專利名稱：3－氨基－2－惡唑烷酮的偶聯(lián)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硝基呋喃類抗生素代謝物的偶聯(lián)物及其制備方法，尤其涉及一種呋喃唑酮(Furazolidone)代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone)的偶聯(lián)物及其制備方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的下列名稱適用于整個說明書和權(quán)利要求書BSA＝牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司產(chǎn)品PBS＝磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-G75＝葡聚糖凝膠，Sigma公司產(chǎn)品AOZ＝3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone)，Sigma公司產(chǎn)品Glutar＝(Glutaraldehyde)戊二醛，上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品透析膜美國聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品呋喃唑酮(Furazolidone)是一種重要的硝基呋喃類抗感染藥，而3-氨基-2-惡唑烷酮即AOZ(3-Amino-2-oxazolidinon)為呋喃唑酮的代謝物。由于其優(yōu)良的抗菌性能和動力學(xué)性質(zhì)，呋喃類藥物早已被廣泛地應(yīng)用于家畜，家禽和水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)的傳染病預(yù)防與治療，是一類廣譜抗菌藥。但長期的動物實驗研究結(jié)果表明，硝基呋喃類藥物以及其代謝產(chǎn)物具有致癌和致突變的特性。動物長期或大劑量服用呋喃類藥物能引起毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為興奮，驚厥，癱瘓的急性神經(jīng)癥狀以及全身出血和反芻獸消化障礙等慢性中毒反應(yīng)。對于人體的不良反應(yīng)主要是胃腸反應(yīng)，溶血性貧血，血小板減少性紫癜，多發(fā)性神經(jīng)炎，眼部損害，急性肝壞死和嗜酸性白細胞增多等過敏反應(yīng)。
由于這些毒害作用，世界上很多國家都對硝基呋喃類藥物的使用及其殘留進行了嚴格的規(guī)定。美國和日本分別于1975和1977年禁止呋喃唑酮作為醫(yī)藥使用；澳大利亞于1992年禁止在養(yǎng)殖業(yè)中使用硝基呋喃類藥物；美國1993年禁止呋喃唑酮作為獸藥；歐盟在1995年6月開始禁止使用呋喃唑酮和呋喃西林，規(guī)定動物源食品中不得檢出硝基呋喃(Commission Regulation 1442/95)；在我國，硝基呋喃藥物是農(nóng)業(yè)部嚴禁的抗菌素。盡管如此，硝基呋喃類藥物由于藥效顯著，價格低廉，難以檢測，在我國的畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用仍然非常普遍，這給人們的健康安全帶來巨大的隱患。我國出口歐盟的魚，蝦，禽肉，兔肉，和腸衣均被檢出過含有硝基呋喃類藥物，尤其是兔肉和禽肉，常常因此導(dǎo)致出口食品被迫就地銷毀。這已嚴重制約我國動物源食品的出口，對國際貿(mào)易帶來極大的威脅。所以，關(guān)于硝基呋喃類藥物殘留的檢測方法的開發(fā)研究已刻不容緩。
由于硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝迅速，通過檢測母體化合物并不能得知這類藥物的濫用情況。因此檢測硝基呋喃類藥物殘留以杜絕使用這種違禁藥物的最佳方法是檢測其代謝物而非母體化合物本身。檢測硝基呋喃類藥物的殘留就變成了檢測這些與蛋白組織結(jié)合在一起的代謝物的殘留。
在抗生素藥物殘留的檢測中，儀器法如液相色譜和質(zhì)譜以及液相質(zhì)譜聯(lián)用是應(yīng)用最廣泛的方法。這些方法準確，穩(wěn)定，可靠，可以作為標準方法。但儀器法價格昂貴，費時較長，需要大型儀器設(shè)備，需要專門的技術(shù)人員，所以難于用于現(xiàn)場操作。酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準確，簡易，不需要專門人員操作等優(yōu)點，這使得ELISA法成為一種理想的，可用于常規(guī)掃描的檢測方法。酶聯(lián)免疫檢測法的核心是需要高質(zhì)量的抗體。大多數(shù)抗生素包括硝基呋喃類藥物都是小分子有機化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，要實施酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)，達到快速，準確，簡易的檢測目的，必須把這些化合物轉(zhuǎn)變成能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。本發(fā)明涉及的3-氨基-2-惡唑烷酮的偶聯(lián)物就是用來引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對AOZ有特異反應(yīng)抗體的免疫原。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，至今尚未有關(guān)于AOZ免疫原合成的相關(guān)文獻或?qū)＠麍蟮馈?br>
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對AOZ有特異反應(yīng)的抗體的免疫原，即3-氨基-2-惡唑烷酮的偶聯(lián)物以及制備這種免疫原的方法。
本發(fā)明的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，由3-氨基-2-惡唑烷酮半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)偶聯(lián)構(gòu)成，所述載體物質(zhì)為優(yōu)選蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段，合成多肽或半合成多肽。
上述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)優(yōu)選是牛血清蛋白。本發(fā)明所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的AOZ的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體
(2)紫外吸收光譜267nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3430，2928，2876，1643，1530，1445，1083，581，537，460。
上述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，其中優(yōu)選n為整數(shù)1～10，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
