專利名稱：全鱉護肝膠囊及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及的是以全鱉為主藥治療肝臟疾病有特殊療效的全鱉護肝膠囊及其配制方法。
背景技術(shù)：
中華鱉，俗稱甲魚，團魚，水魚、王八、神守等，自古以來就是鮮美的佳肴和滋補佳品，除了具有極高的營養(yǎng)價值外，其身體的各個部位甲、骨、肉、血、頭、內(nèi)臟等各有其特殊的醫(yī)療功效；利用全鱉與中草藥進行配伍，應(yīng)用先進的加工方法制成具有保肝護肝功能的專用保健食品，是我們多年來的心愿。

發(fā)明內(nèi)容
木發(fā)明的目的是提供一種以全鱉為主藥能夠?qū)χ委煾闻K疾病有特殊療效的全鱉護肝膠囊及其配制方法。
木發(fā)明的目的是用以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種全鱉護肝膠囊，是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉1.0-5.0份枸杞0.5-3.4份黃 精0.5-2.6份郁金0.5-3.0份百合0.6-3.2份雞內(nèi)金0.6-2.8份。
上述全鱉護肝膠囊，是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉2.0-4.0份枸杞0.7-1.4份黃 精0.8-1.6份郁金1.0-2.0份百合1.1-2.2份雞內(nèi)金0.9-1.8份。
上述全鱉護肝膠囊，是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉2.2-3.5份枸杞1.0-1.2份黃 精1.0-1.4份郁金1.2-1.8份百合1.1-2.0份雞內(nèi)金0.9-1.5份。
一種上述全鱉護肝膠囊的配制方法的加工工藝流程為①首先是鱉加工選出活鱉～暫養(yǎng)凈化～流水清洗～真空冷凍干燥～粉碎～低溫冷藏～按原料配比稱出低溫備用；②中藥加工選出各原料中藥～烘干～破碎～按照各原料重量比稱出混舍備用；③再將上述備用的鱉粉與中草藥粉混合～低溫研磨～細胞級粉碎～紫外滅菌～后添加植物抗氧化劑后高效混合～膠囊罐裝～裝瓶～封口～貼簽～裝箱～檢驗入庫全鱉護肝膠囊中各味原料藥的性能如下全鱉咸、寒。入肝、脾、腎經(jīng)。功效養(yǎng)陰退熱，軟堅散結(jié)。
枸杞甘、平。入肝、腎經(jīng)。功效補腎益精，養(yǎng)肝明目。
黃精甘、平。入脾、肺經(jīng)。功效補脾益肺。
郁金辛、苦、寒。入心、肺、肝經(jīng)。功效行氣通滯，清心安神，利膽退黃。
百合甘、微寒。入心、肺經(jīng)。功效潤肺止咳，養(yǎng)心安神。
雞內(nèi)金甘、平。入開、脾、胃、小腸、膀胱經(jīng)。功效消食化積，縮尿止溺。
由上述各原料藥的性能可看出是無毒的，多是養(yǎng)陰散結(jié)、養(yǎng)肝補脾、清心利膽對護肝是絕對有利。
本發(fā)明的效果很顯著，本發(fā)明開題定名為“康立特護肝膠囊”，由于開題慎重，主研究人員都是中醫(yī)藥專家，嚴格全面按照醫(yī)藥規(guī)范進行，效果是肯定的1、該項目首次研究并提出了全鱉與中草藥配伍的適宜組方，藥食兩用中草藥的采用使該產(chǎn)品既可以作為肝病的治療藥物，又可以作為保健品；2、該發(fā)明。特別是采用了冷凍干燥、細胞級粉碎等先進的加工工藝，既保持了中華鱉及其他中草藥的活性成分，又使其藥效得到充分釋放和吸收，從而提高了療效或保健效果；3、該研究對實驗性免疫性肝損傷小鼠肝組織和血清中的炎癥介質(zhì)和凋亡相關(guān)因子的干預(yù)，該藥可以有效地通過降低血清中IL-18、肝組織中的TNFα、MDA含量和Fas、FasL的表達，增加SOD的含量，減少肝組織中的炎癥反應(yīng)，進而減少肝細胞壞死和凋亡，并表現(xiàn)出療效的明顯隨劑量增加而提高；4、本發(fā)明對30例乙型病毒性肝炎患者的臨床療效，發(fā)現(xiàn)對患者的血清指標(biāo)、癥狀體征、影像學(xué)指標(biāo)均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝損傷、防止肝纖維化形成的作用。臨床總有效率達84.3％，且未發(fā)現(xiàn)各安全指標(biāo)的異常變化；總之，充分證明了本發(fā)明組方科學(xué)，工藝合理、先進，效果顯著、肯定，服用安全可靠，


下面通過附圖對本發(fā)明作進一步說明。
圖1為本發(fā)明生產(chǎn)工藝流程圖上述全鱉護肝膠囊實施例例1、一種全鱉護肝膠囊，是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉18g、枸杞5g、黃精6g、郁金8g、百合917g、雞內(nèi)金7g。
例2、一種全鱉護肝膠囊，是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉20g、枸杞7g、黃精8g、郁金10g、百合11g、雞內(nèi)金9g。
例3、一種全鱉護肝膠囊，是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉2.2g、枸杞1.0g、黃精12g、郁金1.2g、百合12g、雞內(nèi)金11g。
具體實施例方式
