專利名稱：解毒活血栓及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療濕熱挾瘀型慢性前列腺炎的解毒活血栓及其制備方法。
背景技術(shù)：
慢性前列腺炎分為細菌性和非細菌性兩種，是男性泌尿生殖系統(tǒng)的常見病。屬中醫(yī)“淋證”、“精濁”、“白淫”等范疇，其病因病機常為內(nèi)外濕熱之邪侵犯下焦引起，濕熱之邪長期不清，久郁不泄，而致氣血瘀滯。目前臨床上用于治療慢性前列腺炎的藥物，以口服劑型為多見?？诜苿偃碛盟?，由于全身用藥往往難以達到有效的局部藥物濃度，所以這些藥物中，有的起效較慢，療程長，往往需服用數(shù)月，甚至經(jīng)年才能見效，有的治療效果不甚理想，復(fù)發(fā)率較高，或毒副作用大。故臨床上對全身用藥治療效果不佳的頑固性慢性前列腺炎患者采用局部用藥和局部治療的方法，如“前列安栓”，該藥物為純中藥制劑，不僅避免了全身用藥的毒副作用，而且可以使前列腺實質(zhì)及腺管內(nèi)的藥物有效濃度大大超過全身應(yīng)用所獲得的水平，療效明顯好于全身用藥。但是在臨床應(yīng)用過程中也發(fā)現(xiàn)該藥對直腸粘膜存在一定的刺激性，部分病人使用后有腹瀉現(xiàn)象，也影響了療效。因此，現(xiàn)有的治療慢性前列腺炎的藥物有的起效慢、療程長；有的療效差、復(fù)發(fā)率高；有的刺激性強、副作用大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于治療濕熱挾瘀型慢性前列腺炎的解毒活血栓及其制備方法，該解毒活血栓起效快、療程短、療效好、不復(fù)發(fā)、無刺激性、副作用小。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明的內(nèi)容物主要是由下列重量配比的原料制成黃連1200 赤芍1200 冰片25 青黛800 丹參1200 牛膝1200本發(fā)明的制備方法包括下列步驟(1)、取所述重量配比的黃連粉碎成粗粉，用0.5％硫酸為溶劑，浸漬24小時后滲漉，收集7倍量滲漉液，用鹽酸調(diào)pH值為2～3，放置過夜，沉淀物加等量水洗滌1次，烘干，粉碎成細粉，備用；(2)、取所述重量配比的青黛，用85％乙醇為溶劑，浸漬24小時后滲漉，收集8倍量滲漉液，備用；(3)、取所述重量配比的冰片研成細粉，備用；(4)、取所述重量配比的丹參，分別加8倍、6倍量的85％乙醇回流提取二次，每次各提取1小時，合并回流提取液，備用；(5)、取所述丹參藥渣與所述重量配比的赤芍、牛膝加水煎煮提取三次，第一次加水10倍，第二次加水8倍，第三次加水8倍，每次各煎煮1小時，在70℃時合并煎液并濃縮至相對密度為1.05～1.10，放冷，加乙醇使含醇量達70％，攪勻，放置24小時，濾過，濾液與所述青黛滲漉液、所述丹參回流提取液合并，在70℃時回收乙醇并濃縮成相對密度為1.33～1.38的浸膏，備用；(6)、取重量配比為1115的栓劑基質(zhì)，加熱熔化，溫度保持在55℃±2℃，加入所述黃連提取物細粉、所述浸膏及所述冰片細粉，混勻，灌注，封口，制成栓劑。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的內(nèi)容物主要是由黃連、赤芍、冰片、青黛、丹參、牛膝為原料藥制成，它具有清熱燥濕解毒、活血祛瘀止痛的功效，對濕熱挾瘀型慢性前列腺炎治療效果好、毒副作用小。因直腸下段痔靜脈叢回流的血液單向輸送到前列腺周圍的泌尿生殖靜脈叢，這一解剖學(xué)特性決定了經(jīng)直腸途徑給藥治療前列腺疾病的合理性，而本發(fā)明屬直腸給藥，用藥后不僅可避開口服藥物受肝臟首過作用破壞的現(xiàn)象，同時可避免對肝、腎等的損害；更重要的是因給藥部位貼近病所，故給藥后吸收快，并可直達病灶，從而迅速發(fā)揮療效，使療程大大縮短；同時，與相同功能的同類制劑比較，本品不僅療效好，并且使用后無腹瀉現(xiàn)象。
下面通過試驗例來進一步闡述本發(fā)明的有益效果試驗例一、解毒活血栓的主要藥效學(xué)試驗摘要解毒活血栓的功能清熱燥濕解毒、活血祛瘀止痛，對濕熱挾瘀型慢性前列腺炎有很好的治療效果。對消痔靈注射液致大鼠慢性非細菌性前列腺炎的作用實驗證實，解毒活血栓可明顯抑制前列腺組織炎細胞浸潤及纖維母細胞增生，同時能恢復(fù)前列腺的分泌功能；對大鼠實驗性細菌性前列腺炎的抑制作用實驗表明，解毒活血栓對實驗性細菌性前列腺炎有明顯的抑制作用，其作用表現(xiàn)為可提高前列腺液中卵磷脂小體密度，降低白細胞計數(shù)，明顯抑制前列腺腺腔內(nèi)及間質(zhì)炎細胞浸潤，并且呈一定的量效正相關(guān)；體外抑菌實驗顯示解毒活血栓對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、表皮葡萄球菌均有明顯的抑制作用，對綠膿桿菌、大腸桿菌也有一定的抑制作用，同時對前列腺液中大腸桿菌的生長具有明顯的抑制作用；抗炎實驗表明，解毒活血栓對小鼠耳腫脹有很好的抑制作用，對紐扣致大鼠肉芽腫有明顯的抑制作用，說明解毒活血栓具有較好的抗炎作用；對大鼠急性血瘀證模型作用的實驗結(jié)果表明，解毒活血栓可明顯降低血瘀證大鼠不同切變率下的全血粘度，對血小板聚積率亦有一定作用，證明解毒活血栓的確有一定的活血化瘀作用；熱板法試驗顯示解毒活血栓能明顯延長小鼠的疼痛反應(yīng)時間，提高痛域指數(shù)，扭體法試驗顯示解毒活血栓能明顯抑制酒石酸銻鉀引起的小鼠扭體反應(yīng)，證明解毒活血栓具有較好的止痛作用。
實驗?zāi)康慕舛净钛ň哂星鍩嵩餄窠舛?、活血祛瘀止痛的功效。本實驗主要考察其抗炎、止痛、抑菌、活血化瘀及對實驗性前列腺炎的藥理作用?br> 實驗單位中國中醫(yī)研究院基礎(chǔ)理論研究所原始資料保存單位中國中醫(yī)研究院基礎(chǔ)理論研究所
1實驗材料1.1受試藥物解毒活血栓制劑由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室提供，批號為950215(每粒含生藥量為5.625g)。
野菊花栓北京同仁堂二廠生產(chǎn)(940829)吲哚美鋅北京第三制藥廠生產(chǎn)(930612)婦炎平廣東汕頭制藥廠生產(chǎn)(950118)致炎劑(自制)2％巴豆油、20％無水乙醇、5％蒸餾水、73％乙醚培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯25％消痔靈注射液中國中醫(yī)研究院廣安門醫(yī)院、中國吉林省集安制藥廠(911104)0.1％鹽酸腎上腺素注射液北京市永康制藥廠(971019)復(fù)方丹參片河北巨龍藥業(yè)公司(980322)1.2動物及菌種金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003中國藥品生物制品檢定所提供金黃色葡萄球菌(地方株)中國藥品生物制品檢定所提供綠膿桿菌CMCC(B)10211 同上綠膿桿菌(地方株) 同上糞鏈球菌ATCC14506 同上表皮葡萄球菌ATCC12228 同上大腸桿菌CMCC(B)44113 同上大腸桿菌44155-7 同上昆明種小白鼠首都醫(yī)學(xué)院動物中心提供(醫(yī)動字第01-3004)Wistar大白鼠首都醫(yī)學(xué)院動物中心提供(醫(yī)動字第01-3084)
Wistar大白鼠解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(98009)2實驗項目、方法與結(jié)果2.1解毒活血栓對慢性非細菌性前列腺炎的影響選用體重280～320g雄性Wistar大白鼠32只，用異戊巴比妥鈉麻醉，在無菌條件下于下腹正中切口，直達腹腔，提出膀胱及兩側(cè)精囊，暴露附于精囊內(nèi)側(cè)的前列腺背葉，分別注入25％消痔靈注射液0.2ml，縫合肌肉、皮膚。于手術(shù)第2天將手術(shù)動物分為4組，每組8只。各組分別按下述藥物及劑量給藥大劑量組解毒活血栓0.6g/kg(相當(dāng)于3.375g生藥/kg)；小劑量組解毒活血栓0.3g/kg(相當(dāng)于1.688g生藥/kg)；陽性對照組野菊花栓0.6g/kg；模型對照組空白栓0.3g/kg；另取正常大鼠8只做正常對照組。給藥前12小時禁食，將栓劑加溫水配成一定濃度，按以上劑量使每只動物每日給藥量為0.2ml，經(jīng)肛門給藥，一天給藥2次，每次給藥0.1ml，給藥間隔2小時以上，連續(xù)給藥1個月。于末次給藥后24小時處死動物，取出前列腺置于10％福爾馬林液固定標(biāo)本，常規(guī)脫水，切片，H·E染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察正常對照組正常大鼠前列腺組織被一層纖維結(jié)締組織及平滑肌構(gòu)成的被膜所包繞，被膜中的纖維結(jié)締組織及平滑肌與腺體內(nèi)的相連且延續(xù)。前列腺腔大小不一，腺上皮表面形成很多皺襞，使腺腔很不規(guī)則。腺泡上皮多為單層柱狀或立方，個別呈假復(fù)層，腺腔中可見大量深粉染之分泌物，有的形成前列腺凝結(jié)物。
