專利名稱：預(yù)防和治療前列腺疾病的長(zhǎng)鏈脂肪酸天然活性成分的分離、提取和藥用制劑的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有治療作用的長(zhǎng)鏈脂肪酸類衍生物的提取制備及其在治療前列腺疾病方面的臨床應(yīng)用。
背景技術(shù)：
最常見(jiàn)的前列腺疾病包括前列腺癌和前列腺增生。前列腺癌是男性最常見(jiàn)的癌癥之一。美國(guó)1997年癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，在男性腫瘤中，前列腺癌居發(fā)病率之首，占41％，居癌癥死亡的第二位，占14％，50歲以上男性尸解前列腺癌發(fā)生率高達(dá)30％。在我國(guó)，自70年代起前列腺癌發(fā)病率顯著上升。隨著我國(guó)人口的老年化和前列腺癌普查的開(kāi)展，將會(huì)出現(xiàn)越來(lái)越多的前列腺癌患者，前列腺癌已成為越來(lái)越影響公眾健康的問(wèn)題。
前列腺增生是前列腺組織的良性增生，與前列腺癌沒(méi)有必然聯(lián)系，但是二者有時(shí)是并存的。它的主要表現(xiàn)是尿路梗阻。男性的前列腺在25歲時(shí)發(fā)育成熟，正常情況下不再生長(zhǎng)。也有人在40歲左右由于體內(nèi)激素失調(diào)等原因發(fā)生前列腺增生。據(jù)美國(guó)的調(diào)查顯示，50％的60歲男性有前列腺增生，而在80歲男性中，這個(gè)數(shù)字上升到80％。
目前，這兩類前列腺疾病的治療都以手術(shù)摘除為主，對(duì)于前列腺癌早期患者可獲得較高的存活率，但是由于缺乏有效的藥物治療，中晚期患者存活率較低。近年來(lái)的研究表明，前列腺除分泌前列腺液參與精液的組成外，還能產(chǎn)生多種免疫球蛋白，合成具有抗菌作用的含鋅多肽，而且前列腺還具有保護(hù)生殖系統(tǒng)免遭細(xì)菌和其他病原微生物侵襲的局部免疫功能。因此，有人主張?jiān)诳赡艿那闆r下前列腺應(yīng)盡量予以保留。非手術(shù)的藥物療法正亦得更有吸引力。
目前，用于前列腺增生治療的方向?yàn)橄傲邢僭錾膭?dòng)力學(xué)因素或機(jī)械因素。用于消除機(jī)械因素的藥物主要為直接、間接地抑制二氫睪酮的作用，用于消除動(dòng)力學(xué)因素的藥物主要為抑制平滑肌的收縮和緊張度。臨床藥物主要有4類(1)抗雄激素；(2)5α-還原酶抑制劑；(3)天然產(chǎn)物制劑；(4)α1腎上腺素能受體阻滯劑。它們中部分也用于前列腺癌的輔助治療。由于前列腺疾病藥物治療療程較長(zhǎng)，因此藥物的毒副作用令人關(guān)注。在我國(guó)的中草藥寶庫(kù)中，有很多治療前列腺增生和前列腺癌的藥材和藥方，其中有不少藥物經(jīng)臨床驗(yàn)證具有較好的療效。采用現(xiàn)代化的生物和化學(xué)方法，從這些中藥材中提取并篩選出活性成分，有望獲得安全高效的抗前列腺疾病的新藥，這將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
前列腺特異性抗原(PSA)是目前臨床上用于前列腺癌早期診斷的最重要的指標(biāo)，主要由前列腺上皮細(xì)胞在雄激素及其它生長(zhǎng)因子如TGFβ的誘導(dǎo)下表達(dá)。正常人血清中PSA含量在1-4ng/ml，前列腺癌患者血清中PSA含量通常則遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)這個(gè)值，而前列腺增生患者血清中PSA含量一般也高于正常值。這些病患者血清中PSA含量的升高主要是因?yàn)榍傲邢偌?xì)胞中PSA的過(guò)量表達(dá)。如果患者經(jīng)治療，血清中PSA含量明顯下降，則可以初步認(rèn)為治療是有效的。因此PSA含量的變化，可以作為這兩類前列腺疾病療效的一個(gè)指標(biāo)。