專利名稱：CpG DNA分子抗感染免疫制劑的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
1.生物技術(shù) 2.分子免疫學(xué)背景技術(shù)1984年，Tokunaga等人發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的DNA除了一是種遺傳物質(zhì)外，還具有抗腫瘤特性，由此揭開(kāi)了細(xì)菌DNA具有免疫刺激特性研究的新篇章，隨后，他們通過(guò)一些研究認(rèn)為這種免疫刺激特性是由具有自身互補(bǔ)回文結(jié)構(gòu)的六核苷酸所引起的。至1995年，Krieg等人發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA及某些人工合成的ODN(寡聚脫氧核苷酸)均具有免疫刺激作用，但這種作用與其是否具有回文結(jié)構(gòu)并不一定相關(guān)，而是與這些DNA中具有的非甲基化的CpG結(jié)構(gòu)單元(motif)密切相關(guān)，并將其定義為CpG免疫刺激序列(CpG)。
CpG序列主要存在于細(xì)菌、病毒及無(wú)脊椎動(dòng)物的基因組中，而脊椎動(dòng)物基因組中較少，且大部分是甲基化的。CpG通常有一定的結(jié)構(gòu)特征，即以CpG為核心，5′端緊接2個(gè)嘌呤堿、3′端緊接2個(gè)嘧啶堿。細(xì)菌DNA中這些未甲基化的CpG或者人工合成的含CpG的寡核苷酸(CpG-oligideoxynucleotides，CpG-ODN)在無(wú)需T細(xì)胞存在的情況惠，可直接激活B細(xì)胞，刺激B細(xì)胞分泌免疫球蛋白及IL-6。其產(chǎn)生的抗體呈非抗原性異性，細(xì)菌DNA誘導(dǎo)小鼠B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體不僅能同細(xì)菌DNA發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，與其它DNA亦能發(fā)生交叉反應(yīng)。除B細(xì)胞外，CpG亦可直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞，活化CD8+T細(xì)胞并促進(jìn)其分化，誘導(dǎo)多種Th1型細(xì)胞因子如IFN、TNE、IL-1及IL-12等的分泌，這些因子進(jìn)一步激活NK細(xì)胞并分泌IFN-γ，從而產(chǎn)生溶細(xì)胞活性。
雖然細(xì)菌DNA及人工合成的CpG-ODN均有免疫刺激作用，但在某些細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，細(xì)菌DNA作用強(qiáng)于人工合成的的CpG-ODN。Stcey認(rèn)為，這可能是由于寡核苷酸比細(xì)菌DNA更容易降解，或者由于細(xì)菌DNA中不同免疫刺激序列的結(jié)合有更強(qiáng)的免疫刺激作用，或者用于大分子DNA更有效。
21世紀(jì)人類健康問(wèn)題日益突出，在以抗生素等化學(xué)藥物有效治療感染性疾病的同時(shí)，由此也產(chǎn)生了眾多藥源性疾病和細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性問(wèn)題。目前由于過(guò)度依賴抗生素控制感染性疾病，導(dǎo)致病菌耐藥性問(wèn)題。近十多年來(lái)細(xì)菌對(duì)抗生素的耐多藥、全耐藥現(xiàn)象蔓延加劇，造成許多感染性疾病難以控制，如結(jié)核桿菌、0157大腸桿菌等引起的傳染性疾病卷土重來(lái)，嚴(yán)重威脅著人類生命健康。目前迫切需要開(kāi)拓全新的抗感染技術(shù)及藥物，有效增強(qiáng)機(jī)體免疫抗感染能力，克服濫用抗生素的危害。近幾年核酸分子免疫刺激序列的出現(xiàn)，為此帶來(lái)了新的曙光。
目前，已確定CpG序列對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫激活功能主要體現(xiàn)在以下兩方面一是刺激B淋巴細(xì)胞增殖；二是激活單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致自然殺傷細(xì)胞和Th1輔助T細(xì)胞激活，引發(fā)Th1特征的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
CpG-ODN的免疫刺激活性不僅與CpG基序和分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而且具有動(dòng)物種屬特異性。目前CpG免疫刺激序列的應(yīng)用研究主要集中在基因治療、疫苗佐劑、腫瘤免疫等方面，而對(duì)其抗感染生物效應(yīng)的研究較少。新近的研究表明，CpG基序除具有免疫調(diào)節(jié)功能外，對(duì)于控制胞內(nèi)寄生細(xì)菌(李斯特菌，分支桿菌等)的感染也起重要作用，這一作用可依賴也可不依賴淋巴細(xì)胞，可望開(kāi)發(fā)作為新型抗感染的免疫調(diào)節(jié)分子藥物。
