專利名稱：一種含乳酸桿菌的藥物組合物、制備方法及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含乳酸桿菌的藥物組合物，具體涉及一種用于治療陰道炎的藥物組合物、制備方法及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
陰道微生態(tài)平衡的破壞是各種婦科炎癥的誘因，也是各種婦科疾患的結(jié)果。陰道炎癥的治療主要包括殺菌劑、微生態(tài)制劑兩方面。殺菌劑的治療特異性強，效果顯著，但抗菌譜廣，選擇性不強，因此副作用較多，且復(fù)發(fā)率高?，F(xiàn)有單菌種微生態(tài)制劑均以細(xì)菌性陰道炎作為治療靶點，適用范圍局限。同時，陰道不同區(qū)段正常菌群分布有一定的規(guī)律，即深部以雙歧桿菌為主，中段以乳酸桿菌為主，這樣各種正常菌群不協(xié)調(diào)改變可導(dǎo)致不同區(qū)段的陰道炎。
在制劑方面，盡可能提高活菌存活率一直是微生態(tài)制劑追求的目標(biāo)，其存活率的影響因素主要體現(xiàn)在溫度、分散保護劑的使用、氧含量、酸堿度等方面。本發(fā)明的發(fā)明人已公開的專利號為01128659.8、發(fā)明名稱為“一種雙歧桿菌、乳酸桿菌混合活菌滴劑及制備方法”對此進(jìn)行了一些探討，該發(fā)明著重于提出一種陰道雙歧桿菌、乳酸桿菌的分離純化方法。但還存在如下不足1、說明書中所述的抗炎、抗感染、抑菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，是根據(jù)雙歧桿菌的體外試驗文獻(xiàn)報道推斷而來，沒有具體的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行支持。由于雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬分別含有上百株，各菌株理化特性不盡相同，產(chǎn)生的治療效果當(dāng)然不同。如已被證實，格氏乳桿菌和卷曲乳桿菌對大腸桿菌和淋球菌根本無效，不但無抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，而且對人體還能造成機會感染。因此，這種推斷并不客觀，存在相當(dāng)?shù)牟淮_定性。2、在治療的適應(yīng)癥方面，該發(fā)明只提及“抗炎、抗感染、抑菌效果好”，沒有特定的適應(yīng)治療范圍，也沒有具體的實驗結(jié)果進(jìn)行支撐，僅是現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上的推斷。3、沒有考慮藥物的酸堿度同時對乳酸桿菌和雙岐桿菌的活菌存活和生長條件的影響、對抑制致病菌的增長條件的影響、對局部(陰道)用藥環(huán)境酸度相適宜條件的影響。4、在使用時，由于是在體外以平衡液混合溶解，很難避雜菌的污染，同時有氧環(huán)境會降低藥物的活菌數(shù)。而且，該發(fā)明沒有涉及治療的療程，因此療效很難以一定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。5、制備過程中所加的甘油賦形劑會影響活菌數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提出一種既適合于鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的活菌存活和生長條件，又能抑制致病菌的增長，又能與局部(陰道)用藥環(huán)境酸度相適宜的藥物組合物及其制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道炎藥物中的用途，特別是制備治療細(xì)菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。
本發(fā)明的又一目的是提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道內(nèi)菌群失調(diào)藥物中的用途。
本發(fā)明的又一目的是提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等藥物中的用途。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案一種藥物組合物，含有治療有效量的鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌(以下簡稱雙歧桿菌)和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌(以下簡稱乳酸桿菌)，適量的酸、堿以及藥物學(xué)可接受載體，所述適量的酸、堿使其混合后的藥物組合物PH值為3.75-5.3，PH值優(yōu)選4～5。
所述酸是檸檬酸、酒石酸、富馬酸或己二酸，所述堿是碳酸鈉或碳酸氫鈉。
一種藥物組合物的制備方法，包括如下步驟(1)分別制備鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/鑒定編碼為44346222(是否還有一個44346022)的乳酸桿菌的凍干菌粉；(2)將藥物學(xué)可接受載體干燥、粉碎后與適量的酸、堿混合均勻，使其混合物的PH值為3.75-5.3；(3)將步驟(1)制得的菌粉與步驟(2)制得的混合物混合后壓制成形。
進(jìn)一步地，所述藥物學(xué)可接受載體包括填充劑、干燥粘合劑和粘合劑，步驟(2)進(jìn)一步包括如下步驟(4)將填充劑、干燥粘合劑和粘合劑干燥、粉碎后過篩；(5)將酸、填充劑、堿、干燥粘合劑攪拌混合均勻；(6)向步驟(5)中加入粘合劑，制得混合物軟材；(7)將混合物軟材制粒并烘干，制得步驟(2)中所述的混合物。
進(jìn)一步地，所述步驟(3)是先將步驟(1)制得的菌粉與一填充劑混合研勻分散后再與混合物混合后壓制成形。
進(jìn)一步地，所述藥物學(xué)可接受載體包括填充劑乳糖、淀粉，干燥粘合劑、填充劑維晶纖維素，崩解劑、干燥粘合劑低取代羥丙基纖維素，粘合劑5％PVPK30乙醇溶液(95％)，所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉，步驟(2)進(jìn)一步包括如下步驟(4)將稱量的酒石酸加入淀粉攪拌混合，再將稱量的碳酸氫鈉和乳糖加入并混合均勻；(5)在步驟(4)中再加入維晶纖維素和低取代羥丙基纖維素混合均勻后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合劑，制軟材；(6)將軟材在制粒機中用制粒、烘烤，制得空白顆粒；步驟(3)進(jìn)一步包括如下步驟(7)將稱量的菌粉分別與適量的乳糖研勻分散；(8)再與空白顆粒等量遞加混合均勻，(9)加入潤滑劑混勻，壓制成片。
本發(fā)明提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道炎藥物中的用途，特別是制備治療細(xì)菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。
本發(fā)明提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道內(nèi)菌群失調(diào)藥物中的用途。
本發(fā)明提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等藥物中的用途。
本發(fā)明提供上述藥物組合物在制備治療陰道炎藥物中的用途，特別是制備治療細(xì)菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。
本發(fā)明提供上述鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道內(nèi)菌群失調(diào)藥物中的用途。
本發(fā)明提供上述藥物組合物在制備清除大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等藥物中的用途。
采用上述技術(shù)方案，結(jié)合下面將要詳述的實施例，本發(fā)明突出的技術(shù)效果在于1、通過在含有鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的藥物組合物中加入酸和堿，并控制藥物組合物的PH值為3.75-5.3(PH值優(yōu)選4～5)，模擬了女性陰道的PH環(huán)境，與正常生理條件相一致，因而既適合活菌的存活和生長條件，又能抑制致病菌的增長，又能與局部(陰道)用藥環(huán)境酸度相適宜，不會對人體造成刺激。另外，PH在4～5范圍以內(nèi)，片劑可壓性好，便于制作片劑。2、通過藥效學(xué)試驗證實，單一的陰道乳桿菌和雙歧桿菌及其兩種菌以不同比例混合液，對陰道炎致病菌均有抑殺菌效果。而且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單一的陰道乳桿菌或雙歧桿菌及其兩種菌以不同比例混合后的濃度達(dá)到一定值后(1×107CFU/克)，對致病菌的抑制率已達(dá)到了接近100％。且詹氏乳桿菌與青春雙歧菌的比例與抑殺效果無相關(guān)關(guān)系。3、通過體內(nèi)治療細(xì)菌性陰道炎實驗證實二聯(lián)活菌潔陰劑不但具有治療細(xì)菌性陰道炎的肯定療效，而且在達(dá)到治療效果的同時，具有維持或重建陰道內(nèi)正常菌群微生態(tài)環(huán)境的作用。4、通過體內(nèi)治療霉菌性陰道炎和淋病性陰道炎實驗研究證實a、二聯(lián)活菌潔陰劑在產(chǎn)生有效治療作用的基礎(chǔ)上，具明顯的重建陰道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，補充正常菌群糾正菌群失調(diào)的突出優(yōu)點，對預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)或再感染可產(chǎn)生積極的作用。b、二聯(lián)活菌制劑重建的陰道內(nèi)正常菌群可以繼續(xù)發(fā)揮治療作用。c、臨床應(yīng)用中沒有發(fā)現(xiàn)其有明顯副作用，對哺乳期女性應(yīng)用未受到限制，這些正是二聯(lián)活菌潔陰劑的優(yōu)勢所在。
具體實施例方式
一、藥物的制備1、菌粉的制備按照專利號為01128659.8發(fā)明名稱為“一種雙歧桿菌、乳酸桿菌混合活菌滴劑及制備方法”中所述的方法，制得經(jīng)API-20A鑒定編碼為44346022/44346222的乳酸桿菌菌種和編碼為47757732的雙歧桿菌菌種，將菌種分別接種于發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心后制得乳酸桿菌菌泥和雙歧桿菌菌泥，菌泥濃度不低于1.0×109CFU/克，加入分散保護劑，約-70℃凍干后，采用冷凍干燥法制得乳酸桿菌菌粉和雙歧桿菌菌粉。
加入的分散保護劑可以是脫脂牛奶、乳糖、谷氨酸鈉、半胱氨酸和淀粉等，其中，半胱氨酸的加入量控制在0.01％～0.1％之間。加入半胱氨酸的作用是還原氧，使菌粉中氧含量下降，同時在凍干過程中保護細(xì)菌不被破壞。當(dāng)半胱氨酸含量低于0.01％時作用不明顯，但由于半胱氨酸本身會抑制細(xì)菌的增長，當(dāng)半胱氨酸含量高于0.1％時，反而會殺死活菌。
2、劑型的制備(1)藥物組成包括乳酸桿菌、雙岐桿菌、酸、堿和其它藥學(xué)上可接受的載體，通過酸、堿調(diào)節(jié)控制制劑的PH值為3.75-5.3之間，優(yōu)選pH值為4～5之間。
由于培養(yǎng)液PH值的變化對乳酸桿菌和雙岐桿菌菌泥的產(chǎn)量影響較大，實驗表明，PH調(diào)整至6.3-6.5時培養(yǎng)24h濕菌泥得率最高。因此，不通過酸堿調(diào)節(jié)，將制得的菌泥制成菌粉后直接與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合用于人體是不太適合的。
通過向藥物中加入酸、堿調(diào)節(jié)，使藥物的PH值控制在3.75-5.3之間，既能保證乳酸桿菌和雙岐桿菌的活菌存活和生長；同時抑制致病菌的增長，又可與局部(陰道)用藥環(huán)境酸度相適宜，適宜人體，避免受到刺激。
可供選擇的酸源有檸檬酸、酒石酸、富馬酸、己二酸等，堿源有碳酸鈉、碳酸氫鈉等。
本實施例選擇性質(zhì)穩(wěn)定、不易吸濕的酒石酸為酸源，碳酸氫鈉為堿源。為了獲得與局部用藥環(huán)境酸度相適宜、有利于活菌存活的最佳酸度(pH4～5)，我們考察了酸、堿不同比例對酸度的影響。取不同比例酸、堿制得的泡騰片(以常規(guī)輔料為填充劑)各5片分別溶解于50ml蒸餾水中，測定泡騰片溶解后的pH值。見表1表1


