專利名稱：二萜化合物單體及其制法和在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物及其制法，具體地說是以圓滑番荔枝為原料提取的一種抗癌活性物質(zhì)貝殼杉烷型二萜化合物單體及其制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥是危害人類健康的大敵。我國每年新發(fā)癌癥病例約有160萬人，每年死于癌癥的約有130萬人，全國因癌癥而死亡的人數(shù)逐年上升，我國為肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌癥的高發(fā)區(qū)域，癌癥死亡率居高不下。
目前尚無有效的藥物治愈大多數(shù)癌癥患者?；熕幬飳?duì)癌癥雖有一定療效，但毒副作用大，中成藥對(duì)癌癥的療效普遍較低，如參蓮膠曩對(duì)肺、胃癌的癌灶緩解率為3.5％，軟堅(jiān)口服液對(duì)肝癌的癌灶緩解率為6.0％，療效均不理想。
本發(fā)明人研究了圓滑番荔枝(Annona glabra Linn)的根皮或樹皮、或枝葉、或種子、或者它們的混合物的乙醇提取物的制劑，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明對(duì)動(dòng)物移植性肉瘤S180和肝癌H22均有顯著的體內(nèi)抗癌治療效果。在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明人又從浸膏中提取出抗癌單體化合物(活性成分)。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種高效低毒、抗癌譜廣的抗癌單體化合物，具體地說是以圓滑番荔枝為原料提取的一種貝殼杉烷型二萜化合物單體及其在制備治療肝癌、胃癌的藥物方面的應(yīng)用。
2、技術(shù)方案本發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上又作了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)圓滑番荔枝莖葉的浸膏中其抗癌的活性成分主要是本發(fā)明的貝殼杉烷型二萜化合物單體。并經(jīng)資料查閱目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道貝殼杉烷型二萜化合物ent-kauran-19-al-17-oic acid用于抗肝癌、胃癌等癌癥的治療。本發(fā)明從圓滑番荔枝(Annona glabra Linn)中提取的一種貝殼杉烷型二萜化合物單體，它是ent-kauran-19-al-17-oic acid，其分子式為C20H30O3，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
一種貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid的制備方法，其步驟是A、將風(fēng)干的圓滑番荔枝莖粉碎后用60％-95％的乙醇2000ml-4000ml加熱提取，回收乙醇然后將提取液濃縮，得浸膏；B、把浸膏再用氯仿提取，得氯仿提取液；C、將氯仿提取液進(jìn)行硅膠(100-200目)柱層析，用2000ml-4000ml石油醚-氯仿(2∶1)為洗脫劑A洗脫，得到提取物；D、將步驟C中所得的提取物再進(jìn)行硅膠(200-300目)柱層析，用2000ml-4000ml石油醚-乙酸乙脂(100∶2)為洗脫劑B，得到第4批洗脫下的化合物即為本發(fā)明的貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid。它可以用乙酸乙酯重結(jié)晶純化。
本發(fā)明涉及一種貝殼杉烷型二萜化合物單體在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
采用常規(guī)MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721或HepG2肝癌細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種細(xì)胞于96孔板(1×104/孔)，24h后實(shí)驗(yàn)組分別加入化合物終濃度為200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、10ug/ml，另設(shè)5-Fu組、無藥物(含配制藥物的乙醇)培養(yǎng)液和空白對(duì)照孔(同時(shí)作3個(gè)板)，每個(gè)濃度設(shè)9個(gè)復(fù)孔(分3次重復(fù))。加藥后將96孔板置于CO2溫箱37℃培養(yǎng)。加藥培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/mlMTT試劑10ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入DMSO100ul，放震蕩器震蕩15min，用酶標(biāo)儀(λ570nm)測(cè)每孔OD值。抑制率(％)＝(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照孔OD值×100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid濃度的升高，對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制率也升高，二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid在50ug/ml以上劑量對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，其中200ug/ml濃度的抑制作用最高，其抑制率達(dá)75.19％。
本發(fā)明涉及一種貝殼杉烷型二萜化合物單體在制備治療胃癌的藥物中的應(yīng)用。
采用MTT法測(cè)定貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid(用無水乙醇配制)對(duì)BGC823胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823胃癌細(xì)胞調(diào)整至1×105/ml，0.2ml接種于96孔板上，置37℃、5％CO2培養(yǎng)24h后棄原培養(yǎng)液，分別加入化合物終濃度為200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、10ug/ml，每個(gè)濃度設(shè)9個(gè)復(fù)孔(分3次重復(fù))，并另設(shè)5-Fu組、無藥物(含配制藥物的乙醇)培養(yǎng)液和空白對(duì)照孔(同時(shí)作3個(gè)板)。作用24h后傾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶標(biāo)儀570nm處測(cè)OD值。抑制率(％)＝(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照孔OD值×100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid濃度的升高，對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率也升高，二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid在50ug/ml以上劑量對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用，其中200ug/ml劑量的抑制作用最高，其抑制率達(dá)68.50％。