附圖1中的說明原料鱉的選用野生鱉最好區(qū)分養(yǎng)殖與野生從形體上看，養(yǎng)殖鱉的裙邊、背粗糙，不光滑，裙邊較薄，而野生鱉的背甲光潔平滑，裙邊厚實；從鱉的爪子上看，養(yǎng)殖鱉爪子不硬不尖，顏色發(fā)白，而野生鱉爪子又硬又尖，顏色發(fā)黃；從底板的花紋看，養(yǎng)殖鱉的底板發(fā)白發(fā)紅，較嫩，而野生鱉底板發(fā)黑，條紋清楚，顏色發(fā)暗；從內(nèi)臟看，野生鱉油脂發(fā)黃，而養(yǎng)殖鱉的油脂呈淡白色，油脂比較多；半野生鱉以上達到500克以上可用；選鱉必須無病無傷、反應(yīng)靈敏、翻蓋后能迅速翻身的為佳品。
圖1中的暫養(yǎng)凈化是指購入的鱉，先放入自來水中暫養(yǎng)3-5天，以吐凈使其消化系統(tǒng)的內(nèi)容物；暫養(yǎng)時，每只容器中只放一只，以避免其互相撕咬受傷，同時，在容器的上口覆蓋一層40目的紗網(wǎng)，防止蚊子叮咬導(dǎo)致死亡。
附圖1中的低溫真空冷凍干燥是指真空技術(shù)與冷凍技術(shù)相結(jié)合的新型干燥脫水技術(shù)，冷凍干燥有下列優(yōu)點低溫下(-40℃)進行，對于熱敏性的物質(zhì)特別適用，如蛋白質(zhì)、微生物之類不會變性或失去生物活力；低溫干燥時，揮發(fā)性成分損失很小，；冷凍干燥能保持原來的性狀；在凍結(jié)的狀態(tài)下進行干燥，保持了原來的結(jié)構(gòu)，不會發(fā)生濃縮現(xiàn)象；干燥后的物質(zhì)疏松多孔，加水后溶解迅速而完全，幾乎立即恢復(fù)原來的性狀；由于干燥在真空下進行，氧氣極少，易氧化的物質(zhì)得到了保護⑦干燥能排除95-99％以上的水份，使干燥后產(chǎn)品能長期保存而不致變質(zhì)。
圖1中采用的細胞級粉碎機是一超微粉碎保質(zhì)設(shè)備，可對任何物料的高粘度、高精度包括固-固、固-液混合作業(yè)；可控制粉碎溫度，產(chǎn)生的高強度超聲波使粉碎物料中的細菌被殺滅；原料的粉碎粒度控制在0.25-4.37μm，達到了細胞級的粒度，使其藥效得以充分釋放并高效吸收。
圖1中的高效混合是指混合的時間控制在3-5min。
下面定供本發(fā)明研制技術(shù)資料，《全鱉護肝膠囊的研制組》(04年10月8日總結(jié))(一)“康立特膠囊”即全鱉護肝膠囊的中草藥組方的研究1、康立特膠囊的處方組成“康立特膠囊”的主要由全鱉、枸杞、黃精、百合、內(nèi)金、砂仁等藥物組成。
(二)康立特膠囊的成分分析1、理化成分分析表1 理化成分

2、功效成分分析 表2 保健功效成分

表3 氨基酸分析結(jié)果


3、有毒、有害物質(zhì)分析表4 有毒、有害物質(zhì)

4、微生物指標(biāo)分析表5 微生物指標(biāo)

(三)康立特膠囊的實驗研究康立特膠囊干預(yù)免疫性肝損傷小鼠炎癥介質(zhì)及死亡相關(guān)因子的研究肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理狀態(tài)，其長期存在和活動發(fā)展往往是導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌發(fā)生最重要的始動因素。肝細胞的炎癥變性、壞死、凋亡是大多數(shù)肝損傷的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，這些變化與多種炎癥介質(zhì)和凋亡相關(guān)因子密切相關(guān)，本實驗以免疫性肝損傷小鼠為模型，通過檢測血清中IL-18、ALT、AST，肝組織中TNFα、SOD、MDA、Fas、FasL等炎癥介質(zhì)和凋亡相關(guān)因子，觀察中藥康立特膠囊對免疫性肝損傷模型小鼠肝損傷的干預(yù)并分析其機制。
材料與方法1材料1.1動物健康昆明小鼠60只，雄性，體重18±20g，購自山東大學(xué)實驗動物中心，合格證號010284，魯動質(zhì)字20021023。小鼠普通飼料，購自山東大學(xué)實驗動物中心。
1.2藥物康立特膠囊，山東省淡水水產(chǎn)研究所和山東中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合研制，主要組成野生鱉甲、枸杞、黃精、雞內(nèi)金、百合、砂仁等。益肝靈片保肝藥，具有改善肝功能，保護肝細胞膜的作用，用于急慢性肝炎及遷延型肝炎，江蘇中興藥業(yè)有限公司，批號20030409，規(guī)格每片含水飛薊38.5mg，口服，一次2片，一日3次。
1.3主要試劑卡介苗原漿(BCG，1.86×107菌/mg)北京生物制品研究所，批號031030；脂多糖(LPS)，購自北京舒伯偉化工儀器有限責(zé)任公司，美國SIGMA公司產(chǎn)品；SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TNFα放免試劑盒，購自中國人民解放軍科技開發(fā)中心；IL-18酶聯(lián)試劑盒購自大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司，F(xiàn)as、FasL免抗鼠一抗購自北京萊博生物實驗材料研究所，二抗購自武漢博士德生物公司2方法2.1造模用BCG+LPS法將BCG和LPS用生理鹽水分別稀釋為2.5×108菌/ml和50μg/ml，小鼠尾靜脈注射配好的BCG液0.2ml/只，(含5×107個菌以上)，致敏10天后，尾靜脈注射LPS液0.2ml/只，16小時后摘眼球取血處死，剖腹取肝、脾。飼以普通飼料，自由飲水。