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明目的之一在于公開(kāi)一類天然長(zhǎng)鏈脂肪酸類衍生物的藥用制劑；本發(fā)明目的之二在于公開(kāi)這一類天然長(zhǎng)鏈脂肪酸類衍生物的制備方法；本發(fā)明目的之三在于公開(kāi)這一類天然長(zhǎng)鏈脂肪酸類衍生物在治療前列腺相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份由下列化學(xué)結(jié)構(gòu)通式I的化合物組成。
通式(I) A(CH2)n2或(C3H4)n3n1，n2，n3為1～20的整數(shù)BN-羥乙基，1-O-果糖苷，甘油基，OH當(dāng)通式(I)中的A為(C3H4)3，n1為7，B為甘油基，通式(I)所代表的化合物為亞麻酸甘油酯。
當(dāng)通式(I)中的A為(C3H4)3，n1為7，B為N-羥乙基，通式(I)所代表的化合物為N-(2-羥乙基)9，12，15-十八烷三烯酰胺。
當(dāng)通式(I)中的A為(C3H4)3，n1為7，B為O果糖苷，通式(I)所代表的化合物為9，12，15-十八烷三烯酸1-O-β-D果糖苷[9，12，15-Octadecatrienoic acid 1-O-β-D-fructoside]。
當(dāng)通式(I)中的A為(CH2)13，n1為1，B為O-果糖苷，通式(I)所代表的化合物十六烷酸1-O-β-D果糖苷[Hexadecanoic 1-O-β-D-fructoside]。
本發(fā)明的預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份制備方法具體步驟如下制備方法一1、溶劑的提取原植物粉碎后，用水、甲醇、乙醇或含水甲、乙醇(30～95％)、丙酮、含水丙酮或醋酸乙酯，加熱提取(包括回流)或超聲提取，所用溶劑量與原植物重量比為8～15∶1，可重復(fù)提取1～3次，除去藥渣；濾液在常壓或減壓條件下濃縮至相對(duì)密度1.10～1.15。
2、有機(jī)溶劑脫脂將上述濃縮液加適量水溶解，用正己烷、環(huán)己烷、氯仿、石油醚或乙醚提取，棄去有機(jī)溶劑。
3、柱層析將上述的水層濃縮至相對(duì)密度1.10～1.15，進(jìn)行硅膠(100～140目)柱層析，用石油醚-醋酸乙酯、環(huán)己烷-醋酸乙酯、正己烷-醋酸乙酯、石油醚-丙酮、環(huán)己烷-丙酮或正己烷-丙酮進(jìn)行洗脫，收集上述混合溶劑8∶2～6∶4洗脫部分，溶劑蒸干。
4、純化將上述步驟所得的產(chǎn)物進(jìn)行葡聚糖凝膠(sephadex LH20)柱層析，用氯仿-甲醇6∶4洗脫，收集各個(gè)洗脫部分，揮干溶劑得化合物。
制備方法二1、用有機(jī)溶劑脫脂原植物粉碎后，用正己烷、環(huán)己烷、氯仿、石油醚或乙醚加熱回流提取或超聲提取，棄去有機(jī)溶劑。
2、溶劑的提取脫脂后的藥渣用水、甲醇、乙醇或含水甲、乙醇(30～95％)、丙酮、含水丙酮或醋酸乙酯，加熱(包括回流)或室溫浸泡提取，所用溶劑量與原植物重量比為8～15∶1，可重復(fù)提取1～3次，除去藥渣，濾液在常壓下或減壓條件下濃縮至相對(duì)密度1.10～1.15。
3、柱層析將上述濃縮溶液進(jìn)行硅膠(100～140目)柱層析，用石油醚-醋酸乙酯、環(huán)己烷-醋酸乙酯、正己烷-醋酸乙酯、石油醚-丙酮、環(huán)己烷-丙酮或正己烷-丙酮進(jìn)行洗脫，收集上述混合溶劑8∶2～6∶4洗脫部分，蒸干溶劑。
4、純化將上述步驟所得的產(chǎn)物進(jìn)行葡聚糖凝膠(sephadex LH20)柱層析，用氯仿-甲醇洗脫，收集各個(gè)洗脫部分，揮干溶劑，得化合物。
本發(fā)明用于預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份的含量介于0.01～1000mg之間。