因免疫途徑和免疫方式不同，所涉及的抗原呈遞細(xì)胞、抗原呈遞方式均有不同，故可產(chǎn)生不同類型、不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答。肌內(nèi)直接注射和口服是簡(jiǎn)便且有效的兩種途徑。肌肉注射不需要額外的設(shè)備，且能在肌肉細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)外源基因，因此它不僅是免疫動(dòng)物的有效手段，而且還可應(yīng)用于基因治療?？紤]到今后應(yīng)用的簡(jiǎn)便性，口服也是一種可選的免疫方式。由于肌肉注射主要通過(guò)Th1細(xì)胞激活方式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，效率較低，需要注射的DNA劑量較大，而口服經(jīng)消化道所需的DNA量更大。因此，選擇有效的包裹方式將抗感染DNA制劑靶向投遞到抗原提呈細(xì)胞，以誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，在應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑防治傳染性疾病中至關(guān)重要。殼聚糖是天然生物多糖甲殼質(zhì)的脫乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被體內(nèi)多種酶類降解、降解產(chǎn)物安全無(wú)毒，并能被生物體完全吸收；而且由于其具有獨(dú)特的聚陽(yáng)離子特性，已有的研究結(jié)果顯示它是一種具有很大潛力的緩釋材料。近年來(lái)，在基因轉(zhuǎn)染表達(dá)研究領(lǐng)域已出現(xiàn)了基于殼聚糖的納米顆粒系統(tǒng)。大量研究表明，殼聚糖可包裹濃縮DNA，形成小的分散顆粒，將殼聚糖DNA復(fù)合物用于基因運(yùn)載和轉(zhuǎn)染表達(dá)時(shí)，能有效攜帶目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞中。包封于殼聚糖顆粒中的物質(zhì)，其釋放率主要決定于殼聚糖的生物降解和溶蝕，因此物質(zhì)釋放明顯延長(zhǎng)。初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于殼聚糖的顆粒系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，殼聚糖還具有多種生物學(xué)功能，尤其是可作為藥物增效劑。
由于殼聚糖納米顆粒良好的生物相容性使其在DNA制劑的包裹應(yīng)用中顯示了廣闊的前景，因此利用殼聚糖納米顆粒包裝含CpG基序的寡聚核苷酸制備基因制劑，并將其應(yīng)用于提高機(jī)體細(xì)胞和體液免疫水平、增強(qiáng)抗感染能力的應(yīng)用技術(shù)，在科研，醫(yī)療，動(dòng)物保健，和產(chǎn)業(yè)化方面具有潛在的巨大價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是利用殼聚糖為包裹材料制備含CpG基序的寡聚核苷酸基因制劑，并將此制劑用于抗感染的應(yīng)用技術(shù)。該方法包括下列步驟1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的設(shè)計(jì)、合成CpG序列設(shè)計(jì)及合成CpG序列(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)第11頁(yè)序列表)合成了含有11個(gè)CpG基序、長(zhǎng)度為88個(gè)堿基的CpG寡聚核苷酸序列，其特點(diǎn)為含有3個(gè)5’-AACGTT-3’，3個(gè)5’-GTCGTC-3’，1個(gè)5’-GACGTT-3’，1個(gè)5’-ATCGAT-3’，1個(gè)5’-GTCGTT-3’，1個(gè)5’-GGCGTT-3’，1個(gè)5’-GACGTC-3’的特征序列。
CpG序列引物設(shè)計(jì)及合成5’端CGAGATCTAACGTTGTC3’端CGAGATCTAACGTTAAC2、免疫用CpG寡聚核苷酸制備以合成的CpG序列為模版，利用PCR(多聚酶連鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物溶解于滅菌生理鹽水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。
3、CpG寡聚核苷酸體外刺激動(dòng)物血液免疫細(xì)胞增殖反應(yīng)體外培養(yǎng)豬、牦牛及黃牛的淋巴細(xì)胞，制備靶細(xì)胞，分別將CpG寡聚核苷酸、CpG寡聚核苷酸和大腸桿菌疫苗、CpG寡聚核苷酸和副傷寒疫苗加入靶細(xì)胞中，利用MTT法檢測(cè)了該CpG寡聚核苷酸及其協(xié)同疫苗對(duì)動(dòng)物免疫細(xì)胞增殖活性的影響，發(fā)現(xiàn)該CpG寡聚核苷酸及其協(xié)同疫苗均能顯著刺激豬、牦牛及黃牛淋巴細(xì)胞的增殖活性。
4、納米粒的制備利用離子交聯(lián)法，以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖制備納米包裝顆粒，將CpG寡聚核苷酸按一定比例加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，制備CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒，并測(cè)定了納米粒的形態(tài)、粒徑及Zeta電位。
結(jié)果顯示制備的CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒表面帶有正電荷，平均粒徑為45nm；多分散度為0.190；zeta電位為+25.6mV。
5、CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆?？垢腥局苿┑膽?yīng)用昆明鼠120只，隨機(jī)分為8組，每組15只。其中4組為非特異性免疫組，4組為疫苗免疫組。以肌肉注射和口服兩種方式免疫小鼠，口服組CpG寡聚核苷酸免疫劑量為30pmol/頭小鼠，殼聚糖納米顆粒包裝組為6pmol/頭動(dòng)物；疫苗免疫組每只小鼠接種1/40頭份以及相應(yīng)CpG寡聚核苷酸30pmol或殼聚糖納米顆粒包裝的相應(yīng)CpG寡聚核苷酸6pmol。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進(jìn)行攻毒(3×109/ml)。