專利名稱：一種聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌的藥物及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌的藥物及其制法。
背景技術(shù)：
以往相類似的治療鼻咽癌的藥物及治療方法是單純用生物毒素或放射性核素進(jìn)行治療，其缺點(diǎn)在于單純用生物毒素或放射性核素進(jìn)行治療鼻咽癌沒有特異性，也會殺傷正常的細(xì)胞，毒副作用大；并且治療效果有限，不能完全殺傷腫瘤細(xì)胞。
技術(shù)內(nèi)容為了使藥物能集中在患部，顯著地增強(qiáng)鼻咽癌的治療效果，本發(fā)明提供一種聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌的藥物，其特征在于CVF-BAC5取其不低于半數(shù)有效濃度的藥物濃度，131I-BAC5取其不低于半數(shù)有效濃度的藥物濃度。CVF-BAC5與131I-BAC5之間的使用量之體積比必須滿足混合后兩者均能實(shí)現(xiàn)不低于半數(shù)有效濃度的目的。一般可以采用將CVF-BAC5取其半數(shù)有效濃度，131I-BAC5取其半數(shù)有效濃度，兩種物質(zhì)組份以各取50％體積(液態(tài))而混合的做法。兩種物質(zhì)組分的濃度也可高于半數(shù)有效濃度，以不傷害人體健康細(xì)胞為準(zhǔn)。
其中CVF為眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)，BAC5為針對低分化鼻咽癌細(xì)胞表面相關(guān)抗原單克隆抗體，CVF-BAC5為利用新型雙功能交聯(lián)劑3-(2-吡啶乙基)丙酸肼酰(3-(2-pyridylditho)propionyl Hyra2ide，PDPH)制備出的特異免疫毒素；131I為臨床上治療腫瘤常用的放射性核素，131I-BAC5為利用氯胺T制備出的特異免疫核素。
本藥物之所以選用CVF作為殺傷鼻咽癌的彈頭，是因?yàn)镃VF具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)它無需經(jīng)細(xì)胞內(nèi)化，不象其他毒素必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮毒性作用。它通過在靶細(xì)胞周圍聚集，在胞外不斷激活補(bǔ)體系統(tǒng)，形成膜攻擊復(fù)合物，達(dá)到損傷靶細(xì)胞的作用；(2)它發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用是依靠介導(dǎo)宿主體內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)激活，本身無毒性，使用安全。免疫毒素CVF-BAC5在抗體BAC5的導(dǎo)向作用下可以特異性殺傷表面抗原陽性的鼻咽癌細(xì)胞。而免疫核素131I-BAC5與CVF-BAC5聯(lián)合應(yīng)用，可以借助放射性核素131I發(fā)射的β射線殺傷半徑較大的特征，同時(shí)殺傷表面抗原陰性的鼻咽癌細(xì)胞，從而達(dá)到有效的抑瘤效應(yīng)。
上述的聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌的藥物的制法，其特征在于(1)用新型雙功能交聯(lián)劑PDPH將CVF和BAC5偶聯(lián)得CVF-BAC5。即，首先用半乳糖氧化酶將CVF寡糖鏈末端的α-半乳糖上的羥基氧化成醛基后，再與PDPH上的肼?；磻?yīng)，使CVF寡聚糖鏈末端的α-半乳糖殘基通過生成肼?；苌铮攵蜴I。2-亞氨基四氫噻吩在氮?dú)猸h(huán)境下與BAC5中的賴氨酸上8氨基連接，生成巰基衍生物。此巰基衍生物迅速與CVF-PDP上的二硫鍵交換，形成穩(wěn)定的二硫鍵偶聯(lián)物CVF-BAC5。
(2)用氯胺T將131I標(biāo)記在BAC5上得到131I-BAC5。即，利用還原劑氯胺T將抗體BAC5和Na131I連接，加入偏焦亞硫酸鈉可以增強(qiáng)此連接反應(yīng)，KI終止反應(yīng)，得到131I-BAC5。
(3)將半數(shù)有效濃度的CVF-BAC5與半數(shù)有效濃度的131I-BAC5，以各占50％之體積混合在一起得到藥物。