2.2分組及處理方法將小鼠隨機分為6組，即A組正常對照組、B組模型組、C組益肝靈對照組、D組康立特高劑量組、E組康立特低劑量組、F組康立特低劑量組，每組各10只?？盗⑻啬z囊按成人每日0.3×15＝4.5g，換算成小鼠日給藥量4.5g×0.0026＝0.0117g/20g，0.0177×50＝0.585g/kg，0.585g/kg×2＝1.17g/kg，1.17g/kg×4＝4.68g/kg，三個劑量分別為臨床用藥量的1、2和4倍。益肝靈按成人每日用水飛薊38.5×6＝231mg，換算成給藥量0.231×0.0026＝0.0006g/20g 0.0006×50＝0.03g/kg?？盗⑻啬z囊按低、中、高劑量分為三組，用涼開水配成為5.85％、11.7％、23.4％混懸液；益肝靈配成0.015％的混懸液。各組動物處理如下表動物分組及處理情況一覽表組別 動物數(shù)處理方法生理鹽水0.2ml/20g灌胃，8Am喂水，每日一次，A(正常對照組)，10連續(xù)10天。
首日小鼠尾靜脈注射BCG液0.2ml/只，生理鹽水B(模型組)10 0.2ml/20g灌胃，8Am給藥，每日一次，連續(xù)10天，10天后，尾靜脈注射LPS液0.2ml/只C(益肝靈對照 造模方法同上，益肝靈懸液0.2ml/20g灌胃，8Am10組) 給藥，每日一次，連續(xù)10天D(康立特膠囊 造模方法同上，每日8Am，以康立特膠囊23.4％10高劑量組) 懸液0.2ml/20g灌胃，每日一次，連續(xù)10天E(康立特膠囊中造模方法同上，每日8Am，以康立特膠囊11.7％10劑量組) 懸液0.2ml/20g灌胃，每日一次，連續(xù)10天F(康立特膠囊低造模方法同上，每0日8Am，以康立特膠囊5.85％10劑量組) 懸液0.2ml/20g灌胃，每日一次，連續(xù)10天尾靜脈注射LPS 16小時后，稱重、摘眼球取血處死，稱肝、脾濕重，4℃取肝左葉相同部位組織二段，分別浸于4％戊二醛和10％中性福爾馬林中，留作光鏡和電鏡病理觀察；其余肝組織以生理鹽水冰水中勻漿，配成25％肝組織勻漿，3000轉(zhuǎn)/分4℃離心，取上清；所取血液離心取血清。所有動物普通飼料飲食，自由飲水，至處死前8小時。
2.3觀察項目及檢測指標(biāo)2.3.2血清學(xué)檢測 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)用全自動生化分析儀檢測。IL-18含量，按試劑盒采用酶聯(lián)免疫法。
2.3.3病理學(xué)光鏡觀察 取新鮮肝左葉相同部位組織，以10％中性福爾馬林液充分固定，經(jīng)各級酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片厚5μm。
2.3.4免疫組織化學(xué)染色觀察 取上述石蠟切片另兩張分別行Fas、FasL的SABC法免疫組織化學(xué)染色。微波抗原修復(fù)，F(xiàn)as及FasL的一抗的工作濃度為1∶100，，4℃冰箱保存過夜。用已知陽性切片作陽性對照，PBS液取代一抗作陰性對照。DAB顯色。胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性目標(biāo)。多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)Image-Pro Plus version 4.0分析顯色程度。
2.3.5肝組織勻漿，按試劑盒說明進行TNFα、SOD、MDA的放射免疫定量檢測。
2.4 Fas、FasL免疫組化結(jié)果半定量判定標(biāo)準(zhǔn)以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片在10×40倍鏡隨機選擇六個視野，每個視野測量其陽性面積和光密度OD值，以其相乘所得數(shù)值的平均值定為其免疫組化指數(shù)值。
2.5統(tǒng)計方法 將所得數(shù)據(jù)輸入微機經(jīng)PEMS統(tǒng)計軟件(華西醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室Ver.2.0)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示。計量資料采用單因素方差分析。
結(jié)果1動物的一般情況及肝脾系數(shù)正常組一般情況良好，模型組與各用藥組動物飲食量減少，怕冷，不喜活動，個體較小，體重增長較正常組低；由表1可以發(fā)現(xiàn)，模型組肝臟系數(shù)較正常組明顯增大，有顯著性差別(P＜0.01)。康立特膠囊高、中、低劑量組及益肝靈組較模型組肝系數(shù)小，前兩者與模型組相比，有顯著差別(P＜0.05)，但后兩者較模型組無統(tǒng)計學(xué)意義。脾系數(shù)各組均小于空白對照組，且除康立特高劑量組外與空白對照組有較顯著差異(P＜0.05)，但模型組與各用藥組之間無明顯差異。
表1 動物肝脾系數(shù)表組別數(shù)量 肝系數(shù) 脾系數(shù)A 10 4.7603±0.5237 0.587±0.0986B 86.4404±0.6407ΔΔ0.7321±0.1446ΔC 86.3533±0.4625ΔΔ0.7168±0.1248ΔD 85.6881±0.6824*ΔΔ0.6348±0.1168E 85.5951±0.7031*Δ0.7091±0.125ΔF 86.1261±0.6433ΔΔ0.7095±0.1999Δ注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
