專利名稱：用磁性復合微粒對血液中病毒及細胞清除的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于血液凈化方法及裝置的改進。涉及生物化學技術領域。
背景技術：
血液是人體維持生命的根本，一些致病物質對血液的侵襲，會直接威脅人體的生命和健康。因此，對血液制品的安全控制以及對疾病患者血液的凈化處理，具有非常重要的意義。對病毒感染而言，大部分可在幾周內自愈，有些病毒性感染可在幾個月后通過自身的免疫系統(tǒng)作用去除病毒，如麻疹病毒、肝炎B型病毒等，但有些病毒在慢性疾病感染后很難被去除，這些病毒主要包括皰疹病毒、反轉錄病毒、丙型肝炎病毒、刺瘤病毒和多瘤病毒等，這些難以去除的病毒感染血液，并進一步對血細胞、血漿及血漿衍生物引發(fā)感染(Lutz G Guertler.Virus safety of human blood，plasma，and derivedproducts.Thrombosis Research，107S39～S45，2002)，如獲得性免疫缺陷綜合癥病毒(HIV)是艾滋病的致病因子，它感染免疫系統(tǒng)的特定細胞，會危及受感染個體的免疫應答。因此，清除血液制品或人體血液中的病毒顆粒、病毒核酸片段以及被感染的血液細胞對血液的安全具有非常重要的意義。
目前血液制品中所含病毒的處理主要包括滅活和去除兩種形式，其中滅活的方法包括巴斯德消毒法、有機溶劑結合表面活性劑(S/D)法、干熱滅活法、光化學滅活法等，這些方法都存在有各自的缺點，如巴斯德消毒法對一些耐熱病毒的滅活不理想，S/D法不能有效滅活非脂包膜病毒，光化學法對一些血漿蛋白的活性損傷較大，目前的臨床使用表明，沒有一種病毒滅活方法能保證血液制品絕對無傳播病毒的危險(張延瑩等，血液制品滅活及去除病毒工藝，中國生化藥物雜志，23(4)207～209，2002)。由于滅活不能保證血液的安全，且作為異源蛋白本身在血液制品或輸入血液中會存在潛在的危險，因此，徹底去除病毒顯得尤為重要。目前常用的去除病毒的方法包括色譜分離和納米膜過濾的方法，色譜分離主要包括親和色譜和離子交換色譜，已經得到了實際應用，但色譜填料表面常需要通過共價偶聯的方法將特異的生物分子固定在其表面，該過程較為繁瑣。膜法依據蛋白質或病毒顆粒大小的差異會受到膜性質和孔徑大小的影響。因此，開發(fā)更新、效率更高的病毒去除方法是人們一直致力研究和開發(fā)的問題。
本申請所涉及血液中的病毒包括三類①含有包膜的病毒如皰疹病毒、丙肝病毒(HCV)以及反轉錄病毒(HIV，HTLV-1)等，這些病毒有些是通過皮膚傷口或感染的血液而進入體內如HCV；有些如HTLV-1病毒主要通過細胞介導的T-淋巴細胞和巨噬細胞傳遞，血漿中不會存在該種病毒，但在血小板收集過程中會因污染淋巴細胞而感染HTLV-1病毒。②具有特殊被膜的病毒，如乙肝病毒(HBV)主要通過血液和性途徑傳播③一些無包膜的病毒(HAV，細小病毒)等，如細小病毒B19屬DNA病毒，對兒童的感染尤為明顯，急性患者每毫升血液中病毒的含量高達1014，該病毒在血漿成分分離的過程中可去除部分，但殘留的病毒對熱和S/D滅活均具有較強的抑制作用。在上述病毒感染的血液中，有些還存在被病毒感染的細胞。如受HIV感染個體的循環(huán)血液中含有完整的病毒粒子、其中的片段和游離的RNA。伴隨著HIV-1感染，常常會引發(fā)巨細胞病毒(CMV)，乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)的感染，因此，可從被病毒感染個體的血液中清除多種病毒。本申請所涉及血液中的病變細胞主要包括白血病人的淋巴細胞、丙型肝炎患者的外周血單個核細胞等。