根據(jù)本發(fā)明人的研究，貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid可以用于制備抗肝癌或抗胃癌的藥物。
3、有益效果本發(fā)明的貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-l7-oic acid是從植物圓滑番荔枝中提取的抗癌單體化合物，毒副作用小，抗癌譜廣，對(duì)癌細(xì)胞有很明顯的抑制作用。本發(fā)明的貝殼杉烷型二萜化合物單體經(jīng)抗癌藥理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其抗癌活性高。圓滑番荔枝貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid在50ug/ml濃度以上，對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，在200ug/ml劑量時(shí)抑制作用最高，其抑制率達(dá)75.19％；在50ug/ml以上劑量對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯抑制作用，其中200ug/ml劑量的抑制作用最高，其抑制率達(dá)68.50％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1圓滑番荔枝貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid的提取方法①圓滑番荔枝植物樣品采自海南，經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎，粉碎的圓滑番荔枝莖3.5kg，用95％的酒精3000ml回流提取，回收乙醇后濃縮得浸膏300g；②將浸膏再用氯仿提取，得到氯仿提取液；③將氯仿提取液，經(jīng)硅膠(100-200目，2kg)進(jìn)行柱層析，以3000ml石油醚-氯仿(2∶1)為洗脫劑A，得到提取物部分；④將提取物再用硅膠(200-300目)300g進(jìn)行柱層析，以3000ml石油醚-乙酸乙酯(100∶2)為洗脫劑B進(jìn)行洗脫，每50ml洗脫液為一個(gè)單位分別接受，將洗脫液分別作硅膠薄板層析，薄板噴香草醛硫酸溶液后在105℃下加熱3分鐘顯色，合并相同的洗脫液，第4批洗脫下的化合物即為本發(fā)明的貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid。
實(shí)施例2貝殼杉烷型二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid的結(jié)構(gòu)鑒定ent-kauran-19-al-17-oic acid為白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)199-203℃(CHCI3)。1HNMR提示ent-kauran-19-al-17-oic acid為貝殼杉烷型二萜化合物單體。
分子式C20H30O3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 實(shí)施例3二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid的抗肝癌作用1、細(xì)胞培養(yǎng)與化合物將人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721或HepG2常規(guī)培養(yǎng)于含10％滅活小牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPM11640培養(yǎng)液中，置飽和濕度、37℃的5％CO2溫箱培養(yǎng)。單體化合物是經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定的圓滑番荔枝二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid。
2、實(shí)驗(yàn)方法采用常規(guī)MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721或HepG2肝癌細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種細(xì)胞于96孔板(1×104/孔)，24h后實(shí)驗(yàn)組分別加入二萜化合物ent-kauran-19-al-17-oic acid終濃度為200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、10ug/ml，另設(shè)5-Fu組、無藥物(含配制藥物的乙醇)培養(yǎng)液和空白對(duì)照孔(同時(shí)作3個(gè)板)，每個(gè)濃度設(shè)9個(gè)復(fù)孔(分3次重復(fù))。加藥后將96孔板置于CO2溫箱37℃培養(yǎng)。加藥培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/mlMTT試劑10ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入DMSO100ul，放震蕩器震蕩15min，用酶標(biāo)儀(λ570nm)測(cè)每孔OD值。抑制率(％)＝(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照孔OD值×100％。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如表1、表2顯示，隨二萜化合物單體濃度的升高，對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制率也升高，二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid在50ug/ml以上劑量對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯抑制作用。
表1 ent-kauran-19-al-17-oic acid對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(n＝9)藥物濃度(ug/ml) OD值(A±S)抑制率(％)24h 48h 24h48h0 0.570±0.017 0.673±0.0215-Fu100 0.128±0.012 0.135±0.01577.54 79.94二萜化合物 10 0.440±0.016 0.457±0.01922.81 32.10單體50 0.403±0.017 0.330±0.01429.30 50.97**100 0.323±0.013 0.267±0.01543.33* 60.33**200 0.150±0.010 0.173±0.01273.68**74.29***P＜0.05，**P＜0.01與對(duì)照組比較表2 ent-kauran-19-al-17-oic acid對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(n＝9)藥物 濃度(ug/ml) OD值(A±S)抑制率(％)24h 48h 24h 48h0 0.186±0.011 0.270±0.0135-Fu 100 0.067±0.010 0.090±0.014 63.9866.67二萜化合物 10 0.183±0.012 0.180±0.015 1.61 32.33單體 50 0.147±0.013 0.153±0.012 20.9743.03*100 0.096±0.010 0.133±0.013 48.39** 50.74**200 0.053±0.009 0.067±0.010 71.51** 75.19***P＜0.05，**P＜0.01與對(duì)照組比較實(shí)施例4ent-kauran-19-al-17-oic acid的抗胃癌作用1、細(xì)胞培養(yǎng)與單體化合物人胃癌BGC823細(xì)胞培養(yǎng)于RPM11640培養(yǎng)液中，內(nèi)加10％小牛血清，培育在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。單體化合物是經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定的二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid。