2肝臟大體觀察實驗結(jié)束時，肉眼可見正常組肝臟大小正常，質(zhì)地光滑柔軟，顏色暗紅，切面鮮紅；模型組肝臟明顯腫大，邊緣變鈍，表面光滑，顏色變淺微黃，包膜變厚，切面可見黃色脂肪變；各治療組肝臟體積稍大，質(zhì)地柔軟，顏色多數(shù)暗紅，表面光滑，切面顏色接近正常；尤以中藥中劑量組與空白組接近。
3血清相關(guān)指標(biāo)檢測3.1轉(zhuǎn)氨酶的檢測由表2看出，模型組肝功能明顯異常，ALT、AST血清水平異常升高，與正常對照組比較差異均有顯著性(P＜0.01)；而各用藥組均可明顯降低血清中異常升高的ALT水平，與模型組比較差異有顯著性差異，其中益肝靈和康立特高劑量組尤為顯著(P＜0.01)，后者效果優(yōu)于前者，兩者相比有顯著差異(p＜0.05)。康立特高劑量組明顯降低AST水平，與模型組相比有顯著差異(P＜0.01)，但仍高于空白對照組(P＜0.01)，各康立特治療組與益肝靈組相比無顯著差異。
表2 不同組別大鼠血清肝臟功能測定結(jié)果(x±s)組別 例數(shù)ALT(IU/L) AST(IU/L)A 8 66.5±15.72**##214.38±33.47**B 8 197.25±64.24ΔΔ438±71.02ΔΔC 8 116.25±38.33**ΔΔ411.63±216.57*ΔD 8 78.875±21.81**#244.75±59.10**E 8 129.75±55.94*ΔΔ327.25±51.06**ΔΔF 8 130.63±48.88*ΔΔ390.5±79.39ΔΔ注與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與益肝靈比較#p＜0.05，##p＜0.01(同下表)
3.2 IL-18的酶聯(lián)免疫檢測由表3可以看出，模型組血清IL-18含量比正常對照組明顯升高(p＜0.01)，各用藥組IL-18血清平均含量均低于模型組，其中康立特膠囊高劑量組可以明顯降低肝損傷小鼠血清中IL-18的含量(p＜0.01)，效果優(yōu)于益肝靈對照組，兩組相比差異顯著(P＜0.05＝。
表3 小鼠血清IL-18濃度(x±s)組別數(shù)量 IL-18(ng/ml)A 849.13±4.61**#B 861.33±10.2ΔΔC 857±7.57ΔD 848.88±5.82**#E 860.13±10.99ΔF 853.5±11.154肝組織中SOD、MDA、TNFα的放射免疫檢測由表4可以看出，模型組與正常對照組相比肝組織中TNFα含量明顯增加(p＜0.01)，SOD含量明顯減少(p＜0.01)，MDA含量明顯增加(p＜0.05)；SOD含量各用藥組均數(shù)均高于模型組，其中康立特高劑量組明顯高于模型組(p＜0.01)，MDA含量益肝靈組、康立特高、中劑量組均明顯少于模型組，其中益肝靈組與模型組相比有顯著差異(p＜0.01)，各治療組間無顯著差異；TNFα的含量康立特高、中劑量組明顯少于模型組(前者p＜0.01，后者p＜0.05)且前者效果優(yōu)于益肝靈組(p＜0.05)。
表4 不同組別小鼠肝組織勻漿中SOD、MDA、TNFα測定結(jié)果(x±s)組別例數(shù)SOD(NU/mgprot)MDA(NU/mgprot) TNFα(ng/ml)A 8 112.48±6.15**6.05±1.78*2.05±0.35**##B 8 100.09±6.86ΔΔ8.28±1.82Δ3.09±0.84ΔΔC 8 106.7±13.05 5.75±1.50**2.72±0.44ΔΔD 8 108.58±5.39**6.62±1.79*1.83±0.51**##E 8 101.59±10.04Δ6.16±1.88*2.26±0.78*F 8 102.2±11.25Δ8.90±2.94Δ2.49±0.40Δ5光鏡HE片觀察如圖1、圖2所示，模型組匯管區(qū)、中央靜脈周圍有較多的淋巴和中性粒細胞浸潤，小葉間有較多散在的局灶性炎，匯管區(qū)周圍可見重度碎屑樣壞死，炎癥細胞以中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞為主，其間有少量纖維母細胞及變性壞死的肝細胞。肝組織內(nèi)的肝細胞變性以水樣、氣球樣變?yōu)橹鳎h端和周邊的肝組織有散在的及片狀的嗜酸性變性，偶見點狀出血灶。
如圖3、圖4所示，康立特高劑量組肝組織炎癥顯著好于模型組，接近正常組，僅在個別匯管區(qū)周圍見個別散在的炎細胞浸潤，部分肝細胞輕度水樣變性。其余用藥組的病變介于模型組愈康立特高劑量組之間，如圖5、6、76肝組織Fas、FasL的免疫組化定量檢測如圖8至19所示Fas、FasL陽性細胞主要分布于肝組織遠端和周邊，部分匯管區(qū)、中央靜脈周圍。部分小葉間也有散在及片狀分布，在肝細胞死亡后的缺失區(qū)周圍明顯高表達。Fas與FasL在肝組織內(nèi)的分布基本一致，陽性目標(biāo)主要在肝細胞漿和細胞膜上表達，F(xiàn)asL在淋巴細胞上也有明顯表達。陽性細胞的染色程度與陽性細胞的分布面積的乘積值以模型組最高，正常對照組僅有偶見少量陽性細胞，各用藥組介于模型組與正常對照組之間，其中康立特高劑量組的表達最少，其免疫組化指數(shù)明顯小于模型組(p＜0.01)，康立特中劑量組與模型組相比也有較顯著差異(p＜0.05)。各組陽性程度見表5。