由上表可見，酒石酸與碳酸氫鈉的比例選擇為0.8∶1～1.4∶1，優(yōu)選0.9∶1～1.2∶1。
將藥物制成片劑(簡稱二聯(lián)活菌潔陰泡騰片或泡騰片)，藥學(xué)上可接受的載體包括各種填充劑、粘合劑、干燥粘合劑、等，進(jìn)一步地，根據(jù)需要，還包括崩解劑、潤滑劑、潤濕劑和溶劑等。
選用常用的乳糖和淀粉作為本發(fā)明的填充劑。選用維晶纖維素作為顆粒間的干燥粘合劑和填充劑。選用低取代羥丙基纖維素作為崩解劑和干燥粘合劑，加入崩解劑能使陰道用藥后泡騰片迅速崩解，藥物分散在較大范圍粘膜表面，迅速提高局部血藥濃度而發(fā)揮作用，且沒有栓劑的油膩性。選用硬脂酸鎂作為潤滑劑。
粘合劑的選擇要制成片劑，必須有一定的硬度。采用適宜的粘合劑，有利于片劑成型并增加片劑硬度。另外，由于泡騰片中分別含有一定的酸源、堿源，片劑在放置過程中容易吸濕并反應(yīng)產(chǎn)生氣體而使片膨脹、破裂，硬度的增加可以減少片劑中顆粒間孔隙，而且在貯存過程中較有效抵抗潮濕空氣的侵入。我們選擇三種常用的不同種類的粘合劑，以不同濃度的乙醇為溶劑，分別配成一定濃度的溶液，按擬定的同一處方制粒，然后壓片，以顆粒的成型性、片劑硬度及崩解時限為指標(biāo)考察不同濃度粘合劑的粘合效果。結(jié)果如表2表2不同濃度粘合劑的粘合效果

實驗結(jié)果表明，采用5％PVP乙醇溶液作為粘合劑所制得的顆粒有較好的成型性，所壓的片劑有適宜的硬度，崩解速度較快，且PVP能溶于高濃度乙醇中，適用于非水制粒。HPMC(5％)粘合劑也較理想，但需要一定含水量的乙醇配制，可適于不同的制備工藝。
表3給出了三個實驗例表3實驗例篩選及結(jié)果(重量單位克)


從以上結(jié)果中可以看出，采用實驗例2制備得到的片劑有較好的成型性，酸度在4～5范圍以內(nèi)，片劑可壓性好，崩解時限符合要求，較其他兩個實驗例為優(yōu)。后面藥效實驗采用實驗例2制得的片劑進(jìn)行。
(2)制備工藝空白顆粒制備在嚴(yán)格的環(huán)境下[RT18±1℃，相對濕度(45±1)％，無菌室]，所有輔料均預(yù)先干燥、粉碎并過100目篩。將稱量的酒石酸置于混合器中，加入淀粉攪拌混合，稱取碳酸氫鈉和乳糖加入并混合均勻。再加入維晶纖維素和低取代羥丙基纖維素混合均勻后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合劑，制軟材，在制粒機中用18目篩制粒，50～60℃烘烤，控制水份2％以內(nèi)，30目篩整粒，去除50目細(xì)粉得30～50目空白顆粒。
樣品制備將稱量的A、B菌粉分別與等量乳糖研勻分散，再與空白顆粒等量遞加混合均勻，加入潤滑劑混勻后壓片，即得泡騰片，半成品質(zhì)量檢查合格后密封包裝。
本產(chǎn)品為微生態(tài)制劑，有效成分為乳酸桿菌和雙岐桿菌。由于劑量小(約占輔料總量的1％)，因此片劑的處方設(shè)計以輔料為主。由于主藥劑量小及其生物制品的熱、濕不穩(wěn)定性，必須考慮到主藥與輔料混合的均勻性及制劑加工過程中熱、濕對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。因此采用非水制粒直接混合工藝，先制備空白顆粒再與小劑量主藥等量遞增獲得主藥均勻分散的顆粒，再在一定壓力下壓片制備泡騰片。避免熱、濕等因素對活性成分的影響及保證制劑中主藥的均勻性。
按照實驗例2所述配方，采用上述制備工藝，共制得片劑1000片(以下命名為泡騰片)，經(jīng)檢測，含乳桿菌和雙歧桿菌總數(shù)不少于2.0×105CFU/片，酸度平均為4.26。
二、二聯(lián)活菌潔陰泡騰片體外藥效學(xué)試驗2.1材料和方法2.1.1實驗材料(1)陰道詹氏乳桿菌LY2034、陰道青春雙歧桿菌BH0203活菌菌粉。
(2)致病菌種大腸埃希氏菌ATCC2592標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株、金黃色葡萄球菌ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株、淋球菌臨床株、白色念珠菌臨床株由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科和中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室提供。菌株形態(tài)、生化特征、致病菌的血清型和培養(yǎng)特性鑒定均符合該細(xì)菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[1]。淋球菌通過形態(tài)學(xué)和API-NH生化鑒定條由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科鑒定。白色念珠菌通過形態(tài)學(xué)和API-C AUX生化鑒定條由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科鑒定。
(3)培養(yǎng)基MRS配方培養(yǎng)基(用于乳酸桿菌、雙歧桿菌、白色念珠菌培養(yǎng))；普通營養(yǎng)培養(yǎng)基(用于大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng))，淋球菌培養(yǎng)基購自廣州樂通泰公司商品。
2.1.2實驗方法(1)細(xì)菌比濁計數(shù)方法[3]以1.175％硫酸鋇0.05ml加1％硫酸9.95ml，混勻后用530nm波長比色調(diào)整其濁度，使吸收值為0.1，該濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，?xì)菌數(shù)相當(dāng)于5×108/ml。
(2)試驗菌液和對照的制備用接種環(huán)取四種致病菌，劃線接種于相應(yīng)的培養(yǎng)平皿，37℃培養(yǎng)24h，詹氏乳桿菌、青春雙歧桿菌分別接種于液體MRS培養(yǎng)基中，并分裝5ml液體培養(yǎng)基用于對照，共同置于厭氧37℃培養(yǎng)24h。無菌棉簽收集致病菌，洗脫于裝有0.9％生理鹽水的試管中，并以0.9％生理鹽水調(diào)整各菌液相應(yīng)濃度0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?br> 2.1.3體外殺菌試驗各取致病菌菌液0.1ml，用涂布棒涂布于適宜培養(yǎng)基平皿，每種菌重復(fù)5個平皿，用瓊脂板打孔器打孔，打孔直徑為6mm，每個平皿打孔6個，編為1-6號，依次加入MRS液體培養(yǎng)基(空白對照組)、陰道詹氏乳桿菌、陰道青春雙歧桿菌、詹氏乳桿菌和青春雙歧桿菌1∶1混合液、詹氏乳酸桿菌和青春雙歧桿菌3∶1混合液、詹氏乳酸菌和青春雙歧桿菌1∶3混合液各200μl，37℃培養(yǎng)24h后，用精確度為1/10的游標(biāo)卡尺測量抑殺菌環(huán)的直徑。淋球菌培養(yǎng)平板系商用品，面積較??；乳桿菌∶雙歧菌＝1∶3的比例組未做。
2.1.4體外液體最小抑菌濃度各取50μl飽和的標(biāo)準(zhǔn)株大腸桿菌加入到50ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，50μl飽和的標(biāo)準(zhǔn)株金黃色葡萄球菌加入到50ml 7.5％的NaCl肉湯培養(yǎng)基中，混勻后各分裝5管，每管9ml，每管分別加入以MRS空白培養(yǎng)基稀釋的不同濃度(1×109CFU/ml、1×107CFU/ml、1×106CFU/ml、1×105CFU/ml、1×104CFU/ml、1×102CFU/ml、空白)的詹氏乳桿菌/青春雙歧桿菌，置37℃培養(yǎng)6-12h后，用平皿法計數(shù)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌數(shù)量，并與空白對照組進(jìn)行比較，得出最小的抑菌濃度。并通過青春雙歧桿菌與詹氏乳桿菌不同比例混合，濃度為1×104CFU/ml，尋求不同比例的最佳抑殺菌效果。
2.2實驗結(jié)果2.2.1最小抑菌濃度根據(jù)目前在市場上銷售的口服類活菌制劑的有效劑量，選擇在1×102CFU/ml、1×104--1×107CFU/ml、1×109CFU/ml的詹氏乳桿菌/青春雙歧菌(統(tǒng)稱益生菌)濃度進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，詹氏乳桿菌、青春雙歧桿菌菌液對陰道炎常見細(xì)菌大腸桿菌與金黃色葡萄球菌有明顯的抑殺效果。在如下表中可以看出，未加益生菌的試管中致病菌濃度達(dá)到了2.0×109CFU/ml，加入1×102CFU/ml益生菌對兩種致病菌均能產(chǎn)生一定的抑殺作用，1×104濃度的菌液對兩種致病菌的抑殺效果明顯上升，達(dá)到了98％以上，但是再增加益生菌至1×106CFU/ml并沒有改變其抑殺作用，濃度1×107濃度的菌液對致病菌的抑制率已達(dá)到了接近100％。而且發(fā)現(xiàn)，在有效濃度的情況下，詹氏乳桿菌與青春雙歧桿菌的比例與抑殺效果無相關(guān)關(guān)系。見表4、5、6。
表4不同濃度的青春雙歧菌對致病菌的抑制效果