模型對照組所有大鼠前列腺間質(zhì)內(nèi)可見大量的淋巴細胞、單核細胞等炎細胞浸潤，有的地方淋巴細胞浸潤明顯集中呈簇狀。其中4只大鼠可見由淋巴細胞、單核細胞及多核巨噬細胞形成的炎性肉芽腫性病變。由于炎細胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生，使間質(zhì)明顯增寬。極少數(shù)腺腔縮小，所有腺腔分泌物明顯減少，呈淡紅色染色，有的腺腔內(nèi)無分泌物。病變?nèi)珵橹囟取?br> 大劑量治療組前列腺間質(zhì)內(nèi)炎細胞浸潤明顯減少，只見少量淋巴細胞；單核細胞散在浸潤，間質(zhì)內(nèi)纖維母細胞增生也減輕。腺泡上皮呈立體形，腺腔增大，其內(nèi)分泌物明顯增多。呈深粉染色，極少數(shù)分泌物呈淡粉色，未見無分泌物的腺腔。有1例間質(zhì)中可見較多的炎細胞浸潤。病變?nèi)珵檩p度。
小劑量治療組所有動物前列腺間質(zhì)可見淋巴細胞、單核細胞浸潤，纖維母細胞增生，但均較模型組減輕。2例可見輕度肉芽腫形成。病變2例為重度，6例為輕度。
陽性對照藥治療組前列腺間質(zhì)可見少量淋巴細胞浸潤，纖維母細胞增生明顯減少，有的地方恢復(fù)正常，腺腔內(nèi)分泌物恢復(fù)正常，呈深粉紅染色，病變?nèi)珵檩p度。
綜合以上實驗結(jié)果，各組動物前列腺組織炎癥改變見表1、表2表1 解毒活血栓對慢性非細菌性前列腺炎的影響組別 劑量 動物 間質(zhì)炎細 腺腔分 纖維母肉芽腫 間質(zhì)(g/kg) 數(shù) 胞浸潤 泌物細胞 形成正常對照組 8 無 量多均勻深染無無 正常空白栓模型對照組 0.3 8 大量集中成簇 量少空腔淺染大量 4只 增寬解毒活血栓大劑量組0.6 8 少量散在 量多均勻深染少量 無 正常解毒活血栓小劑量組0.3 8 較多散在 量較少淺染 少量 2只 正常野菊花栓陽性對照組0.6 8 少量散在 量多均勻深染少量 無 正常表2 解毒活血栓對慢性非細菌性前列腺炎的抗炎作用動 炎細胞浸潤(％) 纖維母細胞增生組別 劑量物(g/kg)重度 輕度 基本正常重度 輕度基本正常數(shù)模型對照組 8 0 0 4 4 0(空白栓) 0.38 (100) (0) (0) (50) (50)(50)治療大劑量組1 7 0** 0 7 1(解毒活血栓) 0.68 (12.5)(87.5)(0) (0) (87.5) (12.5)治療小劑量組2 6 0** 1 7 0(解毒活血栓) 0.38 (25) (75) (0) (12.5)(87.5) (0)陽性對照組 0 8 0** 0 7 1(野菊花栓)0.68 (0) (100) (0) (0) (87.5) (12.5)與模型對照組比較 **P＜0.01上述結(jié)果顯示，各造模組動物前列腺組織鏡下觀察，均可見不同程度的炎細胞浸潤及纖維母細胞增生，說明消痔靈致大鼠慢性非細菌性慢性前列腺炎模型是成功的；其中治療大劑量組與野菊花栓陽性對照組均可明顯抑制炎細胞浸潤及纖維母細胞增生，使腺腔內(nèi)分泌物增多，小劑量治療組作用強度弱于大劑量組。表明解毒活血栓對慢性前列腺炎具有很好的治療作用。
2.2解毒活血栓對細菌性前列腺炎的影響2.2.1大鼠實驗性細菌性前列腺炎模型的研究取體重300±20克Wistar雄性大白鼠35只，實驗前動物禁食12小時，用6mg/ml的戊巴比妥鈉麻醉，用量0.5ml/100g體重，腹腔注射。麻醉后，在無菌條件下，腹正中切口，于前列腺頭葉根部與精囊的相接處，注射1.4×107個/ml大腸桿菌生理鹽水懸液0.1ml，縫合后放籠中飼養(yǎng)。于術(shù)后1、2、3、4、5、6天后，每天處死5只動物，剖腹，分別取前列腺按摩液和前列腺組織進行如下檢查(一)取一側(cè)前列腺按摩液10μl做白細胞檢查，另取一滴涂片，進行卵磷脂小體檢查，結(jié)果見表3。
表3 造模術(shù)后不同時間大鼠前列腺液檢查結(jié)果(X±SD)造模時間動物數(shù)卵磷脂小體密度白細胞計數(shù)(天數(shù))(評分值) (個/μl)0 5 3.80±0.45560±48.991 5 3.60±0.483040±538.89**2 5 2.60±0.49** 9460±1301.69**3 5 2.40±0.49** 3570±950.05**4 5 2.80±0.40** 3580±1371.70**5 5 2.80±0.40** 1980±384.71**6 5 3.80±0.45980±365.51*與0天比較，*P＜0.05 **P＜0.01(二)取另一側(cè)前列腺組織進行病理檢查，結(jié)果如下
①肉眼觀察造模0天前列腺組織無充血、水腫、出血、粘連等，前列腺液較清亮。
造模1天前列腺組織有充血和不同程度的水腫，前列腺液較粘稠。
造模2天前列腺組織有明顯充血、水腫，前列腺液呈膿液樣，粘稠。
造模3天前列腺組織充血、水腫明顯，較硬，前列腺液為膿性液。
造模4天前列腺組織充血、水腫減輕。
造模5天前列腺組織輕度充血，無水腫，前列腺液較清亮。
造模6天基本恢復(fù)正常。
②鏡下觀察取出前列腺置于10％福爾馬林液固定標(biāo)本，常規(guī)脫水，切片，H·E染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察造模0天前列腺上皮呈低柱狀，立方形，有處呈假復(fù)層，腺腔有處彎曲、形狀不整。間質(zhì)可見纖維結(jié)締組織及平滑肌，未見炎細胞浸潤。腹腔內(nèi)可見蛋白性凝結(jié)物。精囊上皮為立方形，腔大小不一，可見少量凝結(jié)物，間質(zhì)未見炎細胞浸潤，可見少量纖維結(jié)締組織。
造模1天；5只大鼠前列腺及精囊間質(zhì)內(nèi)可見少量中性白細胞，少許單核細胞，腔內(nèi)未見膿細胞，上皮未見增生。
造模2天前列腺及精囊間質(zhì)內(nèi)可見較多中性白細胞，血管擴張充血，少量單核細胞，少許嗜酸性白細胞浸潤，腔內(nèi)可見大量膿細胞聚集。上皮細胞輕度增生呈復(fù)層及乳頭狀，上皮細胞內(nèi)也可見膿細胞浸潤。
造膜3天比造膜2天病變重，間質(zhì)內(nèi)可見大量中性白細胞、單核細胞，少許淋巴細胞，血管明顯擴張充血，腔內(nèi)大量膿細胞聚集，上皮細胞明顯增生，可見核分裂。
造膜4天炎癥明顯減輕，除少量中性白細胞外，尚可見淋巴細胞、單核細胞及嗜酸性白細胞，腔內(nèi)偶見少許中性白細胞，上皮增生明顯減輕。
造膜5天和6天間質(zhì)內(nèi)可見少量淋巴細胞，少許嗜酸性白細胞，腔內(nèi)未見膿細胞，上皮增生明顯減輕。有的自然恢復(fù)，基本正常。
綜合以上實驗結(jié)果，本實驗所采用的實驗性細菌性動物模型為急性細菌性前列腺炎，其炎癥高峰為造膜3天。
2.2.2解毒活血栓對實驗性細菌性前列腺炎抑制作用的實驗研究實驗分組及給藥選用體重280～320g雄性Wistar大白鼠50只，分為5組，每組10只。各組分別按下述藥物和劑量給藥大劑量組解毒活血栓0.6g/kg(相當(dāng)于3.375g生藥/kg)；小劑量組解毒活血栓0.3g/kg(相當(dāng)于1.688g生藥/kg)；陽性對照組野菊花栓0.6g/kg；模型對照組空白栓0.3g/kg；正常對照組。給藥前12小時禁食，將栓劑加溫水配成一定濃度，按以上劑量使每只動物每日給藥量為0.2ml，經(jīng)肛門給藥，一天給藥2次，每次給藥0.1ml，給藥間隔2小時以上，連續(xù)給藥7天。于給藥第4天，除正常對照組動物外，其余各組動物進行造膜手術(shù)。動物用戊巴比妥鈉麻醉，腹正中下部切口，于前列腺頭葉根部與精囊相接處，注入1.4×107個/ml大腸桿菌懸液0.1ml，縫合。動物繼續(xù)飼養(yǎng)并給藥。于第7天給藥后，處死動物，進行以下各種檢查(1)解毒活血栓對大鼠實驗性細菌性前列腺炎的抑制作用大鼠處死時，迅速剖腹，取前列腺液10μl做白細胞計數(shù)，同時取1滴涂于玻片上做卵磷脂小體密度檢查，結(jié)果見表4。