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，檢測(cè)了殼聚糖包裝含CpG基序的寡聚核苷酸及未包裝CpG寡聚核苷酸對(duì)小鼠的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測(cè)定)和細(xì)胞免疫水平(細(xì)胞因子和外周血免疫細(xì)胞數(shù)量)的影響情況，并對(duì)常規(guī)疫苗在不同形式的CpG寡聚核苷酸分子免疫佐劑協(xié)同作用下細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的變化，進(jìn)行了較為系統(tǒng)地分析。在小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察發(fā)病情況；49天時(shí)對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，觀察各種器官的生理病變情況，檢測(cè)免疫保護(hù)效應(yīng)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)以含CpG基序的寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒作為免疫增強(qiáng)劑時(shí)，小鼠的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等細(xì)胞因子水平比對(duì)照組顯著升高；同時(shí)，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量也明顯增加；與常規(guī)疫苗聯(lián)合使用，同樣可以顯著提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等細(xì)胞因子水平以及免疫細(xì)胞數(shù)量；對(duì)疫苗的特異性免疫應(yīng)答也顯著加強(qiáng)。其中殼聚糖納米顆粒包裝含CpG基序的寡聚核苷酸注射組和口服組血清中IgG、IgA、IgM含量和細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6的增加尤為顯著；與對(duì)照組相比，肌注未包裝CpG寡聚核苷酸組體液免疫和細(xì)胞免疫的各項(xiàng)指標(biāo)也明顯提高。殼聚糖納米顆粒包裝含CpG基序的寡聚核苷酸后，雖然DNA用量?jī)H為未包裝組的1/5，但免疫組體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平顯著提高，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。雖口服殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組小鼠各項(xiàng)免疫指標(biāo)比對(duì)照組有顯著增高，但其CpG寡聚核苷酸的用量是肌注殼聚糖包裹組用量的5倍。
這些結(jié)果表明含CpG基序的寡聚核苷酸能顯著提高小鼠的免疫應(yīng)答水平，以殼聚糖納米顆粒作為免疫投遞系統(tǒng)，具有減少質(zhì)粒用量、增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫的優(yōu)點(diǎn)。在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，口服免疫和肌肉注射的方式均能有效提高免疫小鼠對(duì)常規(guī)疫苗的免疫應(yīng)答水平，兩種方式的作用效果差異不大，但肌肉注射DNA劑量?jī)H為口服免疫劑量的1/5時(shí)就能達(dá)到相近的增強(qiáng)效果。這些結(jié)果提示殼聚糖納米顆粒包裹含免疫刺激序列CpG的寡聚核苷酸序列可提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平，增強(qiáng)免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)力，可望作為有效的新型抗感染免疫調(diào)節(jié)劑，具有潛在的廣泛應(yīng)用前景。


表1非特異性免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表2疫苗免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表3CpG體外刺激動(dòng)物血液免疫細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果(OD570)圖1CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒透射電鏡圖(放大倍數(shù)50000)圖2殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖3非特異性免疫組小鼠血清中IgG含量圖4非特異性免疫組小鼠血清中IgA含量圖5非特異性免疫組小鼠血清中IgM含量圖6非特異性免疫組小鼠血清中IL-2含量圖7非特異性免疫組小鼠血清中IL-4含量圖8非特異性免疫組小鼠血清中IL-6含量圖9非特異性免疫組小鼠白細(xì)胞數(shù)量變化圖10非特異性免疫組小鼠單核細(xì)胞數(shù)量變化圖11非特異性免疫組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量變化圖12非特異性免疫組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量變化圖13疫苗免疫組小鼠血清中IgG含量圖14疫苗免疫組小鼠血清中IgA含量圖15疫苗免疫組小鼠血清中IgM含量圖16疫苗免疫組小鼠血清中沙門(mén)氏菌特異性抗體含量圖17疫苗免疫組小鼠血清中乙肝疫苗特異性抗體含量圖18疫苗免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖19疫苗免疫組小鼠血清中IL-2含量圖20疫苗免疫組小鼠血清中IL-4含量圖21疫苗免疫組小鼠血清中IL-6含量圖22疫苗免疫組小鼠白細(xì)胞數(shù)量變化圖23疫苗免疫組小鼠單核細(xì)胞數(shù)量變化圖24疫苗免疫組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量變化圖25疫苗免疫組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量變化具體實(shí)施方式