根據(jù)表4，可計算出青春雙歧菌對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑殺效果在濃度為1×102CFU/ml時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率在27％-57％，而在濃度為1×104CFU/ml時對兩種致病菌的抑制作用都達(dá)到了99％，再增加濃度抑制效果變化不大，至1×107CFU/ml時抑制率達(dá)到了100％。
表5不同濃度的詹氏乳桿菌對致病菌的抑制效果

根據(jù)表5，可計算出詹氏乳桿菌對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑殺效果在濃度為1×102CFU/ml時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率在60％-65％，而在濃度為1×104CFU/ml時對兩種致病菌的抑制作用都達(dá)到了99％，再增加濃度抑制效果變化不大，至1×107CFU/ml時抑制率達(dá)到了100％。
表6不同比例的二聯(lián)活菌對致病菌的抑制效果

表6給出不同比例的二聯(lián)活菌對致病菌的抑制效果。根據(jù)表6，可以看出在有效濃度的情況下，不同比例混合的詹氏乳桿菌與青春雙歧桿菌對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑殺效果，各組之間無顯著性差異。
2.2.2固體培養(yǎng)基中的抑殺菌效果表7給出二聯(lián)活菌對四種致病菌的殺菌效果，根據(jù)表7所示，單一的陰道乳桿菌和雙歧桿菌及其兩種菌以不同比例混合液，均有抑殺菌效果。實驗顯示，可形成清晰的抑殺菌環(huán)，而空白培養(yǎng)基(為擴增實驗用乳桿菌和雙歧桿菌同時配制，并置于增菌環(huán)境中)未形成抑殺菌環(huán)，目測可見以大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌臨床株抑殺菌環(huán)最大，二聯(lián)活菌優(yōu)于單一雙歧桿菌。而對淋球菌、白色念珠菌及金黃色葡萄球菌則非常接近。各不同比例混合液中，等比例混合液抑殺菌環(huán)稍大于其他各組且對金黃色葡萄球菌可獲得較好抑殺菌效果，其環(huán)直徑為30.4±0.5。總體結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)混合菌的抑殺菌環(huán)均稍大于單菌的抑殺菌環(huán)(乳桿菌對大腸埃希氏桿菌除外)。盡管從實驗數(shù)據(jù)中可以看出1∶1比例混合菌似乎可取得較好的抑殺菌效果，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
表7二聯(lián)活菌對四種致病菌的殺菌效果(殺菌環(huán)直徑mm，X±SD，n＝5)