表4 解毒活血栓對大鼠實驗性細菌性前列腺炎的影響(X±SD)組別 劑量卵磷脂小體密度白細胞計數(shù)動物數(shù)(g/kg) (評分值) (個/μl)正常對照組0.3 103.9±0.3**750.0±196.2**空白栓模型對照組101.8±0.4 4160.0±320.8**解毒活血栓大劑量組0.6 103.8±0.4**800.0±31.6**解毒活血栓小劑量組0.3 103.6±0.48** 930.0±228.3野菊花栓陽性對照組0.6 103.0±0.45** 1810.0±320.8**與模型對照組比較 **P＜0.01(2)解毒活血栓對大鼠前列腺液中大腸桿菌的抑制作用動物處死時，迅速取前列腺液10μl，移至5ml生理鹽水中稀釋，再取1ml澆注平板，作菌數(shù)計數(shù)，結(jié)果見表5。
表5 解毒活血栓對大鼠前列腺體內(nèi)大腸桿菌的抑制作用(X±SD)組別 劑量(g/kg)動物數(shù)菌落數(shù)(個/2μl)正常對照組 100.2±1.4**空白栓模型對照組 0.3 102.5±1.8解毒活血栓大劑量組0.6 100.1±0.3**解毒活血栓小劑量組0.3 100.6±0.8*野菊花栓陽性對照組0.6 100.8±0.9*與模型對照組比較 *P＜0.05 **P＜0.01(3)解毒活血栓對大鼠細菌性前列腺炎組織學(xué)的影響取另一側(cè)前列腺組織進行組織學(xué)檢查，結(jié)果如下①肉眼觀察正常對照組前列腺組織無充血、水腫、出血、粘連等，前列腺液較清亮。
模型對照組前列腺組織充血、水腫明顯，較硬，前列腺液為膿性液。
大劑量治療組前列腺組織輕度充血，無水腫，前列腺液較清亮。
小劑量治療組前列腺組織有充血和不同程度的水腫，前列腺液較粘稠。
陽性對照組前列腺組織輕度充血，無水腫，前列腺液較清亮。
②鏡下觀察取出前列腺置于10％福爾馬林液固定標(biāo)本，常規(guī)脫水，切片，H·E染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察正常對照組前列腺上皮呈低柱狀，立方形，有處呈假復(fù)層，腺腔有處彎曲、形狀不整。間質(zhì)可見纖維結(jié)締組織及平滑肌，未見炎細胞浸潤。腺腔內(nèi)可見蛋白性凝結(jié)物。精囊上皮為立方形，腔大小不一，可見少量凝結(jié)物，間質(zhì)未見炎細胞浸潤，可見少量纖維結(jié)締組織。
模型對照組相當(dāng)于造模2～3天模型組病理改變，前列腺及精囊間質(zhì)較多中性白細胞、單核細胞，少量淋巴細胞浸潤，前列腺精囊腔內(nèi)可見少量或較多膿細胞，有處可見慢性炎性肉芽組織形成。
大劑量治療組10只大鼠有7只間質(zhì)內(nèi)可見少許淋巴細胞、單核細胞浸潤，少許嗜酸性白細胞浸潤。偶見(1只)腔內(nèi)可見少許膿細胞。上皮增生明顯減輕，層次明顯減少。有1只基本恢復(fù)正常。
小劑量治療組所有動物(10只)前列腺及精囊間質(zhì)內(nèi)可見有個別區(qū)域較多中性白細胞、單核細胞浸潤，血管擴張充血。腔內(nèi)可見較多膿細胞，上皮細胞增生呈明顯復(fù)層、乳頭狀。有處脂肪結(jié)締組織內(nèi)可見炎細胞浸潤。
陽性對照組10只大鼠亦有7只前列腺及精囊間質(zhì)可見少許淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性白細胞浸潤。未見中性白細胞浸潤。有3只可見少量淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性白細胞浸潤。其中有1只可見慢性炎性肉芽組織。腔內(nèi)未見膿細胞，可見分泌物。有1只病理改變明顯改善，基本正常。腺上皮細胞未見明顯增生。
解毒活血栓對大鼠實驗性細菌性前列腺炎的抑制作用實驗結(jié)果表明，解毒活血栓對實驗性細菌性前列腺炎有明顯的抑制作用，可提高前列腺液中卵磷脂小體密度，降低白細胞計數(shù)，抑制前列腺內(nèi)大腸桿菌的生長，明顯抑制前列腺腺腔內(nèi)及間質(zhì)炎細胞浸潤，其作用強度呈一定的量效正相關(guān)。
表6 解毒活血栓對細菌性前列腺炎的抗炎作用(X±SD)組別 劑量(g/kg) 動物數(shù)炎癥反應(yīng)指數(shù)空白栓模型對照組 0.3 103.0±0.00解毒活血栓大劑量組0.6 101.1±0.57**解毒活血栓小劑量組0.3 101.8±0.42**野菊花栓陽性對照組0.6 101.0±0.47**與模型對照組比較**P＜0.012.3解毒活血栓的體外抑菌實驗本實驗采用液體兩倍稀釋法，即用培養(yǎng)基將供試藥液稀釋成系列濃度，然后加入定量試驗菌在36±1℃培養(yǎng)24小時，觀察是否有細菌生長，實驗結(jié)果見表7、8。
由表7、8可見，解毒活血栓對綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、綠膿桿菌地方株、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌地方株、大腸桿菌、糞鏈球菌、表皮葡萄球菌的最小抑制濃度分別為250，250，0.49，1.95，250，1.95，0.24mg/ml。說明解毒活血栓對金黃色葡萄球菌，糞鏈球菌，表皮葡萄球菌均有明顯的抑制作用，對綠膿桿菌、大腸桿菌也有一定的抑制作用。
表7 解毒活血栓體外抑菌實驗結(jié)果藥物濃度 綠膿桿菌 綠膿桿菌 金黃色葡萄球 金黃色葡萄 大腸 糞鏈 表皮葡(ml/mg) 標(biāo)準(zhǔn)株 地方株 菌標(biāo)準(zhǔn)株 球菌地方株 桿菌 球菌 萄球菌250 - - - -- - -125 + + - -+ - -62.5 + + - -+ - -31.25+ + - -+ - -15.62+ + - -+ - -7.81 + + - -+ - -3.9 + + - -+ - -1.95 + + - -+ - -0.98 + + - ++ + -0.49 + + - ++ + -0.24 + + + ++ + -0.12 + + + ++ + +陽性菌對照 + + + ++ + +加菌量 4.74.11.4 1.8 8.43.01.7(×103個)+有菌生長 -無菌生長表8 婦炎平體外抑菌實驗結(jié)果藥物濃度 綠膿桿菌 綠膿桿菌 金黃色葡萄球 金黃色葡萄 大腸 糞鏈 表皮葡(ml/mg) 標(biāo)準(zhǔn)株 地方株 菌標(biāo)準(zhǔn)株 球菌地方株 桿菌 球菌 萄球菌250 -- - -- - -125 -- - -- - -62.5 -- - -+ - -31.25-- - -+ + -15.62++ - ++ + -7.81 ++ - ++ + -3.9 ++ - ++ + -1.95 ++ - ++ + -0.98 ++ - ++ + +0.49 ++ + ++ + +0.24 ++ + ++ + +0.12 ++ + ++ + +陽性菌對照 ++ + ++ + +加菌量 4.7 4.11.41.8 8.43.01.7(×103個)+有菌生長 -無菌生長2.4解毒活血栓的抗炎實驗
2.4.1小鼠耳腫脹試驗選用體重18～22g雄性昆明種小白鼠，按體重均勻分為4組。各組分別按下述藥物和劑量給藥大劑量組解毒活血栓0.6g/kg(相當(dāng)于3.375g生藥/kg)；小劑量組解毒活血栓0.3g/kg(相當(dāng)于1.688g生藥/kg)；陽性對照組吲哚美鋅0.013g/kg；模型對照組空白栓0.3g/kg。
給藥前動物禁食12小時，藥物加一定量溫水使熔化，按以上劑量使每只動物給藥量為0.04ml，每日給藥一次，均為肛門給藥。實驗前1天給藥1次，實驗當(dāng)天給藥30分鐘后，分別于每只小鼠左耳涂上致炎劑0.1ml。4小時后用直徑9mm打孔器于左右耳同一部位打下耳片，稱重，左耳片重減右耳片重即為小鼠耳腫脹度。結(jié)果見表9。
表9 解毒活血栓對小鼠耳腫脹的抑制作用組別 劑量(g/kg) 動物數(shù) 腫脹度X±SD(mg) 腫脹抑制率(％)解毒活血栓大劑量組 0.6 18 9.98±4.65** 59.90解毒活血栓小劑量組 0.3 17 12.04±7.93** 51.81吲哚美鋅陽性對照組 0.01317 7.75±6.49** 68.68空白栓模型對照組 0.3 19 24.89±5.09注與空白對照組比較 **P＜0.01由上表可見解毒活血栓對小鼠耳腫脹有很好的抑制作用。