1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的設(shè)計(jì)、合成CpG序列設(shè)計(jì)及合成CpG序列(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)第11頁(yè)序列表)該序列長(zhǎng)度為88個(gè)堿基，含有11個(gè)CpG基序，其特點(diǎn)為含有3個(gè)5’-AACGTT-3’，3個(gè)5’-GTCGTC-3’，1個(gè)5’-GACGTT-3’，1個(gè)5’-ATCGAT-3’，1個(gè)5’-GTCGTT-3’，1個(gè)5’-GGCGTT-3’，1個(gè)5’-GACGTC-3’的特征序列。
CpG序列引物設(shè)計(jì)及合成5’端CGAGATCTAACGTTGTC3’端CGAGATCTAACGTTAAC2、免疫用CpG寡聚核苷酸制備以合成的CpG序列為模版，利用PCR(多聚酶連鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物溶解于滅菌生理鹽水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。
3、CpG寡聚核苷酸體外刺激動(dòng)物血液免疫細(xì)胞增殖反應(yīng)無(wú)菌條件下取豬、牦牛及黃牛外周血，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離血液淋巴細(xì)胞。然后在6孔培養(yǎng)板中每孔加入2×107/ml單細(xì)胞懸液2ml，培養(yǎng)48h。制備靶細(xì)胞，用含20mg/ml α-MM的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整靶細(xì)胞濃度為8×106/ml。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入靶細(xì)胞50ul，再分別加入CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)，CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)和大腸桿菌疫苗(1/500頭份)，CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)和副傷寒疫苗(1/500頭份)，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)RPMI 1640完全培養(yǎng)基空白對(duì)照，置5％CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)120h。MTT法檢測(cè)CpG寡聚核苷酸及其協(xié)同疫苗對(duì)動(dòng)物免疫細(xì)胞增殖活性的影響。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖表3。表3顯示CpG，CpG和大腸桿菌疫苗，CpG和副傷寒疫苗三組處理均能顯著刺激淋巴細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。其中，CpG和大腸桿菌疫苗的刺激效果最為明顯。
4、納米粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；將CpG寡聚核苷酸溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置于50℃水浴分別恒溫20min，將DNA溶液按一定比例(氨基摩爾數(shù)與DNA的磷酸酯基摩爾數(shù)比)加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過(guò)濾得到粒徑40-60nm的復(fù)合物微粒。即是CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒樣品液。
5、納米粒的形態(tài)、粒徑及Zeta電位測(cè)定取少量CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態(tài)并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer3000HS/IHPL納米粒度分析儀測(cè)定粒徑、分散度及Zeta電位。
透射電鏡觀察結(jié)果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1)。納米粒度分析儀測(cè)定結(jié)果為平均粒徑為45nm；多分散度為0.190(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2)zeta電位為+25.6mV，說(shuō)明納米粒表面帶有正電荷。
6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫昆明鼠120只，隨機(jī)分為8組，每組15只。其中4組為非特異性免疫組，4組為疫苗免疫組。采用肌肉注射法，通過(guò)注射小鼠兩側(cè)股四頭肌免疫小鼠。
口服組CpG寡聚核苷酸免疫劑量為30pmol/頭小鼠，殼聚糖納米顆粒包裝組為6pmol/頭動(dòng)物；疫苗免疫組每只小鼠接種1/40頭份以及相應(yīng)CpG寡聚核苷酸30pmol或殼聚糖納米顆粒包裝的相應(yīng)CpG寡聚核苷酸6pmol。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進(jìn)行攻毒(3×109/ml)。動(dòng)物免疫分組見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖表1，表2。表1為非特異性免疫組分組情況，表2為疫苗免疫組分組情況。
