專利名稱：Mptp親和標記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了可用作線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物的調(diào)制劑和親和標記物的新化合物。
背景技術(shù)：
線粒體由于在能量代謝、細胞Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和細胞程序死亡中的作用而在細胞存活和組織發(fā)育中扮演關(guān)鍵性角色。鑒于這些多方面的作用，細胞Ca2+調(diào)節(jié)、代謝和生物能學是作為一個整合體系發(fā)揮作用，因為驅(qū)動每一個過程都需要使用能量守恒。線粒體能量守恒(ATP產(chǎn)生)要求呼吸驅(qū)動形成的跨線粒體內(nèi)膜(IMM)質(zhì)子電化電位差(ΔμH)，其由呼吸復(fù)合物通過質(zhì)子泵而產(chǎn)生。梯度的維持要求IMM對質(zhì)子、帶電物質(zhì)和溶質(zhì)具有低通透性，它們的流出被特定載體系統(tǒng)牢牢控制，而所述特定載體系統(tǒng)是由ΔμH的兩個部分，即膜電位差(Δψm)和ΔpH供以動力。然而，體外線粒體可容易地經(jīng)歷IMM對分子量約1,500Da或更低的溶質(zhì)的通透性增加。這種通透性的變化被稱為通透性轉(zhuǎn)換(PT)，其通過膜孔、即線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開啟調(diào)節(jié)。MPTP的長期開啟可導(dǎo)致線粒體外膜(OMM)破裂和細胞色素c釋放，隨之對線粒體功能產(chǎn)生嚴重的后果(例如ΔμH瓦解，吡啶核苷酸耗竭)，從而導(dǎo)致呼吸抑制。因而，該過程作為體內(nèi)線粒體功能異常的標志、特別是對于特定的人病理性事件如局部缺血-再灌注損傷和神經(jīng)變性而言，已經(jīng)過長期研究。MPTP作為程序性細胞死亡(凋亡)的介體和BCL2家族成員通過釋放細胞色素c的作用靶點也引起人們的關(guān)注(Bernardi，P.，陽離子的線粒體轉(zhuǎn)運通道、交換劑和通透性轉(zhuǎn)換，PhysiolRev，1999.79(4)1127-55頁；Nicholls，D.G.和S.L.Budd，線粒體和神經(jīng)元存活，Physiol Rev，2000.80(1)315-60頁；Bernardi.P.等人，線粒體和細胞死亡，機械論方面和方法學討論，Eur J Biochem，1999.264(3)687-701頁；Bernardi.P.等人，從線粒體視角論細胞死亡，Trends Biochem Sci，2001.26(2)112-7頁)。
目前認同的是線粒體在控制細胞存活和死亡方面起重要作用(細胞程序死亡；Kroemer G & Reed JC，細胞死亡的線粒體控制，Nat Med.2000，6(5)513-9)。涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子的數(shù)目增加以及很多代謝物和某些病毒效應(yīng)子似乎都對線粒體起作用并且影響線粒體膜的透化。細胞保護性分子由于能夠穩(wěn)定線粒體膜，可用于治療其中存在過量細胞程序死亡的疾病(神經(jīng)變性疾病、局部缺血、AIDS、暴發(fā)性肝炎等)。
線粒體膜通透性的變化是細胞程序死亡的關(guān)鍵事件，細胞程序死亡與半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活劑和與半胱氨酸蛋白酶無關(guān)的死亡效應(yīng)子自膜間間隙的釋放、內(nèi)跨膜電位的耗散以及氧化磷酸化作用的紊亂相關(guān)(Kroemer G & Reed JC，細胞死亡的線粒體控制，Nat Med.2000，6(5)513-9；Vander Heiden MG & Thompson CB，Bcl-2蛋白質(zhì)細胞程序死亡或線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑？，Nat Cell Biol.(1999)1(8)E209-16；Wallace DC，人和小鼠中的線粒體疾病，Science(1999)；283(5407)，1482-8)。Bcl-2家族的促細胞程序死亡和抗細胞程序死亡成員通過與腺嘌呤核苷酸移位酶(ANT；在內(nèi)膜中)、電壓依賴型陰離子通道(VDAC；在外膜中)的相互作用和/或通過自主通道形成活性來調(diào)節(jié)內(nèi)和外線粒體膜的通透性(Kroemer G & Reed JC，2000；Marzo I、Brenner C、Zamzami N、Jurgensmeier JM、Susin SA、Vieira HL、Prevost MC、Xie Z、MatsuyamaS、Reed JC、Kroemer G.，Bax和腺嘌呤核苷酸易位體在細胞程序死亡的線粒體控制中的合作，Science(1998)，281(5385)2027-31；Shimizu S.、NaritaM.、Tsujimoto Y.，Nature(1999)，399，483-487；Vander Heiden &Thompson，1999)。ANT和VDAC據(jù)信是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)復(fù)合物中的主要組分，所述復(fù)合物是在兩個線粒體膜非常接近的部位構(gòu)成的聚蛋白結(jié)構(gòu)(Crompton M.，Biochem J(1999)，341，233-249)。
線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是在參與調(diào)節(jié)線粒體膜通透性的線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜之間的接觸位點形成的聚蛋白質(zhì)復(fù)合物。它由一組蛋白質(zhì)組成，包括與線粒體有關(guān)的己糖激酶(HK)、孔蛋白(電壓依賴型陰離子通道或VDAC)、腺嘌呤核苷酸易位(ANT)、外周苯并二氮雜受體(PBR)、肌酸激酶(CK)和親環(huán)蛋白D以及Bcl-2家族成員。在生理條件下，MPTP通過調(diào)節(jié)電導(dǎo)率來控制線粒體的鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其中所述調(diào)節(jié)電導(dǎo)率是借助線粒體pH、線粒體膜電位Δψm、NAD/NAD(P)H氧化還原平衡和基質(zhì)蛋白巰基氧化而實現(xiàn)(Shimizu S.、Narita M.、Tsujimoto Y.，Nature(1999)，399，483-487；Crompton M.，Biochem J 341，233-249(1999)；Ichas F.、JouailleL.、Mazat J.，Cell(1997)，89，1145-53)。MPTP已牽涉到細胞程序死亡的很多實例，這是因為其能夠整合多個促細胞程序死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并且因為其受到來自Bcl-2/Bax家族的蛋白質(zhì)的控制。Bcl-2家族包括死亡抑制(Bcl-2樣)和死亡誘導(dǎo)(Bax樣)成員，它們分別防止或促使MPTP開啟。據(jù)報道Bax和Bcl-2可與MPTP內(nèi)的VDAC和ANT相互作用。
細胞程序死亡和相關(guān)形式的受控細胞死亡涉及眾多疾病。細胞死亡過程的過量或不足與自身免疫和神經(jīng)變性疾病、癌癥、局部缺血和病理性感染或疾病如病毒和細菌感染有關(guān)。在神經(jīng)變性疾病領(lǐng)域，很多觀測結(jié)果都提示與細胞程序死亡的線粒體控制密切相關(guān)(參見Kroemer G & Reed JC，細胞死亡的線粒體控制，Nat.Med.(2000)，6(5)513-9)。神經(jīng)毒素-甲基-4-苯基吡啶鎓可誘發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換和細胞色素c的釋放(Cassarino DS、Parks JK、Parker WD Jr、Bennett JP Jr.，帕金森病患者神經(jīng)毒素MPP+在分離的線粒體中借助氧化機理開啟線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔并釋放細胞色素c，Biochem Biophys Acta 1999，1453，49-62)。
線粒體毒素如硝基丙酸或魚藤酮中毒可在靈長類動物和嚙齒類動物中引起亨廷頓氏舞蹈病類型的疾病(Brouillet E、Hantraye P、Ferrante RJ、Dolan R、Leroy-Willig A、Kowall NW、Beal MF.，慢性線粒體能量損傷在靈長類動物中產(chǎn)生選擇性紋狀體變性和異常舞蹈病樣運動，Proc NatlAcad Sci USA.1995年7月18日，92(15)7105-9；Betarbet R、Sherer TB、MacKenzie G、Garcia-Osuna M、Panov AV、Greenamyre JT，長期暴露于系統(tǒng)性殺蟲劑可再現(xiàn)帕金森病特點，Nat.Neurosci.2000，1301-6)。
