專利名稱：大劑量的羥基紅花黃色素a或其可藥用鹽在缺血引起的急性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大劑量的羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽在治療腦缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用，特別涉及到羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽在缺血引起的急性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用，其劑量為80-1600mg/日，給藥的途徑是靜脈滴注給藥。
背景技術(shù)：
隨著人口老齡化進程的加速以及生活方式的改變，腦血管病，特別是缺血性腦中風(fēng)已成為危害人類健康的主要疾病之一。更加安全有效的防治腦血管疾病的藥物的開發(fā)刻不容緩。
紅花Carthamus tinctorius L.收載于《中華人民共和國藥典二000年版》(一部)，是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥。紅花的單味制劑現(xiàn)臨床上有“紅花注射液”(國家藥品標準WS3-B-3825-98)，用于治療閉塞性腦血管疾病，冠心病，脈管炎等。多年的臨床應(yīng)用證明其療效肯定。但該品種為傳統(tǒng)的中藥注射劑，物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，作用機制不清楚，且成分復(fù)雜，沒有對其質(zhì)量進行有效控制的方法，從而導(dǎo)致臨床效果不穩(wěn)定，副反應(yīng)發(fā)生率高。
羥基紅花黃色素A是從菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花中提取的有效成分。
羥基紅花黃色素A結(jié)構(gòu)文獻臧寶霞，金鳴，司南等，羥基紅花黃色素A對血小板活化因子的拮抗作用[J].藥學(xué)學(xué)報，2002，37(9)696顯示，羥基紅花黃色素A通過拮抗血小板活化因子的作用抑制血小板的聚集。中國專利申請公開CN1422616，發(fā)明名稱羥基紅花黃色素A在制備治療、預(yù)防心腦血管疾病方面的藥物用途中詳細描述了在大鼠劑量為6、3、1.5mg/kg情況下，羥基紅花黃色素A劑量依賴性改善大腦中動脈栓塞所致腦缺血大鼠的行為障礙，減少腦缺血區(qū)面積，抑制大鼠體內(nèi)血栓的形成和ADP誘導(dǎo)的腦缺血大鼠血小板聚集，降低大鼠的全血粘度、血漿粘度和紅細胞壓積；在劑量為12、6、3mg/kg時，其延長了小鼠凝血時間。上述公開文獻明確了羥基紅花黃色素A對缺血性腦中風(fēng)具有預(yù)肪和治療作用?？v觀文獻中的實驗方法，可以確定羥基紅花黃色素A預(yù)防給藥或發(fā)病(造模)后早期(30分鐘內(nèi))給藥具有可靠的效果。但臨床實踐中腦中風(fēng)病人發(fā)病后30分鐘內(nèi)得到治療的機會是很少的，大多數(shù)病人是在發(fā)病的3-6小時后被發(fā)現(xiàn)并得到治療。本發(fā)明人通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A在中國專利申請公開CN1422616中所述的劑量范圍內(nèi)，對發(fā)病(造模)3小時后的腦缺血性壞死無治療作用，并證明只有在更大劑量下才能在發(fā)病3小時后給藥時發(fā)揮治療效應(yīng)。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明提供了一種大劑量羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽在制備治療缺血引起的急性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用，其使用劑量為80-1600mg/日，優(yōu)選劑量范圍優(yōu)選為80-500mg/日。
本發(fā)明提供的羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽的給藥途徑為靜脈給藥，優(yōu)選為靜脈滴注。
本發(fā)明提供了一種含有80mg-1600mg的羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽的藥物組合物。
本發(fā)明提供的藥物組合物，以注射液、輸液或凍干粉針形式存在，優(yōu)選為凍干粉針，其均可以以藥學(xué)上常規(guī)方法制備而成。
本發(fā)明提供的羥基紅花黃色素A鹽是藥學(xué)上可接受的鹽。
以下通過制備實施例和試驗例對此予以說明，但不僅限于此。
具體實施例方式
實施例1羥基紅花黃色素A的制備取干燥紅花，80℃下水提取3次，每次1小時，第一次加20倍水，第二次加15倍水，第三次加15倍水，合并提取液；過濾，濾液減壓濃縮至密度為1.05(80℃)，加乙醇至醇濃度為80％，于4℃下沉淀24小時，濾過；濾液于60℃減壓回收乙醇至無醇味，加至10倍水稀釋后上處理好的DM-130大孔吸附樹脂，上樣量(相當(dāng)于生藥量)與樹脂用量的比例為1∶1(w/v)，用5％乙醇洗脫4個柱體積，收集洗脫液。洗脫液上樣于處理好的聚酰胺柱，上樣量相當(dāng)于生藥量與樹脂用量的比例為3∶1(w/v)，先用5％乙醇洗脫3個柱體積，棄去；繼續(xù)用95％乙醇溶液洗脫8個柱體積，收集洗脫液于60℃減壓回收乙醇并濃縮至適當(dāng)濃度；冷凍干燥得到羥基紅花黃色素A。