7、殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸對(duì)小鼠非特異性免疫應(yīng)答的影響小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測(cè)各項(xiàng)免疫指標(biāo)。
(1)IgG、IgA及IgM的測(cè)定含量實(shí)驗(yàn)鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標(biāo)板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國(guó)Bethyl公司生產(chǎn))作一抗，酶標(biāo)羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，測(cè)定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3、圖4、圖5。從圖可見(jiàn)，小鼠在注射CpG寡聚核苷酸后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比對(duì)照組有顯著增高。殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸后，雖然DNA用量?jī)H為未包裝組的1/5，但免疫組血清中的IgG、IgA、IgM含量仍顯著提高，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。雖口服殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組小鼠血清中IgG、IgA、IgM含量比對(duì)照組有顯著增高，但其CpG寡聚核苷酸的用量比肌注殼聚糖包裹組的用量高5倍。第6周大腸桿菌攻毒后，免疫組小鼠IgG、IgA、IgM較對(duì)照組血清中IgG、IgA、IgM含量有顯著增加。
(2)細(xì)胞因子的檢測(cè)小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標(biāo)板，兔抗鼠IL2、IL4、IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法檢測(cè)血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測(cè)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖6、圖7、圖8。由圖可知，含CpG基序的寡聚核苷酸免疫組小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組與未包裹組相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差異不顯著(P＞0.05)?？诜ぞ厶羌{米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸也能有效提高血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量，但口服組其CpG寡聚核苷酸的用量是肌注組的5倍。
(3)免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規(guī)法計(jì)白細(xì)胞總數(shù)；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞核、淋巴細(xì)胞。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖9、10、11、12。免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化是考察小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)重要指標(biāo)。結(jié)果顯示CpG寡聚核苷酸免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組都有顯著增加，中性粒細(xì)胞在攻毒前也較對(duì)照組明顯升高，但攻毒后中性粒細(xì)胞數(shù)量則較對(duì)照組低；用殼聚糖納米微粒包裝CpG寡聚核苷酸后免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)在使用DNA量上減少5倍的情況下，可以同樣達(dá)到提高免疫細(xì)胞數(shù)量的效果。
8、殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸對(duì)疫苗特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)(1)IgG、IgA及IgM的測(cè)定含量實(shí)驗(yàn)鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標(biāo)板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國(guó)Bethyl公司生產(chǎn))作一抗，酶標(biāo)羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，測(cè)定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖13、14、15。圖13、14、15顯示了CpG寡聚核苷酸與乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗免疫小鼠后，小鼠血清中免疫球蛋白的變化情況。結(jié)果表明在同時(shí)免疫了CpG寡聚核苷酸后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的IgG、IgA、IgM含量比對(duì)照組有顯著提高。其中殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸后，再與乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合注射小鼠，結(jié)果顯示這種免疫方法雖然在DNA的使用量上只有未包裝組的1/5，但是可以協(xié)同疫苗免疫，其IgG、IgA、IgM含量較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，與來(lái)包裝免疫組差異不顯著(p＞0.05)?？诜c肌注殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組血清中IgG、IgA、IgM含量增加幅度相似，但口服組DNA所需劑量大。