磁性微粒是由有機或無機基質與磁性超細粉末(包括磁性金屬、金屬氧化物等)復合形成的納米或微米級膠態(tài)顆粒。該材料具有的超順磁性使其通過運動保持在膠體溶液中的穩(wěn)定性，并有磁響應性可保證在外加磁場中顆粒與懸浮介質的分離，當撤去外磁場后，微粒本身會重新懸浮分散不聚集，不具有磁記憶性。更有意義的是，通過高分子或有機試劑與磁性顆粒的復合，可在顆粒表面引入氨基、羧基、巰基、羥基等功能基團，通過共價作用將酶、抗體、細胞、核酸及寡核苷酸等生物分子固定在表面，進而應用于細胞分選、酶的固定化、免疫檢測、藥物載體及核酸的純化與分離、腫瘤的靶向治療研究等生物和醫(yī)學領域。
磁性微粒的制備方法有許多，如球磨法、乳液聚合法、液相干燥法、溶膠-凝膠法、均勻沉淀法、氣溶膠法、反相膠束法、無定型晶化法等。國外已有相關產品上市，1986年挪威的Dynal公司率先實現了該類產品的商業(yè)化，所提供的Dynabead BeadsM-280和M-450已廣泛用于細胞分選、蛋白質及核酸分離等領域；德國Miltenyi Biotech公司利用多糖包覆的磁性微粒偶聯抗體已應用于細胞分選方面；Boehringer Mannheim公司的mRNA分離試劑盒也是特色產品；美國的FeRx公司、PE公司、Perseptive公司、瑞典的Pharmacia公司、法國的Estapor、德國的Micromod以及加拿大的Biochem Immunosystem等公司，都已將相關的產品商業(yè)化。產品所涉及的高分子種類、特性及其與磁性內芯組成等各種各樣，應用領域也越來越廣。
國內在該領域目前大多處于研究階段。中科院成都有機所較早利用單體聚合法進行了磁性聚苯乙烯微粒的合成，并用于固定化中性蛋白酶的研究。南開大學高分子化學所研究了磁性葡聚糖毫微粒的合成，并探討了固定化酶的條件。天津大學生物工程研究中心、第四軍醫(yī)大學等單位在磁性載藥顆粒的靶向治療方面開展了研究。本申請發(fā)明人日前做出的一種核/殼型超順磁性復合微粒及其制備方法與應用(專利申請?zhí)朇N03124061.5)、一種組裝型磁性復合微粒及其制備方法與應用(專利申請?zhí)朇N03153486.4)、磁性熒光微球及其制備方法和采用該磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法(專利申請?zhí)朇N02139365.6)、磁性微球介導的微流體分析系統(tǒng)及其檢測方法(專利申請?zhí)朇N03134319.8)等研究，均與磁性微粒的制備與應用相關。
中國專利公開了(申請?zhí)朇N03113522.6)一種納米級抗艾滋病病毒微球，該方法是以注射方式將磁性微粒導入靜脈，通過誘導產熱將病毒滅活，故其不能徹底清除病毒，病毒仍然存在于體內，而且其也未交待體內殘留病毒和磁性微粒的清除方法，所以該技術不屬于血液病毒清除范圍。經檢索，未見有磁性微粒在血液中清除病毒或病變細胞方法的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種清除血液中感染的病毒和病變細胞的方法和裝置，以解決已有技術存在的缺陷，使其具有操作簡單、特異性強、無殘留、安全可靠、無毒副作用的優(yōu)點。
本發(fā)明所提出的清除血液中感染的病毒和病變細胞的方法是以磁性微粒和血液凈化學為基礎；其特征在于利用磁性復合微粒作為反應和分離的固相載體，將血液與磁性復合微粒充分接觸，使血液中病毒或病變細胞與磁性復合微粒表面的特異性分子反應并被吸附在磁性復合微粒上，再將磁性復合微粒與血液通過外加磁場進行分離，則得到凈化血液；所述磁性復合微粒的表面固定有特異性的生物大分子，其能與被清除的病毒或病變細胞發(fā)生特異性親和反應；所述磁性復合微粒以膠體狀態(tài)存在于水或生理鹽水介質中。本發(fā)明根據血液中的病情，一次處理可清除一種或幾種病毒或/和病變細胞，即可在一種磁性微球表面固定一種特異性的生物分子，清除血液中單一的病毒或病變細胞；也可在幾種磁性復合微粒表面固定不同的生物分子，將這幾種磁性復合微粒同時使用，這樣可以同時除去血液中被感染的幾種不同的病毒或/和病變細胞。