表5 不同組別小鼠肝組織Fas/FasL免疫組化指數(shù)(x±s)組別例數(shù)Fas FasLA 8 0 0B 8 768.28±108.63 816.46±99C 8 685.45±138.12 785.87±120.18D 8 582.63±101.38**602.89±85.9**E 8 657.35±100.32*695.17±116.73*F 8 693.85±108.95 780.963±114.017電鏡觀察如圖20、21、22、23所示，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝細胞內(nèi)線粒體腫脹，嵴模糊不清，核膜模糊，細胞器減少，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、細胞核內(nèi)異染色質(zhì)邊聚、常染色質(zhì)結(jié)成團塊、肝竇絨毛脫落；康立特高劑量組僅見核膜腫脹、炎癥細胞浸潤；其他實驗組也優(yōu)于模型組。
綜上所述，康立特膠囊可以有效地通過降低血清中IL-18、肝組織中的TNFα、MDA含量和Fas、FasL的表達，增加SOD的含量，減少肝組織中的炎癥反應(yīng)，進而減少肝細胞壞死和凋亡。
(四)康立特膠囊的臨床研究康立特膠囊治療慢性乙型肝炎的臨床研究慢性乙型肝炎是一種全世界性的，最常見的傳染病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界約有20億人已受到過乙肝病毒(HBV)感染，其中有3.5億以上患者已成為該病毒攜帶者，每年至少造成200萬人死亡，使乙型肝炎成為世界上第九大致死原因。我國成人HBsAg攜帶率10％，約1.3億人，其中乙型肝炎患者約2800萬，約2000萬人將最終死于與乙肝相關(guān)疾病，其死亡率，男性為50％，女性為15％。其肝硬化和肝細胞癌的年發(fā)病率分別為2％和1％[4]。HBV通過刺激人體的免疫系統(tǒng)攻擊受感染的肝細胞引起肝損傷，其持續(xù)存在使繼發(fā)的肝纖維化不斷發(fā)展，最終發(fā)展為結(jié)節(jié)樣增生，形成肝硬化。統(tǒng)計表明，約1/3的慢性乙肝患者進展為肝硬化，乙肝患者發(fā)生肝細胞癌的危險性增加100倍以上，嚴重危害了患者的身心健康，對社會的發(fā)展也造成了極大的負面影響。因此阻斷這些患者肝損傷的持續(xù)發(fā)展是提高患者的生活質(zhì)量，阻斷其向肝硬化發(fā)展的重要治療環(huán)節(jié)。目前西醫(yī)對病毒性肝炎的治療尚無良策，拉米夫丁和干擾素為主的抗病毒療法的適應(yīng)癥不夠廣泛，干擾素的不良反應(yīng)、拉米夫丁引起的病毒變異極大地限制了其臨床應(yīng)用。中醫(yī)藥在治療病毒性肝炎肝損傷方面有相對的優(yōu)勢，為挖掘中醫(yī)藥遺產(chǎn)，探索有效的抗肝損傷的藥物，通過學(xué)習(xí)中醫(yī)相關(guān)理論文獻，借鑒國內(nèi)先進經(jīng)驗并結(jié)合我們自己的臨床經(jīng)驗，以特定工藝開發(fā)了以滋補肝腎、祛瘀散結(jié)為主要治則，以全鱉為主藥的中藥制劑即康立特護肝膠囊。為驗證康立特護肝膠囊抗肝損傷的臨床療效，對30名慢性乙型肝炎患者進行臨床觀察，獲得了初步的結(jié)論，取得了較好的療效，現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下。
1研究對象1.1診斷標(biāo)準(zhǔn)1.1.1西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2000年(西安)中華醫(yī)學(xué)會傳染病學(xué)會與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。
1.1.2中醫(yī)診斷參照1991年中國中醫(yī)藥學(xué)會內(nèi)科肝膽病專業(yè)委員會修訂的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》(試行)。符合慢性肝炎以肝腎陰虛證為主兼有肝郁脾虛、瘀血阻絡(luò)的診斷。
主癥頭暈?zāi)繚?，腰膝酸軟；?或脅肋脹痛，腹脹便溏，乏力納呆；或面色晦暗，或見赤縷紅絲，脅下痞塊，質(zhì)地較硬1.2臨床病例選擇標(biāo)準(zhǔn)1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)符合西醫(yī)診斷病毒性肝炎，乙型，慢性(輕、中度)；符合中醫(yī)辨證慢性肝炎以肝腎陰虛證為主或兼有肝郁脾虛、瘀血阻絡(luò)證；年齡12～65歲；受試者均知情同意。
1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)(包括不適應(yīng)癥或剔除病例)合并有肝癌、肝性腦病，嚴重的心腦血管、心、肺、腎、內(nèi)分泌、造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)疾病者，及精神病患者；妊娠、準(zhǔn)備妊娠或哺乳期婦女；過敏體質(zhì)，對多種藥物過敏者；凡不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定用藥，無法判斷療效或資料不全等影響療效或安全性判斷者。