(2)特異性抗體的測(cè)定制備乙肝抗原、沙門(mén)氏菌抗原、大腸桿菌抗原包被Costar酶標(biāo)板，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法測(cè)定小鼠血清中乙肝特異性抗體、傷寒特異性抗體、大腸桿菌特異性抗體含量。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖16、17、18。圖16、17、18顯示了乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗與相應(yīng)CpG寡聚核苷酸聯(lián)合免疫動(dòng)物后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特異性抗體變化情況。結(jié)果顯示動(dòng)物在免疫一周后，就檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生；在同時(shí)免疫CpG寡聚核苷酸后，實(shí)驗(yàn)小鼠的上述特異性抗體比對(duì)照組顯著提高(P＜0.05)。用殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸后與疫苗聯(lián)合注射免疫小鼠，在核酸用量?jī)H為未包裝組1/5的情況下，CpG寡聚核苷酸對(duì)提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)疫苗特異性免疫應(yīng)答效果同樣顯著。其中肌肉注射方式對(duì)乙肝疫苗、傷寒疫苗特異性抗體地提升效果較好，而對(duì)于大腸桿菌特異性抗體增加則是口服免疫的方式稍好。
(3)細(xì)胞因子的檢測(cè)小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標(biāo)板，兔抗鼠IL2、IL4，IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法檢測(cè)血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測(cè)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖19、20、21。結(jié)果顯示CpG寡聚核苷酸與乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對(duì)照組高。用殼聚糖納米顆粒包裹含CpG基序的寡聚核苷酸組與未包裝組相比較，包裝的DNA只有未包裹組1/5的用量，但同樣起到了提升免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6含量的作用?？诜M與肌注組的差異不顯著(P＞0.05)。
(4)免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規(guī)法計(jì)白細(xì)胞總數(shù)；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞核、淋巴細(xì)胞。
結(jié)果見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖22、23、24、25。用乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合CpG寡聚核苷酸免疫小鼠，小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的變化情況結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)口服和肌肉注射CpG寡聚核苷酸均對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠外周血免疫細(xì)胞有較好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組稍低；免疫組小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞在免疫后14天達(dá)到了最高值，而單核細(xì)胞則是在免疫49天達(dá)到最高值。用殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸，不僅可以將DNA用量減少至未包裝用量的1/5，還有效增加了小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量。口服和肌肉注射的免疫方式均能有效增加免疫細(xì)胞的數(shù)量，但肌注的方式DNA用量較口服方式少4/5。
9、攻毒小鼠器官病變的檢測(cè)小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88和K99口服攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察小鼠的生長(zhǎng)情況；49天時(shí)用常規(guī)方法對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。