2.4.2抑制肉芽腫試驗選用體重200～220g雄性Wistar大白鼠60只，乙醚麻醉，背部去毛消毒，無菌條件下，沿正中線左側(cè)切口，將已知重量的經(jīng)高溫消毒扭扣塞于皮下，縫合。手術(shù)24小時后，將動物按體重均勻分為4組。各組分別按下述藥物和劑量給藥大劑量組解毒活血栓0.6g/kg(相當(dāng)于3.375g生藥/kg)；小劑量組解毒活血栓0.3g/kg(相當(dāng)于1.688g生藥/kg)；陽性對照組野菊花栓0.6g/kg；模型對照組空白栓0.3g/kg。給藥前12小時禁食，將栓劑加溫水配成一定濃度，按以上劑量使每只動物每日給藥量為0.2ml，經(jīng)肛門給藥，每次給藥0.1ml，一天給藥2次，給藥間隔2小時以上，連續(xù)給藥15天。將動物處死，取出周圍已包裹肉芽組織的扭扣，除去附著組織，稱重，減去扭扣重，即為肉芽凈重，結(jié)果見表10。
由表10可見，解毒活血栓可明顯抑制肉芽組織的形成，其作用略優(yōu)于野菊花栓。
表10 解毒活血栓對大鼠肉芽腫的抑制作用組別 劑量(g/kg)動物數(shù)肉芽重X±SD(mg)解毒活血栓大劑量組0.6 15147.4±39.47*解毒活血栓小劑量組0.3 15160.3±28.91*野菊花栓陽性對照組0.6 15160.1±47.26*空白栓模型對照組 0.3 15221.2±26.22注與空白對照組比較 *P＜0.052.5解毒活血栓對大鼠急性血瘀證模型的作用選用體重180～220g雄性Wistar大白鼠，均勻分為5組。各組分別按下述藥物和劑量給藥大劑量組解毒活血栓0.6g/kg(相當(dāng)于3.375g生藥/kg)；小劑量組解毒活血栓0.3g/kg(相當(dāng)于1.688g生藥/kg)；陽性對照組野菊花栓0.6g/kg；模型對照組空白栓0.3g/kg；正常對照組。給藥前12小時動物禁食，將栓劑加溫水配成一定濃度，按以上劑量使每只動物每日給藥量為0.2ml，經(jīng)肛門給藥，一天給藥2次，每次給藥0.1ml，給藥間隔2小時以上，連續(xù)給藥7天。于末次給藥后3小時，除正常對照組動物外，其余各組動物皮下注射0.1％鹽酸腎上腺素注射液0.08ml/100g，共兩次，間隔4小時。在兩次注射之間(前后各間隔2小時)將大鼠浸入冰水中5分鐘，處置后停食。次晨，各組動物經(jīng)腹主動脈取血，進行血小板及全血粘度檢測。結(jié)果見表11、12。
表11 解毒活血栓對急性血瘀證大鼠血小板聚積率的影響組別劑量(g/kg)動物數(shù)血小板聚積率X±SD(％)正常對照組9 45.5±12.8空白栓模型對照組0.3 7 59.1±9.3Δ解毒活血栓大劑量組 0.6 7 51.1±19.8解毒活血栓小劑量組 0.3 8 50.8±14.5復(fù)方丹參片陽性對照組0.45 8 44.2±14.1*ΔP＜0.05(與正常組比較) *P＜0.05(與模型組比較)表12 解毒活血栓對急性血瘀證大鼠全血粘度的影響劑量 全血粘度(X±SD)組別 動物數(shù)(g/kg) 切變率％10 100200正常對照組10 9.72±2.41 4.71±0.74 4.41±0.98空白栓模型對照組0.3 911.92±0.92Δ5.42±0.44Δ4.96±0.86解毒活血栓大劑量組 0.6 11 9.52±3.75* 4.44±1.29*3.80±1.02*解毒活血栓小劑量組 0.3 910.03±1.56*4.79±0.55*4.10±0.43*復(fù)方丹參片陽性對照組0.45 811.08±1.85 5.22±0.82 4.50±0.66ΔP＜0.05(與正常組比較) *P＜0.05(與模型組比較)由表11、12可見，模型組動物血小板聚積率及全血粘度與正常動物比較，均具有較顯著性差異。說明本實驗所復(fù)制的大鼠急性血瘀證模型是成功的；兩個給藥治療組動物與模型組動物全血粘度比較均顯著降低，血小板聚積率也有明顯的降低趨勢，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異。以上結(jié)果表明，解毒活血栓對急性血瘀證大鼠具有一定的預(yù)防和治療作用。
2.6解毒活血栓的鎮(zhèn)痛實驗2.6.1熱板法選用體重18～22g雄性昆明種小白鼠80只，按體重均勻分為4組。各組分別按下述藥物和劑量給藥大劑量組解毒活血栓0.6g/kg(相當(dāng)于3.375g生藥/kg)；小劑量組解毒活血栓0.3g/kg(相當(dāng)于1.688g生藥/kg)；陽性對照組吲哚美鋅0.013g/kg；模型對照組空白栓0.3g/kg。給藥前動物禁食12小時，藥物加一定量溫水使熔化，按以上劑量使每只動物給藥為0.04ml，每日給藥一次，均為肛門給藥。于給藥后30分鐘，將小鼠分別放在事先加熱到55±1℃恒溫水浴槽的金屬板上，記錄自投入起到出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時間作為痛域指數(shù)，結(jié)果見表13。
2.6.2扭體法選用體重18～22g雄性昆明種小白鼠80只，按體重均勻分為4組。分別按下述藥物和劑量給藥大劑量組解毒活血栓0.6g/kg(相當(dāng)于3.375g生藥/kg)；小劑量組解毒活血栓0.3g/kg(相當(dāng)于1.688g生藥/kg)；陽性對照組吲哚美鋅0.013g/kg；模型對照組空白栓0.3g/kg。給藥前動物禁食12小時，藥物加一定量溫水使熔化，按以上劑量使每只動物給藥為0.04ml，每日給藥一次，均為肛門給藥。于給藥后30分鐘分別于每只小鼠腹腔注射0.05％酒石酸銻鉀0.1ml/10g體重，記錄從注射起到出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間及20分鐘內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)為指標(biāo)。20分鐘內(nèi)未出現(xiàn)扭體反應(yīng)的動物，出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間以20分鐘計，扭體次數(shù)以0計。結(jié)果見表14。
表13 解毒活血栓的鎮(zhèn)痛作用(熱板法)組別 劑量 動物數(shù) 痛反應(yīng)時間 痛閾提高百分率(g/kg) X±SD(秒)(％)解毒活血栓大劑量組0.6 20 42.05±10.67** 46.26解毒活血栓小劑量組0.3 20 43.25±9.96**50.43吲哚美鋅陽性對照組0.013 20 38.75±8.30**34.78空白栓空白對照組 0.3 20 28.75±7.13注與空白對照組比較**P＜0.01表14 解毒活血栓的鎮(zhèn)痛作用(扭體法)劑量 出現(xiàn)扭體時間 20分鐘內(nèi)出現(xiàn)扭體組別 動物數(shù)(g/kg) X±SD(分) 次數(shù)(X±SD)解毒活血栓大劑量組 0.6 1016.80±3.42** 1.2±0.92**解毒活血栓小劑量組 0.3 1013.63±3.43** 2.2±1.03**吲哚美鋅陽性對照組 0.013 1019.20±1.70** 0.2±0.42**空白栓模型對照組 0.3 108.78±2.456.6±1.58注與空白對照組比較**P＜0.01由表13、表14可見解毒活血栓具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。
3結(jié)論經(jīng)主要藥效學(xué)實驗表明，解毒活血栓可明顯抑制前列腺組織炎細胞浸潤及纖維母細胞增生，同時能恢復(fù)前列腺的分泌功能；對實驗性細菌性前列腺炎具有明顯的抑制作用；對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、表皮葡萄球菌均有明顯的抑制作用，對綠膿桿菌、大腸桿菌也有一定的抑制作用，同時，可明顯抑制前列腺液中大腸桿菌的生長；具有一定的活血化瘀作用；具有較好的抗炎止痛作用。也就是說解毒活血栓具有明顯抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、活血化瘀藥理作用，對細菌性、非細菌性前列腺炎均具有較好的預(yù)防和治療作用，可望成為治療慢性前列腺炎的理想藥物。
試驗例二、解毒活血栓的急性毒性試驗實驗?zāi)康挠^察解毒活血栓直腸給藥、灌胃給藥的最大耐受劑量和毒性反應(yīng)及直腸給藥對直腸的刺激反應(yīng)、皮膚給藥對皮膚的過敏反應(yīng)。
實驗單位北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中心實驗室藥理室中國中醫(yī)研究院基礎(chǔ)理論研究所藥理室原始資料保存處北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中心實驗室藥理室中國中醫(yī)研究院基礎(chǔ)理論研究所藥理室1大鼠直腸給藥的最大耐受劑量1.1實驗材料1.1.1實驗藥物 解毒活血栓，2g/粒，每粒相當(dāng)于5.625g生藥，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室供給，批號為980309。實驗前將解毒活血栓配成3.6g生藥/ml，備用。