上述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法是將3-氨基-2-惡唑烷酮與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
上述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法具體步驟如下(1)將AOZ與牛血清蛋白以15∶1～30∶1的摩爾比溶于設(shè)定體積的磷酸緩沖液中，反應(yīng)4～6小時，制成溶液A；(2)在25℃～30℃條件下，以溶液A體積75分之一的量加入戊二醛于溶液A中，同時不斷攪拌，反應(yīng)3～6小時，得到溶液B；(3)將溶液B用磷酸緩沖液透析70～78小時，每10～12小時更換一次透析液；(4)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液；(5)將制取的上清液凍干，得到3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物粗品；(6)以磷酸緩沖溶液為洗脫液，用葡聚糖凝膠層析分離純化上述粗品，制得AOZ偶聯(lián)物純品，再經(jīng)凍干得到白色固體粉末狀的，具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的AOZ偶聯(lián)物。
在上述制備方法中，AOZ與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比優(yōu)選為20∶1。
在上述制備方法中，所述的磷酸緩沖液優(yōu)選pH為7.40，濃度為0.01M。
在上述制備方法中，所述的戊二醛濃度是體積百分比為25％的水溶液。
在上述制備方法中，所述的葡聚糖凝膠層析優(yōu)選采用Sephadex-G75。
利用本發(fā)明的技術(shù)方案可以成功地把半抗原AOZ與載體蛋白特別是牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)起來，從而合成了能夠在動物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完全免疫原。利用此免疫原免疫兔，鼠，雞等動物可以得到對半抗原AOZ有特異反應(yīng)的抗體，這為該偶聯(lián)物用于制備AOZ的酶聯(lián)免疫檢測試劑提供了廣闊的應(yīng)用空間。把該抗體鍍在微孔盤內(nèi)，就可以用來檢驗動物源食品中呋喃唑酮抗生素的殘留。由于該方法具有簡易，快速，特異，準確的特點，所以可以用于食品檢驗檢疫中的初步掃描檢測之用。這樣不但可以節(jié)省大量的檢驗時間，還可以用于現(xiàn)場操作，從而彌補了儀器法費時較長，需要大型儀器設(shè)備支持，需要專門的技術(shù)人員操作，難于用于現(xiàn)場的不足。所以，半抗原AOZ與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物的合成為這種快速檢驗法奠定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式
實施例1(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶內(nèi)，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入AOZ 10.00mg(0.0980mmol)，牛血清蛋白BSA 222.00mg(0.00327mmol)(所用BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反應(yīng)4小時，得到溶液A。
(2)溶液B的制備在25℃條件下，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反應(yīng)4小時，得到淡黃色溶液B。
(3)制備AOZ免疫原將溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)緩沖液透析72小時(透析膜美國聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品)，每12小時更換一次透析液。以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液。凍干上清液，得到180mg白色固體粉末，即為3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(pH＝7.40，0.01M)為洗脫液。收集AOZ偶聯(lián)物純品。再經(jīng)凍干得到AOZ免疫原固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物的偶聯(lián)情況。本發(fā)明的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物在267nm處有特征紫外吸收峰。紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3430，2928，2876，1643，1530，1445，1083，581，537，460。
實施例2(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶內(nèi)，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入AOZ 10.00mg(0.0980mmol)，牛血清蛋白BSA 444.04mg(0.00653mmol)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反應(yīng)5小時，得到溶液A。
(2)溶液B的制備在25℃條件下，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反應(yīng)5.5小時，得到淡黃色溶液B。
(3)制備AOZ免疫原將溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)緩沖液透析77小時(透析膜美國聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品)，每11小時更換一次透析液。以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液。凍干上清液，得到360mg白色固體粉末，即為3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(pH＝7.40，0.01M)為洗脫液。收集AOZ偶聯(lián)物純品。再經(jīng)凍干得到AOZ免疫原固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物的偶聯(lián)情況。本發(fā)明的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物在267nm處有特征紫外吸收峰。紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3430，2928，2876，1643，1530，1445，1083，581，537，460。