1.2.3終止實驗標(biāo)準(zhǔn)對本藥過敏者；實驗期間，在一個月內(nèi)病人病情持續(xù)惡化ALT連續(xù)兩次升高超過100μ/l者。
2一般資料2.1病例來源30例患者，均來自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病門診，于2003年5月～2004年5月收集。其中男20例，女10例，年齡最大55，最小15，平均年齡37歲。均符合上述臨床病例選擇標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病程最長7年，最短6個月，平均14個月。
3治療方法所有患者在首次檢查后即開始口服康立特膠囊，每日3次，每次5片，每6個周觀察一次，總療程12個周；病情持續(xù)惡化，而未達排除標(biāo)準(zhǔn)者，給予肌苷、復(fù)合維生素B、維生素C靜滴營養(yǎng)保肝，繼續(xù)服用本藥；達終止實驗標(biāo)準(zhǔn)者，給予甘利欣靜滴、阿拓莫蘭靜注并終止服藥，列入排除病例。
4觀察指標(biāo)4.1安全性指標(biāo)包括一般性體檢項目；血、小便、大便常規(guī)檢查；心電圖、腎功能檢查；上述檢查分別于治療前后各查一次。
4.2療效性觀測4.2.1主要癥狀、體征和舌象、脈象參照《中藥新藥治療病毒性肝炎的臨床研究指導(dǎo)原則》和臨床常見癥狀體征，采用重點癥狀與體征積分法，將常見主要癥狀和體征按輕重進行量化，對治療前后單個癥狀和體征的積分情況和總積分的情況進行比較，判斷康立特膠囊對這些臨床表現(xiàn)的療效。具體積分方法見下表。
表2 重點癥狀與體征積分癥狀體征積分0 1 2 3納呆無食欲減退不思飲食 不能進食伴嘔惡腹脹無輕度腹脹，進腹脹不適，進食腹脹更甚，進食2食后半小時減半小時到一小時小時不能好轉(zhuǎn)輕或消失內(nèi)較甚乏力無體倦，身不欲四肢無力，困倦氣短懶言動 欲臥肝區(qū)隱痛無偶有發(fā)作，隱發(fā)作較頻，疼痛持續(xù)疼痛隱作痛，不影較重響正常工作腰痛無偶有發(fā)作發(fā)作較頻 持續(xù)腰痛，伴有雙下肢酸軟無力肝脾腫大無肋下觸及2cm 肋下觸及2～ 肋下觸及3cm以內(nèi)，質(zhì)軟，3cm，質(zhì)韌，有壓可有壓痛痛4.2.2相關(guān)的理化檢查肝功ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、r-GT(r谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)、TBIL(總膽紅素)；肝膽脾B超；病毒學(xué)指標(biāo)乙肝五項，HBVDNA(乙肝病毒DNA)；肝纖維化四項HA(透明質(zhì)酸)、LN(層粘蛋白)、PCIII(III型前膠原)、IV-C(IV型膠原)
以上指標(biāo)中肝功和B超在治療前、中、后各檢測一次，每兩次之間相隔6個月；其余指標(biāo)在治療前后各檢查一次。
4.3統(tǒng)計數(shù)據(jù)經(jīng)PEMS統(tǒng)計軟件(華西醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室Ver.2.0)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以X±s表示，計量資料采用t檢驗。
5療效標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥治療病毒性肝炎的臨床研究指導(dǎo)原則》，根據(jù)本研究具體需要制定。總療效標(biāo)準(zhǔn)顯效療程結(jié)束后主要癥狀消失，肝脾恢復(fù)正?；蚧乜s，肝功能恢復(fù)正常；有效療程結(jié)束后主要癥狀明顯減輕或消失，肝脾腫大不變，肝功能明顯好轉(zhuǎn)；無效不符合上述改變者。
證候療效判定標(biāo)準(zhǔn)療效按公式(尼莫地平法)[(治療前積分-治療后積分)/治療前積分]×100％計算。
臨床治愈癥狀體征基本消失，療效指數(shù)≥90％；癥狀體征明顯改善，療效指數(shù)≥60％，癥狀體征好轉(zhuǎn)，療效指數(shù)≥30％，癥狀體征無明顯好轉(zhuǎn)，甚或加重，療效指數(shù)≤30％。
安全性評價標(biāo)準(zhǔn)1級安全，無任何不良反應(yīng)；2級比較安全，如有不良反應(yīng)，無需處理，可繼續(xù)用藥；3級有安全性問題，中等程度不良反應(yīng)，處理后可繼續(xù)治療；4級因不良反應(yīng)終止實驗。
6治療結(jié)果6.1總有效率臨床觀察30例，服藥3個月，總療效臨床顯效7例，占23.3％；有效18例，占60％，總有效率占83.3％；無效5例，占16.7％。
6.2中醫(yī)證候結(jié)果分析用藥后患者的癥狀體征均有明顯改善，各癥狀體征均有明顯好轉(zhuǎn)，與治療前相比均有顯著差異(p＜0.01)。其中療效指數(shù)≥90％者，1例；療效指數(shù)≥60％者，18例；≥30％者有10例，無效者1例。即臨床痊愈患者占3.3％，明顯改善者占60％，好轉(zhuǎn)者占33.3％，無效占3.3％。