1.1.2實驗動物 體重145～155g的雄性Wistar大鼠，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所繁育場提供，合格證號為醫(yī)動字第01-3008。大鼠的飼養(yǎng)和實驗均在II級動物實驗室內(nèi)進行，合格證號為京動管準(zhǔn)字(1996)第013號，醫(yī)動字第01-2096.1996。
1.2實驗方法 將雄性大鼠隨機分為給藥組和對照組，每組20只。給藥組給3.6g生藥/ml解毒活血栓液，每次0.25ml/100g。對照組直腸給6％中性淀粉糊狀物，0.25ml/100g。以上2組均3小時直腸給藥一次，連續(xù)4次。每次在給藥前均幫助刺激大鼠排便、排便后立即給藥，給藥后立即觀察大鼠的毒性反應(yīng)及體重、死亡等情況，連續(xù)觀察七天。
1.3實驗結(jié)果大鼠直腸給藥后，未見毒性反應(yīng)。大鼠自主活動正常，未見蜷縮、松毛、精神萎靡現(xiàn)象，鼻、眼、口腔未見分泌物，大便未見溏泄等。七日內(nèi)無一例動物死亡。大鼠直腸給藥的最大耐受量為36g生藥/kg，為人臨床用藥量的192倍(成人臨床用量為2次/日，1粒/次)。大鼠直腸給藥7天后，同對照組相比，體重未見明顯變化。
2大鼠直腸給藥對直腸的刺激性實驗2.1實驗材料2.1.1實驗藥物 解毒活血栓，2g/粒，每粒相當(dāng)于5.625g生藥，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室供給，批號為980309?？瞻姿?由聚乙二醇1000和聚乙二醇4000，按3∶2的比例組成)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室供給，批號為980310。實驗前將解毒活血栓和空白栓做成黃豆大的顆粒，0.125g/粒，備用。
2.1.2實驗動物 體重145～155g的雄性Wistar大鼠，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所繁育場提供，合格證號為醫(yī)動字第01-3008。大鼠的飼養(yǎng)和實驗均在II級動物實驗室內(nèi)進行，合格證號為京動管準(zhǔn)字(1996)第013號，醫(yī)動字第01-2096.1996。
2.2實驗方法 將雄性大鼠隨機分為給藥組和對照組，每組30只。給藥組分為大、小劑量組，給藥劑量分別為1粒/100g、0.5粒/100g，每3小時給藥一次，連續(xù)4次，每次在給藥前均幫助刺激大鼠排便，排便后立即給藥。在直腸給藥后1天、2天、7天時，均頸動脈放血處死10只大鼠，取出直腸，將直腸縱剖開，固定在紙板上，肉眼觀察直腸粘膜有無充血和水腫，然后用10％的甲醛液固定，石蠟切片，H.E染色。
2.3實驗結(jié)果肉眼觀察所見大鼠直腸給藥后1天、2天和7天后，給藥大、小劑量組和對照組直腸粘膜均未見充血、水腫、潰瘍、點狀或片狀壞死。
鏡下觀察所見給藥大、小劑量組和對照組直腸組織外膜均完整，粘膜上皮細胞為單層柱狀上皮，固有層中含有大量直管狀腸腺，在腺體底部有少量未分化細胞及內(nèi)分泌細胞，粘膜下層可見血管、淋巴管。粘膜和粘膜下層可見到炎性細胞浸潤，未見到血管擴張和水腫。與對照組相比，各劑量組直腸組織均未見病理變化。
3豚鼠皮膚給藥過敏性實驗3.1實驗材料3.1.1實驗藥物 解毒活血栓，2g/粒，每粒相當(dāng)于5.625g生藥，制劑由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室供給，批號為980309。實驗前將解毒活血栓配成3.6g生藥/ml，備用。
3.1.2實驗動物 體重250～300g的雄性Hartley豚鼠，由中國藥品生物制品鑒定所實驗動物中心供給，合格證號為DB11/019.1-02。豚鼠的飼養(yǎng)和實驗均在II級動物實驗室內(nèi)進行，合格證號為京動管準(zhǔn)字(1996)第013號，醫(yī)動字第01-2096.1996。
3.2實驗方法 將雄性豚鼠隨機分為給藥組、空白對照組、陽性對照組，每組10只。給藥組涂3.6g生藥/ml解毒活血栓液，每次0.5ml。空白對照組涂空白栓液，每次0.5ml。陽性對照組涂1％2、4-二硝基氯代苯乳狀液(用吐溫80作成)，每次0.2ml。實驗前24小時將豚鼠背部兩側(cè)毛用硫化鋇和淀粉糊狀物脫掉，脫毛區(qū)范圍為4×4cm2。將3.6g生藥/ml解毒活血栓液0.5ml涂在左側(cè)脫毛區(qū)，面積為3×3cm2/只，持續(xù)6小時；第7天和第14天，以同樣的方法各重復(fù)一次，共計3次?？瞻讓φ战M、陽性對照組方法同上。在末次給藥后14天，再以同樣的方法各重復(fù)一次(但2、4--二硝基氯代苯的濃度為0.1％)，6小時后去掉受試物，以皮膚紅斑和水腫為指標(biāo)，即刻進行觀察，然后于24、48、72小時再次觀察豚鼠過敏反應(yīng)情況。
3.3 實驗結(jié)果 在第3次涂藥6、24、48、72小時后，給藥組、空白對照組豚鼠皮膚未見紅斑和水腫等過敏反應(yīng)情況，陽性對照組在涂藥6、24、48、72小時后，豚鼠皮膚均出現(xiàn)不同程度的過敏反應(yīng)，6小時后豚鼠皮膚均可見明顯紅斑，其中1例可見到中度紅斑；24小時后豚鼠過敏癥狀和6小時后癥狀基本相似，但癥狀略有減輕，其中1例已恢復(fù)到勉強可見程度；48小時后豚鼠皮膚過敏程度逐漸減輕，其中4例已恢復(fù)到勉強可見程度；72小時后除1例勉強可見紅斑外，其余均恢復(fù)正常。結(jié)果見表15。
表15 豚鼠皮膚過敏反應(yīng)程度比較表

4小鼠灌胃給藥的最大耐受劑量4.1實驗材料4.1.1藥物 解毒活血栓，2g/粒，每粒相當(dāng)于5.625g生藥，制劑由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室供給，批號為980309。實驗前將解毒活血栓配成3g生藥/ml，備用。
4.1.2實驗動物 體重16～20g的雄性II級昆明小白鼠(KM)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場提供，合格證號為醫(yī)動字第01-3001號。小鼠的飼養(yǎng)和實驗均在II級動物實驗室內(nèi)進行，合格證號為京動管準(zhǔn)字(1996)第013號，醫(yī)動字第01-2096.1996。
4.2實驗方法 將雄性小鼠隨機分為給藥組和對照組，每組20只。給藥組給3g生藥/ml解毒活血栓液，每次0.3ml/10g，每4小時灌胃一次，連續(xù)2次，給藥后立即觀察小鼠的毒性反應(yīng)及體重等情況，連續(xù)觀察7天。
4.3實驗結(jié)果小鼠灌胃給藥后，未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)。小鼠自主活動正常，未見蜷縮、松毛、精神萎靡現(xiàn)象，鼻、眼、口腔未見分泌物，大便未見溏泄等。七日內(nèi)無一例死亡。小鼠灌胃給藥的最大耐受劑量為180g生藥/kg體重，為人用量的960倍(成人臨床用量為2次/日，1粒/次)。小鼠灌胃給藥7天后，同對照組相比，體重未見明顯變化。
結(jié)論A大鼠直腸給藥的最大耐受劑量為36g生藥/kg體重，相當(dāng)于人用量的192倍。
B大鼠直腸給藥，在劑量為36g生藥/kg體重和18g生藥/kg體重時，未見刺激性反應(yīng)。
C豚鼠皮膚給藥，未見皮膚過敏反應(yīng)。
D小鼠灌胃給藥的最大耐受劑量為180g生藥/kg體重，相當(dāng)于人用量的960倍。
試驗例三、解毒活血栓的長期毒性試驗實驗?zāi)康挠^察解毒活血栓對雄性大鼠機體有無慢性毒性反應(yīng)及肝腎功能損害，以判斷和評價解毒活血栓臨床用藥的安全性。
實驗單位北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中心實驗室藥理室原始資料保存處北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中心實驗室藥理室實驗材料1.藥物解毒活血栓2g/粒，每粒相當(dāng)于5.625g生藥。由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室供給，批號為980309。