本發(fā)明所提出清除血液中病毒或病變細胞的方法有三種實施方式1.用于血站血液流通過程中對病毒和病毒核酸片段的體外快速清除；將血液或血液制品流經一個裝有磁性復合微粒的吸附裝置，使血液中的病毒和病毒核酸片段被磁性復合微粒吸附，流出的即為凈化的血液；此方法的溫度最好在15～25℃，血液流經吸附裝置的時間為10～30分鐘，由于血站的進出血液所含有病毒和病毒核酸為常見的幾種，所以此方式所用的磁性復合微粒是1-5種生物大分子微粒的混合或組合。凈化后的血液或血液制品即可貯存或用于臨床。
2.用于病人治療過程中血液在體外快速凈化并回輸；首先要確定病人血液中所含病毒或病變細胞的種類，以選擇確定磁性復合微粒表面固定的特異性生物大分子，其方式與血液透析原理相同；將患者血液安全地引出體外，流經一個裝有磁性復合微粒的吸附裝置，使血液中的病毒或/和病變細胞被磁性復合微粒吸附，再將流出的凈化血液輸回患者體內；此方式的溫度最好在30～40℃，血液流經吸附裝置的時間為10～30分鐘。
3.用于危重病人治療過程中體內循環(huán)吸附、體外分離清除并回輸；
首先要確定病人血液中所含病毒或病變細胞的種類，以選擇確定磁性復合微粒表面固定的特異性生物大分子；以注射液為介質將磁性復合微粒導入患者血液中，經2～8天體內循環(huán)吸附，再將患者血液安全引出，流經一個固定磁場，血液中的磁性復合微粒在磁場中被吸附固定，流出的凈化血液回輸至患者體內。此方式血液在固定磁場的流經時間不少于1分鐘，磁場強度不小于3000高斯，為防止磁性微粒對血管的阻塞(粒徑過大)同時保證磁性復合微粒不被組織吸收(粒徑過小)，所用磁性復合微粒的粒徑在0.1～1μm。
實現本發(fā)明所提出清除血液中病毒和病變細胞方法的關鍵裝置是裝有磁性復合微粒的吸附裝置，其結構原理為在一兩端設有進出口的管狀容器內，裝有膠態(tài)溶液形式的磁性復合微粒，該磁性復合微粒均勻分布，其固形物含量在1mg/mL～20mg/mL之間；為防止血液流動中因渦流造成的溶血現象，吸附裝置兩端進出口的口徑應與設備(血液過濾機或血液透析機)中血液流經管路的口徑一致；為使血液與磁性復合微粒充分接觸，吸附裝置的管徑應大于設備流經管路口徑，以降低流速，增加接觸時間；吸附裝置的管長取決于血液在其中需要流經的時間，流經時間越長管越長，但管長與管徑成反比，即管徑越大，管長越短；所以，吸附裝置管狀容器可以是粗短的直管，也可以是較長的螺線管；為防止血流帶走磁性復合微粒，使血液與磁性復合微粒分離，在吸附裝置進出口的外周設置有固定磁場，以吸附流出的磁性復合微粒。由于本發(fā)明的吸附裝置是與已有設備套接使用，已構成獨立的產品，故兩端的進出口有密封蓋，且有密封的無菌外包裝。
本發(fā)明的吸附裝置在血站的使用(方式1)，其吸附管可采用粗大的直管，這樣流量更大些；其內的磁性復合微?？刹捎梦⒚准?，這樣可降低成本；管內磁性復合微粒表面所固定的生物大分子，可以是幾種微粒的混合，也可以是幾種復合微粒在管內分區(qū)段的組合。本發(fā)明的吸附裝置在體外血液循環(huán)凈化中的使用(方式2)，其吸附管可使用較長的螺線管，這樣使吸附更徹底；此方式的應用還需結合血液體外循環(huán)系統(tǒng)的使用，以保證患者血液正常的流出速度和合適的回輸靜脈壓，同時調節(jié)磁性復合微粒與血液在吸附裝置中的反應時間。在這兩種方式的使用中，為使病毒或病變細胞更充分地與磁性復合微粒接觸，可在吸附裝置外周設置一可變電磁場，以帶動微粒在吸附管內的運動；為提高凈化血液的安全性，可在設備的后管路(吸附管以后)設置一個固定磁場(永磁鐵或電磁場)，使凈化血液流出時再次吸附流失的磁性微粒，處理結束清洗設備時，撤去磁場，磁粒即被清除。
實現本發(fā)明用于危重病人治療過程中體內循環(huán)吸附體外分離清除方法的裝置(方式3)，在分離回收磁性復合微粒時，是與血液體外循環(huán)機配合使用，在循環(huán)機上血液流經的管路設有外加磁場，實現血液中磁性復合微粒吸附和分離。