上述方法中，CVF可以利用陰離子交換層析的方法從中華眼鏡蛇毒中提取。CVF作為中華眼鏡蛇毒中的成分之一(即，用Q-sephrase fast flow陰離子樹脂從中華眼鏡蛇毒中提取CVF。)有著與其它成分不同的等電點(diǎn)。在特定pH值的緩沖液環(huán)境里，中華眼鏡蛇毒的各種成分與陰離子樹脂凝膠有著不同的親和力，利用不同離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫陰離子樹脂凝膠，將CVF和中華眼鏡蛇毒的其它成分分離，純化得到CVF。
實(shí)施方案1.CVF的制備和鑒定采用Q-sephrase fast flow陰離子交換柱層析的方法，層析柱內(nèi)徑1.2cm、高20cm，交換劑床高15cm。將Q-sephrase fast flow陰離子均勻上柱，然后依次用1mol/L HCl、0.01mol/L PB(pH＝7.2)、1mol/L NaOH、0.01mol/L PB(pH＝7.2)、1mol/LNaCl、0.01mol/L PB(pH＝7.2)洗柱。將5克中華眼鏡蛇毒干凍粉溶于約80ml0.01mol/L PB(pH＝7.2)緩沖液中，均勻上樣，并用此緩沖液洗柱1.5ml/min，洗脫液連于紫外檢測儀和記錄儀上(量程0.5A，紙速6cm/min)。待用0.01mo1/L PB緩沖液洗脫出第1峰后，開始改用含0.15mol/L NaCl和0.4mol/LNaCl的0.01mol/L PB(pH＝7.2)緩沖液進(jìn)行分布洗脫。最后再用含1mol/L NaCl的0.01mol/LPB(pH＝7.2)的緩沖液進(jìn)行洗柱，在全部的洗柱過程中始終用紫外檢測儀檢測洗脫液中的蛋白含量。分別收集含有各吸收峰的洗脫液。并將收集到的各吸收峰洗脫液經(jīng)截留分子量為30KD的超濾器超濾濃縮，濃縮液用0.22μm濾器無菌過濾，-70℃保存?zhèn)渥鯟VF鑒定。
將收集到的各受試組分加入1∶100稀釋的新鮮豚鼠血清，在37℃水浴中孵育60min，然后在各管中加入敏化綿羊紅細(xì)胞，37℃水浴孵育15min，取出的各管中加入5ml冷GVB2+終止反應(yīng)。肉眼觀察各管的溶血變化，不發(fā)生溶血的試管中即為CVF成分。結(jié)果表明，用含0.4mol/L NaCl的0.01mol/L PB(pH＝7.2)緩沖液洗脫出的成分為CVF。
采用凝膠濃度為10％的還原性SDS-PAGE電泳法測定CVF的分子量和純度。凝膠板150mm×150mm×1.5mm，分離膠pH為8.8，濃度為10％；濃縮膠pH為6.8，濃度為5％。取CVF樣品20μl加入非還原型2×上樣緩沖液，另取20μl標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白樣品和20μlCVF加入還原型上樣緩沖液?；靹蚍兴?min，冷卻至室溫加樣。在200V電壓下恒壓電泳3h。電泳完畢，取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色1h，然后脫色過夜。利用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并對電泳條帶進(jìn)行分析。通過SDS-PAGE電泳法，利用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行分析，結(jié)果表明非還原條件下，提取物基本上呈一條主帶，中華眼鏡蛇毒粗毒的電泳條帶呈多條。還原條件下，CVF呈三條主帶。CVF的分子量為150.9KD，其三個(gè)亞基分子量分別為62.2KD、49KD和39.4KD；CVF純度為88％。
采用Brafford法測定CVF蛋白濃度。配成1mg/ml牛血清白蛋白溶液，分別加20μl、40μl、60μl、80μl和100μl白蛋白溶液于5ml Bradford工作液(Bradford工作液含有425ml雙蒸水，15ml 95％乙醇，30ml 88％磷酸，30ml Bradord儲存液；Bradford儲存液含有100ml 95％乙醇，200ml 88％磷酸，350mg考馬斯亮蘭G250)。振蕩混勻，15min內(nèi)用紫外分光光度計(jì)測各溶液在595nm處OD值，可得到濃度-OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線。取2μl CVF樣品加入5ml Bradford工作液，15min內(nèi)測595nm處OD值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為y＝0.0046x，r＝0.996，P＜0.05。計(jì)算出超濾濃縮后CVF的蛋白濃度為7.8mg/ml。
