專利名稱：小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控基因及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控基因PCAG(自命名)及制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
一個世紀(jì)以來，生命科學(xué)界一直認(rèn)為小腸上皮是緊密排列不可改變和調(diào)控的天然的、絕對的屏障，(intercellular tight junction，TJ)，因而，胰島素，生長激素、干擾素、白細(xì)胞介素、紅血球生成素等大分子蛋白、多肽類生物藥物都以注射的藥物劑型生產(chǎn)和使用，給病人帶來諸多痛苦及不便。
近十年來，在細(xì)菌病理學(xué)上，相關(guān)配合學(xué)科的綜合研究，獲得若干有重大意義的突破。近年來對若干與人有直接關(guān)系的微生物基因組(如大腸桿菌)的全基因測序完成，改變及完善了科學(xué)家對細(xì)菌一宿主間相互作用的觀念。分子細(xì)菌學(xué)研究從分子水平向縱深發(fā)展 導(dǎo)致細(xì)菌一宿主細(xì)胞相互作用方面獲得若干新的進(jìn)展，最重要的是通過細(xì)胞骨架和細(xì)胞間隙信號傳遞可實現(xiàn)對小腸壁通透性的改變和調(diào)控的這一重大發(fā)現(xiàn)。
過去幾十年的生物研究發(fā)現(xiàn)，人體伴隨發(fā)育學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)方面的體況不同，小腸上皮屏障(intestinal epithelial barrier，.IEB)是可以發(fā)生動力學(xué)改變的，而且TJ隨IEB環(huán)境的變化改變很快。1991年已由美國馬里蘭大學(xué)發(fā)現(xiàn)的ZOT(Zonula Occludens Toxin)基因及其表達(dá)蛋白，已證實可以可逆性的打開小腸上皮細(xì)胞孔道20至40分鐘左右，從而實現(xiàn)大分子藥物的口服吸收。但由于該功能蛋白發(fā)現(xiàn)有輕度致腹瀉副作用，至今未被醫(yī)藥業(yè)采用。
糖尿病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題?，F(xiàn)今全世界糖尿病患者總數(shù)約為1.35億，我國糖尿病患者現(xiàn)有4000萬，以一個糖尿病人為例中等維持劑量用胰島素如每天30μ，每一月就需付出259.50元。自我皮肉注射起碼每天一次，皮肉注射給病人帶來痛苦，相當(dāng)一層病人表示，只要能維持正常血糖水平，如能以口服取代注射，則患者免受長期皮肉注射所帶來的痛苦。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目是提供一種通過對人體功能基因PCAG的發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)基因PCAG在蛋白、多肽類藥物從注射給藥到口服給藥的新型制藥工藝上的應(yīng)用，以及該基因的制備方法。
本發(fā)明以美國馬里蘭大學(xué)Alessio教授等提出的調(diào)控小腸壁通透性理論為研究思路，在他們用了不同來源的功能蛋白進(jìn)行的動物體內(nèi)外小腸壁通透性試驗，發(fā)現(xiàn)ZOT/PCAG等是一類同功異源性功能蛋白的基礎(chǔ)上，從蛋白功能轉(zhuǎn)到其基因結(jié)構(gòu)及篩選，進(jìn)行了大量的深入研究，我們發(fā)現(xiàn)除Alessio等從霍亂弧菌源分離的ZOT基因外，在人體腸道大腸桿菌系統(tǒng)及T4噬菌體系統(tǒng)內(nèi)也有一個此類異源性同功能蛋白及其基因存在。并制備了人體腸道大腸桿菌基因組的COSMID(柯斯質(zhì)粒)一全基因庫，使用此類調(diào)控小腸壁通透性類蛋白(ZOT)的抗體血清從蛋白水平，及從蛋白信息合成DNA探針的基因水平，定位及篩選出完整小腸壁通透性調(diào)控功能基因，本人命名其為PCAG基因，實現(xiàn)了將大分子蛋白、多肽藥物由注射改成口服給藥技術(shù)的關(guān)鍵突破。