2、實(shí)驗(yàn)方法采用常規(guī)MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823胃癌細(xì)胞調(diào)整至1×105/ml，0.2ml接種于96孔板上，置37℃、5％CO2培養(yǎng)24h后棄原培養(yǎng)液，分別加入化合物終濃度為200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、10ug/ml，每個(gè)濃度設(shè)9個(gè)復(fù)孔(分3次重復(fù))，并另設(shè)5-Fu組、無藥物(含配制藥物的乙醇)培養(yǎng)液和空白對(duì)照孔(同時(shí)作3個(gè)板)。作用24h后傾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶標(biāo)儀570nm處測(cè)OD值。抑制率(％)＝(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照孔OD值×100％。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如表3顯示，隨二萜化合物單體濃度的升高，對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率也升高，二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid在50ug/ml以上劑量對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用。
表3 ent-kauran-19-al-17-oic acid對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用(n＝9)藥物 濃度(ug/ml) OD值(A±S) 抑制率(％)24h 48h 24h 48h0 0.320±0.019 0.327±0.0165-Fu 100 0.173±0.012 0.009±0.013 45.94 72.48二萜化合物 10 0.241±0.018 0.220±0.017 24.69 32.72單體 50 0.193±0.015 0.193±0.015 39.97*40.98*100 0.187±0.010 0.177±0.014 41.56*45.87*200 0.117±0.009 0.103±0.010 63.44** 68.50***P＜0.05，**P＜0.01與對(duì)照組比較
權(quán)利要求
1.一種抗癌藥物貝殼杉烷型二萜化合物單體，其特征是它是ent-kauran-19-al-17-oic acid，分子式為C20H30O3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2.一種制備權(quán)利要求1所述的ent-kauran-19-al-17-oic acid的方法，其特征是制備步驟如下A、將風(fēng)干的圓滑番荔枝莖粉碎后用乙醇加熱提取，回收乙醇然后將提取液濃縮，得浸膏；B、把浸膏，再用氯仿提取，得氯仿提取液；C、將氯仿提取液進(jìn)行硅膠(100-200目)柱層析，用石油醚-氯仿為洗脫劑A洗脫，得到提取物；D、將步驟C中所得的提取物再進(jìn)行硅膠(200-300目)柱層析，用石油醚-乙酸乙脂為洗脫劑B，得到第4批洗脫下的化合物即為本發(fā)明的ent-kauran-19-al-17-oic acid。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是在步驟A中乙醇濃度為60％-95％，用量為2000ml-4000ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是步驟C中洗脫劑A石油醚-氯仿以2∶1配比，用量為2000ml-4000ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是步驟D中洗脫劑B石油醚-乙酸乙脂以100∶2配比，用量為2000ml-4000ml。
6.二萜化合物單體ent-kauran-19-al-17-oic acid在制備治療抗肝癌或抗胃癌藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的ent-kauran-19-al-17-oic acid在制備治療抗肝癌或抗胃癌藥物中的應(yīng)用，其特征是ent-kauran-19-al-17-oic acid在50ug/ml以上劑量對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用；在50ug/ml以上劑量對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯抑制作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的ent-kauran-19-al-17-oic acid在制備抗肝癌或抗胃癌藥物中的應(yīng)用，其特征是ent-kauran-19-al-17-oic acid在200ug/ml劑量時(shí)，對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最高，其抑制率為75.19％；在200ug/ml劑量時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最高，其抑制率為68.50％。
全文摘要
一種抗癌藥物貝殼衫烷型二萜化合物單體ent－kauran－19－al－17－oic acid，它是從圓滑番荔枝莖中提取得到的抗癌化合物單體，其制備方法是首先將風(fēng)干的圓滑荔枝莖粉碎后用乙醇提取，濃縮得浸膏；其次，再用氯仿提取，經(jīng)柱層析，用洗脫劑脫洗后再柱層析；最后再用洗脫劑脫洗而得到貝殼杉烷型二萜化合物單體，經(jīng)抗癌藥理實(shí)驗(yàn)，對(duì)人肝癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并具有高效低毒、毒副作用小、抗癌譜廣、抗癌活性高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1594267SQ200410041150
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月2日
發(fā)明者章永紅 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)