CVF抗補(bǔ)體活性的定量測定。含有補(bǔ)體的新鮮豚鼠血清能使敏化的綿羊紅血細(xì)胞溶血，當(dāng)血清與CVF孵育，CVF通過不斷激活補(bǔ)體系統(tǒng)，能夠消耗血清中的補(bǔ)體，從而抑制新鮮血清的溶血作用。將CVF用明膠巴比妥緩沖液(GVB2 +)對倍稀釋，在各管中加入1∶100的新鮮豚鼠血清0.5ml，37℃水浴孵育60min后，各管加入0.4ml 5×108/ml的敏化綿羊紅細(xì)胞，37℃水浴孵育15min，取出各管后加入3ml冷GVB2+終止反應(yīng)，2000rpm/min離心5min，測各管在541nm處的光密度(OD值)。根據(jù)抗補(bǔ)體率Q＝(全溶管OD-樣本管OD)/全溶管OD，ln[Q/(1-Q)]為縱坐標(biāo)，lnCVF劑量為橫坐標(biāo)，做回歸方程。Q/(1-Q)等于1時(shí)，即50％的抗補(bǔ)體率時(shí)的CVF劑量定義為一個(gè)抗補(bǔ)體活性單位。實(shí)驗(yàn)證實(shí)CVF的抗溶血作用有量效關(guān)系，抗溶血百分率的對數(shù)與CVF濃度的對數(shù)有直線關(guān)系，其回歸方程為ln[Q/(1-Q)]＝0.5478lnCVF-0.5624，得出純化的CVF的一個(gè)抗補(bǔ)體活性為2.78μg。
CVF溶血活性的定量測定。將CVF用GVB2+對倍稀釋，加入0.15ml正常新鮮豚鼠血清0.1ml 5×108/ml和豚鼠紅細(xì)胞，在37℃水浴孵育60min，不時(shí)振蕩，取出各管后加入5ml冷GVB2+終止反應(yīng)，2000rpm/min離心5min，測各管在412nm處的光密度(OD)。根據(jù)溶血率Z＝樣本管OD/全溶管OD，ln[Z/(1-Z)]為縱坐標(biāo)，lnCVF劑量為橫坐標(biāo)，做回歸方程。將Z/(1-Z)等于1時(shí)，即50％的溶血率時(shí)的CVF劑量定義為一個(gè)溶血單位。CVF直接激活補(bǔ)體引起的溶血效應(yīng)與CVF濃度有著量效關(guān)系。溶血百分率的對數(shù)與CVF劑量的對數(shù)有著直線關(guān)系其回歸方程為ln[Z/(1-Z)]＝0.5376lnCVF-1。.988，得出純化的CVF的一個(gè)溶血單位為6.224μg。
2.BAC5的制備和鑒定選取4～6周齡的健康BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml石蠟預(yù)處理；約一周后小鼠腹腔注射5×105BAC5雜交瘤細(xì)胞，注射后繼續(xù)飼養(yǎng)7-10天，待小鼠腹部漲大，頸椎脫臼處死，取腹水，2000rpm/min離心15min，吸取上層液體，-70℃凍存待進(jìn)一步純化。采用正辛酸-硫酸胺沉淀法提取BAC5抗體。用pH4.0的乙酸緩沖液按3∶1的比例稀釋腹水，HCl調(diào)pH值為4.5，邊攪拌邊加入辛酸，辛酸量約占總體積的2.5％，室溫下攪拌30min；然后4℃、10000rpm/min離心30min，取上清，加入相等體積的飽和硫酸胺，4℃攪拌4h；接著4℃、10000rpm/min離心30min，棄去上清，沉淀物用pH7.4的PBS緩沖液溶解備用。將PBS溶解液用截留分子量為100KD超濾器超濾，濃縮液用0.22μm濾器無菌過濾，冷凍備用。
采用凝膠濃度為10％的還原性SDS-PAGE電泳測定，結(jié)果表純化前的BAC5腹水有多條區(qū)帶，經(jīng)正辛酸—硫酸胺鹽析法提純后，基本呈一條主帶，經(jīng)超濾后，主帶濃度提高。
采用Brafford法測定BAC5的蛋白濃度為48.5mg/ml。