在生理條件下，ANT是ADP和ATP的特異性反向轉(zhuǎn)運劑。然而，ANT與不同的促細胞程序死亡劑相互作用時還可形成致死性的孔，所述促細胞程序死亡劑包括Ca2+、蒼術(shù)苷、HIV-Vpr衍生的肽和促氧化劑。線粒體膜的透化也可通過非特異性VDAC孔調(diào)節(jié)，所述非特異性VDAC孔由外膜中的Bcl-2/Bax樣蛋白質(zhì)和/或由線粒體基質(zhì)和細胞質(zhì)之間的代謝性ATP/ADP梯度的變化調(diào)制。
盡管MPTP在壞死性細胞死亡和細胞程序死亡中所起的作用獲得了廣泛的認同，但是關(guān)于其分子鑒定的許多信息仍然依賴于間接的證據(jù)。而且，其組分的特異性高度親和探針的缺乏阻礙了該領(lǐng)域的進展。
更具體而言，本領(lǐng)域需要用于研究和調(diào)制線粒體透化和細胞程序死亡的方法和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種新類型的化合物，用于標記和調(diào)制μM以下范圍的MPTP。此外，本發(fā)明提供了作為MPTP組分和作為這些化合物的分子靶的VDAC(VDAC1)的同種型1的鑒定法。
本發(fā)明提供了通式I化合物和通式II化合物作為MPTP復(fù)合物的調(diào)制劑和親和標記物的用途。此外，本發(fā)明提供了用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法、用于測定MPTP復(fù)合物組分存在的方法和用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，具體而言是鑒別通過與VDAC1組分相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法。此外，本發(fā)明還提供了新的通式I和通式II的化合物。
本發(fā)明提供了選自a)通式I和b)通式II的化合物作為MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑的用途，所述a)通式I為
其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，且R3選自H、D、T，所述b)通式II為 其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。優(yōu)選的是上述通式I化合物的用途。更優(yōu)選的是上述通式I化合物的用途，其中R1和R2是H且R3是H。優(yōu)選的是上述通式II化合物的用途，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。
本發(fā)明的MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑是可抑制、消除或增強MPTP活性的化合物。至于“MPTP活性”，應(yīng)當理解為由于成孔單元從關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)換至開啟狀態(tài)或反之所導(dǎo)致的線粒體內(nèi)膜的通透性變化。
此外，本發(fā)明提供了選自a)通式I和b)通式II的化合物作為親和標記物的用途，所述通式I中，R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素，所述通式II中，R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素。優(yōu)選的是上述化合物作為MPTP復(fù)合物組分的親和標記物的用途。甚至更優(yōu)選的是上述化合物作為MPTP復(fù)合物之VDAC1組分的親和標記物的用途。對于上述用途，同樣優(yōu)選的是上述通式I化合物。更優(yōu)選的是上述通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。同樣優(yōu)選的是上述通式II化合物，其中R是鹵素的放射性同位素，優(yōu)選Br、Cl或Cl2的放射性同位素。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法，該方法包括向生物樣品中的細胞或組織中添加化合物，并且測定與所述化合物不存在時的活性相比較的MPTP復(fù)合物的活性，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，和b)通式II，其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。
本文使用的“生物樣品”包括所有取自動物或人體的組織、細胞和體液樣品，其包含具有MPTP復(fù)合物的線粒體。
測定或測量MPTP活性的方法是本領(lǐng)域已知的，包括測量由Ca2+或其它活性劑誘發(fā)的線粒體的膨脹和收縮、測量放射性標記的蔗糖的攝取、測量線粒體的Ca2+-保留容量，或使用熒光探針或標記或未標記的親脂性陽離子測量線粒體膜電位(Bernardi，P.等人，線粒體和細胞死亡，機械論方面和方法學討論，Eur J Biochem，1999.264(3)687-701頁)。
在另一個實施方案中，提供了測定MPTP復(fù)合物組分存在的方法，該方法包括a)使所針對的生物樣品與化合物接觸，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中殘基R1、R2和R3中的至少一個包含至少一個放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素，所述接觸在允許所述化合物與MPTP復(fù)合物組分結(jié)合的條件下進行；和b)檢測化合物的結(jié)合；并且c)任選地對所檢測的化合物結(jié)合進行定量。
化合物與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物組分的結(jié)合可在各種條件下測定，包括將培養(yǎng)的細胞或分離的線粒體在生理條件下暴露于標記化合物，并通過本領(lǐng)域已知的方法將未結(jié)合的化合物與結(jié)合的化合物分離。優(yōu)選的是將自組織如腦或肝臟分離的線粒體與放射性標記的化合物培育確定的一段時期。對于標記反應(yīng)而言，線粒體可以處于去能狀態(tài)，即在不存在任何呼吸底物的條件下培育，或者當存在呼吸底物如琥珀酸或谷氨酸/蘋果酸時呈能化狀態(tài)。化合物與MPTP復(fù)合物組分的結(jié)合可以通過測量與線粒體部分結(jié)合的放射活性進行定量。通過自游離的標記親和化合物分離有助于這種量化。分離方法包括但不限于洗滌、過濾和離心。分離方法還應(yīng)包括均化技術(shù)，例如閃爍親近測定法(SPA)，其中不將原位的游離標記親和化合物與結(jié)合的標記親和化合物分離?！盎衔锏慕Y(jié)合”是指化合物的總結(jié)合，包括特異性和非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合是通過與飽和濃度的相同或另一種已知化合物競爭進行評估。然后親和化合物的特異性結(jié)合可通過自親和化合物的總結(jié)合中減去非特異性結(jié)合來確定。如果放射性標記的化合物與線粒體轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物的組分形成共價鍵，則可通過十二烷基硫酸鈉凝膠電泳首先分離線粒體蛋白，并且通過放射自顯影術(shù)測定與蛋白質(zhì)譜帶相關(guān)的放射活性。
進一步的實施方案提供了用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP的細胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時化合物與MPTP的結(jié)合與所述活性劑不存在時化合物與MPTP的結(jié)合；并且c)任選地測試所述選定活性劑對包含具有MPTP的亞細胞成分的細胞提取物配制物中的MPTP活性的作用。
所選活性劑對MPTP活性的作用可通過比較按上述方法所測量的所述活性劑存在和不存在時的MPTP活性而確定。
此外，本發(fā)明提供了鑒別通過與VDAC1相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP之VDAC1的細胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基，其中R包含至少一個放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合與所述活性劑不存在時化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合；并且c)任選地在制備包含具有MPTP之VDAC1的亞細胞元素的細胞提取物時，測試所述選定活性劑對MPTP活性的作用。