本發(fā)明用于預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份，其應(yīng)用方式為在各單一活性成份或由兩個(gè)及兩個(gè)以上活性成份組成的混合物中加入相關(guān)的賦形劑，制成片劑、膠囊、軟膠囊、液體制劑、顆粒劑、煎膏劑、丸劑、粉劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑、注射劑。其中的賦形劑包括粘合劑，如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙甲纖維素等；崩解劑，如羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙纖維素等；稀釋劑，如淀粉、糖粉、糊精、微晶纖維素、甘露醇、乳糖、大豆油等；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、滑石粉；甜味劑，如蔗糖、果糖、天冬甜素等；穩(wěn)定劑，如羧甲基纖維素鈉、環(huán)糊精等；防腐劑，如對(duì)羥基苯甲酸乙酯、苯甲酸鈉等。
脂肪酸甘油酯分布于咖啡豆、橄欖油、菜油等植物油中，有文獻(xiàn)報(bào)道甘油酯可用于治療糖尿病和肥胖癥。棕櫚酸甘油酯、亞麻酸甘油酯、亞油酸甘油酯具有抗炎、抗過(guò)敏作用。亞麻酸甘油酯尚存在于中藥木通的果實(shí)與種子中，在杏香鑼兔兒風(fēng)屬植物中及槭樹(shù)科中也有分布，但未見(jiàn)有將本品或這些植物用于前列腺疾病治療的報(bào)道。9，12，15-十八烷三烯酸1-O-β-D果糖苷和十六烷酸1-O-β-D果糖苷為新的化學(xué)結(jié)構(gòu)體。


圖1為本發(fā)明幾種化合物對(duì)雄激素丙睪的抑制作用示意圖.
下列實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，實(shí)施例不應(yīng)被視為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1取油菜花粉3Kg，粉碎，加18L氯仿加熱回流提取1小時(shí)，放冷，濾過(guò)。藥渣加24L醋酸乙酯加熱回流提取兩次，濾過(guò)。合并提取液，減壓回收溶劑，加入兩倍量柱層析用硅膠拌勻，真空干燥，研細(xì)，裝入層析柱，以環(huán)己烷-丙酮(9∶1～6∶4)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，收集8∶2～6∶4洗脫組分，繼用Sephadex LH-20柱再次分離純化得到九個(gè)化合物。
實(shí)施例2長(zhǎng)鏈酰胺、亞麻酸甘油脂和十六烷酸果糖苷在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出抑制PSA(前列腺特異抗原)分泌的活性，見(jiàn)表一.采用酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定上述幾種物質(zhì)對(duì)LNCaP細(xì)胞分泌PSA的影響.
首先將包被多抗稀釋至4ug/ml，加入酶標(biāo)板中，每孔100ul，4℃放置12小時(shí)以上。用PBST洗后加封閉液封閉，37℃1小時(shí)。加入經(jīng)藥物作用后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃溫浴2小時(shí)。洗滌后加入一抗溶液，200ng/ml，37℃溫浴1小時(shí)。洗滌后加入1∶8000稀釋的二抗溶液，室溫1小時(shí)，避光。洗滌后加入顯色液，避光溫浴10min后加入2N硫酸，于492nm測(cè)量光吸收值。
實(shí)施例3長(zhǎng)鏈酰胺、十八烷三烯酸-果糖苷和十六烷酸果糖苷在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示出抗雄激素的活性。如圖1所述為幾種化合物對(duì)雄激素丙睪的抑制作用示意圖.
螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)雄激素受體AR激活活性的分析用PCR的方法從人的脂肪組織中克隆到全長(zhǎng)的AR cDNA，所用的引物序列1為5′-cgggatcctggaagattcagccaagctcaagg-3′，序列2為5′-gctctagaatgggagggttagatagggaggga-3′，將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物插入表達(dá)載體后測(cè)序鑒定。報(bào)告基因用Promega公司的熒光素酶檢測(cè)載體pGL3-Promoter構(gòu)建，在它上游插入了三個(gè)拷貝的AR反應(yīng)元件(序列3為5′-gatctggctctttcagttctaggaagaactgaaagagcctttgggctctttcagttctaggaagaactgaaagagcctttg-3′)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)用U2OS細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行，在轉(zhuǎn)報(bào)告基因的同時(shí)共轉(zhuǎn)AR基因，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后每孔加入10nM丙酸睪丸素及待檢測(cè)的藥物，并使溶劑DMSO的終濃度保持在0.1％。藥物作用24小時(shí)后裂解細(xì)胞并進(jìn)行熒光素酶活性的檢測(cè)。
表一

注nd表示該濃度沒(méi)有測(cè)試活性。
權(quán)利要求
1.一種由長(zhǎng)鏈脂肪酸衍生物組成的天然產(chǎn)物藥用制劑，其特征在于，該藥用制劑的活性成份為由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)通式組成的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為 其中A為(CH2)n2或(C3H4)n3n1，n2，n3為1～10的整數(shù)；B為N-羥乙基，1-O-果糖苷，甘油基，OH；
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物取代基結(jié)構(gòu)為A為(C3H4)n2，n2等于3；B為甘油基；n1等于7；該化合物為亞麻酸甘油酯。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的取代基結(jié)構(gòu)為A為(C3H4)n2，n2等于3；B為N-羥乙基；n1等于7；該化合物為亞麻酸甘油酯為N-(2-羥乙基)9，12，15-十八烷三烯酰胺。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的取代基結(jié)構(gòu)中A為(C3H4)n2，n2等于3；n1等于7；B為1-O果糖苷該化合物為9，12，15-十八烷三烯酸1-O果糖苷(9，12，15-Octadecatrienoicacid 1-O-β-D-fructoside)。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的取代基結(jié)構(gòu)中A為(CH2)n2，n2等于13；n1等于1；該化合物為十六烷酸1-O-果糖苷(Hexadecanoic 1-O-β-D-fructoside)。
6.如權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)通式表示的長(zhǎng)鏈化合物組成的藥用制劑，其特征在于，該藥物制劑由該類長(zhǎng)鏈衍生物活性成分或組分以及藥用載體或稀釋劑組成。
7.如權(quán)利要求6所述的藥用制劑，其特征為，該藥物制劑由所述結(jié)構(gòu)通式表示的長(zhǎng)鏈衍生物活性成份或組分制成的片劑、膠囊、軟膠囊、液體制劑、顆粒劑、煎膏劑、丸劑、粉劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、注射劑。
8.如權(quán)利要求6所述的藥用制劑的用途，其特征在于，所述藥用制劑用于預(yù)防和治療前列腺增生、前列腺炎及前列腺腫瘤。
9.如權(quán)利要求6所述的藥用制劑，其特征在于，其所含活性成份的含量介于0.01～1000mg之間。
10.如權(quán)利要求6所述的藥用制劑，其特征在于，其所含活性組分的優(yōu)選含量介于0.50～500mg之間。
11.如權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)通式表示的長(zhǎng)鏈化合物活性成分，其特征在于，這些活性成份的制備方法為將原植物粉碎，加溶劑提?。惶崛∥镉糜袡C(jī)溶劑脫脂，藥渣繼用溶劑提取，層析和純化制備而成。
12.如權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，提取溶劑是水、甲醇、乙醇或含水甲、乙醇(30-95％)、丙酮、含水丙酮或醋酸乙酯中的一種；提取采用加熱回流或超聲提取。
13.如權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，用于脫脂的有機(jī)溶劑是正己烷或環(huán)己烷或氯仿或石油醚或乙醚。
14.如權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，柱層析可用硅膠柱層析、聚胺柱層析及葡聚糖凝膠柱層析中的一種。
15.如權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，硅膠柱層析可用由以下任何兩種溶劑，如石油醚、醋酸乙酯、環(huán)己烷、丙酮、正己烷組成的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫。
全文摘要
一種具有預(yù)防和治療前列腺疾病的長(zhǎng)鏈脂肪酸衍生物活性成分的分離、提取和藥用制劑的制備和用途。該藥用制劑的活性成分為由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)通式組成的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如上，其中A為(CH
文檔編號(hào)A61K31/19GK1672678SQ20041002712
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月3日
發(fā)明者魯先平, 姚新生, 山松, 韓慧英, 李志斌, 王乃利, 羅艷萍, 張雪, 寧志強(qiáng), 高昊 申請(qǐng)人:深圳微芯生物科技有限責(zé)任公司, 深圳中藥及天然藥物研究中心