實施例3(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶內(nèi)，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入AOZ 10.00mg(0.0980mmol)，牛血清蛋白BSA 333.20mg(0.00490mmol)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反應(yīng)6小時，得到溶液A。
(2)溶液B的制備在25℃條件下，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反應(yīng)5小時，得到淡黃色溶液B。
(3)制備AOZ免疫原將溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)緩沖液透析72小時(透析膜美國聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品)，每12小時更換一次透析液。以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液。凍干上清液，得到273mg白色固體粉末，即為3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(pH＝7.40，0.01M)為洗脫液。收集AOZ偶聯(lián)物純品。再經(jīng)凍干得到AOZ免疫原固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物的偶聯(lián)情況。本發(fā)明的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物在267 nm處有特征紫外吸收峰。紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3430，2928，2876，1643，1530，1445，1083，581，537，460。
權(quán)利要求
1.一種3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，由3-氨基-2-惡唑烷酮類半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)偶聯(lián)構(gòu)成，所述載體物質(zhì)為優(yōu)選蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段，合成多肽或半合成多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)是牛血清蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的AOZ的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體(2)紫外吸收光譜267nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3430，2928，2876，1643，1530，1445，1083，581，537，460。
4.如權(quán)利要求3所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，其中n為整數(shù)1～10，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
5.權(quán)利要求1～4中任一項所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是，將3-氨基-2-惡唑烷酮與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
6.如權(quán)利要求5所述3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，該方法步驟如下(1)將AOZ與牛血清蛋白以15∶1～30∶1的摩爾比溶于設(shè)定體積的磷酸緩沖液中，反應(yīng)4～6小時，制成溶液A；(2)在25℃～30℃條件下，以溶液A體積75分之一的量加入戊二醛于溶液A中，同時不斷攪拌，反應(yīng)3～6小時，得到溶液B；(3)將溶液B用磷酸緩沖液透析70～78小時，每10～12小時更換一次透析液；(4)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液；(5)將制取的上清液凍干，得到3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物粗品；(6)以磷酸緩沖溶液為洗脫液，用葡聚糖凝膠層析分離純化上述粗品，制得AOZ偶聯(lián)物純品，再經(jīng)凍干得到白色固體粉末狀的，具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的AOZ偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求6所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的AOZ與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比為20∶1。
8.如權(quán)利要求6所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的磷酸緩沖液pH為7.40，濃度為0.01M。
9.如權(quán)利要求6所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的戊二醛濃度是體積百分比為25％的水溶液。
10.如權(quán)利要求6所述的3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的葡聚糖凝膠層析采用Sephadex-G75。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通式(I)的3－氨基－2－惡唑烷酮(AOZ)的偶聯(lián)物，由3－氨基－2－惡唑烷酮半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)優(yōu)選牛血清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的AOZ的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20，BSA為牛血清蛋白，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa。本發(fā)明還公開了所述的偶聯(lián)物的制備方法，即將3－氨基－2－惡唑烷酮與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明具有方法簡便，快速，特異，準確的特點，為用所述偶聯(lián)物制備AOZ的酶聯(lián)免疫檢測試劑提供了廣闊的應(yīng)用空間。
文檔編號A61K47/42GK1593658SQ200410024478
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者郗日沫, 盧圣欣, 劉金庭, 張玉蘭 申請人:山東大學(xué)