本文使用的“活性劑”是指被篩選出用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的任何化合物?！罢{(diào)制”應(yīng)當理解為MPTP復(fù)合物的活性可以受到抑制、可以被消除或者可以被增強。應(yīng)當說明的是在本發(fā)明用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法中是活性的“活性劑”隨后可在用于治療神經(jīng)變性病癥或用于治療神經(jīng)系統(tǒng)病癥的藥物組合物中使用，所述神經(jīng)變性病癥選自肌萎縮性側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、亨廷頓氏舞蹈病和帕金森?。凰錾窠?jīng)系統(tǒng)病癥選自糖尿病性神經(jīng)病、大腦低氧、腦炎和腦膜炎(meningitis)。
興奮毒性損傷過程中的鈣進入是神經(jīng)元細胞死亡的必要介體。線粒體功能障礙在興奮毒性細胞死亡中扮演重要角色。據(jù)報道，MPTP的抑制劑是神經(jīng)保護性的已發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素A可延遲/減少NMDA-誘發(fā)型線粒體膜去極化和細胞死亡，且在某些動物模型中(局部缺血、低血糖和腦創(chuàng)傷)具有神經(jīng)保護作用。N-Me-Val4-CsA，即CsA非免疫抑制類似物，也已顯示具有神經(jīng)保護特性。因此，調(diào)制劑、特別是MPTP抑制劑可代表新的神經(jīng)保護治療策略(Mruphy AN、Fiskum G、Beal MF.，神經(jīng)變性中的線粒體細胞生存和死亡中的生物能功能，J Cereb Blood Flow Metab，1999 19，231-45；Tatton WG，Chalmers-Redman RM，神經(jīng)變性細胞程序死亡中的線粒體治療的機遇？Ann Neurol，1998 44(3 Suppl 1)S134-41)。
本發(fā)明還提供了通過如上所述的本發(fā)明方法鑒別的活性劑。
通式I化合物， 其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D和T，是新化合物。
優(yōu)選的是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是H。所述的化合物可以用作MPTP活性的調(diào)制劑。
通式I化合物，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D和T，其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素，是新化合物。優(yōu)選的是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。所述化合物可以用作親和標記物。優(yōu)選地，所述化合物可用作MPTP組分的親和標記物。
通式I化合物可按照下述的合成路徑合成
通式I化合物可分3步自中間體IV中制備氫化、氘化或氚化，以得到飽和化合物III，然后與仲胺鹽酸鹽如吡咯烷鹽酸鹽縮合，得到Mannich加合物，最后在酸性條件下通過使用例如硅膠作為酸催化劑將其轉(zhuǎn)化成I。中間體IV可以使用標準化學轉(zhuǎn)化法自化合物VII制備，如Denmark等人，“有機合成”，74卷，33中所述用堿如二異丙氨基鋰和4-溴丁腈處理VII，得到VI，然后在堿性條件下環(huán)化得到V。將V酸性水解形成中間體IV。起始物質(zhì)VII可按照Regnier G.J.，J.Med.Chem.1992，35，2481-2496中描述的已知方法制備。其中R1、R2是放射性標記(D，T)的通式I化合物可通過將其中R1和R2是鹵素的化合物III氘化或氚化而制備，得到其中R1和R2是D或T的化合物III。
通式II化合物已在EP 118685和EP 117412中被描述為植物生長抑制劑，并且可按其中所述方法合成。通式Ⅱ化合物，其中R選自H、T、D、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，可以用作MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑。優(yōu)選的是所述的式II化合物，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。

通式II化合物，其中R選自T、D、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素，是新化合物。優(yōu)選的是所述的其中R包含T的化合物。同樣優(yōu)選的是所述式II化合物，其中R是Cl、Cl2或Br的放射性同位素。這些化合物可用作親和標記物。優(yōu)選地，這些化合物用作MPTP復(fù)合物組分的親和標記物。
本文使用的“親和標記物”是指對微摩爾級濃度或優(yōu)選更低濃度的MPTP的組分具有親和性的化合物，這些化合物被放射性同位素所標記，所述放射性同位素在實驗體系或當施用于哺乳動物時適合于檢測。適宜的放射性同位素對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的且包括例如鹵素(如氯、氟、溴和碘)的同位素，以及金屬，包括锝和銦的同位素。優(yōu)選的放射性同位素包括3H和14C。最優(yōu)選的是3H。放射性標記的本發(fā)明化合物可以使用本領(lǐng)域公知的標準放射性標記方法制備。適宜的合成方法已有詳述。
這種放射性標記還應(yīng)當無論是化學上還是代謝學上是適度穩(wěn)定的，適用于本領(lǐng)域中的公認標準。而且，盡管本發(fā)明的化合物可以用各種不同放射性同位素以各種方式進行標記，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認同的，但這種放射性標記應(yīng)當以未標記的親和化合物對MPTP組分的高度結(jié)合親和性及特異性不受到顯著影響的方式進行?！安皇艿斤@著影響”是指結(jié)合親和性和特異性所受到的影響不大于約3個對數(shù)單位、優(yōu)選不大于約2個對數(shù)單位、更優(yōu)選不大于約1個對數(shù)單位、甚至更優(yōu)選不大于約500％且仍然甚至更優(yōu)選不大于約250％，且最優(yōu)選結(jié)合親和性和特異性完全不受影響。
MPTP組分的放射性標記親和化合物可具有500mCi/mmole至100Ci/mmole的比活性。優(yōu)選地，它的比活性為65Ci/mmole。被結(jié)合的放射性標記親和化合物可通過添加閃爍劑來測量。
以上對本發(fā)明進行了總體上的描述，通過參考具體的實施例，本發(fā)明將變得更易于理解，本文所包括的具體實施例連同以下附圖僅出于說明的目的，除非有具體說明，其并非旨在限制本發(fā)明。


圖1MPTP基本單元的建議示意圖。
圖2螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM EGTA和5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，用Tris緩沖至pH7.4，作為CPI呼吸底物。在25℃、螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下，經(jīng)短時(～5分鐘)預(yù)培育后，通過添加40μM CaCl2誘發(fā)線粒體膨脹，并且監(jiān)測MPTP的開啟，表現(xiàn)為540nm處的吸光度降低。
圖3螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-、其類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮和CsA對大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。實驗條件如圖2。添加40μM CaCl2后20分鐘，通過使用四參數(shù)邏輯斯諦方程、使用SigmaPlot計算機程序，對數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析擬合，確定EC50值，以540nm(AA540)處的吸光度相對基準(無CaCl2)的百分比變化表示。所示的數(shù)值是使用不同的肝臟線粒體制品一式兩份進行3至5次實驗所得的均值±SEM。
圖4(A)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA對大鼠腦線粒體的Ca2+保留容量的影響。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM EGTA和5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，用含有0.01％(w/v)牛血清白蛋白和1μM CalciumGreen-5N的Tris緩沖至pH7.4。終體積為2.5ml。跡線(a)對照，(b)1μMCsA，(c)1μM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和(d)1μM CsA加1μM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-。每個熒光峰對應(yīng)于加入5μM Ca2+。(B)肝臟(a)和腦(b)線粒體的Ca2+保留容量比較。