實施例2羥基紅花黃色素A凍干粉針劑的制備稱取40g甘露醇，置于適當(dāng)容器內(nèi)，加入200ml注射用水，加針用炭0.2g(0.1％w/v)，加熱至80℃，攪拌30min，0.22μm微孔濾膜過濾，濾液備用。
稱取80g羥基紅花黃色素A，加注射用水至1000ml，攪拌使羥基紅花黃色素A完全溶解。混合羥基紅花黃色素A溶液及甘露醇溶液，補加注射用水至2000ml，用0.22μm微孔濾膜過濾，分裝，裝量為每支含羥基紅花黃色素A 80mg，冷凍干燥。真空壓塞，軋蓋，貼簽，包裝即得。
實施例3羥基紅花黃色素A氯化鈉注射液的制備氯化鈉-乙二胺四乙酸二鈉水溶液的配制在1000ml注射用水中，加入30mg乙二胺四乙酸二鈉，攪拌使之溶解，再加入9g氯化鈉，攪拌使之完全溶解，得氯化鈉-乙二胺四乙酸二鈉水溶液；稱取800mg羥基紅花黃色素A，加入到上述氯化鈉-乙二胺四乙酸二鈉水溶液中，攪拌使之完全溶解，得淺黃色溶液；用稀NaOH溶液和稀HCl溶液調(diào)節(jié)上述溶液的pH值至5.0～6.0；向上述已調(diào)好pH值的溶液中加入活性碳0.5g(0.05％，w/v)，于80℃攪拌20分鐘后過濾，得粗濾液；檢查中間體含量，確定濾液中羥基紅花黃色素A含量為80mg/100ml；用0.22μm微孔濾膜過濾，得精濾液。灌封、壓蓋；于105℃加熱30分鐘滅菌；貼簽，檢測合格后包裝，得成品。
實施例4羥基紅花黃色素A注射液的制備稱取0.5g乙二胺四乙酸二鈉，加入到1000ml注射用水中，攪拌使之完全溶解，得溶液1；稱取20.0g羥基紅花黃色素A，加入到溶液1中，攪拌使之完全溶解，得溶液2；調(diào)節(jié)溶液2的pH值至5.0～6.0；向調(diào)節(jié)好pH的上述溶液中加入1g活性碳(0.1％)，于80℃加熱15分鐘，過濾得濾液1；取樣測中間體含量，確定濾液每ml含20mg羥基紅花黃色素A；用0.22μm微孔濾膜過濾，得濾液2；灌封，每支安瓿灌封1.0ml藥液，熔封；100℃流通蒸汽滅菌20分鐘；經(jīng)檢驗合格后得成品。
實驗例1羥基紅花黃色素A給藥時間及劑量對大鼠大腦中動脈栓塞所致缺血性壞死的影響動物隨機分為假手術(shù)組(i.v賦形劑)，模型對照組(i.v賦形劑)，尼莫地平組(i.vNim，1mg/kg)，羥基紅花黃色素A(HSYA)各劑量及時間點組(表1)，每組10只。禁食12小時后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側(cè)頸總動脈，夾閉頸內(nèi)、頸總動脈，頸外動脈近心端及遠心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內(nèi)動脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24mm尼龍線，長度5.0cm)由頸外動脈插入至顱內(nèi)，遇輕微阻力時停止，插入深度約為2cm。結(jié)扎頸外動脈開口，并打開頸總動脈動脈夾，消毒縫合傷口，造成右側(cè)大腦中動脈缺血模型；假手術(shù)組僅進行右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈的分離(以上實驗均在23℃～25℃進行)。各組動物術(shù)后不同時間點尾靜脈注射相應(yīng)藥物。造模24小時后按文獻所述方法處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，染色后照相，用中國航空航天大學(xué)病理圖像分析軟件求梗塞面積比。數(shù)據(jù)用X±s表示，以組間t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果顯示(表2)，缺血24小時后，大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的灶狀缺血壞死區(qū)，達到全腦的25％左右；給予不同劑量的HSYA，除1mg/kg給藥外，造模0.5h給藥均可使大鼠腦缺血區(qū)壞死面積明顯縮小。造模后3h給藥，只有劑量達到gmg/kg以上才能降低缺血壞死面積。當(dāng)劑量達到32mg/kg時，各不同時間給藥組(包括0.5、1、3、6、10h)均可使缺血壞死面積減少。表明大鼠腦缺血3h后給藥，羥基紅花黃色素A的劑量須達到8mg/kg以上才能有比較確切的療效，即臨床實踐中(病人多在發(fā)病后3-6h以上才進入臨床治療)缺血性腦中風(fēng)發(fā)病急性期病人，用羥基紅花黃色素A治療，切實有效的劑量不能小于80mg/日。
表1羥基紅花黃色素A給藥時間及劑量對大鼠大腦中動脈栓塞所致缺血性壞死的影響

缺血面積假手術(shù)組0；模型對照組24.0±4.1；Nim組18.6±3.0。與模型對照組比較。與模型對照組比較，*，P＜0.05；**，P＜0.01。