1.小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG DNA核苷酸順序如下atgcaagagagacacacggaacaggactatcgtgccctgctgattgctgatacgcccattattgatgttcgcgcccctatcgagtttgagcacggcgcaatgcccgccgctatcaatctgccgttaatgaataacgatgaacgcgccgccgttggcacctgctataaacagcaaggctcagacgcagcgctggcgctgggacataaactggtggcgggtgaaattcgtcagcagcgcatggacgcctggcgggcagcgtgcctgcaaaatccgcaaggtattctctgctgcgcccgtggcggtcagcgctcacatattgtgcaaagctggttgcatgcagcggggattgattatccgctggtggaaggcggttataaggcactgcgccagaccgcgattcaggcgactattgaactggcacaaaaaccgatagtgctgattggcggttgtaccggcagcggtaaaacgctgttagtgcagcaacagccgaacggtgttgatctggaagggttggcgcgtcatcgcggttcggcgtttggtcgcacgttacaaccacaacttagccaggcgagttttgaaaacctgctggctgccgaaatgctaaaaaccgacgcccgtcagaatttgcgcctgtgggtgctggaagacgaaagccggatg
atcggttcgaatcacctgccggaatgcctgcgcgagcgaatgactcaggcggcgattgcggtggtagaagatccgtttgagatccgtcttgagcgcctgaacgaagagtatttcttgcgtatgcatcatgattttacccacgcgtacggcgacgaacagggctggcaggagtattgcgaatacctgcatcacggactttcggcgattaagcgtcggctggggctacagcgctataacgaactggctgcaaggctggatgcagcactgacaacgcaactcaccaccggcagcaccgacggtcatctggcctggctggtgccgttacttgaagaatattacgacccgatgtatcgctatcagcttgagaaaaaagcggaaaaagttgtctttcgcggtgagtgggcggaagtggcggaatgggttaaggcgcggtaa以上所述的小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG的制備方法包括1)使用大腸桿菌Escherichia coli系統(tǒng)表達(dá)該基因蛋白；2)使用酵母菌及其他真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)該基因蛋白，即1)將致病性大腸桿菌E.coli.CT-58和非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655、E.coli.0157、E.coli.CR63、E.coli.Be、E.coli.XL-1這幾種細(xì)菌表達(dá)的完全蛋白跑聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，用小腸壁通透性調(diào)控蛋白的抗體做免疫雜交后，出現(xiàn)幾種細(xì)菌都有一條清晰的陽性條帶，分離、純化這一條帶蛋白，胰蛋白酶處理，對小片段進(jìn)行C端氨基酸測序，以此結(jié)果作為篩選大腸桿菌基因庫的核酸探針信息；2)用Cosmid作載體，構(gòu)建非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655的全基因組基因庫，按以上小腸壁通透性調(diào)控蛋白信息合成脫氧核酸DNA探針，P32放射性同位素標(biāo)記，從基因庫中釣出一個陽性克隆DNA測序結(jié)果，得到530bp長度的一個小腸壁通透性調(diào)控蛋白基因，其5’，3’兩端編碼的氨基酸順序，與探針來源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白一個小片段的兩端實際測得氨基酸順序完全相同，由此得到了大腸桿菌源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白基因，用此基因序列進(jìn)一步與國際NCBI的基因核酸數(shù)據(jù)庫序列做BLAST(基因同源性檢測)，所得的基因片斷與E.coli.基因組上的6205-6702之間的序列完全一致，由此定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白完整基因PCAG。
3.小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控基因PCAG的應(yīng)用本發(fā)明從相對無害的非致病性K-12大腸桿菌屬，克隆了小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控因子族中另一個同功異源、具有重大實用價值的新基因PCAG。是與ZOT不同來源的其他一個同功能異源蛋白。利用PCAG蛋白的調(diào)控小腸壁通透性功能而將大分子蛋白、多肽藥物由注射改成口服藥物，實現(xiàn)了將胰島素、免疫球蛋白、生長激素、干擾素、白細(xì)胞介素、紅血球生成素等蛋白多肽類藥物制成口服藥物的重大突破。