圖5Ub5對螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-抑制MPTP的影響。(A)Ca2+-誘發(fā)型大鼠肝臟線粒體膨脹。實驗條件如圖2，不同之處是加入60μM Ca2+以便誘發(fā)MPTP。在跡線a和b中，沒有添加Ca2+，b中存在50μM Ub5。對其它跡線而言，或者單獨添加60μM Ca2+，即c，或者在以下物質(zhì)存在下添加60μM Ca2+50μM Ub5，即d，300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-，即e，以及300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和50μM Ub5，即f。化合物在Ca2+之前～5分鐘添加。(B)大鼠腦線粒體的Ca2+誘發(fā)型去極化。所用的介質(zhì)如圖4中的說明，不同之處是添加0.5μM羅丹明-123代替Calcium Green-5N，并且通過添加20μM Ca2+誘發(fā)MPTP。跡線a對照(單獨添加Ca2+)，b；300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-，c300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和50μM Ub5。
圖6分離的大鼠腦(A)和肝臟(B)線粒體的親和標記。在10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下、在存在或不存在各種濃度的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-(未標記的)的條件下，于25℃將線粒體制品培育15分鐘。對樣品進行SDS-PAGE(細節(jié)參見實驗過程部分)和熒光自顯影。圖中顯示了凝膠的熒光圖譜?？v坐標顯示的是分子量分級(kDa)。
圖7螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記的32kDa蛋白質(zhì)的純化。將先前用20nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記的、Triton X-100增溶的線粒體注射入hydrohyapatite FPLC柱中。以0.5ml/min的速率用磷酸鈉緩沖液pH6.8線性梯度進行洗脫(25分鐘內(nèi)達250mM，然后在5分鐘內(nèi)達400mM)，自動收集1分鐘的級分。直方圖顯示了計數(shù)級分的等分試樣(5μl)后得到的放射活性洗脫曲線。插圖顯示了Triton X-100增溶的線粒體的銀染色(起始物質(zhì)，a道)及柱流通物的銀染色(級分7-9，b道)。相應(yīng)的純化物質(zhì)的熒光圖譜示于c道。
圖8(A)在大鼠腦部線粒體中monobromobimano(MBBM)和氧化苯胂(PhAO)對螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11 ′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記VDAC1的影響。實驗條件如圖5的說明。(B)各種MPTP抑制劑蒼術(shù)苷(ATR)和DIDS對大鼠腦線粒體中螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記VDAC1的影響。將線粒體暴露于DIDS達5分鐘，然后清洗除去游離的活性劑并用螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-進行標記。
圖9存在或不存在不同濃度的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-(未標記的)的條件下，對缺乏YVDAC1的por1基因(Δpor1)的酵母線粒體和用YVDAC1轉(zhuǎn)染的Δpor1酵母線粒體進行螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基親和標記。圖中顯示了SDS-PAGE后的凝膠的熒光圖譜。將自酵母系中分離的線粒體在10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基存在下于25℃培育15分鐘。數(shù)字表示添加的各種化合物的濃度(μM)。
實施例除非另外說明，實施例中提及的市售可得的試劑按照制造商的指示使用。[3H]-四苯基鏻([3H]-TPP，24-29Ci/mmol)購自AmershamBiosciences(瑞士)。CsA、TFP、泛醌0(Ub0)、泛醌5(Ub5)得自Sigma(瑞士)；蒼術(shù)苷(ATR)和米酵霉酸(BKA)得自BioMol(Anawa，瑞士)。Calcium-Green 5N(六鉀鹽)、羅丹明-123和4，4′-二異硫氰基均二苯代乙烯-2，2′-二磺酸(DIDS，二鈉鹽)得自Molecular Probes(Juro，瑞士)。
實施例1篩選試驗在鑒定新的MPTP抑制劑的嘗試中，使用琥珀酸能化(在2μM魚藤酮存在下)的大鼠肝臟線粒體的Ca2+誘發(fā)型膨脹(在Pi存在下)篩選化合物庫，作為功能性試驗。
自雄性Albino RoRo大鼠或MoRo小鼠(BRL，F(xiàn)üllinsdorf，瑞士)制備肝臟和腦線粒體。對于膨脹實驗而言，按照標準方法(Costantini，P.、Petronilli，V.、Colonna，R.& Bernardi，P.(1995)，Toxicology 99，77-88)、通過差速離心分離肝臟線粒體。將線粒體沉淀重新懸浮于用10mM TrisHCl緩沖至pH7.4的250mM蔗糖并保存于冰中直至使用。按照Sims，N.R.(1990)J.Neurochem.55，698-707中所述的方法、使用Percoll梯度得到來自大鼠和小鼠腦部的線粒體。對于肝臟線粒體中的親和標記實驗，該組織的細胞器也是經(jīng)Percoll梯度進行分離。使用Pierce bicichoninic acid蛋白質(zhì)分析試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。
25℃下于96孔平板中，借助由SOFTmax PROTM軟件(MolecularDevices，瑞士)控制的SPECTRAMax 250分光光度計測量540nm處的吸光度變化，對能化線粒體中的Ca2+誘發(fā)型膨脹(蔗糖通透性)進行分析。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM EGTA。用Tris緩沖至pH7.4的琥珀酸(5mM，在2μM魚藤酮存在下)或5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，被用作呼吸底物。在存在或不存在供試化合物下經(jīng)短時(～5分鐘)預(yù)培育后，通過添加20μl CaCl2誘發(fā)線粒體膨脹，使CaCl2的終濃度為40至80μM，這取決于呼吸底物以及線粒體制品的Ca2+敏感性。最終培育體積為0.2ml且線粒體濃度為～0.5mg線粒體蛋白質(zhì)ml-1。在25℃下監(jiān)測膨脹動力學達30分鐘。每12秒取吸光度讀數(shù)，并在讀數(shù)之間將平板搖動3s以確保實驗過程中氧的擴散并避免線粒體的沉積。膨脹實驗也可按照Chernyak，B.V.& Bernardi，P.(1996)Eur.J.Biochem.238，623-630所述在完全去能的肝臟線粒體中進行。
按分批方式將分離的肝臟線粒體(～0.5mg蛋白質(zhì)ml-1)在20nM[3H]TPP([3H]-四苯基鏻([3H]-TPP，24-29Ci/mmol)，來自AmershamBiosciences，瑞士)存在下于25℃培育15分鐘。然后，將混合物的等分試樣(100μl)分配至含有100μl供試化合物的96孔板中并于25℃下延長培育15分鐘。然后，使用96通道細胞收集器，將樣品通過0.3％(v/v)聚乙烯亞胺處理的GF/B玻璃纖維濾器過濾，并用1ml緩沖液將濾器洗滌兩次。然后向每孔添加50μl的MICROSCINT 40(Packard)，然后于TopCount閃爍計數(shù)器(Packard)中計數(shù)放射活性。在1mM未標記的TPP或1μM羰基氰-對-三氟甲氧基苯腙(FCCP)存在下測定非特異性吸收。使用Clark型電極、用極譜法于25℃下測定線粒體的氧消耗。
然后，對所發(fā)現(xiàn)的能夠抑制MPTP的化合物使用電勢探針[3H]-TPP攝入法(Hoek，J.B.、Nicholls，D.G.& Williamson，J.R.(1980)J.Biol.Chem.255，1458-1564)進行計數(shù)器篩選，以便以半定量但快速的方式確定它們是否干擾線粒體呼吸(例如protonophore)。這樣可掘棄“假陽性”結(jié)果，其例如通過降低線粒體膜電位可降低Ca2+向線粒體的流入，而這對于MPTP開啟是必要的。然后，選擇在抑制MPTP濃度下同樣不干擾線粒體呼吸(O2消耗)的化合物以進一步表征。在篩選中已鑒別出通式I化合物和通式II化合物。許多EC50在μM以下范圍的活性化合物顯現(xiàn)具有常見的藥效成分，如作為Michael受體的烯酮。