統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用均數(shù)的one-wayANOVA統(tǒng)計方法，對淋球菌和白色念珠菌的作用接近(p＞0.05)，單一活菌和混合活菌的殺菌作用接近，詹氏乳桿菌和青春雙歧桿菌比例為1∶1、3∶1、1∶3混合后的殺菌作用相近(p＞0.05)2.3結(jié)果分析和討論為確定陰道詹氏乳桿菌LY2034株和陰道青春型雙歧菌BH0203株在體外對陰道炎致病菌的殺滅或抑制作用，以及摸索最低的抑菌濃度，為后續(xù)的體內(nèi)試驗及制劑處方提供試驗依據(jù)。本試驗選擇四種陰道炎常見致病菌大腸埃希氏菌ATCC25922和臨床株、金黃色葡萄球菌ATCC25923和臨床株、淋球菌臨床株、白色念珠菌臨床株作為受試菌。通過固體平皿打孔法和液體培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)，詹氏乳桿菌和青春雙歧菌均對陰道炎常見致病菌有明顯的抑殺作用。這種抑殺作用具備開發(fā)一種治療陰道炎藥物的條件。從量的角度分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種抑殺作用具有一定的濃度依賴性。1×104CFU/ml的詹氏乳桿菌或青春雙歧菌對這兩種致病菌有明顯的抑殺作用，抑殺效果達(dá)到了99.8％，隨著濃度的遞增，其抑殺效果亦無改變，出現(xiàn)一個平臺期，所以，1×104CFU/ml為最小抑殺菌劑量(最小抑菌濃度，MIC)。根據(jù)臨床用藥的一般原則，用最小的量達(dá)到最大的效果，1×104CFU/ml為單次治療用量。制成片劑后為確保療效，制劑處方選擇1×105CFU/片為佳。固體打孔法和液體培養(yǎng)法均發(fā)現(xiàn)，在有效濃度情況下，改變兩者的比例對于致病菌的抑殺效果并無明顯改變，即這種抑殺效果無疊加和拮抗作用?？紤]到女性生殖道的解剖結(jié)構(gòu)和菌群分布特點，即陰道中段以乳酸桿菌為主，陰道深部則以雙歧菌占優(yōu)，因此，本潔陰劑按女性正常菌群生理狀態(tài)下的分布規(guī)律，選用陰道詹氏乳桿菌LY2034株和陰道青春型雙歧菌LY2034株二聯(lián)活菌作為治療用菌種，同時補充中段和深部的菌群，混合比例為1∶1。
2.4結(jié)論1、詹氏乳桿菌及青春雙歧菌在體外對常見的陰道炎致病菌均有良好的抑殺作用。
2、根據(jù)高效低毒的原則，后續(xù)制劑處方選擇1×105CFU/片為佳。
3、根據(jù)女性生殖道的解剖和菌群分段特點，選用兩種菌的混合制劑，比例為1∶1，同時補充不同區(qū)段的菌群。
三、二聯(lián)活菌潔陰泡騰片體內(nèi)藥效學(xué)實驗(一)——治療細(xì)菌性陰道炎實驗3.1目的用三種臨床引起細(xì)菌性陰道炎的常見致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和淋球菌注入受試動物陰道建立陰道炎動物模型，觀察二聯(lián)活菌潔陰泡騰片對陰道炎的治療作用，定量評價二聯(lián)活菌制劑的藥效。
3.2材料5號頭皮針、10ml注射器、無菌石蠟油、0.2％氧氟沙星注射液(四川科倫大藥廠，產(chǎn)品批號A020216，規(guī)格為100ml)。新西蘭雌性大白兔60只，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物實驗室提供。淋球菌專用培養(yǎng)基，購自廣州樂通泰公司；甘露醇高鹽瓊脂(選擇培養(yǎng)金葡菌)；伊美紅藍(lán)瓊脂(選擇培養(yǎng)大腸桿菌)，購自中國進(jìn)出口商品檢驗技術(shù)研究所；MRS培養(yǎng)基(培養(yǎng)乳酸桿菌和雙歧桿菌)。大腸埃希氏菌臨床株菌液，配制成1.35×108CFU/ml的濃度；金黃色葡萄球菌臨床株菌液，配成1.35×108CFU/ml的濃度，淋球菌臨床株菌液，配制成6.3×106CFU/ml的濃度[1]，這些細(xì)菌均由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科提供和鑒定，上述三種致病菌等體積混合成造模菌。二聯(lián)活菌菌粉由前述實驗例2制得，輔料由中南大學(xué)藥學(xué)院提供。
3.3方法3.3.1.細(xì)菌性陰道炎模型建立[2]60只雌性新西蘭大白兔，體重1.95±0.30kg，用5號頭皮針硅膠管涂無菌石蠟油，緩慢插入大白兔陰道，插入深度約5-8cm，回抽確定在陰道內(nèi)注射造模菌液0.75ml，隨后注少許空氣確保藥液全部注入腔內(nèi)。造模第6天，隨機處死12只大白兔。取陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，陰道潔度分級；三種致病菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)做細(xì)菌學(xué)檢查；取陰道組織，固定，行組織病理學(xué)檢查。
3.3.2.動物實驗將48只陰道炎模型大白兔分成6組，每組8只，分別為低劑量治療組(7×103CFU/ml)、中劑量治療組(7×104CFU/ml)、高劑量治療組(7×105CFU/ml)、氧氟沙星組(10mg/kg)、輔料組、空白對照組[1]。每只陰道炎模型動物陰道內(nèi)注射藥液1ml，療程為5天。分別在治療前、治療后測量體重、肛溫，觀察動物生長、活動情況和外陰潔凈情況，無菌小棉簽采陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，檢查陰道潔度；三種致病菌選擇性培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)做細(xì)菌學(xué)檢查；分別處死大白兔，取陰道組織10％中性福爾馬林固定，石蠟包塊、切片、HE染色做病理學(xué)檢查。
3.3.3陰道潔度分級參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第5版統(tǒng)篇教材I級鏡下以陰道桿菌為主，并可見大量上皮細(xì)胞。
II級鏡下有部分陰道桿菌和少量膿細(xì)胞和雜菌，上皮細(xì)胞亦可見。
III級鏡下可見少量陰道桿菌和上皮細(xì)胞，伴有大量膿細(xì)胞和其它雜菌。
IV級鏡下無陰道桿菌，除有少量上皮細(xì)胞外，主要是膿細(xì)胞和大量雜菌。
3.3.4造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]1.白兔外陰外觀紅腫、流膿、潰爛為+，外陰潔凈為-。
2.陰道拭子涂片，陰道潔度分級III-IV級為+，I-II級為-。
3.選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)三種細(xì)菌均生長為+，無致病菌生長為-。
4.取陰道組織，行組織病理學(xué)檢查有充血、水腫、壞死和炎性細(xì)胞浸潤為+，無充血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤為-。
4項判斷標(biāo)準(zhǔn)有2項陽性即認(rèn)為造模成功。
3.3.5陰道炎有效和治愈標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第5版統(tǒng)篇教材1.陰道局部無充血、水腫、異常分泌物2.陰道潔度分級III-IV級，治療后恢復(fù)為II級為有效，I級定義為治愈3.致病菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)無菌生長為治愈4.病理檢查無水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤.
治愈標(biāo)準(zhǔn)陰道外觀正常，潔度I級，無致病菌生長，病理檢查正常，無充血、水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤等改變。
好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)陰道外觀由充血水腫或流膿轉(zhuǎn)變?yōu)檎?，潔度由III-IV級轉(zhuǎn)變?yōu)镮I級或I級，無或每平皿少數(shù)致病菌落，病理檢查大致正常。
3.3.6治愈率及有效率的計算治愈率(％)＝痊愈的動物數(shù)/各組總動物數(shù)×100％有效率(％)＝(好轉(zhuǎn)的動物數(shù))/各組總動物數(shù)×100％3.4結(jié)果3.4.1雌兔陰道炎造模結(jié)果3.4.1.1雌兔陰道炎造模檢測造模第6天，觀察動物外陰外觀，隨機處死12只動物進(jìn)行包括陰道潔凈度分級，細(xì)菌學(xué)檢測。陰道組織病理學(xué)檢查，以評判造模是否成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處死的12只雌兔全部造模成功，表現(xiàn)為陰道外觀有不同程度的紅腫，分泌物異常，潔度III-IV級；細(xì)菌學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)致病菌；病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)陰道粘膜充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤。建模成功率100％。見表8表8 12只人工制造的大白兔陰道炎模型檢測結(jié)果

表中“+、-”符號為根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)所得。數(shù)字為動物編號。
3.4.1.2用于治療觀察的48只動物陰道分泌物檢測陰道分泌物革蘭氏染色檢查。結(jié)果顯示，治療前動物的陰道潔凈度均為III級和IV級，其中III級28只動物，IV級20只動物，符合陰道炎的診斷。證明未處死48只動物也形成了陰道炎，部分受試動物的陰道分泌物涂片鏡下照片，可見大量膿球.。
3.4.2治療前后陰道潔度與療效通過陰道拭子涂片，革蘭氏染色結(jié)果，治療前陰道分泌液中見大量膿球和致病菌，無Gram’s陽性的桿菌，治療第6天鏡下觀，中、高劑量涂片未見膿菌和致病菌，可見陰道桿菌。低劑量組，膿球明顯減少，上皮細(xì)胞產(chǎn)生，致病菌減少；而氧氟沙星組鏡下比較干凈，無膿球和致病菌，也無Gram’s陽性的桿菌。
根據(jù)臨床診斷細(xì)菌性陰道炎常用的檢測方法，陰道分泌液革蘭氏染色檢查。結(jié)果顯示如表9所示，治療前動物的陰道潔凈度均為III級和IV級，符合陰道的診斷。用低劑量的二聯(lián)活菌制劑亦取得一定的治療效果，治愈率達(dá)到50％，III級和IV級的潔度轉(zhuǎn)為I-II級潔凈度，有效率100％，中、高劑量的二聯(lián)活菌制劑與氧氟沙星療效相近，可達(dá)到88％治愈率和100％的有效率。輔料組和空白對照組無效，僅有12.5％動物自然好轉(zhuǎn)，無痊愈的動物。療效結(jié)果說明，二聯(lián)活菌制療效較為肯定，量的角度分析，中劑量足以達(dá)到治療效果。
表9治療前后陰道潔凈度變化和療效

表內(nèi)數(shù)字為動物數(shù)，有效率和治愈率根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)計算所得。
統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法，陰道潔度變化和療效高劑量組、中劑量組、氧氟沙星組無差異(p＞0.10)，但與輔料組、空白對照組有顯著性差異(p＜0.025)3.4.3細(xì)菌學(xué)檢測3.4.3.1造模后三種致病菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)取陰道拭子在三種致病菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，處死的12只動物陰道拭子涂皿均發(fā)現(xiàn)三種選擇性培養(yǎng)基上均有大量成片菌落生長，說明陰道炎模型動物是與三種致病菌有關(guān)。
3.4.3.2細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢測，在上述三種選擇性培養(yǎng)基上挑單克隆涂片，Gram’s染色，鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，以便從形態(tài)學(xué)鑒定克隆中的細(xì)菌。結(jié)果分別顯示，可見大量革蘭氏陰性桿菌、大量革蘭氏陽性葡萄球菌和大量革蘭氏陰性雙球菌，從形態(tài)學(xué)的角度，與選擇性培養(yǎng)基的目標(biāo)吻合，進(jìn)一步證明致動物陰道炎模型的三種致病菌存在于動物的陰道內(nèi)。
3.4.4治療前后一般情況3.4.4.1治療前后受試動物一般情況和體重變化進(jìn)入試驗的所有48號動物自造模至治療的全過程存活，無一號死亡。受試動物均生長良好，活動自如，毛發(fā)見全身光滑。治療前后體重各組均稍有增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異。各組間動物體重增加也無統(tǒng)計學(xué)意義，間接說明二聯(lián)活菌潔陰劑對受試動物無明顯的毒性影響，結(jié)果見表10。
表10造模前后體重的變化(kg，X±SD)


★統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss統(tǒng)計軟件采用one-wayANOVA分析，各組間治療前后體重?zé)o顯著差異(p＞0.05)3.4.4.2治療前后動物體溫變化因為本實驗?zāi)Ｐ褪羌?xì)菌性陰道炎。體溫的變化對判斷炎癥性疾病程度，發(fā)生，發(fā)展具有一定意義。表11所示為48號受試動物治療前后的變化。無論是在炎癥發(fā)展的高峰期和治愈后，受試動物體溫?zé)o明顯變化。說明受試動物對致病菌所致陰道炎癥，體溫變化不明顯。為說明該現(xiàn)象，本試驗測定20號健康新西蘭大白兔肛門與受試動物體溫接近，平均為39.5℃左右。
表11造模前后體溫的變化(℃，X±SD)