采用標(biāo)記鏈親和素生物素(LASB)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定抗體的免疫活性。采用標(biāo)記鏈親和素生物素(LASB)免疫細(xì)胞化學(xué)染色。常規(guī)消化貼壁培養(yǎng)的CNE2細(xì)胞，離心5min，吸棄上清。在離心管中加入2倍體積的PBS混勻。用細(xì)嘴吸管加細(xì)胞懸液于帶線圈的玻片上，盡量不要加到線圈外。待完全干燥后，置于丙酮中固定15min，取出晾干，放于-20℃保存?zhèn)溆?。?6孔板上稀釋BAC5(1mg/ml)，先稀釋200倍，再對倍連續(xù)稀釋。將稀釋好的梯度濃度抗體加入CNE2細(xì)胞涂片上，37℃水浴30min，取出用PBS洗三次，每次洗2min。然后，每孔加入生物素標(biāo)記的二抗于線圈內(nèi)，37℃溫育30min，再用PBS洗三次，每次2min。在各孔加入辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈白素，37℃溫育30min，用PBS洗三次。加入AEC染色，鏡下觀察各孔染色情況，蒸餾水終止染色。有紅染的細(xì)胞為陽性。濃度梯度剛開始出現(xiàn)陽性的濃度，即為抗體的滴度，反映出抗體的免疫活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)提取的1mg/ml BAC5免疫活性為1∶614 400。
3.CVF-BAC5的制備和鑒定將300μl的7.8mg/ml CVF加入1ml 0.1mol/L PB(pH＝6.5)，同時(shí)加入3μl的125mg/ml PDPH、30U的HRP和10U的半乳糖氧化酶(分別在反應(yīng)0h和8h各加入5U)。常溫下反應(yīng)30h。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)物上樣于SephadexG-25層析柱(0.9cm×15cm)，用內(nèi)含0.15mol/L Nacl、0.002mol/L EDTA的0.05mol/L PB緩沖液(pH＝8.0)洗柱，將未反應(yīng)的PDPH去除，并通過層析的方法更換緩沖液。紫外檢測儀檢測并收集到到兩個(gè)洗脫峰，將收集到的第一個(gè)洗脫峰用截留分子量為30KD的超濾器超濾濃縮，得到CVF-PDPH濃縮液。2mg BAC5在內(nèi)含0.15mol/LNaCl、0.002mol/LEDTA的0.05mol/LPB緩沖液(pH＝8.0)中加入新鮮配制的150μl的2mg/L2-IT。在氮?dú)猸h(huán)境中，4℃反應(yīng)1h。反應(yīng)完畢后，立即用截留分子量為30KD的超濾器超濾濃縮，去除未反應(yīng)的2-IT。將超濾濃縮后的BAC5-SH和CVF-PDP按1∶2等摩爾混合，在氮?dú)猸h(huán)境中，室溫條件下反應(yīng)過夜。將反應(yīng)物用Q-sephrase fast flow陰離子交換柱層析的方法純化，100KD超濾器超濾濃縮，超濾后的成分即為CVF-BAC5偶聯(lián)物。0.22um濾器過濾除菌，-70℃保存待用。
采用10％SDS-PAGE法，經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)分析偶聯(lián)混合物的偶聯(lián)率為52.4％，純度為82％。采用標(biāo)記鏈親和素生物素(LASB)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定抗體的免疫活性，偶聯(lián)物CV-BAC5(1mg/ml)的滴度為1∶409 600。CVF-BAC5引起的溶血效應(yīng)與CVF的濃度有著量效關(guān)系。溶血百分率的對數(shù)與CVF劑量的對數(shù)有著直線關(guān)系，其回歸方程為ln[R/(1-R)]＝2.302lnCVF-2.733。
從回歸方程可計(jì)算出CVF-BAC5的一個(gè)溶血單位為15.34μg。
4.131I-BAC5的制備和鑒定在試管中加入0.05ml的10mg/ml BAC5或mIgG、7.4×104Bq Na131I和20μl的2mg/ml氯胺T，不斷振蕩反應(yīng)3min，再加入20μl的2mg/ml氯胺T，振蕩反應(yīng)2min。加入40μl的2mg/ml偏焦亞硫酸鈉，振蕩反應(yīng)2min，最后加入100μl的5％KI終止反應(yīng)。
紙層析法測定標(biāo)記率為74.2％；將反應(yīng)物上樣于Sephrase-G25柱，PBS緩沖液洗柱，用試管收集洗柱液(每管約1ml)，檢測各管放射性，收集放射性第一峰洗柱液。紙層析法測定放化純度為99.5％。