實施例2螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-(0.3g，1.14mmol)、吡咯烷鹽酸鹽(0.146g，1.37mmol)和低聚甲醛(0.1g，4.42mmol)溶解于DMF(1ml)中。將反應(yīng)混合物浸入80℃油浴中，氬氣條件下攪拌2.5小時，然后在高真空下蒸發(fā)溶劑。將殘余物放入MeCl2中并加入1N NaOH。將水相用MeCl2萃取并將合并的有機相用水洗滌，用Na2SO4干燥，真空濃縮。將殘余物溶解于4ml CH2Cl2中并在SiO2(1.3g)存在下于室溫下攪拌20分鐘。過濾后，用CH2Cl2洗滌SiO2。將濾液濃縮并將殘余物在硅膠上進行層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-(0.138g，44％)，為白色固體，MSm/e＝274(M+)。
實施例3螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-(2.2Ci)、吡咯烷鹽酸鹽(3.5mg，0.033mmol)和低聚甲醛(3mg，0.1mmol)溶解于DMF(0.1ml)中。將反應(yīng)混合物浸入80℃油浴中，氬氣條件下攪拌2.5小時，然后在高真空下蒸發(fā)溶劑。將殘余物放入MeCl2中并加入1NNaOH。將水相用MeCl2萃取并將合并的有機相用水洗滌，用Na2SO4干燥，真空濃縮。將殘余物溶解于4ml CH2Cl2中并在SiO2(200mg)存在下于室溫下攪拌2小時。過濾后，將濾液在1g Lichroprep Si60 25-40μm上進行層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)。純化產(chǎn)物的總活性為1.376Ci并通過質(zhì)譜法測定比活性，放射化學純度分別為65.1Ci/mmole和98.4％。
實施例4螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮(0.02g，0.077mmol)溶解于乙酸乙酯(2ml)中，并在Pd/C(0.01g，10％于碳上)存在下于一個大氣壓的氫下回流36小時。過濾催化劑并將濾液蒸發(fā)。將殘余物在硅膠上層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-(0.017g，84％)，為無色油狀物，MSm/e＝262(M+)。
實施例5螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮(0.01g，0.034mmol)溶解于DMF(0.8ml)中，并在Pd/C(6mg，10％于碳上)存在下于一個大氣壓的氚下于80℃加熱3小時。將粗產(chǎn)物(2.5Ci)在1g Lichroprep Si60，25-40μm的柱上進行層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-，總活性為2.2Ci。
實施例6螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮 將2′-氨基螺[5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5，1′-<2>-環(huán)戊烯]-3′-甲腈(0.96g，3.38mmol)溶解于二噁烷(33ml)中。加入水(16ml)和HCl(16ml，37％)。將反應(yīng)混合物在氬氣條件下回流18小時，然后冷卻至室溫并用水和乙酸乙酯使反應(yīng)中止。將水相用乙酸乙酯萃取并將合并的有機相用水洗滌，用Na2SO4干燥并真空濃縮。將所得的固體在己烷中攪拌1小時并過濾，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮(0.324g，36％)，為白色固體，MSm/e＝260(M+)。
實施例72′-氨基螺[5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5，1′-<2>-環(huán)戊烯]-3′-甲腈 將5-(3-氰基-丙基)-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈(2g，7mmol)溶解于THF(8ml)和tBuOH(17ml)中，并用tBuOK(0.78g，7mmol)處理。將反應(yīng)混合物在65℃下加熱2小時，然后冷卻至室溫并用水和醚使反應(yīng)中止。將水相用醚萃取并將合并的有機相用水洗滌，用Na2SO4干燥并真空濃縮。將殘余物在0℃下于CH2Cl2中結(jié)晶，得到2′-氨基螺[5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5，1′-<2>-環(huán)戊烯]-3′-甲腈(0.47g，24％)，為白色固體，MSm/e＝284(M+)。
實施例85-(3-氰基-丙基)-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈 向-5℃的二異丙胺(0.143ml，1mmol)的THF(1ml)溶液滴加nBuLi(0.67ml，1.06mmol，1.6M于己烷中)。在-5℃下攪拌20分鐘后，滴加5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈(按照Regnier G.J.等人，J.Med.Chem.1992，35，2481-2496制備)(0.2g，0.9mmol)的THF(1ml)溶液。在-5℃下15分鐘后，緩慢添加4-溴丁腈(0.1ml，1mmol)的THF(1ml)溶液。將反應(yīng)混合物緩慢溫熱至室溫，攪拌過夜并用水和醚使反應(yīng)中止。將水相用醚萃取并將合并的有機相用水洗滌，用Na2SO4干燥并真空濃縮。將殘余物在硅膠上層析(己烷-乙酸乙酯9∶1)，得到5-(3-氰基-丙基)-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈(0.2g，76％)，為無色油狀物，MSm/e＝284(M+)。
實施例9螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。
培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μMEGTA和5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，用Tris緩沖至pH7.4，作為CPI呼吸底物。在螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下于25℃經(jīng)短時(～5分鐘)預(yù)培育后，通過添加40μM CaCl2誘發(fā)線粒體膨脹，并監(jiān)測MPTP開啟，表現(xiàn)為540nm處的吸光度降低(圖2)。
實施例10螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-、6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮和CsA對大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。
實驗條件如實施例9。添加40μM CaCl2后20分鐘，通過使用四參數(shù)邏輯斯諦方程、使用SigmaPlot計算機程序?qū)?shù)據(jù)進行非線性回歸分析擬合，確定EC50值，以540nm處的吸光度相對基準(無CaCl2)的百分比變化(ΔA540)表示。所示的數(shù)值是使用不同肝臟線粒體制品一式兩份進行3至5次實驗所得的均值±SEM(圖3，表1)。
螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-有效地抑制了Ca2+誘發(fā)型線粒體膨脹(圖2)。因此，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-抑制了用NADH-關(guān)聯(lián)底物(谷氨酸/蘋果酸)能化的肝臟線粒體中的MPTP開啟，其EC50為98±10(圖3)。在相似條件下，CsA和烯酮類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮所表現(xiàn)的EC50分別為169±9和930±30nM。表1顯示了在琥珀酸能化的線粒體中所獲得的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-、6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮、6-氯-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮、6，8-二氯-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮與那些已知MPTP抑制劑相比較的EC50。同樣在這些實驗條件下，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-似乎在抑制肝臟線粒體中的MPTP方面至少與CsA同樣有效，并且比所測試的其它MPTP抑制劑更為有效。然而，應(yīng)當提醒的是所報道的EC50是相對值并且似乎取決于誘發(fā)膨脹所添加的Ca2+的量(以及呼吸底物)，參見Fontaine，E.、Ichas，F(xiàn).、Bernardi.P.(1998)J.Biol.Chem.273，25734-25740。但是改變Ca2+的加載量，各種抑制劑的相對效力仍然能夠保持。
螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-及其類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮在抑制去能化線粒體中的MPTP方面也是有效的，在這種條件下，應(yīng)當排除與間接調(diào)制MPTP的位點的相互作用(Linder，M.D.、Morkunaite-Haimi，S.、Kinnunen，P.K.、Bernardi，P.& Eriksson，O.(2002)J.Biol.Chem.273，937-942)，其EC50值分別為0.37和2.8μM(n＝2，添加200μM Ca2+后30分鐘測定的數(shù)值)。作為比較，發(fā)現(xiàn)CsA和Ub0在此實驗條件下的EC50為0.22和4.9μM。螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-還抑制由氧化苯胂(25μM)和由ATR(ATR)誘發(fā)的MPTP，因而證明了這種化合物能夠抑制各種誘發(fā)條件下的MPTP。
在完全阻斷MPTP的濃度下，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮并不抑制線粒體的呼吸(基礎(chǔ)的、ADP-誘發(fā)的和非偶聯(lián)的)或Cyp-D肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶的酶活性。
實施例11螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA對大鼠腦線粒體Ca2+保留容量的影響(圖4)。
使用由FL WinLab計算機程序控制的Perkin-Elmer LS-50B熒光計測定外線粒體Ca2+的量度。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、1mM Pi-Tris、10mMTris-Mops、5μM谷氨酸-Tris、2.5mM蘋果酸-Tris pH7.4，含有0.01％(w/v)BSA和1μM低親和Ca2+指示劑Calcium Green-5N(Fontaine，E.、Eriksson，O.、Ichas，F(xiàn).& Bernardi.P.(1998)J.Biol.Chem.273，12662-12668)。終體積為2.5ml，將比色杯在25℃下恒溫。然后對腦線粒體系列添加5μM Ca2+(～150nmol mg蛋白質(zhì)-1)。在505-535的激發(fā)/發(fā)射波長下監(jiān)測外線粒體Ca2+。根據(jù)制造商的指示進行Ca2+信號的校準，假定染料的Ca2+KD為14μM。還比較了肝臟(a)和腦線粒體(b)中的Ca2+-保留容量。
在自大鼠前腦中分離的線粒體中也研究了螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-在抑制MPTP方面的效果。盡管自該組織中獲得線粒體的得率低，使得膨脹實驗難以進行，但螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-仍可抑制通過添加80μM CaCl2誘發(fā)的腦線粒體膨脹，其效力位于在肝臟線粒體中所觀察的范圍內(nèi)。由于以上提及的困難，因而針對螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對腦線粒體中MPTP的效果進行了更精確地研究，通過對自大鼠前腦分離的線粒體進行一系列Ca2+脈沖處理(5μM，～150nmol mg蛋白質(zhì)-1)并通過監(jiān)測外線粒體Ca2+，或使用熒光探針進行。在這些條件下，線粒體吸收并且保留Ca2+直至加載量達到閾值，在此閾值下線粒體經(jīng)歷快速Ca2+釋放、伴隨去極化的過程，該效果已顯示應(yīng)當歸因于MPTP的開啟。圖4顯示了CsA和螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-在這些實驗中的效果。在1μM下(即所觀察到的化合物的最大有效濃度)，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA都可增加線粒體緩沖Ca2+的能力，直至達到閾值，在此閾值下不再有Ca2+被吸收。兩種化合物均使腦線粒體吸收的Ca2+的量約加倍。由此，對照線粒體能夠蓄積530±70nmol Ca2+/mg蛋白質(zhì)，而在1μM CsA和螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下，Ca2+緩沖容量分別增加至1130±80和1200±120nmol Ca2+/mg蛋白質(zhì)(3次獨立實驗的均值±SEM)。螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA的組合(各為1μM)具有加合效果，線粒體能夠積累至2050±450nmol Ca2+/mg蛋白質(zhì)。就螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11 ′-二氫-3-亞甲基-不抑制Cyp-D活性的事實而言，這說明螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的作用位點不同與Cyp-D。正如所預(yù)料的，在螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-及其類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮存在下，沒有觀察到加合效果。從系列添加Ca2+(每次5μM)后監(jiān)測ΔΨm的實驗中，獲得了事實上完全相同的結(jié)果。每次Ca2+的添加都引起ΔΨm可逆性降低，直至MPTP開啟完全使ΔΨm瓦解，并且在添加protonophore FCCP后不再能夠觀察到熒光增加。同樣在這些條件下，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA都使誘發(fā)完全去極化所必需的添加Ca2+的次數(shù)增加，并且在將二種化合物組合后觀察到加合的效果。另一方面，采用相同的方法，對螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-與其它MPTP抑制劑的組合進行了測試，結(jié)果顯示螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-與BKA、ADP、TFP和三苯氧胺具有加合效果，由此表明螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-具有不同的作用位點。唯一的例外是Ub0，這是一種以前表征過的MPTP阻斷劑，對其而言沒有看到這種加合效果。
與Ub0組合缺乏加合效果提示螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的結(jié)合位點可能對應(yīng)于Fontaine及其合作者所報道的調(diào)制MPTP開啟的泛醌的位點(Walter，L.、Nogueira，V.、Leverve，X.、Heitz，M.P.、Bernardi.P.& Fontaine，E.(2000)J.Biol.Chem.275，29521-29527)。為進一步證實之，研究了已顯示可減輕Ub0的抑制效果的泛醌衍生物Ub5是否也能夠拮抗螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對MPTP的抑制。正如圖5A中針對大鼠肝臟線粒體所示，Ub5(50μM)能夠拮抗螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的抑制作用，使螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的EC50從290nM位移至2.4μM(n＝2，60μM Ca2+，谷氨酸/蘋果酸作為呼吸底物)。而且，在大鼠腦線粒體中(圖5B)，其中300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-可抑制Ca2+誘發(fā)的去極化，該抑制作用也因50μMUb5的存在而減弱。單獨的Ub5沒有效果。這些結(jié)果支持了以下觀點螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和泛醌衍生物可能作用于MPTP的相同或功能性相關(guān)的位點。