治療前中后癥狀體征積分表(x±s)癥狀體征 治療前 治療中 治療后(療中總體平均(療后總體平均療效指療效指數(shù))數(shù))
納呆 1.47±1.04 0.9±0.84*0.43±0.50**(38.6) (70.5)腹脹 1.67±0.90 1±0.73**0.5±0.51**(40) (70)乏力 0.97±0.67 0.76±0.62 0.63±0.49*(20.7) (34.5)肝區(qū)隱痛 1.43±0.82 0.93±0.74**0.6±0.50**(34.9) (58.1)腰痛 1.23±0.73 0.83±0.65*0.27±0.45**(32.4) (78.3)肝脾腫大 0.53±0.68 0.5±0.680.36±0.49(6.2)(31.3)總分 8±2.02 5.73±1.78**2.7±1.7**(32.4) (61.6)與治療前相比，**p＜0.01，*p＜0.056.2肝功的療效分析用藥后6個周，肝功能各項指標(biāo)均有改善，除總轉(zhuǎn)肽酶和膽紅素外，其它指標(biāo)與治療前有顯著差異(p＜0.01，p＜0.05)；用藥12個周，肝功能各項除轉(zhuǎn)肽酶外與治療前相比均有顯著改善(p＜0.01，p＜0.05)。
治療前中后肝功能比較表(x±s)肝功能 治療前(U/L) 治療中(U/L) 治療后(U/L)ALT 115.89±77.5168.46±34.47**49.15±19.93**AST 80.82±307.7962.43±41.91*60.08±34.72*GGT 64.6±34.96 55.05±29.50 50.27±34.3TBil21.76±12.1 18.4±7.5717.23±6.89*與治療前相比，**p＜0.01，*p＜0.056.3血清肝纖維化四項的療效分析經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，血清纖維化指標(biāo)除LN外，均有明顯改善，其中PCIII、LN與治療前相比，明顯降低(p＜0.05)，IV-C顯著降低(p＜0.01)治療前后血清肝纖維化四項比較表(x±s)肝功能治療前 治療后PCIII(mg/ml) 128.33±17.59121.5±12.38*HA(ng/ml) 136.03±29.04134.7±20.46LN(ng/ml) 129.3±9.23 124.67±9.21*IV-C(ng/ml) 71.89±6.49 67.65±6.70**與治療前相比，**p＜0.01，*p＜0.05。
6.4 B超的療效分析原有的患者中有20例B超表現(xiàn)有不同程度的回聲增粗，肝脾不同程度的腫大，其余10例B超無明顯異常。治療后，脾臟平均縮小1.02cm，2例肝腫大恢復(fù)正常，1例脾臟腫大恢復(fù)正常，1例肝臟回聲表現(xiàn)轉(zhuǎn)為正常。原有10例B超正常患者，治療后B超仍無異常。
6.5病毒學(xué)指標(biāo)的療效分析治療前后血清病毒指標(biāo)病毒指標(biāo)治療前陽性患者治療后陽性患者轉(zhuǎn)陰例數(shù)(率)例數(shù) 例數(shù)HBsAg 30291(3.3％)HBeAg 149 5(25％)HBVDNA 29253(10％)6.6安全性分析30例患者的血、尿、大便常規(guī)檢查均未發(fā)現(xiàn)與治療前相比的異常結(jié)果，心電圖、腎功能的檢查也未獲異常結(jié)果，安全性指標(biāo)的檢查中未發(fā)現(xiàn)該藥有明顯的毒性。安全性級別為1級。
因此，可以認為康立特膠囊安全有效，經(jīng)三個月的治療后患者血清指標(biāo)、癥狀體征、影像學(xué)指標(biāo)均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝損傷、防止肝纖維化形成的作用。臨床總有效率達83.3％，且未發(fā)現(xiàn)各安全指標(biāo)的異常變化。
(五)結(jié)論通過三年的研究，得出以下結(jié)論1、該項目充分借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究成果，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗，首次研究并提出了全鱉與中草藥配伍的適宜組方，藥食兩用中草藥的采用使該課題研制的產(chǎn)品既可以作為肝病的治療藥物，又可以作為保健品進行開發(fā)；2、該項目研究并總結(jié)出一套完整的生產(chǎn)全鱉護肝膠囊(康立特護肝膠囊)的工藝流程。特別是冷凍干燥、細胞級粉碎等先進的加工工藝，既保持了中華鱉及其他中草藥的活性成分，又使其藥效得到充分釋放和吸收，從而提高了療效或保健效果。
3、該研究通過觀察康立特膠囊對實驗性免疫性肝損傷小鼠肝組織和血清中的炎癥介質(zhì)和凋亡相關(guān)因子的干預(yù)，證明康立特膠囊可以有效地通過降低血清中IL-18、肝組織中的TNFα、MDA含量和Fas、FasL的表達，增加SOD的含量，減少肝組織中的炎癥反應(yīng)，進而減少肝細胞壞死和凋亡，并表現(xiàn)出療效的明顯隨劑量增加而提高。
4、該研究通過觀察康立特膠囊對30例乙型病毒性肝炎患者的臨床療效，發(fā)現(xiàn)康立特膠囊對患者的血清指標(biāo)、癥狀體征、影像學(xué)指標(biāo)均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝損傷、防止肝纖維化形成的作用。臨床總有效率達84.3％，且未發(fā)現(xiàn)各安全指標(biāo)的異常變化。