131I標(biāo)記物的免疫活性測定。對數(shù)生長期的CNE2細(xì)胞為BAC5的靶細(xì)胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取2只試管，各加入濃度為1×105/ml的細(xì)胞稀釋液100μl。在一試管中加入1×104cpm即(放射性總計(jì)數(shù)T)的131I-BAC5，另一試管中加入無相關(guān)抗體131I-mIgG，混勻，37℃作用2h，離心去上清，測沉淀物的cpm(B)，計(jì)算標(biāo)記抗體的免疫活性結(jié)合率＝B/T×100％。131I-BAC5對CNE2細(xì)胞的免疫結(jié)合率為35％；而131I-mIgG對CNE2細(xì)胞的免疫結(jié)合率為5％。
制備出CVF-BAC5和131I-BAC5兩種物質(zhì)組分后，將半數(shù)有效濃度的CVF-BAC5與半數(shù)有效濃度的131I-BAC5，以各占50％之體積混合在一起得到藥物。經(jīng)過注射進(jìn)入血液途徑，在BAC5的導(dǎo)向作用下，藥物集中到患部周圍起到特異抑制和殺傷腫瘤的作用。
5.CVF-BAC5和131I-BAC5聯(lián)合應(yīng)用對鼻咽癌的作用1)CVF-BAC5和131I-BAC5在體外對鼻咽癌細(xì)胞的作用(MTT法)取對數(shù)生長期的CNE2細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后，離心，用含10％胎牛血清的RPM1640配成5×105/ml細(xì)胞懸液，以每孔100μl接種于96孔板上，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，按設(shè)計(jì)方案加藥，每個(gè)濃度加100μl，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，同時(shí)在各孔中加入50μl新鮮人血清。各用藥組培養(yǎng)4h后，吸去每孔上層的培養(yǎng)液和藥物，重新加入100μl的含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)44h后，再加入10μl的5mg/ml MTT，培養(yǎng)4h。吸去培養(yǎng)液和游離的MTT，每孔加入100μl DMSO溶液，稍振蕩待紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解后，在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定各孔的OD570值。
按以下公式計(jì)算每孔的相對抑制率，繪制劑量—效應(yīng)曲線 求出各試驗(yàn)組的半數(shù)抑制濃度(IC50)進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)a)CVF組CVF的終濃度分別為9.8×10-6mol/L，4.9×10-6mol/L，2.45×10-6mol/L。
b)CVF-BAC5組CVF-BAC5偶聯(lián)物中CVF的終濃度分別為9.8×10-6mol/L，4.9×10-6mol/L，2.45×10-6mol/L。
c)131I-mIgG組放射性濃度分別為6×105Bq/ml，3×105Bq/ml，1.5×105Bq/ml。
d)131I-BAC5組放射性濃度分別為6×105Bq/ml，3×105Bq/ml，1.5×105Bq/ml。
e)CVF-BAC5與131I-BAC5聯(lián)合應(yīng)用組濃度分別為CVF-BAC5 9.8×10-6mol/L+131I-BAC5 6×105Bq/ml，CVF-BAC5 4.9×10-6mol/L+131I-BAC5 3×105Bq/ml，CVF-BAC5 2.45×10-6mol/L+131I-BAC5 1.5×105Bq/ml。
對照組采用生理鹽水。
結(jié)果表明CVF-BAC5對CNE2的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系(Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，r＝0.966，，IC50為5.89×10-6mol/L；而游離的CVF在本試驗(yàn)中的最大濃度未達(dá)到對CNE2細(xì)胞的半數(shù)抑制作用的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CVF-BAC5對CNE2細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于CVF。