該腸壁通透性調(diào)控蛋白的具體應(yīng)用方法將胰島素、免疫球蛋白、生長激素、干擾素、白細(xì)胞介素、紅血球生成素等蛋白多肽類藥物與PCAG基因表達(dá)的小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白質(zhì)混合制成口服藥(可制成耐胃酸膠囊)。將所述的蛋白多肽類藥物與小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG混合時，二者用量為蛋白多肽類藥物以產(chǎn)品注射計量作參考，腸壁通透性調(diào)控蛋白0.1～0.4nmol(納摩)/每公斤體重。以胰島素為例胰島素1.2～2.4 Humulin U(國際單位)，腸壁通透性調(diào)控蛋白0.1～0.4nmol(納摩)(按體重調(diào)節(jié))。
ZOT/PCAG類調(diào)控小腸壁通透性功能蛋白動物體內(nèi)外試驗結(jié)果試驗動物新西蘭白兔、大鼠。
藥物1)胰島素(分子量5.7Kda)，2)免疫球蛋白(分子量140～160Kda)試驗方法體外Ussing Chambers腸壁通透性電生理測定系統(tǒng)。
體內(nèi)兔食管插管給藥，頸靜脈插管抽血檢測。
實驗結(jié)果1)胰島素體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加72％。體內(nèi)小腸(空腸、廻腸)壁吸收量增加10倍。
高血糖大鼠胰島素與腸壁通透性調(diào)控蛋白混合口服(服用量胰島素1.2～2.4 Humulin U，腸壁通透性調(diào)控蛋白0.1～0.4nmol，按體重調(diào)節(jié))，使血糖水平下降到胰島素注射后水平。
高血糖大鼠慢性毒性試驗胰島素與腸壁通透性調(diào)控蛋白混合口服(服用量與上同)，高血糖大鼠存活時間與胰島素注射組相似。
2)免疫球蛋白體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加52％。體內(nèi)空腸壁吸收量增加2倍，廻腸壁吸收量增加6倍。
從該動物試驗結(jié)果可見，ZOT/PCAG類調(diào)控小腸壁通透性功能蛋白，可使胰島素及免疫球蛋白等大分子蛋白質(zhì)藥物經(jīng)腸道吸收，而不用注射。
本發(fā)明既可創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)價值，又給注射病人帶來福音，深受患者的喜愛，市場使用廣泛，全世界糖尿病患者預(yù)測有10％使用胰島素給藥口服液，每位患者每年醫(yī)藥費(fèi)利潤預(yù)計100元，則每年創(chuàng)利10億元。
具體實施例方式
實施例1由下述方法獲得小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控基因PCAG1.將致病性大腸桿菌E.coli.CT-58-和非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655、E.coli.0157、E.coli.CR63、E.coli.Be、E.coli.XL-1這幾種細(xì)菌表達(dá)的完全蛋白跑聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，用小腸壁通透性調(diào)控蛋白的抗體做免疫雜交后，出現(xiàn)幾種細(xì)菌都有一條清晰的陽性條帶，分離、純化這一蛋白組分，蛋白酶處理，對小片段進(jìn)行C端氨基酸測序，以此結(jié)果作為篩選大腸桿菌基因庫的探針信息；2.用Cosmid(柯斯質(zhì)粒)作載體，構(gòu)建非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655的全基因組基因庫，按以上小腸壁通透性調(diào)控蛋白的氨基酸排列結(jié)構(gòu)信息，合成脫氧核酸DNA探針，P32放射性同位素標(biāo)記，從基因庫中釣出一個陽性克隆DNA測序結(jié)果，得到530bp長度的一個小腸壁通透性調(diào)控蛋白基因，其5’，3’兩端編碼的氨基酸順序，與探針來源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白一個小片段的兩端實際測得氨基酸順序完全相同，由此得到了大腸桿菌源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白基因，用此基因序列進(jìn)一步與國際NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫序列做BLAST(基因同源性檢測)，所得的基因片斷與E.coli.