試驗例2羥基紅花黃色素A給藥途徑對大鼠大腦中動脈栓塞所致缺血性壞死的影響動物隨機分為假手術(shù)組(i.v賦形劑)，模型對照組(i.v賦形劑)，尼莫地平組(i.vNim，1mg/kg)，HSYA不同給藥途徑及時間點組(表2)，每組10只。禁食12小時后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側(cè)頸總動脈，夾閉頸內(nèi)、頸總動脈，頸外動脈近心端及遠心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內(nèi)動脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24mm尼龍線，長度5.0cm)由頸外動脈插入至顱內(nèi)，遇輕微阻力時停止，插入深度約為2cm。結(jié)扎頸外動脈開口，并打開頸總動脈動脈夾，消毒縫合傷口，造成右側(cè)大腦中動脈缺血模型；假手術(shù)組僅進行右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈的分離(以上實驗均在23℃～25℃進行)。各組動物術(shù)后不同時間點尾靜脈注射或灌服相應(yīng)藥物。造模24小時后按文獻方法觀察并記錄大鼠的行為障礙(1)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，計為0分，如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲計為1分，肘屈曲計為2分，肩內(nèi)旋計為3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩內(nèi)旋者，計為4分。(2)將動物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢查阻力。如雙側(cè)阻力對等且有力，計為0分，如向手術(shù)對側(cè)推動時阻力下降者，根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計為1，2和3分。(3)將動物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為0分。同樣根據(jù)手術(shù)對側(cè)肌張力下降程度不同計為1，2和3分。(4)動物有不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，計為1分。根據(jù)標準評分，滿分為11分，分數(shù)越高，表示動物行為障礙越嚴重。行為評分后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，染色后照相，用中國航空航天大學(xué)病理圖像分析軟件求梗塞面積比。數(shù)據(jù)用X±s表示，以組間t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果顯示(表2)，缺血24小時后，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的灶狀缺血壞死區(qū)，達全腦的近25％；尾靜脈給予不同劑量的HSYA，大鼠腦缺血區(qū)壞死有明顯縮??；而灌服給藥作用不明顯。表明靜脈給藥是HSYA治療急性發(fā)病期缺血性腦中風(fēng)的有效給藥途徑。
表2羥基紅花黃色素A給藥途徑對大鼠大腦中動脈栓塞所致缺血性壞死的影響

與模型對照組比較。與模型對照組比較，*，P＞0.05；**，P＜0.05。
試驗例3靜脈推注羥基紅花黃色素A所致的犬不良反應(yīng)以beagle犬為試驗動物。設(shè)計HSYA藥物大劑量組為45mg/kg，中劑量組15mg/kg，小劑量組5mg/kg。另設(shè)溶媒對照組。給藥體積為2ml/kg，緩慢靜脈推注，約每分鐘推注3ml。實驗期間每二周稱一次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。觀察指標包括一般情況及凝血指標。凝血時間在給藥后24h，當(dāng)日給藥前測定。
結(jié)果顯示(表3)注射用HSYA連續(xù)靜脈推注給藥42天，其主要毒性表現(xiàn)是(1)大、中劑量組犬凝血時間與溶媒對照組比較明顯延長。停藥15天后凝血時間恢復(fù)正常。(2)大劑量組(45mg/kg)給藥后犬出現(xiàn)站立不穩(wěn)摔倒，似病人的一過性暈厥，可能與HSYA擴張周圍血管的作用有關(guān)，暈厥后出現(xiàn)的精神萎靡不振。凝血時間(試管法)給藥21天及42天大、中劑量組犬凝血時間與溶媒對照組比較明顯延長(P＜0.01)，小劑量組與溶媒對照組比較凝血時間無明顯差異。停藥15天后凝血時間恢復(fù)正常，與溶媒對照組比較無明顯異常(P＞0.05)。
以上結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A中劑量(15mg/kg)給藥后對凝血時間的影響可維持24h，當(dāng)其劑量達到45mg/kg時靜脈推注給藥會引起明顯的不良反應(yīng)(暈倒)。據(jù)此推算人的用藥劑量為558mg/日具有較好的“活血化瘀”作用，而達到1674mg/日時會導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生(據(jù)此，羥基紅花黃色素A的劑量不得達到1674mg/日)。
表3.羥基紅花黃色素A不同劑量對犬凝血時間的影響(分，X±SD)動物數(shù)大劑量組 中劑量組小劑量組檢測日期對照組(只)(45mg/kg) (15mg/kg) (5mg/kg)給藥前(1) 64.71±1.02 4.83±0.814.67±0.92 4.89±0.77給藥前(2) 64.79±0.50 4.67±0.724.78±0.61 4.97±0.59給藥21天64.39±0.64 9.27±1.26**7.58±0.67**4.85±0.83給藥42天64.84±0.52 11.43±1.75**9.24±1.27**5.66±1.03停藥15天35.02±1.05 4.94±0.794.95±1.16 5.12±1.24**，與對照組比較，P＜0.01。