131I-BAC5對CNE2細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于131I-mIgG，并且抑制作用呈劑量依賴關(guān)系(Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，r＝0.922，P＜0.01＝，IC50為6.68×105Bq/ml；而131I-mIgG在本試驗(yàn)中的最大濃度未達(dá)到對CNE2細(xì)胞的半數(shù)抑制作用的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明131I-BAC5對CNE2細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于131I-mIgG。VF-BAC5和131I-BAC5聯(lián)合應(yīng)用對CNE2細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系(Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，r＝0.959，P＜0.01＝。在聯(lián)合應(yīng)用組中，當(dāng)抑制率達(dá)到50％時(shí)，合用中的CVF-BAC5用量為2.95×10-6mol/L，131I-BAC5用量為3。7×105Bq/ml，分別比它們單獨(dú)用量的IC50明顯減少。對三次試驗(yàn)所得的IC50均值做t-檢驗(yàn)結(jié)果顯示CVF-BAC5的IC50聯(lián)合應(yīng)用組與單獨(dú)用CVF-BAC5組比較，t＝6.377，P＜0.05，兩組的抑制作用有差異；131I-BAC5的IC50聯(lián)合應(yīng)用組與單獨(dú)用131I-BAC5組比較，t＝7.915，P＜0.05，兩組的抑制作用有差異。
2)CVF-BAC5和131I-BAC5在體內(nèi)對鼻咽癌的作用(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)a)CVF-BAC5組CVF-BAC5偶聯(lián)物中CVF的終濃度分別為9.8×10-6mol/L，2.45×10-6mol/L。
b)131I-BAC5組放射性濃度為3×105Bq/ml，c)CVF-BAC5與131I-BAC5聯(lián)合應(yīng)用組濃度分別為CVF-BAC5 9.8×10-6mol/L+131I-BAC3×105Bq/ml，CVF-BAC5 2.45×10-6mol/L+131I-BAC 3×105Bq/ml。
d)對照組采用生理鹽水。
處理細(xì)胞取對數(shù)生長期的CNE2細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后，離心，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成1.5×105/ml細(xì)胞懸液，以每瓶14ml接種于底面積為75cm2的培養(yǎng)瓶上(共接種12瓶)，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)加入藥物，每瓶并加入新鮮豚鼠血清1.5ml和適量培養(yǎng)液，保證藥物的終濃度與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一致。
收集處理后的細(xì)胞待細(xì)胞處理4h后，吸去藥物和培養(yǎng)液。加入新鮮培養(yǎng)液14ml后繼續(xù)培養(yǎng)44h，再將各培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液移至各離心管；盡量將各培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞完全消化下來，移至對應(yīng)的離心管中；離心3000rpm/min，5min；計(jì)數(shù)對照組細(xì)胞，將細(xì)胞用配制為10％胎牛血清的RPM1640稀釋為1×107/ml細(xì)胞懸液；其余各處理組的細(xì)胞依據(jù)對照組細(xì)胞稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，配制為相應(yīng)的細(xì)胞懸液。
