專利名稱：杠柳甙在制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及杠柳甙在制備預(yù)防和治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
用于抗腫瘤治療的化療藥物，通常是基于他們對(duì)快速增殖細(xì)胞的毒性作用。他們?cè)跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)快速增殖的正常細(xì)胞，如造血干細(xì)胞等，也產(chǎn)生明顯的殺傷作用，引起嚴(yán)重的毒性作用。一個(gè)理想的抗腫瘤藥物，應(yīng)該對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異的殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。
杠柳甙是一種強(qiáng)心甙，是中藥香五加皮的主要有效成分之一。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 杠柳甙曾在臨床上作為治療心力衰竭的輔助藥物使用(見(jiàn)Gruzina，E.A.(1961)Sov.Med 25，38-42；Gruzina，E.A.(1960)Sov.Med 24，45-51)，但其強(qiáng)心作用較弱，累積作用差，未在臨床上獲得廣泛使用。日本研究者曾發(fā)現(xiàn)杠柳甙能誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制蛋白p16CDKN2的基因啟動(dòng)子活性，促進(jìn)正常培養(yǎng)細(xì)胞的老化(見(jiàn)，Egawa，K.，Kurihara，Y.，Ito，T.，Matsumoto，M.，and Nose，K.(2002)Biol Pharm.Bull.25，461-465)。在他們相關(guān)內(nèi)容的專利中，將杠柳甙用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，自身免疫性胰腺炎，全身性紅斑狼瘡等。尚未有資料證明杠柳甙可以作為抗腫瘤藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了式(I)所示的杠柳甙及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供以式(I)所示的杠柳甙及其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分的預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物。
本發(fā)明通過(guò)MTT法實(shí)驗(yàn)表明，杠柳甙對(duì)正常細(xì)胞毒性很小，在10μmol/L濃度時(shí)，正常細(xì)胞系基本維持生長(zhǎng)狀態(tài)，而多數(shù)腫瘤細(xì)胞系在0.1-1μmol/L濃度時(shí)，即產(chǎn)生明顯的抑制作用，一些敏感腫瘤細(xì)胞系的IC50，低于0.1μmol/L。杠柳甙對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞有良好的細(xì)胞毒性作用，特別對(duì)肝癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、鼻咽癌、黑色素瘤、皮膚癌和白血病作用較強(qiáng)，而對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌作用較弱，對(duì)正常細(xì)胞基本無(wú)抑制作用。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明杠柳甙有抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用。
本發(fā)明在細(xì)胞水平還分別采用形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞DNA含量檢測(cè)兩者方法對(duì)杠柳甙對(duì)一些惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用進(jìn)行了研究，說(shuō)明杠柳甙對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。
從形態(tài)學(xué)觀察當(dāng)杠柳甙作用達(dá)24小時(shí)時(shí)，0.01-1μmol/L濃度的杠柳甙可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生典型的凋亡核形態(tài)，即核固縮，著色成明亮的藍(lán)色，間或呈新月型，或碎裂成分節(jié)狀。正常的人胚肺成纖維細(xì)胞則未發(fā)生凋亡。腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生率與藥物劑量存在明確的依賴關(guān)系。當(dāng)0.01-1μmol/L濃度的杠柳甙作用達(dá)48小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率略有增高，而正常的人胚肺成纖維細(xì)胞仍未發(fā)生凋亡。
本發(fā)明采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杠柳甙可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，特別是白血病細(xì)胞HL60，1μmol/L杠柳甙作用24和48小時(shí)后，G1期前出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰，即凋亡峰，并且這種杠柳甙的誘導(dǎo)凋亡作用有明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。