試驗例4靜脈滴注對犬一般狀況和凝血指標的影響動物分組及給藥將犬隨機分為4組，分別為生理鹽水對照組、羥基紅花黃色素A高劑量組(180mg/kg)、中劑量組(60mg/kg)和低劑量組(20mg/kg)。給藥體積為250ml/只。按每天每只犬的給藥量將藥物加到250ml生理鹽水中靜脈滴注，滴注速度約為250ml/1h。每天給藥一次，連續(xù)給藥45天，每周根據(jù)體重調(diào)整給藥量。觀察指標包括一般情況及凝血指標。凝血時間在前日給藥后約24h測定。
結(jié)果顯示(表4)，在給藥過程中，各給藥組犬進食、活動等一般狀況可，未出現(xiàn)靜脈推注時的暈倒現(xiàn)象。凝血時間(試管法)給藥21天及42天各劑量組犬凝血時間與溶媒對照組比較明顯延長(P＜0.01)。停藥15天后凝血時間恢復(fù)正常，與溶媒對照組比較無明顯異(P＞0.05)。
以上結(jié)果表明，更大劑量(按大鼠給藥劑量180mg/kg推算，人的劑量為6696mg/日)的羥基紅花黃色素A靜脈滴注給藥不會引起“暈倒”等不良的發(fā)生，即靜脈滴注給藥比靜脈注射(推注)具有更好的安全性。因臨床用藥(靜脈滴注)因人因時而致給藥速度不同(按給予羥基紅花黃色素A的量計算，高濃度靜脈滴注給藥時有可能達到試驗例3中靜脈推注的給藥速度)，為確保用藥病人的安全，劑量仍應(yīng)控制在試驗例3中證明的558mg/日以內(nèi)(為制造和臨床用藥計算方便，以每日劑量控制在500mg為宜)。
表4.不同劑量羥基紅花黃色素A對犬凝血時間的影響(分，X±SD)動物數(shù)大劑量組中劑量組小劑量組檢測日期對照組(只)(180mg/kg) (60mg/kg) (20mg/kg)給藥前(1) 64.84±1.094.78±0.79 4.74±0.88 4.93±0.86給藥前(2) 64.81±0.504.74±0.89 4.64±0.90 4.75±0.63給藥21天 64.69±0.649.98±1.53**8.46±0.80**8.02±0.72**給藥42天 64.89±0.6410.43±1.66**9.90±1.77**8.89±1.42**停藥15天 34.09±1.054.89±0.76 4.85±1.34 5.09±1.33**，與對照組比較，P＜0.01。
綜合試驗例1-4的結(jié)果，羥基紅花黃色素A臨床用于急性期腦缺血病人的治療時，須采用靜脈給藥，給藥的劑量須達到80mg/日以上。為保證臨床用藥的安全，宜采取靜脈滴注給藥的方式。給藥的劑量應(yīng)控制在500mg/日以內(nèi)。
權(quán)利要求
1.大劑量的羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽在缺血引起的急性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用，其特征是每日應(yīng)用羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽的劑量為80-1600mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其劑量范圍優(yōu)選為80-500mg/日。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其劑量范圍更優(yōu)選為80-160mg/日。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，給藥途徑為靜脈給藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，給藥途徑優(yōu)選為靜脈滴注。
6.一種用于缺血引起的急性腦中風(fēng)的藥物組合物，其特征是含有80mg-1600mg的羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽及藥學(xué)上可接受的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其可以為注射液、輸液或凍干粉針。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其優(yōu)選為凍干粉針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大劑量的羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽在治療腦缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用，特別涉及到羥基紅花黃色素A或其可藥用鹽在缺血引起的急性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用，其劑量為80－1600mg/日，給藥的途徑是靜脈滴注給藥。
文檔編號A61P9/00GK1640392SQ200410023508
公開日2005年7月20日 申請日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者傅風(fēng)華, 劉珂, 李桂生, 劉志峰, 曲桂武 申請人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司