荷人鼻咽癌裸鼠模型的制備和分組[53]取30只裸鼠稱重后完全隨機(jī)分為六組(每組5只)，即正常對照組、CVF-BAC5低濃度組和高濃度組、131I-BAC5組、聯(lián)合用藥低濃度組和高濃度組。無菌條件下，在裸鼠右背部皮下接種CNE2細(xì)胞懸液0.2ml/只復(fù)制荷人鼻咽癌裸鼠模型，接種腫瘤細(xì)胞后不作任何處理。每5天稱裸鼠體重(g)以及測量腫瘤的長徑(L)和寬徑(D)一次，按照公式V＝1/6×π×L×D2計(jì)算腫瘤體積。對各組別腫瘤體積做方差分析。
結(jié)果表明在接種CNE2細(xì)胞后的第5天，各處理組之間的腫瘤體積均沒有差異。在復(fù)制荷人NPC裸鼠模型的第10天，對照組的腫瘤體積與131I-BAC5組的腫瘤體積沒有差異，但是明顯大于其余各處理組的腫瘤體積(P值均小于0.05)；131I-BAC5組的腫瘤體積與聯(lián)合應(yīng)用(低濃度、高濃度)組的體積都有差異(P值均小于0.05)；CVF-BAC5(低濃度)組的腫瘤體積大于聯(lián)合應(yīng)用(低濃度)組、CVF-BAC5(高濃度)組的腫瘤體積(P值均小于0.05)；CVF-BAC5(高濃度)組與聯(lián)合應(yīng)用(高濃度)組的腫瘤體積沒有差異；聯(lián)合應(yīng)用(低濃度)組與聯(lián)合應(yīng)用(高濃度)組的腫瘤體積也有著明顯的差異(P＜0.05)。在接種CNE2細(xì)胞后的15天，對照組的腫瘤體積明顯大于其余各組的腫瘤體積(P值均小于0.05)；131I-BAC5組的腫瘤體積與聯(lián)合(低濃度、高濃度)組的體積都有差異(P值均小于0.05)；CVF-BAC5(低濃度)組的腫瘤體積大于聯(lián)合應(yīng)用(低濃度)組(P＜0.05)、CVF-BAC5(高濃度)組的腫瘤體積(P＜0.05)；并且CVF-BAC5(高濃度)組的腫瘤體積也明顯大于聯(lián)合應(yīng)用(高濃度)組的腫瘤體積(P＜0.05)；聯(lián)合應(yīng)用(低濃度)組與聯(lián)合應(yīng)用(高濃度)組的腫瘤體積也有差異(P＜0.05)。第20天，對照組的腫瘤體積仍明顯大于其余各處理的組腫瘤體積(P值均小于0.05)；131I-BAC5組的腫瘤體積與聯(lián)合應(yīng)用(低濃度、高濃度)組的體積都有差異(P值均小于0.05)；CVF-BAC5(低濃度)組的腫瘤體積大于CVF-BAC5(高濃度)組、聯(lián)合應(yīng)用(低濃度)組的腫瘤體積(P值均小于0.05)，并且CVF-BAC5(高濃度)組的腫瘤體積也明顯大于聯(lián)合應(yīng)用(高濃度)組的腫瘤體積(P＜0.05)；聯(lián)合應(yīng)用(低濃度)組與聯(lián)合應(yīng)用(高濃度)組的腫瘤體積也有著明顯的差異(P＜0.05)。
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌的藥物，其特征在于CVF-BAC5取不低于半數(shù)有效濃度，131I-BAC5取不低于半數(shù)有效濃度。
2.一種權(quán)利要求1所述的聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌的藥物的制法，其特征在于(1)用雙功能交聯(lián)劑PDPH將CVF和BAC5偶聯(lián)得CVF-BAC5；(2)用氯胺T將131I標(biāo)記在BAC5上得131I-BAC5；(3)將50％CVF-BAC5與50％131I-BAC5合在一起得到藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述得聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌得藥物的制法，其特征在于用Q-sephrase fast flow陰離子樹脂從中華眼鏡蛇毒中提取CVF。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聯(lián)合導(dǎo)向治療鼻咽癌的藥物及其制法。其主要特征在于，藥物采用CVF－BAC5取不低于半數(shù)有效濃度的藥物濃度，
文檔編號A61K51/00GK1593664SQ20041002779
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日
發(fā)明者楊惠玲, 宋成 申請人:中山大學(xué)