃配液，然后稀配、灌裝成半成品，制成無(wú)菌制劑，用高效液相色譜法(HPLC)，以凝膠色譜柱分析，其色譜圖(肽圖)應(yīng)與對(duì)照溶液的色譜圖基本一致，而其溶液色譜圖中與對(duì)照溶液色譜圖中不一致的峰面積不得過(guò)5.0％。本工藝具有安全、高效、處理速度快速、設(shè)備投入少，無(wú)污染、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
2、采用多酶酶解法，以澄清技術(shù)、超濾技術(shù)和納濾技術(shù)提純、濃縮腦蛋白水解物，優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)周期大大縮短、產(chǎn)量提高、生產(chǎn)環(huán)境要求降低、操作簡(jiǎn)便易行。同時(shí)，減少生產(chǎn)環(huán)節(jié)、縮短生產(chǎn)周期就意味著減少了藥品可能受污染的機(jī)會(huì)，就可降低藥品在生產(chǎn)過(guò)程中變質(zhì)的幾率。
3、降低了生產(chǎn)成本，生產(chǎn)可采用密閉式生產(chǎn)，采用物理方法，無(wú)泄漏、無(wú)污染、符合GMP要求。


圖1是本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品肽譜。
圖2是本發(fā)明的樣品的肽譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、取新鮮豬腦100公斤，去除表面的包膜及血管等，邊勻漿邊加入100L的純化水(以下簡(jiǎn)稱為水)，隔水蒸汽加熱至85℃，15分鐘，快速降溫至40℃時(shí)，用6mol/L鹽酸調(diào)pH至1.5，加3Kg胃蛋白酶酶解3小時(shí)后，用12mol/L氫氧化納調(diào)pH至8.0，加2Kg胰酶多酶(胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶)，使用前加入0.04mol/L CaCl2活化胰酶多酶1小時(shí)，在42℃條件下，酶解2小時(shí)，然后再用6mol/L鹽酸調(diào)pH值至3.0，-20℃下靜置冷凍12小時(shí)；在室溫條件下，用多層紗布過(guò)濾，加氫氧化鈉調(diào)pH值到中性，用孔徑為1.0um的微孔濾膜過(guò)濾澄清，取澄清液，用截流分子量為1萬(wàn)的超濾膜超濾，收集透過(guò)液，再用截流分子量為400的納濾膜進(jìn)行納濾濃縮，棄透過(guò)液，得到的濃縮液經(jīng)121℃蒸汽滅菌30分鐘，該除菌溶液為腦蛋白水解物精制品；調(diào)配L-色氨酸、L-酪氨酸，根據(jù)所需藥液量，按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2000年12月28日頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)WS1-XG-25-2000)計(jì)算需要添加的各種氨基酸用量，調(diào)配肽圖，用高效液相色譜法(HPLC)，以凝膠色譜柱分析，其色譜圖(肽圖見(jiàn)圖1)應(yīng)與對(duì)照溶液的色譜圖(見(jiàn)圖2)基本一致，而其溶液色譜圖中與對(duì)照溶液色譜圖中不一致的峰面積不得過(guò)5.0％，與上述溶液配制成濃配液，然后稀配、灌裝成半成品，再經(jīng)115℃蒸汽滅菌30分鐘，制成無(wú)菌注射液。