本發(fā)明還進(jìn)行了杠柳甙對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)。依照美國(guó)環(huán)境保護(hù)局推薦的上下法急性毒性實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為L(zhǎng)D50估測(cè)值為100mg/kg，用輪廓或然法(profile likelihood)計(jì)算LD50的95％可信限為100-224mg/kg。說(shuō)明杠柳甙對(duì)小鼠的急性毒性較低?，F(xiàn)有技術(shù)中杠柳甙對(duì)大鼠的LD50為480mg/kg(見(jiàn)，Merck Index，13thedition)。和已知的一些強(qiáng)心甙相比較，如地高辛對(duì)大鼠和小鼠腹腔注射的LD50分別為6.2mg/kg和4.8mg/kg(見(jiàn)，Merck Index，13thedition)，哇巴因?qū)Υ笫箪o脈注射的LD50為14mg/kg(見(jiàn)，Merck Index，13thedition)，毒毛旋花子甙K對(duì)小鼠腹腔注射的LD50為2.4mg/kg(見(jiàn)，MDL InformationSystem)，羥基洋地黃毒甙對(duì)大鼠靜脈注射和小鼠腹腔注射的LD50為21mg/kg和6.4mg/kg(見(jiàn)，Merck Index，13thedition)?？梢?jiàn)，杠柳甙對(duì)大鼠和小鼠的毒性劑量，比常見(jiàn)的強(qiáng)心甙類藥物高1-2數(shù)量級(jí)。杠柳甙應(yīng)用于臨床病人治療心力衰竭時(shí)，其強(qiáng)心作用不及毒毛旋花子甙K和其它強(qiáng)心甙(見(jiàn)，Gruzina，，E.A.(1961)Sov.Med 25，38-42.和Gruzina，E.A.(1960)Sov.Med 24，45-51)，也說(shuō)明其在人體的毒性也較低。而杠柳甙對(duì)敏感腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，與哇巴因類似。
根據(jù)本發(fā)明還涉及含有作為活性成份的杠柳甙和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95重量％的杠柳甙。
含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、透皮、皮下、皮內(nèi)、腹膜、直腸、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、眼內(nèi)、顱內(nèi)、陰道給藥等。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、穴位注射、鞘內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型的溶液性質(zhì)可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。液體劑型形式可以是糖漿劑、酏劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液或乳液；固體劑型例如片劑、錠劑、膠囊、滴丸、丸劑、粒劑、粉劑、霜?jiǎng)?、溶液劑、栓劑、可分散粉劑如凍干粉針劑、氣霧劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子包括，賦形劑例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣、磷酸鈉；稀釋劑與吸收劑例如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁、葡聚糖、膠態(tài)二氧化硅、阿拉伯膠、明膠、三硅酸鎂、角蛋白等；濕潤(rùn)劑與粘合劑例如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、三乙胺硬脂酸鎂、三乙胺硬脂酸、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片，以延遲其在胃腸道中的崩解和吸收，并由此提供在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的持續(xù)作用。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如為了將給藥單元制成口服液體制劑，包括乳液、溶液、懸浮液、糖漿等。合適的載體包括溶液、懸浮液、糖漿等，并任選含有添加劑例如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑例如薄荷、冬青油等、甜味劑例如蔗糖、乳糖、糖精等或其它材料。
例如，將本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、植物油例如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射有機(jī)酯例如油酸乙酯、聚氧乙烯山梨醇、脂肪酸酯等。這樣的劑型還可以含有輔料例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。
本發(fā)明所用的無(wú)菌介質(zhì)都可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制得?？蓪⑺鼈儨缇?，例如通過(guò)經(jīng)由細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾、通過(guò)向組合物中加入滅菌劑、通過(guò)將組合物放射處理、或通過(guò)將組合物加熱宋滅菌。還可以在臨用前將它們制成無(wú)菌可注射介質(zhì)。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。當(dāng)然用于實(shí)施本發(fā)明的化合物的給藥途徑取決于疾病和需要治療的部位。因?yàn)楸景l(fā)明化合物的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特征會(huì)有某種程度的不同，因此在組織中獲得治療濃度的最優(yōu)選方法是逐漸增加劑量并監(jiān)測(cè)臨床效果。對(duì)于這樣的逐漸增加治療劑量，初始劑量將取決于給藥途徑。
對(duì)于任何特定患者，本發(fā)明化合物藥物組合物的具體治療有效劑量水平取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)、疾病嚴(yán)重程度、給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的、該化合物的清除速度、治療持續(xù)時(shí)間，該具體化合物聯(lián)合或同時(shí)使用的具體藥物，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格、飲食、個(gè)體反應(yīng)以及一般健康狀況等醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域眾所周知的因素，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。根據(jù)所治療患者的病癥，可能必須對(duì)劑量作出某些改變，并且在任何情況下，都由醫(yī)師決定個(gè)體患者的合適劑量。