2.實驗動物體重85～95g的雄性Wistar大鼠，清潔級，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究繁育場供給，合格證號為醫(yī)動字第01-3008。大鼠飼養(yǎng)和實驗均在清潔級動物實驗室內(nèi)進行，合格證號為京動管理準(zhǔn)字(1996)第013號，醫(yī)動管字01-2096.1996。大鼠飼料為消毒飼料，由北京科澳協(xié)力飼養(yǎng)有限公司供給。
3.實驗藥品與試劑 RBC、HGB、HCT、WBC、PLT、MID、AST、ALT、BUN、CREA、LDH、CK、ALP、ACP、TP、ALB、TC檢測藥盒由北京化學(xué)試劑公司供給。
4.儀器 微量血球測定儀，型號為HEMAL ASER-3，法國SEBIA公司生產(chǎn)。全自動生化分析儀，儀器型號為CCX，美國亞培公司生產(chǎn)。
實驗方法分組與給藥 將清潔級雄性大鼠160只，隨機分為4組，每組40只。大、中、小給藥組給藥劑量分別為15、7.5、3.75g生藥/kg/day。對照組給6％中性淀粉糊狀物，4ml/kg。以上各組均直腸給藥。給藥前將栓劑取出，配制成3.75g生藥/ml。大、中、小劑量組直腸給藥的體積分別為0.4ml、0.2ml、0.1ml/100g。在直腸給藥體積超過0.4ml/100g.BW時，每4小時給藥一次。在每次給藥前均幫助刺激大鼠排便二次，每次間隔20分鐘，第二次排便后，立即給藥。
觀察項目和測定方法 實驗期間每日有專人負責(zé)觀察各組大鼠的食量、自主活動、精神狀態(tài)、大便等情況，每周測定一次各實驗組大鼠的體重和每周每籠大鼠進食量，用百克體重進食量來表示。
在給藥后45天、90天和停藥后15天，將大鼠用乙醚麻醉，腹主動脈取血。取0.2ml血，用固體枸櫞酸鈉抗凝，用于測定血象指標(biāo)，包括紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血球壓積(HCT)、血小板(PLT)、白細胞(WBC)及其分類[中性白細胞(GRA)、淋巴細胞(LYM)、中間白細胞(簡稱為MID，包括嗜酸性白細胞、嗜堿性白細胞、單核白細胞)]，用微量血球測定儀測定。取2.5ml血，分離血清，用于測定血清生化指標(biāo)，包括肝腎功能、血清酶和血蛋白等，項目有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌CK酶(CK)、堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、尿素氮(BUN)、肌肝(Crea)、血清總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、血清膽固醇(TC)，用全自動生化分析儀測定。凝血時(CT)用平皿法測定，從刺入腹主動脈取血開始到取二滴血放在平皿上，用細針挑動，直至出現(xiàn)細絲的時間為凝血時間。
給藥后90天和停藥后15天的各實驗組大鼠除作血常規(guī)和血生化指標(biāo)的檢查外，還要取出心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、前列腺、腦、精囊、直腸等組織進行稱量和組織學(xué)檢查。
實驗結(jié)果1.各實驗組大鼠的一般情況各劑量組在給藥全過程中無一例大鼠死亡，各組大鼠自主活動良好，無蜷縮、松毛現(xiàn)象，皮毛光滑，肛門周圍無稀濕現(xiàn)象，口、鼻、眼未見分泌物。同相應(yīng)的對照組相比，各實驗組大鼠體重和進食量均未見明顯差異，各劑量組組間相比，體重和進食量也未見明顯差異。
2.各實驗組大鼠血象和凝血時的變化 在給藥后45天、90天和停藥后15天，血象和凝血時的檢測結(jié)果表明，紅細胞、血紅蛋白、血球壓積、血小板、白細胞及其分類(淋巴細胞、中性白細胞、中間白細胞[嗜酸性白細胞、嗜堿性白細胞、單核白細胞])和凝血時均在正常變化范圍內(nèi)。同相應(yīng)對照組相比，血常規(guī)各項和凝血時均未見明顯變化，各劑量組組間相比也未見差異。結(jié)果見表16。
3.各實驗組大鼠血清生化指標(biāo)的變化 在給藥后45天、90天和停藥后15天，肝功(ALT、AST)、腎功(BUN、Crea)、血清酶(LDH、CK、ALP、ACP)、血蛋白(TP、ALB)、血清TC均在正常變化范圍內(nèi)。同相應(yīng)對照組相比，上述各項指標(biāo)均未見明顯變化，各劑量組組間相比也未見差異。結(jié)果見表17。
4.各實驗組大鼠組織重量系數(shù)和組織病理學(xué)變化 在給藥后90天和停藥后15天后的各實驗組大鼠主要器官，肉眼均未見到腫物、贅生物和寄生蟲。主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、睪丸、附睪、精囊、前列腺、直腸)臟器重量系數(shù)均在正常變化范圍內(nèi)。同相應(yīng)對照組比，上述組織重量系數(shù)均未見明顯變化，各劑量組組間相比也未見差異。結(jié)果見表18。
表16 各實驗組大鼠血象凝血時(CT)變化比較表(M±SD)組別小劑量組 中劑量組大劑量組對照組劑量(3.75g生藥/kg)(7.5g生藥/kg) (15g生藥/kg)(6％淀粉糊)給藥后45天(n＝10)RBC(1012/L) 7.46±0.877.87±0.73 7.88±0.78 7.96±0.62HGB(g/L)148.11±5.16 148.55±7.40149.15±12.41 149.30±11.67檢 HCT(％) 45.88±6.40 45.33±3.53 45.76±2.92 46.01±2.46測 PLT(109/L) 492.40±69.03 489.65±65.55 495.20±39.46 493.05±48.07項 WBC(109/L) 10.16±2.12 9.95±1.87 9.58±1.01 9.57±2.17目 LYM(％) 83.10±5.84 82.05±3.33 83.65±7.27 82.15±9.57GRA(％) 8.95±1.618.85±1.95 8.45±1.15 9.08±1.39MID(％) 8.20±1.008.56±1.51 8.30±1.17 8.25±1.25CT(S) 59.65±12.74 57.85±8.06 59.31±3.81 58.70±8.37給藥后90天(n＝20)RBC(1012/L) 7.50±0.977.66±0.67 7.61±1.14 7.60±0.96HGB(g/L)142.45±13.85 144.20±22.05 146.35±14.18 148.10±16.32檢 HCT(％) 44.47±5.10 44.00±6.17 44.90±5.98 45.82±5.33測 PLT(109/L) 480.65±58.57 485.25±35.93 480.70±54.97 490.75±64.29項 WBC(109/L) 9.57±1.868.95±2.21 8.98±2.43 9.36±1.78目 LYM(％) 82.50±6.34 83.80±3.69 83.15±5.01 82.95±5.31GRA(％) 9.07±1.648.75±1.65 8.65±2.76 9.00±2.27MID(％) 8.20±1.288.25±1.55 8.45±1.61 8.30±1.49CT(S) 61.75±12.37 61.11±11.5160.55±15.8860.95±11.69停藥后15天(n＝10)RBC(1012/L) 7.36±0.677.43±0.53 7.50±0.76 7.53±0.53HGB(g/L)140.30±12.09 141.12±12.69 145.63±9.47145.66±10.93HCT(％) 43.09±5.11 42.89±5.39 43.15±6.37 44.18±4.19檢 PLT(109/L) 474.50±77.22 477.60±64.17 479.90±59.92 488.30±34.03測 WBC(109/L) 9.19±1.698.82±1.39 8.32±1.21 9.05±1.88項 LYM(％) 81.90±8.29 82.60±3.95 82.50±1.10 83.20±2.40目 GRA(％) 9.10±1.459.00±1.49 9.20±1.62 9.11±1.37MID(％) 8.20±1.488.40±1.71 8.70±1.42 8.10±1.17CT(S) 63.80±11.63 65.70±10.6263.30±12.8463.54±11.63表17各實驗組大鼠血清生化指標(biāo)變化比較表(M±SD)