★統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss統(tǒng)計軟件采用one-wayANOVA分析，各組間治療前后體溫?zé)o顯著差異(P＞0.05)3.4.5治療前后受試動物外陰情況治療前陰道炎模型動物外陰，都有不同程度的充血，水腫，部分有膿性分泌物，少數(shù)有糜爛現(xiàn)象。治療后除輔料及空白對照組動物外陰輕度充血水腫外，二聯(lián)活菌制劑和氧氟沙星治療組動物外陰均恢復(fù)正常的外觀粉紅色，干凈無分泌物。
3.4.6細(xì)菌學(xué)檢查3.4.6.1.二聯(lián)活菌潔陰劑治療后陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測.
在注入致病菌造模成功的基礎(chǔ)上，為觀察二聯(lián)活菌潔陰劑的抑殺菌效果，用三種致病菌的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)入陰道分泌物涂片培養(yǎng)，予以檢查是否有效的抑殺了致病菌達(dá)到了治療目的.又因為陰道內(nèi)的正常菌群大部分為厭氧菌，有報道稱之為陰道桿菌，本試驗采用培養(yǎng)二聯(lián)活菌的MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，觀察是否存在菌群失調(diào)，和治療后菌群失調(diào)能否得到糾正。
觀察結(jié)果表明高劑量組和氧氟沙星有強大的抑殺致病菌的作用，未培養(yǎng)出致病菌。二聯(lián)活菌潔陰劑可重建動物的正常陰道菌群，而氧氟沙星無此作用。低劑量的二聯(lián)活菌制劑甚有明顯抑殺菌作用，致病菌落明顯減少。且有重建陰道內(nèi)正常菌群的作用，對照組動物陰道內(nèi)仍有大量的致病菌存活，無厭氧菌。說明發(fā)生陰道炎后正常陰道內(nèi)菌群微生態(tài)環(huán)境遭到了破壞。
3.4.6.2.細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定。
為了明確選擇培養(yǎng)基所能培養(yǎng)的菌群為相應(yīng)的致病菌。取克隆鏡檢觀察，結(jié)果顯示，細(xì)菌學(xué)的形態(tài)與相應(yīng)選擇培養(yǎng)基的目的相符。分別顯示，可見大量革蘭氏陽性葡萄球菌、革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏陰性雙球菌、量桿狀和短棒狀厭氧菌。
3.4.6.3.二聯(lián)活菌潔陰劑治療后受試動物陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測。
為全面評估二聯(lián)活菌潔陰劑治療陰道炎的機制。取所有各組受試動物陰道分泌物，用選擇性培養(yǎng)基對致病菌進(jìn)行檢測，以便證明二聯(lián)活菌制劑的治療效果是通過抑殺致病菌或其他機理。同時用MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)陰道炎正常菌群，以證明陰道炎動物存在菌群失調(diào)。二聯(lián)活菌制劑治療后能否達(dá)到重建陰道內(nèi)菌群失調(diào)的目的。表12結(jié)果表明二聯(lián)活菌制劑和氧氟沙星局部用藥能有效地抑殺陰道內(nèi)致病菌。以氧氟沙星作用最強。二聯(lián)活菌潔陰劑的抑殺菌作用與劑量有關(guān)，中高劑量效果最好。空白和輔料無抑殺菌作用。從中可以看出陰道炎模型動物陰道內(nèi)存在菌群失調(diào)。用二聯(lián)活菌潔陰劑可重建或糾正陰道炎模型動物陰道內(nèi)的菌群失調(diào)。
表12治療第六天陰道拭子培養(yǎng)48小時后有菌落生長的平皿數(shù)

表內(nèi)數(shù)字為平皿數(shù)，+為有菌生長，-為無菌生長。
治療后，陰道拭子在4種選擇性培養(yǎng)基上劃皿培養(yǎng)48小時，空白對照組和輔料組仍有大量雜菌生長，幾乎沒有厭氧菌生長.中高劑量組幾乎沒有致病菌生長，有大量厭氧菌生長.氧氟沙星組幾乎沒有致病菌生長也沒有厭氧菌生長.*p＜0.05與空白對照組，輔料組比較，+p＜0.05與空白對照組，輔料組，氧氟沙星組比較，統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法分析。
3.4.7受試動物治療后的病理學(xué)變化治療各組的陰道粘膜外觀光滑，無潰瘍及糜爛，結(jié)構(gòu)清楚。治療組中，低劑量組二只動物陰道內(nèi)可見稍有粘稠的分泌物，空白對照組及輔料組各一只動物陰道不充血水腫，其余都可見不同程度的充血水腫及分泌物增多，粘稠。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)中，高劑量的二聯(lián)活菌制劑治療的動物，組織病理學(xué)無異常。低劑量組2號動物陰道組織見充血伴水腫。對照組動物見明顯的鏡下充血，水腫，并有5只動物伴炎性細(xì)胞浸潤(如表13)。
表13治療后陰道炎模型陰道組織病理學(xué)改變

◆表中數(shù)字為病理學(xué)異常例數(shù)，每組動物數(shù)為8只。造模第5天陰道組織鏡下觀，有充血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤；治療第6天陰道組織鏡下觀，充血、水腫明顯減輕，未見炎性細(xì)胞浸潤，無糜爛，高劑量組、中劑量組、氧氟沙星組無差異，但與輔料組、空白對照組有顯著性差異(p＜0.05)，統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用X2檢驗方法分析。
3.5結(jié)果分析在體外有效性試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，觀察二聯(lián)活菌制劑治療陰道炎動物模型的效果。用三種致病菌直接注入新西蘭大白兔陰道內(nèi)，能成功地制備出陰道炎動物模型。從外觀、陰道分泌物檢測、細(xì)菌學(xué)檢測及陰道組織病理學(xué)檢查證明了動物陰道炎的存在，其特點為陰道分泌物膿球是主要指標(biāo)，能很好地反映陰道炎的存在，與現(xiàn)行的臨床診斷吻合。組織病理學(xué)以充血水腫為主的非特異性改變。細(xì)菌學(xué)檢測有一定的意義。從陰道分泌物涂片和空白治療組厭氧菌培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)正常菌，證明陰道炎發(fā)生后陰道內(nèi)存在菌群失調(diào)，即致病菌可抑殺陰道內(nèi)正常菌。
用二聯(lián)活菌制劑治療后，陰道外觀的紅腫及分泌物減少至消失，恢復(fù)正常外觀。將臨床用于檢測潔凈度判斷炎癥的方法發(fā)現(xiàn)，治療后的動物模型陰道分泌物明顯好轉(zhuǎn)，幾乎均有朝潔凈方向發(fā)展。中、高劑量組療效顯著，治愈率88％，明顯優(yōu)于輔料組及空白對照組，與氧氟沙星的治療效果接近。從陰道涂片和致病菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果說明，氧氟沙星治療效果盡管很明顯，鏡下分泌物潔凈且無細(xì)菌的痕跡，達(dá)到了治療目標(biāo)，同時也留下了菌群失調(diào)潛在隱患?？蓪?dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)或重新感染。從空白對照組和輔料對照組的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，致病菌引起的陰道炎可導(dǎo)致引道內(nèi)正常菌群破壞。二聯(lián)活菌潔陰劑治療原理是糾正菌群失調(diào)，補充正常菌來達(dá)到的。因此，結(jié)果顯示中、高劑量二聯(lián)活菌劑在達(dá)到治療效果的同時，保持和重建了陰道內(nèi)正常菌群微環(huán)境是本制劑的主要優(yōu)勢。
3.6結(jié)論1、二聯(lián)活菌潔陰劑具有治療細(xì)菌性陰道炎的肯定療效。與氧氟沙星局部用藥效果接近，治愈率為88％。劑量為中等劑量(7×104CFU/ml)為好。
2、二聯(lián)活菌潔陰泡騰片治療陰道炎的作用機理是通過建立正常菌群抑殺致病菌達(dá)到的。
3、二聯(lián)活菌潔陰泡騰片具有維持或重建陰道內(nèi)正常菌群微生態(tài)環(huán)境的作用。
參考文獻(xiàn)[1]徐叔云，卞如濂，陳修，《藥理實驗方法學(xué)》，人民衛(wèi)生出版社，2002年版[2]施新猷，《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》，北京，人民軍醫(yī)出版社，2000年版四、二聯(lián)活菌潔陰泡騰片體內(nèi)藥效學(xué)實驗(二)——治療霉菌性陰道炎和淋病性陰道炎實驗4.1材料5號頭皮針、10ml注射器、無菌石蠟油。淋必治(2g，批號020601山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))。氟康唑注射液(100ml，0.2g，批號020203025上海華源制藥股份有限公司生產(chǎn))。雌性新西蘭大白兔72只，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物實驗室提供。淋球菌專用培養(yǎng)基，購自廣州樂通泰公司；玫瑰紅鈉瓊脂(培養(yǎng)白色念珠菌)購自中國進(jìn)出口商品檢驗技術(shù)研究所(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；MRS培養(yǎng)基(培養(yǎng)乳酸桿菌和雙歧桿菌)。白色念珠菌臨床株菌液(3.6×107CFU/ml)，淋球菌臨床株菌液(6.3×106CFU/ml)[3]，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗科提供和鑒定。二聯(lián)活菌菌粉按前述實驗例2制備，輔料由中南大學(xué)藥學(xué)院提供。
4.2方法4.2.1.霉菌性和淋病性陰道炎模型建立72只雌性新西蘭大白兔，隨機分成2組，每組36只，一組陰道內(nèi)注射白色念珠菌液造模，另一組注射淋球菌液造模。用5號頭皮針硅膠管涂無菌石蠟油，緩慢插入大白兔陰道，插入深度約5-8cm，回抽確定在陰道內(nèi)注射相應(yīng)造模菌液0.25ml，白色念珠菌液濃度3.6×107CFU/ml淋球菌液濃度6.3×106CFU/m，造模第6天，每組隨機處死6只大白兔。做陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，陰道潔度分級，二種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測。取陰道組織，10％中性福爾馬林固定，行組織病理學(xué)檢查。
4.2.2.動物實驗將30只白色念珠菌陰道炎模型大白兔隨機分成5組，每組6只，分別為低劑量治療組(7×103CFU/ml)、中劑量治療組(7×104CFU/ml)、高劑量治療組(7×105CFU/ml)、氟康唑組(14mg/kg)、生理鹽水對照組[2]。將30只淋病性陰道炎模型大白兔隨機分成5組，每組6只，分別為低劑量治療組(7×103CFU/ml)、中劑量治療組(7×104CFU/ml)、高劑量治療組(7×105CFU/ml)、淋必治組(140mg/kg)、生理鹽水對照組，每只陰道炎模型動物陰道內(nèi)注射藥液1ml。隨后注射少量空氣以確保藥液進(jìn)入腔內(nèi)，治療7天。分別在治療前、治療后觀察動物生長、活動情況和外陰潔凈情況，無菌小棉簽取陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，檢查陰道潔度；選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測；分別處死大白兔，取陰道組織10％中性福爾馬林固定，石蠟包塊、切片、HE染色行病理學(xué)檢查。
4.3結(jié)果4.3.1雌兔陰道炎建模結(jié)果4.3.1.1處死的12只雌兔陰道炎造模結(jié)果造模后第6天，隨機處死12只大白兔，觀察外陰外觀，做陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，陰道潔度分級，細(xì)菌學(xué)檢測。取陰道組織行病理學(xué)檢查，以評判造模是否成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處死的12只雌兔全部造模成功，表現(xiàn)為陰道外觀有不同程度的紅腫，分泌物異常，潔度III-IV級，陰道粘膜充血，水腫。結(jié)果表明大白兔全部造模成功，成功率100％，見表14。
表14 12只大白兔造模成功判斷結(jié)果