實施例12使用螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-對線粒體進行親和標記將Percoll純化的線粒體(每樣品～30μg蛋白質(zhì))在10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-存在下培育，終體積為200μl。在25℃下培育15分鐘后，將樣品在25000xg下離心并將線粒體沉淀用緩沖液清洗兩次。然后將樣品增溶于含有β-巰基乙醇的樣品緩沖液中(37℃下1小時)，并在Tris-甘氨酸Novex預(yù)制小型凝膠上(12％單體濃度，Invitrogen BV，荷蘭)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理。考馬斯藍染色后，對凝膠進行處理以進行熒光自顯影，將凝膠在AmplifyTM(Amersham Biosciences)中浸泡、干燥并在-80℃下曝光于X射線BioMax MS膠片持續(xù)適當?shù)臅r間，同時使用BioMax MS增感屏(Kodak)。
將分離的線粒體(Percoll梯度，～5mg蛋白質(zhì))在20nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-存在下于25℃標記15分鐘。然后將線粒體沉淀用3ml 3％TritonX-100(Surfact-Amps X-100，Pierce)增溶于10mM NaPO4pH6.8中，其含有0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、1μg/ml亮抑蛋白酶肽、1.8μg/ml抑蛋白酶肽和1μg/ml抑胃酶肽A。然后，將增溶膜注射到在含有0.3％TritonX-100的10mM NaPO4pH6.8中平衡的陶瓷hydroxyhapatite CHT-II1×5cm柱(Bio-Rad，瑞士)中。然后，用含有0.3％Triton X-100、不超過400mM的NaPO4pH6.8的梯度洗脫柱子，流速為0.5ml min-1。收集級分(1min)并計數(shù)等分試樣(5μl)的放射活性。然后對放射活性級分進行SDS-PAGE處理，隨后進行染色和/或熒光自顯影。
為鑒別螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-標記的蛋白質(zhì)，將放射活性層析級分中的蛋白質(zhì)用三氯乙酸(終濃度20％)沉淀。待在SDS-PAGE樣品緩沖液中重構(gòu)且使用碘乙酰胺進行酰胺基甲基化(carboxamidomethylation)后，對蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE處理。用膠體考馬斯藍(Novex)染色并脫色后，切除凝膠斑點并在使用改性胰蛋白酶(Promega)進行凝膠內(nèi)消化后，通過如前所述的基質(zhì)輔助型激光解吸電離-質(zhì)譜法(MALDI-MS)對蛋白質(zhì)進行分析(Fountoulakis，M.&Langen，H.(1997)Anal.Biochem.250，153-156；Yoo，B.C.、Fountoulakis，M.、Cairns，N.& Lubec，G.(2001)Electrophoresis 22，172-179)。在裝配有反射器的飛行時間PerSeptive Biosystems質(zhì)譜儀中對樣品進行分析。獲得的肽質(zhì)量與SWISS-PROT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(http//us.expasy.org/sprot/)中來自所有品種的所有蛋白質(zhì)的理論肽質(zhì)量相符。對于蛋白質(zhì)查找而言，使用單同位素質(zhì)量，并且質(zhì)量允許誤差可為0.0075％。不匹配的肽或錯裂的部位沒有考慮。通過納電噴射串聯(lián)MS(Wilm，M.& Mann，M.(1996)Anal.Chem.68，1-8)、借助API 365三聯(lián)四極質(zhì)譜儀(Sciex，Toronto，加拿大)，也證實了一些胰蛋白酶片段的同一性，如前所述(Krafenbauer，K.、Berger，M.、Friedlein，A.、Lubec，G.& Fountoulakis，M.(2001)Eur JBiochem.268，3532-3537)。
圖6顯示了用10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記自大鼠腦(圖A)和肝臟(圖B)中分離的完整線粒體后獲得的結(jié)果。有限數(shù)量的蛋白質(zhì)似乎被標記，并且在兩種制品中，似乎主要標記的是～32kDa的蛋白質(zhì)。增加未標記螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的濃度，抑制此譜帶的標記。這種32kDa蛋白質(zhì)是膜蛋白，因為在線粒體可溶性級分中沒有觀察到蛋白質(zhì)標記。使用自小鼠腦和肝臟和自人成神經(jīng)細胞瘤細胞中分離的線粒體，也似乎是～32kDa譜帶被主要標記。呼吸底物(谷氨酸/蘋果酸或琥珀酸/魚藤酮)的存在并不改變這種標記模式。
這種得自由上述組織制備的線粒體的蛋白質(zhì)可通過單一FPLC層析步驟、使用hydroxyhapatite柱進行純化。如圖7所示，絕大多數(shù)放射活性沒有被柱子保留，而是洗脫在柱的前沿。對這些級分進行SDS-PAGE處理，然后進行銀染色和熒光自顯影，結(jié)果顯示存在主要的單一蛋白質(zhì)(圖7，插圖)。凝膠內(nèi)消化后的胰蛋白酶片段MALDI-MS分析和納電噴射串聯(lián)MS表明這些蛋白質(zhì)相當于VDAC的同種型I(電壓依賴型陰離子選擇性通道蛋白質(zhì)I或線粒體外膜蛋白質(zhì)孔蛋白1，POR1_RAT，Q9Z2L0)。
實施例13在大鼠腦線粒體中monobromobimano(MBBM)和氧化苯胂(PhAO)對螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記VDAC1的影響。
實驗條件如實施例12(圖8A)。研究了各種MPTP抑制劑蒼術(shù)苷(ATR)和DIDS在大鼠腦線粒體中對螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記VDAC1的影響。將線粒體暴露于DIDS達5分鐘，然后清洗除去游離的活性劑并用螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯0并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-進行標記(圖8B)。
為了將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-對VDAC1的標記與該化合物作為MPTP阻斷劑的功能性效果相聯(lián)系，研究了許多MPTP抑制劑和MPTP誘發(fā)劑ATR在大鼠腦線粒體中對螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標記VDAC1的效果。如圖8B所示，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮(以及β-氨基酮衍生物6-溴-3-二乙基氨基甲基-苯并二氫吡喃-4-酮)抑制了放射活性的摻入。在阻斷MPTP濃度的Ub0存在下，觀察到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基標記受到抑制。后一種發(fā)現(xiàn)與上述報道的功能性實驗相一致(見圖5)，說明VDAC可能代表泛醌抑制劑的分子靶。CsA、AdNT配體(ADP、BKA和ATR)和TFP不影響放射活性的摻入。有趣的是，陰離子通道抑制劑DIDS，據(jù)顯示其可抑制超氧化物誘發(fā)型VDAC-依賴型細胞色素-c自線粒體的釋放(Madesh，M.& Hajnoczky，G.(2001)J.Cell.Biol.155，1003-1015)，也似乎可抑制螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基的摻入(圖8B)。使用肝臟線粒體在親和標記實驗中也獲得了事實上完全相同的結(jié)果。
實施例14在酵母線粒體中的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基標記為進一步證實VDAC1作為螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的蛋白質(zhì)靶，研究了螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基對自酵母制備的線粒體中的蛋白質(zhì)的標記。在其中酵母中主要VDAC同種型YVDAC1的表達已通過缺失por1(Δpor1)基因而消除的株系中，事實上沒有觀察到標記。然而，自含有可介導(dǎo)YVDAC1表達的質(zhì)粒的Δpor1株系制備的酵母線粒體顯示出29kDa譜帶的突出標記，29kDa為酵母VDAC分子量的預(yù)期大小，如使用針對YVDAC1所培育的抗體進行的免疫印跡分析所證實。增加未標記的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的濃度可抑制放射活性的摻入(圖9)。然而，令人驚訝的是，在自用介導(dǎo)人VDAC1表達的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Δpor1品系制備的酵母線粒體中，沒有觀察到明顯的標記。盡管免疫印跡分析顯示蛋白質(zhì)確實已被表達。