由上述內容可見，本發(fā)明采用的磁性復合微粒其表面所固定的生物大分子應對血液制品和患者血液內病毒或/和病毒核酸和病變細胞有特異性的親和反應。其具體的對應物及制備在現有技術中已為人熟知。如，清除血液中乙型肝炎病毒可選擇特異性的抗體IgG-HBs，并通過該抗體的Fc端將其固定在磁性復合微粒表面以實現吸附；HIV感染者血液內會存在一定的RNA病毒片段，可通過對HIV基因序列比對，應用現有的生物信息學BLAST分析軟件，篩選出針對HIV核酸片段特異性的DNA探針序列，合成并將其固定在磁性復合微粒表面，通過磁性復合微粒表面探針與血液中核酸片段的特異性雜交反應即可除去病毒的核酸片段；還可以通過將丙型肝炎患者外周血中病變的單核細胞表面受體的特異性抗體固定在磁性復合微粒以清除相應的病變細胞。本發(fā)明可針對單個病毒的清除，也可針對多種病毒的同時清除，如伴隨著HIV-1感染的同時，會引發(fā)巨細胞病毒(CMV)、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)的感染，因此，通過固定有幾種特異性抗體的磁性復合微粒的同時應用，可從被病毒感染血液中清除多種病毒。
本發(fā)明根據感染血液病毒的不同情況，通過磁性復合微粒表面固定的DNA序列或抗體對血液中病毒顆粒、RNA片段以及被感染細胞的清除，實現清除血液中病毒粒子或病變細胞的目的。本發(fā)明解決了目前熱滅活法、S/D法、干熱滅活法等已有技術不能徹底清除血液中病毒的缺點，與膜法相比，具有不會影響血液中正常組分的優(yōu)勢。此外，本發(fā)明具有操作簡單、特異性強、無殘留、安全可靠、無毒副作用的優(yōu)點，這對改變目前血液制品和患者血液中病毒清除的現狀具有非常重要的意義。
具體實施例方式
例1本實施例僅說明所用Fe3O4/Au組裝型磁性復合微粒的制備，但不限于本例所述的范圍購得商品化磁性Fe3O4納米微粒，用高純水反復洗滌至中性，配制成懸浮液；取25mL的Fe3O4懸浮液，磁性分離后，棄上清液，加入H2O∶C2H5OH(體積比1∶1)的混合溶劑250ml左右，然后加入三巰基丙基-3乙氧基硅烷2mL，50℃反應10小時進行硅烷化處理，磁性分離后用雙蒸水反復洗滌至中性，完成表面修飾；取30mL表面修飾有功能基團的磁性微粒(固形物含量為4mg/mL)，磁性分離去上清，然后加入100mL粒徑為20nm的膠體金，在振蕩器上反應5-8小時，使其組裝在磁性顆粒的表面，形成組裝型磁性復合微粒Fe3O4/Au。
例2本實施例說明與病毒、病毒顆粒以及被病毒感染細胞具有親和作用的生物分子，如抗體、核酸探針等，在磁性復合微粒表面的固定化方法。
以HIV病毒衣殼蛋白gp120的特異性抗體的固定化為例.可依據不同磁性復合微粒的特點通過不同的方法進行固定化，若表面含有膠體金和金殼層的磁性復合微粒，可在0.01的PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液中將抗體與磁性復合微?；旌霞s10～30min，就可方便地將抗體固定在其表面；若磁性復合微粒表面帶有氨基，可通過戊二醛為交聯劑的二步法將抗體通過希夫堿的形成固定化；帶有羧基的磁性復合微粒，可利用水溶性碳二亞胺為偶聯劑將抗體固定在微粒表面。固定有抗體的磁性復合微?？蓪⒀褐破坊蚧颊哐褐械牟《绢w粒進行清除。
對核酸探針的固定，可將所選擇特異性探針在合成過程中進行氨基或生物素標記，然后通過共價鍵作用或生物素-親和素體系將寡核苷酸探針在磁性復合微粒表面固定化。
例3本實施例用于說明針對HIV-1病毒特定區(qū)域的寡聚核苷酸的篩選通過HIV-1基因序列比對和BLAST軟件分析可篩選HIV-1探針序列，如篩選序列可作為5′LTR區(qū)的保守序列的互補鏈。這一序列存在于不同的HIV-1株中，已有技術表明該序列具有一定的應用價值。
權利要求