組別 小劑量組 中劑量組 大劑量組對照組劑量 (3.75g生藥/kg)(7.5g生藥/kg)(15g生藥/kg)(6％淀粉糊)給藥后45天(n＝10)ALT(IU/L) 51.97±8.92 52.09±7.22 52.25±6.82 53.22±6.50AST(IU/L) 152.07±27.12 155.58±30.9 154.36±15.10152.12±23.31LDH(IU/L) 1384.1±116.7 1306.8±55.7 1379.8±147.51307.5±164.1檢 CK(IU/L) 965.4±166.5 957.3±177.4 951.4±120.1 959.7±163.6測 ALP(IU/L) 377.63±73.59 383.3±67.9 388.90±70.03386.52±70.32項 ACP(ug/L) 0.193±0.043 0.192±0.054 0.187±0.039 0.186±0.038目 BUN(mmol/L)8.72±1.698.44±1.53 8.66±1.32 8.47±0.93Crea(mmol/L) 42.58±12.59 42.59±5.29 42.48±9.25 42.95±9.32TP(g/L)81.34±4.71 80.09±5.70 82.61±9.25 80.33±6.79ALB(g/L) 29.45±4.78 28.17±2.49 26.05±2.82 28.77±2.19TC(g/L)1.51±0.111.47±0.14 1.50±0.13 1.47±0.08給藥后90天(n＝20)ALT(IU/L) 49.97±10.23 51.00±8.49 51.57±7.56 51.47±11.75AST(IU/L) 152.86±16.02 152.7±20.2 153.37±21.99150.89±24.37LDH(IU/L) 1328.2±169.6 1260.1±165.51293.2±197.51255.8±116.1檢 CK(IU/L) 961.9±191.5 946.1±15 8.1893.9±191.5 932.3±175.1測 ALP(IU/L) 358.2±106.7 366.85±48.23366.59±65.49376.26±70.43項 ACP(ug/L) 0.189±0.029 0.191±0.058 0.187±0.054 0.192±0.040目 BUN(mmol/L)8.68±1.058.10±1.43 8.52±0.83 8.25±1.05Crea(mmol/L) 41.87±9.14 41.41±7.74 41.94±7.63 41.94±7.10TP(g/L)79.02±6.70 79.89±7.15 80.17±7.66 78.46±10.78ALB(g/L) 27.56±2.33 27.06±1.94 25.98±3.02 26.27±1.74TC(g/L)1.48±0.111.44±0.12 1.45±0.12 1.45±0.09停藥后15天(n＝10)ALT(IU/L) 47.73±7.89 50.02±8.66 49.88±5.31 50.72±7.72AST(IU/L) 147.22±18.20 148.4±24.9 150.95±24.60150.55±26.58LDH(IU/L) 1223.4±230.3 1222.8±185.21267.6±194.11228.4±150.1檢 CK(IU/L) 959.3±115.7 876.7±180.9 897.8±109.3 904.8±112.4測 ALP(IU/L) 353.27±40.31 350.65±40.02359.95±36.94366.93±60.4項 ACP(ug/L) 0.186±0.048 0.183±0.052 0.184±0.057 0.189±0.061目 BUN(mmol/L)7.88±1.237.59±1.68 8.07±1.36 7.65±1.42Crea(mmol/L) 40.72±6.65 40.44±5.77 40.96±6.16 40.52±5.15TP(g/L)78.49±2.61 78.88±6.23 79.83±2.63 77.61±3.79ALB(g/L) 25.66±1.99 25.43±1.99 25.22±2.45 25.74±2.23表18 對大鼠組織重量影響比較表(M±SD)組別 小劑量組 中劑量組大劑量組對照組劑量 (3.75g生藥/kg)(7.5g生藥/kg) (15g生藥/kg)(6％淀粉糊)
給藥90天后(n＝20)心臟系數(shù) 0.260±0.0110.2570.019 0.265±0.0130.260±0.027檢 肝臟系數(shù) 3.120±0.4103.178±0.3663.088±0.1973.152±0.165脾臟系數(shù) 0.200±0.0200.198±0.0310.197±0.0220.196±0.022測 肺臟系數(shù) 0.460±0.0400.470±0.0650.479±0.0510.476±0.056腎臟系數(shù)(雙) 0.581±0.0510.585±0.0340.578±0.0500.583±0.055系 腦系數(shù) 0.471±0.0320.455±0.0450.476±0.0350.459±0.049腎上腺系數(shù)(雙) 12.83±2.50 12.75±2.19 12.98±2.97 12.88±2.65標(biāo) 胸腺系數(shù) 0.105±0.01 0.111±0.0210.103±0.0110.107±0.025睪丸系數(shù)(雙) 0.810±0.0800.807±0.1270.824±0.0690.833±0.077附睪系數(shù)(雙) 0.320±0.0300.328±0.0480.322±0.0320.327±0.018精囊系數(shù)(雙) 0.370±0.0400.380±0.0460.379±0.0550.384±0.041前列腺系數(shù) 0.180±0.0130.187±0.0430.191±0.0290.185±0.027停藥15天后(n＝10)心臟系數(shù) 0.26±0.020 0.259±0.0150.264±0.0220.265±0.086檢 肝臟系數(shù) 3.098±0.0173.083±0.1743.085±0.1223.045±0.219脾臟系數(shù) 0.194±0.0250.193±0.0180.186±0.0180.187±0.027測 肺臟系數(shù) 0.490±0.0560.494±0.0360.492±0.0560.496±0.043腎臟系數(shù)(雙) 0.596±0.0650.582±0.0260.591±0.0450.594±0.039系 腦系數(shù) 0.458±0.0350.453±0.0290.466±0.0340.462±0.072腎上腺系數(shù)(雙) 12.71±1.56 12.87±1.25 12.60±1.13 12.86±2.31標(biāo) 胸腺系數(shù) 0.106±0.0190.103±0.0170.106±0.0220.104±0.018睪丸系數(shù)(雙) 0.841±0.1140.806±0.0390.825±0.0880.809±0.059附睪系數(shù)(雙) 0.330±0.0280.319±0.0460.327±0.0340.324±0.034精囊系數(shù)(雙) 0.382±0.0630.378±0.0740.388±0.0410.389±0.022前列腺系數(shù) 0.185±0.0240.199±0.0280.190±0.0240.196±0.023注除腎上腺單位為(mg/100g.體重)，其它組織單位均為(g/100g.體重)給藥后90天和停藥后15天的各實驗組大鼠主要臟器組織切片病理報告結(jié)果表明在各實驗組直腸組織均可見到淋巴細胞浸潤，但未見到組織變性和壞死。其他組織心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、睪丸、附睪、精囊、前列腺均未見病理性變化。各實驗組大鼠器官組織病理學(xué)變化報告如下心臟各實驗組大鼠心外膜均完整，心肌纖維排列整齊，未見到炎性細胞浸潤，心肌纖維無增生、斷裂、萎縮、壞死及瘢痕形成。心肌細胞核居中，結(jié)構(gòu)清晰，呈卵園形，無濁腫或空泡變性，無脂褐素沉著。心肌細胞間質(zhì)無充血水腫及炎性細胞浸潤，心內(nèi)膜之內(nèi)皮細胞完整，無缺血性改變及附壁血栓形成。