給藥劑量是指不包括載體重量在內(nèi)(當(dāng)使用載體時(shí))的化合物的重量。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍優(yōu)選為0.01-10mg/kg體重，更優(yōu)選為0.1-1mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥；這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。當(dāng)然，本發(fā)明的藥物夜課用于處理體外培養(yǎng)的組織以清除其中的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案的優(yōu)點(diǎn)在于a.杠柳甙能特異性的抗腫瘤細(xì)胞增殖；b.杠柳甙能特異性的誘導(dǎo)惡性細(xì)胞凋亡；c.在細(xì)胞水平和對(duì)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明杠柳甙的毒性較低。


圖1.杠柳甙對(duì)體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的抑制作用量效曲線。
圖2.杠柳甙對(duì)人肺癌細(xì)胞A549誘導(dǎo)凋亡作用的熒光顯微鏡觀察圖。其中A為未加藥對(duì)照細(xì)胞；B為1μmol/L杠柳甙作用24小時(shí)C為1μmol/L杠柳甙作用48小時(shí)。
圖3.杠柳甙對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL7402誘導(dǎo)凋亡作用的熒光顯微鏡觀察圖。其中A為未加藥對(duì)照細(xì)胞；B為1μmol/L杠柳甙作用24小時(shí)C為1μmol/L杠柳甙作用48小時(shí)。
圖4.杠柳甙對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC823誘導(dǎo)凋亡作用的熒光顯微鏡觀察圖。其中A為未加藥對(duì)照細(xì)胞；B為1μmol/L杠柳甙作用24小時(shí)C為1μmol/L杠柳甙作用48小時(shí)。
圖5.杠柳甙對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8誘導(dǎo)凋亡作用的熒光顯微鏡觀察圖。其中A為未加藥對(duì)照細(xì)胞；B為1μmol/L杠柳甙作用24小時(shí)C為1μmol/L杠柳甙作用48小時(shí)。
圖6.杠柳甙對(duì)正常的人胚肺成纖維細(xì)胞HELF誘導(dǎo)凋亡作用的熒光顯微鏡觀察圖。其中A為未加藥對(duì)照細(xì)胞；B為1μmol/L杠柳甙作用24小時(shí)C為1μmol/L杠柳甙作用48小時(shí)。
圖7.杠柳甙對(duì)人白血病細(xì)胞HL60誘導(dǎo)凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。其中A，D為未加藥對(duì)照細(xì)胞于培養(yǎng)24及48小時(shí)的DNA含量分布圖；B，E為0.1μmol/L杠柳甙作用于細(xì)胞24及48小時(shí)的DNA含量分布圖；C，F(xiàn)為1μmol/L杠柳甙作用于細(xì)胞24及48小時(shí)的DNA含量分布圖。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 杠柳甙抗腫瘤細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)操作將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1200-1500個(gè)/100μl接種于96孔培養(yǎng)板。24小時(shí)后加入不同濃度藥物(0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10μmol/L)及相應(yīng)溶劑對(duì)照(1/10體積)，每組平行4孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，棄上清，每孔加100μl新鮮配制的含0.5mg/ml MTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄培養(yǎng)上清，加100μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，在Bio-Rad 450型酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm處光密度值(650nm為參考波長(zhǎng))，用logistic方法擬合量效曲線并計(jì)算IC50。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)SigmaPlot軟件輔助擬合量效曲線和計(jì)算IC50。圖1表示三種細(xì)胞的量效曲線，表1表示各種細(xì)胞的IC50。
表1.杠柳甙對(duì)體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

表2.杠柳甙與哇巴因?qū)γ舾心[瘤細(xì)胞IC50(nmol/L，95％可信限)的比較。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論研究表明，杠柳甙對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞系在0.1-1μmol/L濃度時(shí)，即產(chǎn)生明顯的抑制作用，說(shuō)明對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞有良好的細(xì)胞毒性作用。特別是一些敏感腫瘤細(xì)胞系的IC50，低于0.1μmol/L，例如宮頸癌、鼻咽癌、腎癌、皮膚癌、黑色素瘤和白血病；對(duì)于卵巢癌、肺癌、肝癌的作用也較強(qiáng)，而對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌作用較弱，對(duì)正常細(xì)胞毒性很小。在10μmol/L濃度時(shí)，正常細(xì)胞系基本維持生長(zhǎng)狀態(tài)，說(shuō)明對(duì)正常細(xì)胞基本無(wú)抑制作用。與哇巴因比較，杠柳甙對(duì)敏感腫瘤細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)度相近。
實(shí)施例2 杠柳甙對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用(形態(tài)學(xué)觀察)實(shí)驗(yàn)操作培養(yǎng)細(xì)胞以3000-5000個(gè)/100μl接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后加入不同濃度的杠柳甙(1/10體積)，繼續(xù)培養(yǎng)6-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，加入細(xì)胞透過(guò)性DNA結(jié)合染料Hoechst33342至終濃度為1μg/ml，37℃孵育30分鐘。于倒置熒光顯微鏡下，用紫外光激發(fā)，觀察細(xì)胞核的藍(lán)色熒光強(qiáng)度與凋亡形態(tài)。凋亡核形態(tài)特征為核固縮，著色成明亮的藍(lán)色，間或呈新月型，或碎裂成分節(jié)狀。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3(結(jié)果為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值)和圖2-6。