實(shí)施例2、取新鮮豬腦100公斤，去除表面的包膜及血管等，邊勻漿邊加入200L的純化水(以下簡(jiǎn)稱為水)，隔水蒸汽加熱至80℃，15分鐘，快速降溫至45℃時(shí)，用6mol/L鹽酸調(diào)pH至2.0，加3Kg胃蛋白酶酶解12小時(shí)后，用12mol/L氫氧化納調(diào)pH至7.7，加2Kg胰酶多酶，使用前加入0.04mol/L CaCl2活化胰酶多酶0.5小時(shí)，在38℃條件下，酶解4小時(shí)，然后再用6mol/L鹽酸調(diào)pH值至2.0，-10℃下靜置冷凍48小時(shí)；在室溫條件下，用多層紗布過(guò)濾，加氫氧化鈉調(diào)pH值到中性，用孔徑為0.2um的微孔濾膜過(guò)濾澄清，取澄清液，用截流分子量為1萬(wàn)的超濾膜超濾，收集透過(guò)液，再用截流分子量為400的納濾膜進(jìn)行納濾濃縮，棄透過(guò)液，得到的濃縮液經(jīng)121℃蒸汽滅菌30分鐘，得到除菌溶液稱為腦蛋白水解物精制品；調(diào)配L-色氨酸、L-酪氨酸，根據(jù)所需藥液量，按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2000年12月28日頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)(編號(hào)WS1-XG-25-2000)計(jì)算需要添加的各種氨基酸用量，調(diào)配肽圖，見(jiàn)圖1，與上述溶液配制成濃配液，加入賦型劑右旋糖苷40，用0.2um孔徑的微孔濾膜過(guò)濾、分裝、低溫真空冷凍干燥成成品，制成無(wú)菌凍干粉針劑。
權(quán)利要求
1.一種腦蛋白水解物制劑的制備方法，其特征在于用新鮮或凍存豬腦去除表面的包膜及血管，加1～2倍體積的純化水勻漿，隔水蒸汽加熱至80～85℃，15分鐘，快速降溫至40～45℃時(shí)，用鹽酸調(diào)pH至1.5～2.0，用胃蛋白酶酶解3～12小時(shí)或沉淀分離取上清，調(diào)溫至40～42℃后，用氫氧化納調(diào)pH至7.7～8.0，用胰酶多酶在38～42℃條件下，酶解2～4小時(shí)，然后再用鹽酸調(diào)pH值2.5～3.0，-20～-10℃下靜置冷凍12～48小時(shí)；在室溫條件下，過(guò)濾，加氫氧化鈉調(diào)pH值到中性，用孔徑為0.2～1.0um的微孔無(wú)機(jī)膜過(guò)濾澄清，取澄清液，用截流分子量為1萬(wàn)的超濾膜超濾，收集透過(guò)液，再用截流分子量為100～1000的納濾膜進(jìn)行納濾濃縮，棄透過(guò)液，得到的濃縮液經(jīng)121℃蒸汽滅菌30分鐘，該除菌溶液為腦蛋白水解物精制品；調(diào)配L-色氨酸、L-酪氨酸，根據(jù)所需藥液量，計(jì)算需要添加的各種氨基酸用量，調(diào)配肽圖，與上述溶液配制成濃配液，然后稀配、灌裝成半成品，再經(jīng)115～121℃蒸汽滅菌30分鐘，制成無(wú)菌制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦蛋白水解物制劑的制備方法，其特征在于所述的制劑為注射液和凍干粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明是一種腦蛋白水解物制劑的制備方法。其特征在于用新鮮或凍存豬腦，加1～2倍體積的純化水勻漿，加熱至85℃，降溫后，用鹽酸調(diào)pH至1.5～2.0，用胃蛋白酶酶解3～12小時(shí)，調(diào)溫至42℃后，用氫氧化納調(diào)pH至7.7～8.0，用胰酶多酶在38～42℃條件下，酶解2～4小時(shí)，再調(diào)pH值2.5－3.0，－20～－10℃下靜置冷凍；在室溫條件下過(guò)濾，加氫氧化鈉調(diào)pH值到中性，取澄清液，用截流分子量為1萬(wàn)的超濾膜超濾，收集透過(guò)液,納濾濃縮，得到的濃縮液經(jīng)121℃蒸汽滅菌30分鐘，得到除菌溶液稱為腦蛋白水解物精制品；調(diào)配L－色氨酸、L－酪氨酸，添加的各種氨基酸，調(diào)配肽圖，與上述溶液配制成濃配液，然后稀配、灌裝成成品，蒸汽滅菌，制成無(wú)菌制劑。本發(fā)明縮短了生產(chǎn)周期、產(chǎn)量提高、操作簡(jiǎn)便易行，減少生產(chǎn)環(huán)節(jié)、避免了藥品受污染的機(jī)會(huì)。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1562339SQ20041002209
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者嚴(yán)家定 申請(qǐng)人:嚴(yán)家定