基因組上的6205-6702之間的序列完全一致，由此定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白完整基因，該基因命名為PCAG。其基因結(jié)構(gòu)如下PCAG基因全部核苷酸順序atgcaagagagacacacggaacaggactatcgtgccctgctgattgctgatacgcccattattgatgttcgcgcccctatcgagtttgagcacggcgcaatgcccgccgctatcaatctgccgttaatgaataacgatgaacgcgccgccgttggcacctgctataaacagcaaggctcagacgcagcgctggcgctgggacataaactggtggcgggtgaaattcgtcagcagcgcatg
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藥物1)胰島素(分子量5.7Kda)，2)免疫球蛋白(分子量140～160Kda)試驗方法體外Ussing Chambers腸壁通透性電生理測定系統(tǒng)。
體內(nèi)兔食管插管給藥，頸靜脈插管抽血檢測。
實驗結(jié)果1)胰島素體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加72％。體內(nèi)小腸(空腸、廻腸)壁吸收量增加10倍。
高血糖大鼠胰島素與腸壁通透性調(diào)控蛋白混合口服(服用量胰島素1.2-2.4 Humulin U(國際單位)，腸壁通透性調(diào)控蛋白0.1-0.4nmol納摩，按體重調(diào)節(jié))，使血糖水平下降到胰島素注射后水平。
高血糖大鼠慢性毒性試驗胰島素與腸壁通透性調(diào)控蛋白混合口服，服用量胰島素1.2～2.4 Humulin U，腸壁通透性調(diào)控蛋白0.1～0.4nmol(按體重調(diào)節(jié))，高血糖大鼠存活時間與胰島素注射組相似。
2)免疫球蛋白體外小腸(空腸、廻腸)壁通透性增加52％，體內(nèi)空腸壁吸收量增加2倍，廻腸壁吸收量增加6倍。
從該動物試驗結(jié)果可見，ZOT/PCAG類調(diào)控小腸壁通透性功能蛋白，可使胰島素及免疫球蛋白等大分子蛋白質(zhì)藥物經(jīng)腸道吸收，而不用注射。
權(quán)利要求
1.一種小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG，其特征在于PCAG基因DNA核苷酸順序如下atgcaagagagacacacggaacaggactatcgtgccctgctgattgctgatacgcccattattgatgttcgcgcccctatcgagtttgagcacggcgcaatgcccgccgctatcaatctgccgttaatgaataacgatgaacgcgccgccgttggcacctgctataaacagcaaggctcagacgcagcgctggcgctgggacataaactggtggcgggtgaaattcgtcagcagcgcatggacgcctggcgggcagcgtgcctgcaaaatccgcaaggtattctctgctgcgcccgtggcggtcagcgctcacatattgtgcaaagctggttgcatgcagcggggattgattatccgctggtggaaggcggttataaggcactgcgccagaccgcgattcaggcgactattgaactggcacaaaaaccgatagtgctgattggcggttgtaccggcagcggtaaaacgctgttagtgcagcaacagccgaacggtgttgatctggaagggttggcgcgtcatcgcggttcggcgtttggtcgcacgttacaaccacaacttagccaggcgagttttgaaaacctgctggctgccgaaatgctaaaaaccgacgcccgtcagaatttgcgcctgtgggtgctggaagacgaaagccggatgatcggttcgaatcacctgccggaatgcctgcgcgagcgaatgactcaggcggcgattgcggtggtagaagatccgtttgagatccgtcttgagcgcctgaacgaagagtatttcttgcgtatgcatcatgattttacccacgcgtacggcgacgaacagggctggcaggagtattgcgaatacctgcatcacggactttcggcgattaagcgtcggctggggctacagcgctataacgaactggctgcaaggctggatgcagcactgacaacgcaactcaccaccggcagcaccgacggtcatctggcctggctggtgccgttacttgaagaatattacgacccgatgtatcgctatcagcttgagaaaaaagcggaaaaagttgtctttcgcggtgagtgggcggaagtggcggaatgggttaaggcgcggtaa