表中“+”號為根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)所得。數(shù)字為動物編號。
5、9、20、26、31、36號為白色念珠菌造模組，42、45、53、60、69、71淋球菌造模組。
4.3.1.2未處死60只動物陰道分泌物涂片陰道分泌物革蘭氏染色檢查。結(jié)果顯示，治療前動物的陰道潔凈度均為III級和IV級，其中III級29只動物，IV級31只動物，符合陰道炎的診斷。證明未處死60只動物也造模成功。
4.3.2治療前后陰道潔度的變化4.3.2.1受試動物陰道拭子涂片革蘭氏染色鏡下檢測治療前白色念珠菌和淋球菌動物模型陰道分泌液中見大量膿球充斥于視野。氟康唑治療后白色念珠菌動物模型和淋必治治療后淋球菌動物模型陰道分泌物無膿球，視野比較干凈。中、高劑量的二聯(lián)活菌制劑治療的淋球菌性和白色念珠菌性陰道炎動物模型陰道分泌物大部分無膿球，治療組各一例可見少許膿球。低劑量組二聯(lián)活菌制劑治療組，白色念珠菌組2例，淋球菌組3例陰道分泌物可見少許膿球。
其中，白色念珠菌造模組治療前后動物陰道拭子檢查造模第5天取陰道拭子涂片，可見大量膿球和致病菌；氟康唑組未見膿球和致病菌，上皮細(xì)胞產(chǎn)生；高劑量組治療后第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；中劑量組治療后第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；生理鹽水組治療后第8天，可見膿球及致病菌，未見陰道桿狀菌。
淋球菌造模組治療前后動物陰道拭子檢查造模第5天取陰道拭子涂片，可見大量膿球和致病菌；B為淋必治治療組，未見膿球和致病菌，可見上皮細(xì)胞產(chǎn)生；高劑量組治療第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；中劑量組治療第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；生理鹽水組治療第8天，可見膿球及致病菌，未見陰道桿狀菌。
4.3.2.2二聯(lián)活菌潔陰劑治療白色念珠菌陰道炎動物陰道潔度和療效結(jié)果顯示，以氟康唑的療效最好，有效率和治愈率達(dá)100％。二聯(lián)活菌潔陰劑療效肯定，有效率甚達(dá)100％，以陰道潔度為標(biāo)準(zhǔn)的治愈率為83％，較氟康唑的療效差。低劑量治療組的治愈率甚達(dá)66％。二聯(lián)活菌制劑各治療組均優(yōu)于生理鹽水組，有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果如表15。
表15白色念珠菌造模組治療前后陰道潔度變化和療效

表內(nèi)數(shù)字為動物數(shù)，有效率和治愈率根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)計算所得。
統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法，陰道潔度變化和療效高劑量組、中劑量組、氟康唑組無差異(0.25＞p＞0.10)，但與輔料組、空白對照組有顯著性差異(0.025＞p＞0.01)4.3.2.3二聯(lián)活菌潔陰劑治療淋病性陰道炎陰道潔度和療效。
如表16結(jié)果所示，淋球菌性陰道炎以以淋必治的療效最好，有效率和治愈率達(dá)100％。二聯(lián)活菌潔陰劑療效肯定，有效率甚達(dá)100％，以陰道潔度為標(biāo)準(zhǔn)的治愈率為83％，較淋必治的療效差。低劑量治療組的治愈率甚達(dá)66％。二聯(lián)活菌制劑各治療組均優(yōu)于生理鹽水治療組，有統(tǒng)計學(xué)意義。
表16淋球菌造模組治療前后陰道潔度變化和療效