表3-1.杠柳甙作用24小時(shí)的細(xì)胞凋亡發(fā)生率

表3-2.杠柳甙作用48小時(shí)的細(xì)胞凋亡發(fā)生率

實(shí)驗(yàn)結(jié)論本發(fā)明杠柳甙作用達(dá)24小時(shí)時(shí)，0.01-1μmol/L濃度的杠柳甙可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生典型的凋亡核形態(tài)。正常的人胚肺成纖維細(xì)胞則未發(fā)生凋亡。腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生率與藥物劑量存在明確的依賴關(guān)系。
作用達(dá)48小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率略有增高，而正常的人胚肺成纖維細(xì)胞仍未發(fā)生明顯凋亡，也說(shuō)明對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。
實(shí)施例3 杠柳甙對(duì)人白血病細(xì)胞HL60的誘導(dǎo)凋亡作用(細(xì)胞DNA含量檢測(cè))實(shí)驗(yàn)操作采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。懸浮培養(yǎng)的人白血病細(xì)胞HL60，加入終濃度為0.1和1μmol/L杠柳甙，置于37℃，5％CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。300g離心5分鐘收集細(xì)胞，用80％乙醇4℃固定保存。300g離心5分鐘，磷酸鹽緩沖液洗一次，細(xì)胞重懸于含50μg/ml RNA酶的磷酸鹽緩沖液中，37℃作用30分鐘；再加入碘化丙啶至終濃度為10μg/ml染色，室溫作用30分鐘后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL60細(xì)胞熒光分布。使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)和620nm放射波長(zhǎng)檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7和表4不同濃度杠柳甙作用24小時(shí)和48小時(shí)后，HL60細(xì)胞凋亡發(fā)生率(％)。結(jié)果為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值。
表4.杠柳甙對(duì)人白血病細(xì)胞HL60的誘導(dǎo)凋亡作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)論杠柳甙可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL60發(fā)生凋亡，1μmol/L杠柳甙作用24和48小時(shí)后，G1期前出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰，即凋亡峰，并且這種杠柳甙的誘導(dǎo)凋亡作用有明顯的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。
實(shí)施例4 杠柳甙對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作體重19-23g的健康CD1品系雌性小白鼠共15只，腹腔注射不同濃度的杠柳甙，依照美國(guó)環(huán)境保護(hù)局推薦的上下法急性毒性實(shí)驗(yàn)方案(未設(shè)定終止指標(biāo))，觀察24小時(shí)杠柳甙對(duì)小鼠的致死反應(yīng)。死亡小鼠均在0.5小時(shí)內(nèi)死亡，存活小鼠則在24小時(shí)完全恢復(fù)正常狀態(tài)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5.杠柳甙腹腔注射引起的小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論LD50估測(cè)值為100mg/kg，用輪廓或然法(profile likelihood)計(jì)算LD50的95％可信限為100-224mg/kg。
權(quán)利要求
1.如式(I)所示的杠柳甙及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤包括肝癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、鼻咽癌、皮膚癌、黑色素瘤、胃癌、結(jié)腸癌和白血病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的劑型包括霜?jiǎng)?、片劑、膠囊、丸劑、可分散粉劑、粒劑、栓劑、糖漿劑、酏劑、錠劑、注射溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物每天的合適劑量范圍為0.01-10mg/kg體重。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物每天的合適劑量范圍為0.1-1mg/kg體重。
6.一種預(yù)防或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，含有有效劑量的如式(I)所示的杠柳甙或其藥學(xué)上可接受的鹽
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了式(I)所示的杠柳甙及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)杠柳甙具有抗腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)惡性細(xì)胞凋亡特異性強(qiáng)，毒性低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/7042GK1695630SQ20041003803
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月14日
發(fā)明者王楠, 閻征, 周金云, 郭紅麗 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所