肝臟各實驗組大鼠肝小葉細胞排列成梁索狀，圍繞中央靜脈成放射狀排列，并相互聯(lián)接成網(wǎng)狀，結(jié)構(gòu)完整，均未見細胞增生、氣球樣變、脂肪變性、點狀小灶性或片狀壞死。肝竇枯否細胞未見增生，匯管區(qū)、中央靜脈未見炎癥及纖維化。膽管周圍未見淋巴細胞和酸性細胞浸潤。
腎臟各實驗組大鼠腎被膜未見炎癥及纖維組織增生，腎小球未見血管增生及萎縮纖維化，亦無變性壞死。腎近曲小管及遠曲小管正常，髓袢及集合管未見細胞管型及蛋白管型，間質(zhì)未見充血性水腫及炎細胞浸潤。腎盂粘膜完整，未見變性、脫落、壞死。
肺臟各實驗組大鼠肺間隔未見組織增厚和淋巴細胞浸潤。各級支氣管管腔及肺泡內(nèi)均未見滲出、水腫或出血，亦無炎性細胞浸潤。粘膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮未見增生、萎縮、變性、壞死。肺間質(zhì)未見充血樣水腫及炎性細胞浸潤。
脾臟各實驗組大鼠脾被膜未見炎癥及纖維組織增生。白髓由密集淋巴細胞構(gòu)成，并可見生發(fā)中心，邊緣區(qū)T細胞和B細胞數(shù)量未見減少。紅髓偶見含鐵黃素沉積。同對照組相比，各劑量組紅髓、血竇、脾小梁未見異常變化。
腦各實驗組大鼠腦組織未見病變。腦蛛網(wǎng)膜下腔及軟腦膜血管未見出血及炎性滲出或纖維組織增厚，腦實質(zhì)細胞各層結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細胞未見變性或壞死，膠質(zhì)細胞未見增生，無嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象及衛(wèi)星現(xiàn)象，間質(zhì)血管未見出血或淋巴細胞圍管現(xiàn)象。
腎上腺各實驗組大鼠腎上腺被膜完整，被膜未見炎癥，球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶均未見異常變化，球狀帶細胞排列成團，著色較深；束狀帶細胞成索狀；網(wǎng)狀帶細胞交織成網(wǎng)狀。未見充血、出血及壞死。
睪丸和附睪各實驗組雄性大鼠睪丸曲細精管可見各級精細胞及較多的成熟精子，細胞數(shù)量及排列均正常。附睪管內(nèi)可見大量成熟精細胞，均未見異常變化。
胸腺各實驗組大鼠胸腺組織皮質(zhì)有上皮網(wǎng)狀細胞構(gòu)成，其間有淋巴細胞與巨噬細胞，著色較深。胸腺髓質(zhì)含有較多的上皮網(wǎng)狀細胞，未見壞死及纖維化。與對照組相比，各劑量組均未見明顯變化。
前列腺各實驗組大鼠前列腺組織腺實質(zhì)均由大小不等的復(fù)管泡狀腺組成，腺的分泌部由單層柱狀上皮及假復(fù)層柱狀上皮構(gòu)成。未見淋巴細胞、單核細胞浸潤，未見結(jié)締組織增生。與對照組相比，各劑量組均未見明顯變化。
直腸各實驗組大鼠直腸組織外膜完整，粘膜可見半環(huán)行皺襞，上皮為單層柱狀上皮，固有層中含有大量直管狀腸腺，在腺體底部有少量未見分化細胞及內(nèi)分泌細胞，粘膜下層可見血管、淋巴管，肌層可見內(nèi)環(huán)行和外縱行平滑肌，粘膜和粘膜下層可見到淋巴細胞浸潤，但未見到壞死和潰瘍形成，未見到血管擴張和水腫。與對照組相比，各劑量組均未見明顯變化。
以上組織切片檢查結(jié)果表明，同對照組相比，大、中、小劑量組和恢復(fù)期組織病理學(xué)檢查，各器官組織均未見組織增生、變性、壞死等明顯病理變化，除直腸組織外，其他組織也未見淋巴細胞浸潤等病理變化。
結(jié)論1.本實驗分為大劑量組(15g生藥/kg/d)、中劑量組(7.5生藥/kg/d)、小劑量組(3.75g生藥/kg/d)和對照組4組，按體重計算，分別為臨床用藥的80、40、20倍。
2.在連續(xù)給藥45天、90天和停藥(正常飼養(yǎng))15天后，各劑量組在不同時間，同相應(yīng)的對照組相比，大鼠自主活動、精神狀態(tài)、體重、血常規(guī)、生化指標(biāo)(包括RBC、HGB、HCT、PLT、WBC及其分類[LYM、GRA、MID]、CT、AST、ALT、RUEA、CREA、LDH、CK、ACP、ALP、TP、ALB、TC)等均未見明顯變化。經(jīng)NDST檢驗，各實驗組間均無統(tǒng)計學(xué)意義。
3.在連續(xù)給藥90天和停藥(正常飼養(yǎng))15天后，各劑量組大鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、睪丸、附睪、精囊、前列腺、甲狀腺、直腸)臟器系數(shù)均正常，組織切片檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變。
4.上述實驗結(jié)果表明，解毒活血栓在連續(xù)直腸給藥90天后，多項指標(biāo)檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯毒性，提示解毒活血栓毒性較低，安全范圍大。為臨床用藥提供了較充實的藥理學(xué)基礎(chǔ)。
具體實施例方式
本發(fā)明的解毒活血栓，其內(nèi)容物主要是由下列重量的原料制成黃連1200g 赤芍1200g 冰片25g 青黛800g 丹參1200g 牛膝1200g以上原料可制成栓劑1000粒。
其制備方法包括下列步驟(1)取所述重量的黃連粉碎成粗粉，采用滲漉法，用0.5％硫酸為溶劑，浸漬24小時后滲漉，收集7倍量滲漉液，用鹽酸調(diào)pH值為2～3，放置過夜，沉淀物加等量水洗滌1次，烘干，粉碎成細粉，備用；(2)取所述重量的青黛，采用滲漉法用85％乙醇為溶劑，浸漬24小時后滲漉，收集8倍量滲漉液，備用；(3)取所述重量的冰片研成細粉，備用；(4)取所述重量的丹參，分別加8倍、6倍量的85％乙醇回流提取二次，每次各提取1小時，合并回流提取液，備用；(5)取所述丹參藥渣與所述重量的赤芍、牛膝加水煎煮提取三次，第一次加水10倍，第二次加水8倍，第三次加水8倍，每次各煎煮1小時，在70℃時合并煎液并濃縮至相對密度為1.05，放冷，加乙醇使含醇量達70％，攪勻，放置24小時，濾過，濾液與所述青黛滲漉液、所述丹參回流提取液合并，在70℃時回收乙醇并濃縮成相對密度為1.33的浸膏，備用；(6)取栓劑基質(zhì)1115g，加熱熔化，溫度保持在55℃，加入所述黃連提取物細粉、所述浸膏及所述冰片細粉，混勻，灌注，封口，制成栓劑1000粒。
權(quán)利要求
1.一種解毒活血栓，其特征在于，它的內(nèi)容物主要是由下列重量配比的原料制成黃連1200 赤芍1200 冰片25 青黛800 丹參1200 牛膝1200
2.一種權(quán)利要求1所述的解毒活血栓的制備方法，其特征在于，它包括下列步驟(1)、取所述重量配比的黃連粉碎成粗粉，用0.5％硫酸為溶劑，浸漬24小時后滲漉，收集7倍量滲漉液，用鹽酸調(diào)pH值為2～3，放置過夜，沉淀物加等量水洗滌1次，烘干，粉碎成細粉，備用；(2)、取所述重量配比的青黛，用85％乙醇為溶劑，浸漬24小時后滲漉，收集8倍量滲漉液，備用；(3)、取所述重量配比的冰片研成細粉，備用；(4)、取所述重量配比的丹參，分別加8倍、6倍量的85％乙醇回流提取二次，每次各提取1小時，合并回流提取液，備用；(5)、取所述丹參藥渣與所述重量配比的赤芍、牛膝加水煎煮提取三次，第一次加水10倍，第二次加水8倍，第三次加水8倍，每次各煎煮1小時，在70℃時合并煎液并濃縮至相對密度為1.05～1.10，放冷，加乙醇使含醇量達70％，攪勻，放置24小時，濾過，濾液與所述青黛滲漉液、所述丹參回流提取液合并，在70℃時回收乙醇并濃縮成相對密度為1.33～1.38的浸膏，備用；(6)、取重量配比為1115的栓劑基質(zhì)，加熱熔化，溫度保持在55℃±2℃，加入所述黃連提取物細粉、所述浸膏及所述冰片細粉，混勻，灌注，封口，制成栓劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種解毒活血栓及其制備方法，旨在提供一種起效快、療程短、療效好、不復(fù)發(fā)、無刺激性、副作用小的解毒活血栓。該解毒活血栓的內(nèi)容物主要是由黃連、赤芍、冰片、青黛、丹參、牛膝作原料制成，它具有清熱燥濕解毒、活血祛瘀止痛的功效。因本發(fā)明屬直腸給藥，用藥后不僅可避開口服藥物受肝臟首過作用破壞的現(xiàn)象，同時可避免對肝、腎等的損害；更重要的是因給藥部位貼近病所，故給藥后吸收快，并可直達病灶，從而迅速發(fā)揮療效，使療程大大縮短。本發(fā)明適于治療濕熱挾瘀型慢性前列腺炎。
文檔編號A61K9/02GK1562284SQ20041002690
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者李曰慶 申請人:珠海星光制藥有限公司