1.一種用磁性復合微粒對血液中病毒及病變細胞清除的方法，其特征在于利用磁性復合微粒作為反應和分離的固相載體，將血液與磁性復合微粒充分接觸，使血液中病毒或病變細胞與磁性復合微粒表面的特異性分子反應并被吸附在磁性復合微粒上，再將磁性復合微粒與血液通過外加磁場進行分離，則得到凈化血液；所述磁性復合微粒的表面固定有特異性的生物大分子，其能與被清除的病毒或病變細胞發(fā)生特異性親和反應；所述磁性復合微粒以膠體狀態(tài)存在于水或生理鹽水介質中。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將血液或血液制品流經一個裝有磁性復合微粒的吸附裝置，使血液中的病毒和病毒核酸片段被磁性復合微粒吸附，流出的即為凈化的血液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述親和反應的溫度為15-25℃，血液流經吸附裝置的時間為10-30分鐘；所述的磁性復合微粒是1-5種生物大分子微粒的混合或是組合。
4.根據權利要1所述的方法，其特征在于，將患者血液安全地引出體外，流經一個裝有磁性復合微粒的吸附裝置，使血液中的病毒或/和病變細胞被磁性復合微粒吸附，再將流出的凈化血液輸回患者體內。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述親和反應的溫度為30-40℃，血液流經吸附裝置的時間為10-30分鐘。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，以注射液為介質將磁性復合微粒導入患者血液中，經2～8天體內循環(huán)吸附，再將患者血液安全引出，流經一個固定磁場，血液中的磁性復合微粒在磁場中被吸附固定，流出的凈化血液回輸至患者體內。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述固定磁場的強度不小于3000高斯，血液在固定磁場的流經時間不少于1分鐘；所用磁性復合微粒的粒徑在0.1-1μm。
8.一種實現權利要求1所述方法的吸附裝置，其特征在于，在一兩端設有進出口的管狀容器內，裝有膠態(tài)溶液形式的磁性復合微粒，該磁性復合微粒均勻分布，其固形物含量在1mg/mL～20mg/mL之間；吸附裝置兩端進出口的口徑應與設備中血液流經管路的口徑一致；吸附裝置的管徑應大于設備流經管路口徑。
9.根據權利要求8所述的吸附裝置，其特征在于，所述的吸附裝置管狀容器可以是直管，或是螺線管；在吸附裝置進出口的外周設置有固定磁場，在兩端的進出口有密封蓋。
10.一種實現權利要求1所述方法的血液體外循環(huán)機，其特征在于，在循環(huán)機上血液流經的管路設有外加磁場。
全文摘要
一種用磁性復合微粒對血液中病毒及病變細胞清除的方法及裝置，本發(fā)明的特點是利用磁性復合微粒作為反應和分離的固相載體，將血液與磁性復合微粒充分接觸，使血液中病毒或病變細胞與磁性復合微粒表面的特異性分子反應并被吸附在磁性復合微粒上，再將磁性復合微粒與血液通過外加磁場進行分離，則得到凈化血液；本發(fā)明通過磁性復合微粒表面固定的DNA序列或抗體與血液中病毒顆粒、RNA片段以及被感染細胞的親和反應，實現了清除血液中病毒粒子和病變細胞的目的。本發(fā)明解決了已有技術不能徹底清除血液中病毒的缺點，與膜法相比，具有不影響血液中正常組分的優(yōu)勢。本發(fā)明具有操作簡單、特異性強、無殘留、安全可靠、無毒副作用的優(yōu)點，這對改變目前血液制品和患者血液中病毒清除的現狀具有非常重要的意義。
文檔編號A61M1/00GK1583185SQ20041002622
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月8日 優(yōu)先權日2004年6月8日
發(fā)明者陳超, 崔亞麗, 陸祖宏 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司