2.如權(quán)利要求1所述的小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG的制備方法，其特征在于具體方法包括1)使用大腸桿菌Escherichia coli系統(tǒng)表達(dá)該基因蛋白；2)使用酵母菌及其他真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)該基因蛋白，即1)將致病性大腸桿菌E.coli.CT-58和非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655、E.coli.0157、E.coli.CR63、E.coli.Be、E.coli.XL-1這幾種細(xì)菌表達(dá)的完全蛋白跑聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，用小腸壁通透性調(diào)控蛋白的抗體做免疫雜交后，出現(xiàn)幾種細(xì)菌都有一條清晰的陽性條帶，分離、純化這一條帶蛋白，胰蛋白酶處理，對小片段進(jìn)行C端氨基酸測序，以此結(jié)果作為篩選大腸桿菌基因庫的核酸探針信息；2)用Cosmid作載體，構(gòu)建非致病性大腸桿菌E.coli.MG1655的全基因組基因庫，按以上小腸壁通透性調(diào)控蛋白信息合成脫氧核酸DNA探針，P32放射性同位素標(biāo)記，從基因庫中釣出一個陽性克隆DNA測序結(jié)果，得到530bp長度的一個小腸壁通透性調(diào)控蛋白基因，其5’，3’兩端編碼的氨基酸順序，與探針來源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白一個小片段的兩端實際測得氨基酸順序完全相同，由此得到了大腸桿菌源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白基因，用此基因序列進(jìn)一步與國際NCBI的基因核酸數(shù)據(jù)庫序列做BLAST(基因同源性檢測)，所得的基因片斷與E.coli.基因組上的6205-6702之間的序列完全一致，由此定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白完整基因PCAG。
3.如權(quán)利要求1、2所述的小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG的應(yīng)用，其特征在于將胰島素、免疫球蛋白、生長激素、干擾素、白細(xì)胞介素、紅血球生成素等蛋白多肽類藥物與PCAG基因表達(dá)的小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白質(zhì)混合制成口服藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG的應(yīng)用，其特征在于將所述的蛋白多肽類藥物與小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG混合時，二者用量為蛋白多肽類藥物以產(chǎn)品注射計量作參考，腸壁通透性調(diào)控蛋白0.1～0.4nmol(納摩)/每公斤體重。
全文摘要
本發(fā)明是一種小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG及制備和應(yīng)用。小腸上皮細(xì)胞孔道調(diào)控蛋白的基因PCAG的制備方法是1)使用大腸桿菌Escherichia coli系統(tǒng)表達(dá)該基因蛋白；2)使用酵母菌及其他真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)該基因蛋白。定位篩選到大腸桿菌源的小腸壁通透性調(diào)控蛋白完整基因PCAG。本發(fā)明既可創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)價值，又給注射病人帶來福音，深受患者的喜愛，市場使用廣泛，全世界糖尿病患者預(yù)測有10％使用胰島素給藥口服液，每位患者每年醫(yī)藥費(fèi)利潤預(yù)計100元，則每年創(chuàng)利10億元。
文檔編號A61K38/16GK1680551SQ20041004078
公開日2005年10月12日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月8日
發(fā)明者任兆鈞 申請人:任兆鈞, 廣州銘俊基因技術(shù)開發(fā)有限公司