攻毒3周后剖解實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)現(xiàn)，CpG寡聚核苷酸接種小鼠均健康存活，肝、脾、十二指腸、等消化道和呼吸道組織器官未出現(xiàn)明顯病變，而對(duì)照小鼠均發(fā)病，精神萎靡，被毛聳立，糞便稀軟，帶棕褐色；解剖觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠均出現(xiàn)以胃、十二指腸、空腸粘膜等處出血、肝脾腫大等為主的病變。
10、數(shù)據(jù)分析上述各種數(shù)據(jù)均用方差分析進(jìn)行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
CpG序列表<110>四川大學(xué)<120>含CpG基序的寡聚核苷酸抗感染基因制劑的制備及應(yīng)用<160>1<210>1<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1cgagatctaa cgttgtcgtc gacgtcgtcg tcaggcctga cgttatcgat ggcgttgtcg 60tcaacgttgt cgttaacgtt agatctcg88
表1非特異性免疫小鼠分組

注CNP殼聚糖納米顆粒表2疫苗免疫小鼠分組

注CNP殼聚糖納米顆粒表3CpG體外刺激動(dòng)物血液免疫細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果(OD570)

權(quán)利要求
1.含CpG基序的寡聚核苷酸抗感染免疫制劑的制備及應(yīng)用，其特點(diǎn)包括含CpG基序的寡聚核苷酸的人工合成、殼聚糖納米顆粒的制備、殼聚糖納米顆粒對(duì)含CpG基序的寡聚核苷酸的分子包裝及將此殼聚糖CpG納米顆粒免疫制劑應(yīng)用于豬、黃牛、牦牛等動(dòng)物抗感染增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的技術(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CpG寡聚核苷酸抗感染免疫制劑的制備，其特征在于所述的免疫制劑的基質(zhì)是人工合成的含有11個(gè)CpG特征序列、長(zhǎng)度為88個(gè)堿基的寡聚核苷酸，其特點(diǎn)含有3個(gè)5’-AACGTT-3’，3個(gè)5’-GTCGTC-3’，1個(gè)5’-GACGTT-3’，1個(gè)5’-ATCGAT-3’，1個(gè)5’-GTCGTT-3’，1個(gè)5’-GGCGTT-3’，1個(gè)5’-GACGTC-3’的特征序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含CpG基序的寡聚核苷酸抗感染免疫制劑的制備，其特征在于所述的免疫制劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，用離子交聯(lián)法制備殼聚糖CpG納米顆粒分子。
4.使用權(quán)利要求1要求的殼聚糖包裝含CpG基序的寡聚核苷酸納米顆粒作為豬、黃牛、牦牛等動(dòng)物新型抗感染分子免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用技術(shù)，其特征在于以下幾方面(1)以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將制備的殼聚糖CpG寡聚核苷酸納米顆粒以兩種不同的投遞方式(口服和肌注)免疫，比較了不同免疫途徑對(duì)免疫效果的影響；(2)以制備的殼聚糖CpG寡聚核苷酸納米顆粒非特異性免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果表明殼聚糖CpG納米顆粒能有效提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞和體液免疫水平，增強(qiáng)其非特異性免疫力；(3)以制備的殼聚糖CpG納米顆粒聯(lián)合疫苗(乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗)共免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果表明殼聚糖CpG寡聚核苷酸納米顆?？娠@著增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)疫苗的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。
全文摘要
該發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域1.生物技術(shù)，2.分子免疫學(xué)。本發(fā)明人工合成了能刺激豬、黃牛及牦牛等動(dòng)物免疫細(xì)胞增殖活性的CpG寡聚核苷酸序列，并提供了包裝此段CpG DNA分子以制備抗感染基因納米顆粒制劑的方法，公開(kāi)了該CpG納米顆粒作為新型抗感染分子免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用技術(shù)。該方法包括利用分子量150000、脫乙酰度95％以上殼聚糖制備殼聚糖納米顆粒，納米顆粒分子包裝CpG寡聚核苷酸，將此制備的納米顆粒制劑以肌肉注射或口服的方式單獨(dú)或協(xié)同疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特異性和非特異性細(xì)胞和體液免疫水平，提供了殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸作為豬、黃牛及牦牛等動(dòng)物新型抗感染分子免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用技術(shù)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1692943SQ20041004070
公開(kāi)日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者武梅, 高榮, 李惠, 付滿良, 吳凱源, 楊毅, 章歡, 程馳, 劉狄廣, 李化 申請(qǐng)人:四川大學(xué)