表內(nèi)數(shù)字為動物數(shù)，有效率和治愈率根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)計算所得。
統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法，高劑量、中劑量、淋必治對淋病性陰道炎療效無差異(p＞0.10)，但與低劑量組、生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.025)。
4.3.3細(xì)菌學(xué)檢測造模動物致病菌檢查白色念珠菌造模組取陰道拭子在玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上涂皿，培養(yǎng)48小時，有大量菌落生長，說明陰道炎模型動物是與白色念珠菌有關(guān)，造模成功；而MRS培養(yǎng)基，未見活菌生長。
淋球菌造模組取陰道拭子在淋球菌專用培養(yǎng)基上涂皿，培養(yǎng)48小時，發(fā)現(xiàn)有大量菌落生長，說明陰道炎模型動物是與淋球菌有關(guān)，造模成功；而MRS培養(yǎng)基，未見活菌生長。
細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢測在上述兩種選擇性培養(yǎng)基上挑單克隆涂片，Gram’s染色，鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。對應(yīng)可見大量革蘭氏陽性球菌及革蘭氏陰性雙球菌。
4.3.4治療前后動物一般情況和外陰外觀實驗動物生長良好，活動自如，毛發(fā)貼身光滑，造模前外陰干凈，無紅腫，無膿性分泌物，造模第5天觀察，實驗動物均不同程度出現(xiàn)外陰紅腫，有膿性分泌物，其中42號、44號、57號動物見潰爛，經(jīng)過5天不同劑量藥物治療后，高、中劑量組和氟康唑組、淋必治組治療后動物外陰紅腫均消失，膿性分泌物明顯減少。低劑量組治療后外陰無充血水腫，生理鹽水組治療后動物外陰有充血水腫。
4.3.5治療后細(xì)菌學(xué)檢測4.3.5.1霉菌性陰道炎模型治療后細(xì)菌學(xué)檢測二聯(lián)活菌制劑治療白色念珠菌性陰道炎受試動物后，陰道分泌物中白色念珠菌和厭氧菌檢測結(jié)果如表17，氟康唑能有效殺滅白色念珠菌，用玫瑰紅鈉瓊脂選擇性培養(yǎng)，氟康唑治療組所有6只動物陰道分泌物中均未發(fā)現(xiàn)有白色念珠菌，高、中劑量的二聯(lián)活菌制劑治療組有5只動物陰道分泌物中均未發(fā)現(xiàn)有白色念珠菌，說明二聯(lián)活菌潔陰劑有肯定的抑殺白色念珠菌的作用。低劑量組的二聯(lián)活菌制劑有4只動物陰道分泌物中均未發(fā)現(xiàn)有白色念珠菌生長，進(jìn)一步說明該制劑有明顯抑殺白色念珠菌的作用。而生理鹽水治療組均可培養(yǎng)出白色念珠菌。用厭氧菌MRS相對選擇培養(yǎng)二聯(lián)活菌，表17結(jié)果顯示，氟康唑治療組未培養(yǎng)出二聯(lián)活菌，而各劑量的二聯(lián)活菌治療組均可培養(yǎng)出厭氧的二聯(lián)活菌。同時各劑量組厭氧培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，高、中劑量組各1例，低劑量組2例培養(yǎng)皿中出現(xiàn)白色念珠菌生長，生理鹽水治療組可發(fā)現(xiàn)大量白色念珠菌生長。
表17治療后陰道拭子白色念珠菌和厭氧菌有菌落生長的平皿數(shù) 表內(nèi)數(shù)字為平皿數(shù)，+為有菌生長，-為無菌生長。
雌性白兔治療第8天，陰道拭子在3種選擇性培養(yǎng)基上劃皿培養(yǎng)48小時，發(fā)現(xiàn)生理鹽水組仍有大量致病菌生長，幾乎沒有厭氧菌生長，而中高劑量組幾乎沒有致病菌生長，但有大量厭氧菌生長，氟康唑組幾乎沒有致病菌生長也，沒有厭氧菌生長.▲vs●中、高劑量組和氟康唑組抑菌顯著，明顯優(yōu)于生理鹽水組，■vs★中、高劑量組厭氧菌平皿數(shù)明顯多于氟康唑組，統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法分析，高劑量組、中劑量組、氟康唑組無差異(0.25＞p＞0.10)，與生理鹽水組有顯著性差異(0.025＞p＞0.01)。
4.3.5.2二聯(lián)活菌潔陰劑治療后陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測在注入致病菌造模成功的基礎(chǔ)上，為觀察二聯(lián)活菌潔陰劑的抑殺菌效果，用玫瑰紅鈉瓊脂選擇性培養(yǎng)基將陰道分泌物涂片培養(yǎng)，予以檢查是否有效的抑殺了致病菌達(dá)到了治療目的.又因為陰道內(nèi)的正常菌群大部分為厭氧菌，有報道稱之為陰道桿菌，本試驗采用培養(yǎng)二聯(lián)活菌的MRS培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，觀察是否存在菌群失調(diào)，和治療后菌群失調(diào)能否得到糾正。高劑量組和氟康唑有強大的抑殺致病菌的作用，未培養(yǎng)出致病菌。二聯(lián)活菌潔陰劑可重建動物的正常陰道菌群，而氟康唑無此作用。低劑量的二聯(lián)活菌制劑甚有明顯抑殺菌作用，致病菌落明顯減少。且有重建陰道內(nèi)正常菌群的作用，對照組動物陰道內(nèi)仍有大量的致病菌存活，無厭氧菌。說明發(fā)生陰道炎后正常陰道內(nèi)菌群微生態(tài)環(huán)境遭到了破壞。
4.3.5.3淋病性陰道炎模型治療后細(xì)菌學(xué)檢測二聯(lián)活菌制劑治療淋球菌性陰道炎受試動物后，陰道分泌物中淋球菌和厭氧菌檢測結(jié)果如表18，淋必治能有效殺滅淋球菌，用淋球菌專用培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，淋必治治療組所有6只動物陰道分泌物中均未發(fā)現(xiàn)有淋球菌，高、中劑量的二聯(lián)活菌制劑治療組有5只動物陰道分泌物中均未發(fā)現(xiàn)有淋球菌，說明二聯(lián)活菌潔陰劑有肯定的抑殺淋球菌的作用。低劑量組的二聯(lián)活菌制劑有4只動物陰道分泌物中均未發(fā)現(xiàn)有淋球菌生長，進(jìn)一步說明該制劑有明顯抑殺淋球菌的作用。而生理鹽水治療組均可培養(yǎng)出淋球菌。用厭氧菌MRS相對選擇培養(yǎng)二聯(lián)活菌，表18結(jié)果顯示，淋必治治療組未培養(yǎng)出二聯(lián)活菌，而各劑量的二聯(lián)活菌治療組均可培養(yǎng)出厭氧的二聯(lián)活菌。同時各劑量組厭氧培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，高、中劑量組各1例，低劑量組2例培養(yǎng)皿中出現(xiàn)淋球菌生長，生理鹽水治療組可發(fā)現(xiàn)大量淋球菌生長。
表18治療第八天陰道拭子培養(yǎng)48小時后有菌落生長的平皿數(shù) 表內(nèi)數(shù)字為平皿數(shù)，+為有菌生長，-為無菌生長。
雌性白兔治療第8天，陰道拭子在3種選擇性培養(yǎng)基上劃皿培養(yǎng)48小時，發(fā)現(xiàn)生理鹽水組仍有大量致病菌生長，幾乎沒有厭氧菌生長，而中高劑量組幾乎沒有致病菌生長，但有大量厭氧菌生長，淋必治組幾乎沒有致病菌生長也，沒有厭氧菌生長.▲vs●中、高劑量組和淋必治組抑菌顯著，明顯優(yōu)于生理鹽水組，■vs★中、高劑量組厭氧菌平皿數(shù)明顯多于淋必治組，與生理鹽水組有顯著性差異，統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法分析。高劑量組、中劑量組、淋必治組無差異(0.25＞p＞0.10)，與生理鹽水組有顯著性差異(0.025＞p＞0.01)。
4.3.5.4二聯(lián)活菌潔陰劑治療后陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測在注入致病菌造模成功的基礎(chǔ)上，為觀察二聯(lián)活菌潔陰劑的抑殺菌效果，用淋球菌專用選擇性培養(yǎng)基將陰道分泌物涂片培養(yǎng)，予以檢查是否有效的抑殺了致病菌達(dá)到了治療目的，觀察是否存在菌群失調(diào)，和治療后菌群失調(diào)能否得到糾正。高劑量組和淋必治有強大的抑殺致病菌的作用，未培養(yǎng)出致病菌。二聯(lián)活菌潔陰劑可重建動物的正常陰道菌群，而淋必治無此作用。低劑量的二聯(lián)活菌制劑甚有明顯抑殺菌作用，致病菌落明顯減少。且有重建陰道內(nèi)正常菌群的作用，對照組動物陰道內(nèi)仍有大量的致病菌存活，無厭氧菌。說明發(fā)生陰道炎后正常陰道內(nèi)菌群微生態(tài)環(huán)境遭到了破壞。
4.3.6.受試動物組織病理學(xué)檢測4.3.6.1.二聯(lián)活菌制劑治療白色念珠菌所致陰道炎的組織病理學(xué)變化。
表19的結(jié)果顯示，中高劑量二聯(lián)活菌制劑和氟康唑治療組，陰道組織外觀無充血水腫，光滑，組織學(xué)檢查其無充血，水腫及炎性細(xì)胞浸潤。低劑量治療組有一例外觀輕度充血改變，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)1例充血，水腫伴少許炎性細(xì)胞浸潤，1例鏡下充血水腫。生理鹽水。6例外觀均有充血水腫。其中3例鏡下僅見充血水腫無炎性細(xì)胞浸潤。另3例不僅粘膜充血水腫伴有炎性細(xì)胞均潤。
表19白色念珠菌造模組白兔治療后陰道組織病理改變

◆表中數(shù)字為病理學(xué)異常例數(shù)，每組動物數(shù)為6只白色念珠菌造模組治療第8天陰道組織鏡下觀，充血、水腫明顯減輕，未見炎性細(xì)胞浸潤，統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用X2檢驗方法分析，高劑量組、中劑量、淋必治組無差異，但與生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.05)4.3.6.2二聯(lián)活菌制劑治療淋球菌所致陰道炎的組織病理學(xué)變化表20的結(jié)果顯示，中高劑量二聯(lián)活菌制劑和淋必治治療組，陰道組織外觀無充血水腫，光滑，組織學(xué)檢查其無充血，水腫及炎性細(xì)胞浸潤。低劑量治療組有一例外觀輕度充血改變，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)1例充血，水腫伴少許炎性細(xì)胞浸潤，1例鏡下充血水腫。生理鹽水6例外觀均有充血水腫。其中3例鏡下僅見充血水腫無炎性細(xì)胞浸潤。另3例不僅粘膜充血水腫伴有炎性細(xì)胞浸潤。
表20淋球菌造模組白兔治療后陰道組織病理改變