權(quán)利要求
1.一種全鱉護肝膠囊，是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉1.0-5.0份、枸杞0.5-3.4份、黃精0.5-2.6份、郁金0.5-3.0份、百合0.6-3.2份、雞內(nèi)金0.6-2.8份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述全鱉護肝膠囊，其持征是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉2.0-4.0份、枸杞0.7-1.4份、黃精0.8-1.6份、郁金1.0-2.0份、百合1.1-2.2份、雞內(nèi)金0.9-1.8份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述全鱉護肝膠囊，其持征是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉2.2-3.5份、枸杞1.0-1.2份、黃精1.0-1.4份、郁金1.2-1.8份、百合1.1-2.0份、雞內(nèi)金0.9-1.5份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述全鱉護肝膠囊，其持征是由以下原料按重量比配制而成的膠囊全鱉20g、枸杞7g、黃精8g、郁金10g、百合11g、雞內(nèi)金9g。
5.一種上述全鱉護肝膠囊的配制方法的加工工藝流程為①首先是鱉加工選出活鱉～暫養(yǎng)凈化～流水清洗～真空冷凍干燥～粉碎～低溫冷藏～按原料配比稱出低溫備用；②中藥加工選出各原料中藥～烘干～破碎～按照各原料重量比稱出混舍備用；③再將上述備用的鱉粉與中草藥粉混合～低溫研磨～細胞級粉碎～紫外滅菌～后添加植物抗氧化劑后高效混合～膠囊罐裝～裝瓶～封口～貼簽～裝箱～檢驗入庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述全鱉護肝膠囊的配制方法，其特征是選鱉是指選野生鱉最佳，家養(yǎng)應(yīng)500克以上，所選的鱉，必須無病無傷、反應(yīng)靈敏、翻蓋后能迅速翻身。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述全鱉護肝膠囊的配制方法，其特征是鱉的暫養(yǎng)凈化是指購入的鱉，先放入自來水中暫養(yǎng)3-5天，以吐凈使其消化系統(tǒng)的內(nèi)容物；暫養(yǎng)時，每只容器中只放一只，，在容器的上口覆蓋一層40目的紗網(wǎng)，防止蚊子叮咬導(dǎo)致死亡。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述全鱉護肝膠囊的配制方法，其特征低溫真空冷凍干燥是指冷凍干燥在低溫下(-40℃)進行，是真空技術(shù)與冷凍技術(shù)相結(jié)合的新型干燥脫水技術(shù)，能保持原來的性狀；保持了原來的結(jié)構(gòu)，不會發(fā)生濃縮現(xiàn)象；干燥后的物質(zhì)幾乎立即恢復(fù)原來的性狀；易氧化的物質(zhì)得到了保護；干燥能排除95-99％以上的水份，能長期保存使干燥后產(chǎn)品不變質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述全鱉護肝膠囊的配制方法，其特征細胞級粉碎是指采用的超微粉碎作業(yè)，可對任何物料的高粘度、高精度包括固-固、固-液混合，可以控制粉碎溫度，機內(nèi)高強度超聲波使物料中的細菌被殺滅；原料的粉碎粒度控制在0.25-4.37μm細胞級的粒度，使其藥效得以充分釋放并高效吸收。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述全鱉護肝膠囊的配制方法，其特征高效混合是指混合的時間控制在3-5min。
全文摘要
本發(fā)明全鱉護肝膠囊及其配制方法含有全鱉、枸杞、黃精、郁金、百合、雞內(nèi)金等原料，該項目首次研究并提出了全鱉與中草藥配伍的適宜組方，藥食兩用中草藥的采用使該產(chǎn)品既可以作為肝病的治療藥物，又可以作為保健品；既保持了中華鱉及其他中草藥的活性成分，又使其藥效得到充分釋放和吸收，從而提高了療效或保健效果；該藥可以有效地減少肝組織中的炎癥反應(yīng)，進而減少肝細胞壞死和凋亡；本發(fā)明對30例乙型病毒性肝炎患者的臨床療效，發(fā)現(xiàn)對患者的血清指標(biāo)、癥狀體征、影像學(xué)指標(biāo)均有改善，具有良好的抗病毒性肝炎肝損傷、防止肝纖維化形成的作用；臨床總有效率達84.3％，且未發(fā)現(xiàn)各安全指標(biāo)的異常變化；總之，充分證明了本發(fā)明組方科學(xué)，工藝合理、先進，效果顯著、肯定，服用安全可靠。
文檔編號A61P1/16GK1634230SQ200410036258
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月9日
發(fā)明者張家國, 尹常健, 楊鉑, 郭元春, 楊玲, 彭偉, 崔愛慶, 趙惠琴, 張永, 鞏俊霞, 孫建光, 王小利 申請人:山東省淡水水產(chǎn)研究所