表1各種抑制劑在用琥珀酸能化的大鼠肝臟線粒體中對Ca2+誘發(fā)型MPTP的影響

*使用ADP的實驗在1μg/ml寡霉素存在下進行培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μMEGTA。使用琥珀酸(5mM，在2μM魚藤酮存在下)作為呼吸底物。用各種化合物進行～5分鐘的培育后，通過添加80μM Ca2+誘發(fā)膨脹，并監(jiān)測A540。在添加CaCl2后20分鐘，通過使用四參數(shù)邏輯斯諦方程、使用SigmaPlot計算機程序?qū)?shù)據(jù)進行非線性回歸分析擬合，確定EC50值，以540nm處的吸光度相對基準(無CaCl2)的百分比變化(ΔA540)表示。
權(quán)利要求
1.選自a)通式I和b)通式II的化合物作為MPTP復(fù)合物的活性調(diào)制劑的用途，其中所述a)通式I為 其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，所述b)通式II為 其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。
2.權(quán)利要求1的用途，其中化合物選自上述通式I化合物，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T。
3.權(quán)利要求2的用途，其中化合物是上述通式I化合物，其中R1和R2是氫且R3是H。
4.權(quán)利要求1的用途，其中化合物選自上述通式II化合物，其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基和烷氧基。
5.權(quán)利要求4的用途，其中化合物是上述通式II化合物，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。
6.選自a)上述通式I和b)上述通式II的化合物作為親和標記物的用途，所述通式I中，R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素；所述通式II中，R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素。
7.權(quán)利要求6的化合物的用途，其中所述化合物是MPTP復(fù)合物組分的親和標記物。
8.權(quán)利要求6和7的化合物的用途，其中所述化合物選自上述通式I化合物，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素。
9.權(quán)利要求8的化合物的用途，其中所述化合物是上述式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。
10.權(quán)利要求6和7的化合物的用途，其中所述化合物選自上述通式II化合物，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素。
11.權(quán)利要求10的化合物的用途，其中所述化合物選自上述式II化合物，其中R選自Br、Cl和Cl2的放射性同位素。
12.用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法，該方法包括向生物樣品的細胞或組織中添加化合物并測量與所述化合物不存在時的活性相比較的MPTP復(fù)合物的活性，所述化合物選自a)上述通式I，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，和b)上述通式II，其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。
13.用于測定MPTP復(fù)合物組分存在的方法，該方法包括a)使所針對的生物樣品與化合物接觸，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一含有至少一個放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素，所述接觸在允許所述化合物與MPTP復(fù)合物的組分結(jié)合的條件下進行；和b)檢測化合物的結(jié)合；和c)任選地對所檢測的化合物的結(jié)合進行定量。
14.用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP的細胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時化合物與MPTP的結(jié)合與所述活性劑不存在時化合物與MPTP的結(jié)合；和c)任選地測試所述被選活性劑對包含具有MPTP的亞細胞成分的細胞提取物配制物中的MPTP活性的作用。
15.用于鑒別通過與VDAC1相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP之VDAC1的細胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合與所述活性劑不存在時化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合；和c)任選地測試所述被選活性劑對包含具有MPTP之VDAC1的亞細胞成分的細胞提取物配制物中的MPTP活性的作用。
16.通過權(quán)利要求14和15的任一項的方法鑒別的活性劑。
17.通式I化合物， 其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T。
18.權(quán)利要求17的化合物，其中所述化合物是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是H。
19.權(quán)利要求17的化合物，其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個放射性同位素。
20.權(quán)利要求17的化合物，其中所述化合物是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。
21.權(quán)利要求17至20的化合物，其作為MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑。
22.權(quán)利要求19和20的化合物，其作為親和標記物。
23.權(quán)利要求19和20的化合物，其作為用于MPTP復(fù)合物組分的親和標記物。
24.通式II化合物， 其中R選自H、T、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個放射性同位素，其中所述化合物是親和標記物。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中所述化合物是用于MPTP復(fù)合物組分的親和標記物。
26.權(quán)利要求24和25的化合物，其中R包含至少一個T。
27.權(quán)利要求24和25的化合物，其中R選自Br、Cl和Cl2的放射性同位素。
28.通式II化合物， 其中R選自H、T、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中所述化合物是MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。
全文摘要
本發(fā)明提供了通式I化合物和通式II化合物作為MPTP復(fù)合物的調(diào)制劑和親和標記物的用途。此外，本發(fā)明提供了用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法、用于測定MPTP復(fù)合物組分存在的方法及用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，具體地為鑒別通過與VDAC1相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法。此外，本發(fā)明提供了新的通式I化合物。
文檔編號A61P25/28GK1609086SQ20041003380
公開日2005年4月27日 申請日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者A·塞蘇爾, E·皮那德 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司