◆表中數(shù)字為病理學(xué)異常例數(shù)，每組動物數(shù)為6只淋球菌造模組治療第8天陰道組織鏡下觀，充血、水腫明顯減輕，未見炎性細(xì)胞浸潤，無糜爛，統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用spss軟件采用X2檢驗方法分析，高劑量組、中劑量、淋必治組無差異，但與生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.05)4.4結(jié)果分析用兩種致病菌直接注入新西蘭大白兔陰道內(nèi)，能成功地制備出霉菌性陰道炎和淋菌性陰道炎動物模型，從外觀，陰道分泌物檢測，細(xì)菌學(xué)檢測，陰道組織病理學(xué)檢查證明了動物陰道炎的存在，其特點為陰道分泌物膿球是主要指標(biāo)，能很好地反映陰道炎的存在，與現(xiàn)行的臨床診斷吻合。組織病理學(xué)以充血水腫明顯的非特異性改變。細(xì)菌學(xué)檢測有一定的意義。同時也發(fā)現(xiàn)陰道炎發(fā)生后陰道內(nèi)存在菌群失調(diào)。
經(jīng)過從受試動物的一般情況，陰道外觀模擬臨床檢測的陰道分泌物潔度，致病菌和正常菌群的細(xì)菌學(xué)檢測，組織病理學(xué)等多項檢查，全面評價二聯(lián)活菌制劑的療效。結(jié)果表明，二聯(lián)活菌制劑能有效地治療白色念珠菌和淋球菌所致的陰道炎，中高劑量的治愈率均達(dá)到了80％以上。與臨床主要治療藥物氟康唑和淋必治的療效接近。從細(xì)菌學(xué)檢測的角度，二聯(lián)活菌潔陰劑有明顯的抑制白色念珠菌和淋球菌的作用。中高劑量的效果與氟康唑和淋必治的抑殺菌效果接近。氟康唑和淋必治抑殺白色念珠菌和淋球菌的能力強于二聯(lián)活菌制劑。重要的是，二聯(lián)活菌潔陰劑在產(chǎn)生有效治療作用的基礎(chǔ)上，可以糾正陰道內(nèi)的微生態(tài)失衡，建立正常菌群微環(huán)境。對預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)或再感染可產(chǎn)生積極的作用。而氟康唑和淋必治盡管治療效果和抑殺菌作用療效肯定，同時也留下了陰道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境失衡的隱患。該階段是易于再感染和復(fù)發(fā)的時段。再者，氟康唑和淋必治為化學(xué)藥物作用時間短。而二聯(lián)活菌制劑重建的陰道內(nèi)正常菌群可以繼續(xù)發(fā)揮治療作用。其次，氟康唑和淋必治在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其有明顯副作用，尤其對某些哺乳期女性應(yīng)用受到限制，這些也正是二聯(lián)活菌潔陰劑的優(yōu)勢所在。
4.5結(jié)論1，二聯(lián)活菌潔陰劑治療淋菌性陰道炎的療效接近于淋必治。抑殺淋球菌的效果稍遜于淋必治，用量以中劑量適用于臨床治療。
2，二聯(lián)活菌潔陰劑治療白念性陰道炎療效接近于氟康唑。抑殺白念的效果比氟康唑差。中等劑量適合為推薦量。
3，二聯(lián)活菌潔陰劑具明顯的重建陰道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，補充正常菌群糾正菌群失調(diào)是其突出優(yōu)點。
參考文獻(xiàn)[1]何曉青衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗[C]，北京新華社出版，1989。
徐叔云，卞如濂，陳修，《藥理實驗方法學(xué)》，人民衛(wèi)生出版社，2002年版[3]施新猷，《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》，北京，人民軍醫(yī)出版社，2000年版。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于含有治療有效量的鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌，適量的酸、堿以及藥物學(xué)可接受載體，所述適量的酸、堿使其混合后的藥物組合物PH值為3.75-5.3。
2.權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的PH值為4～5。
3.權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述酸是檸檬酸、酒石酸、富馬酸或己二酸。
4.權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述堿是碳酸鈉或碳酸氫鈉。
5.權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉。
6.權(quán)利要求5所述藥物組合物，其特征在于按重量百分比計，所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.8∶1～1.4∶1。
7.權(quán)利要求6所述藥物組合物，其特征在于所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.9∶1～1.2∶1。
8.權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述藥物學(xué)可接受載體包括填充劑和粘合劑。
9.權(quán)利要求8所述藥物組合物，其特征在于所述藥物學(xué)可接受載體還包括干燥粘合劑。
10.權(quán)利要求9所述藥物組合物，其特征在于所述藥物學(xué)可接受載體還包括崩解劑。
11.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物制劑中鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的活菌數(shù)含量不低于1×102CFU/克。
12.權(quán)利要求11所述藥物組合物，其特征在于所述藥物制劑中鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的活菌數(shù)含量為1×104CFU/克～1×107CFU/克。
13.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道炎藥物中的用途。
14.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的用途。
15.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療霉菌性陰道炎藥物中的用途。
16.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療淋病性陰道炎藥物中的用途。
17.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除大腸埃希氏菌藥物中的用途。
18.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除金黃色葡萄球菌藥物中的用途。
19.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除淋球菌藥物中的用途。
20.鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除白色念珠菌藥物中的用途。
21.權(quán)利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備治療陰道炎藥物中的用途。
22.權(quán)利要求21所述藥物組合物在制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的用途。
23.權(quán)利要求21所述藥物組合物在制備治療霉菌性陰道炎藥物中的用途。
24.權(quán)利要求21所述藥物組合物在制備治療淋病性陰道炎藥物中的用途。
25.權(quán)利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除大腸埃希氏菌藥物中的用途。
26.權(quán)利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除金黃色葡萄球菌藥物中的用途。
27.權(quán)利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除淋球菌藥物中的用途。
28.權(quán)利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除白色念珠菌藥物中的用途。
29.藥物組合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的凍干菌粉；(2)將藥物學(xué)可接受載體干燥、粉碎后與適量的酸、堿混合均勻，使其混合物的PH值為3.75-5.3；(3)將步驟(1)制得的菌粉與步驟(2)制得的混合物混合后壓制成形。
30.權(quán)利要求29所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述藥物學(xué)可接受載體包括填充劑、干燥粘合劑和粘合劑，步驟(2)進(jìn)一步包括如下步驟(2-1)將填充劑、干燥粘合劑和粘合劑干燥、粉碎后過篩；(2-2)將酸、填充劑、堿、干燥粘合劑攪拌混合均勻；(2-3)向步驟(5)中加入粘合劑，制得混合物軟材；(2-4)將混合物軟材制粒并烘干，制得步驟(2)中所述的混合物。
31.權(quán)利要求30所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述步驟(3)是先將步驟(1)制得的菌粉與一填充劑混合研勻分散后再與混合物混合后壓制成形。
32.權(quán)利要求29-31任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述酸是檸檬酸、酒石酸、富馬酸或己二酸。
33.權(quán)利要求29-31任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述堿是碳酸鈉或碳酸氫鈉。
34.權(quán)利要求29-31任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉。
35.權(quán)利要求34所述藥物組合物的制備方法，其特征在于按重量百分比計，所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.8∶1～1.4∶1。
36.權(quán)利要求35所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.9∶1～1.2∶1。
37.權(quán)利要求29所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述藥物學(xué)可接受載體包括填充劑乳糖、淀粉，干燥粘合劑、填充劑維晶纖維素，崩解劑、干燥粘合劑低取代羥丙基纖維素，粘合劑5％PVPK30乙醇溶液(95％)，所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉，步驟(2)進(jìn)一步包括如下步驟(2-1)將稱量的酒石酸加入淀粉攪拌混合，再將稱量的碳酸氫鈉和乳糖加入并混合均勻；(2-2)在步驟(2-1)中再加入維晶纖維素和低取代羥丙基纖維素混合均勻后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合劑，制軟材；(2-3)將軟材在制粒機中用制粒、烘烤，制得空白顆粒；步驟(3)進(jìn)一步包括如下步驟(3-1)將稱量的菌粉分別與適量的乳糖研勻分散；(3-2)再與空白顆粒等量遞加混合均勻，(3-3)加入潤滑劑混勻，壓制成片。
38.權(quán)利要求29-31、37任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述凍干菌粉中加入有含量為0.01％～0.1％的半胱氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，含有治療有效量的鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌，適量的酸、堿以及藥物學(xué)可接受載體，所述適量的酸、堿使其混合后的藥物組合物pH值為3.75－5.3。本發(fā)明還涉及該藥物組合物的制備方法及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，特別是制備治療細(xì)菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。通過藥效學(xué)試驗證實，當(dāng)乳酸桿菌的濃度達(dá)到一定值(1×10
文檔編號A61K9/20GK1718196SQ20041004022
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者林剛, 盧放根 申請人:湖南一泰中南醫(yī)藥研究有限公司