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      抗促性腺激素釋放激素核酸疫苗及制備方法

      文檔序號(hào):1080820閱讀:207來源:國知局
      專利名稱:抗促性腺激素釋放激素核酸疫苗及制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      在醫(yī)學(xué)的腫瘤領(lǐng)域中,通??梢杂媚[瘤疫苗來治療腫瘤。本發(fā)明提供的抗促性腺激素釋放激素的核酸疫苗能用于治療性激素依賴型腫瘤。
      背景技術(shù)
      促性腺激素釋放激素(Gonadotrophin Releasing Hormone,GnRH)是下丘腦分泌的一不含游離氨基和羧基的10肽激素,它由下丘腦腹側(cè)的弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核的多個(gè)核團(tuán)的多肽能神經(jīng)元合成,通過下丘腦正中隆起的門脈系統(tǒng)運(yùn)送至垂體前葉,刺激黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和釋放,這兩種促性腺激素又能促進(jìn)性腺細(xì)胞的正常發(fā)育和性激素的分泌。通過這種級(jí)聯(lián)作用,GnRH在垂體-性腺軸系統(tǒng)中發(fā)揮著巨大的功能,成為生物體內(nèi)性激素的產(chǎn)生、性器官的發(fā)育以及生殖的主要調(diào)控分子。
      GnRH除影響垂體外,還可能影響別的各種組織,直接或間接的導(dǎo)致疾病的發(fā)生。前列腺增生時(shí),前列腺二氫睪酮的含量急劇升高,增生的前列腺中5-α還原酶活性的升高以及閹割以后前列腺的萎縮都顯示二氫睪酮在前列腺增生中所起的重要作用。在老年人中發(fā)病極高的前列腺癌已成為男性癌死亡的主要原因之一,研究表明前列腺癌病人體內(nèi)雄激素分泌過多是致癌因素,癌細(xì)胞的代謝大多依賴于雄激素,降低雄激素的水平,可干擾癌細(xì)胞內(nèi)的DNA合成,抑制腫瘤的生長。因此,前列腺癌的致病機(jī)理與性激素的分泌密切相關(guān)。其它的研究也表明乳腺癌、結(jié)腸癌等癌癥都與性激素的分泌有關(guān)。最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤上存在GnRH的特異性結(jié)合位點(diǎn)。這些研究成果顯示通過阻斷GnRH的作用,降低體內(nèi)性激素的水平,能抑制上述激素依賴型腫瘤的生長。目前,用于治療這些腫瘤的已上市或正處于臨床實(shí)驗(yàn)的藥物如Buserelin(布舍瑞林)、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、Synarel(醋酸那法瑞林)、Abarelix等都為GnRH的類似物或拮抗劑,這些藥物通過阻斷GnRH與其特異性結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的治療。
      同樣,用抗促性腺激素釋放激素疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗促性腺激素釋放激素抗體,也能阻斷GnRH發(fā)揮作用,進(jìn)而治療相關(guān)疾病。由于GnRH是自身抗原,免疫原性很弱,在體內(nèi)不易產(chǎn)生抗體,一般將GnRH與白喉毒素、破傷風(fēng)毒素或卵清蛋白等大分子載體物質(zhì)相偶聯(lián),增強(qiáng)其免疫原性,以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗GnRH特異性抗體,顯示能用于前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的治療。GnRH疫苗不僅可以用于人類,還可以用于多種動(dòng)物,由于阻斷GnRH能抑制促性腺激素合成和釋放,進(jìn)而抑制性激素合成、精子產(chǎn)生、卵泡發(fā)育和排卵。因此,在畜牧業(yè)上,GnRH疫苗廣泛用來代替手術(shù)閹割對(duì)牲畜和家禽的生殖進(jìn)行控制??傊_發(fā)GnRH疫苗是具有廣泛意義的,研制有效的GnRH疫苗已成為許多疫苗研究人員追求的目標(biāo)。
      隨著90年代初核酸疫苗技術(shù)的誕生,其作為一種新的免疫接種手段在短短的十多年里已經(jīng)獲得了很大發(fā)展,至今已廣泛用于病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、寄生蟲感染性疾病、腫瘤以及自身免疫性疾病的預(yù)防和治療研究。核酸疫苗,又稱DNA疫苗、基因疫苗,就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上,然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動(dòng)物體內(nèi),使外源基因在活體內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng),引發(fā)免疫反應(yīng)。相比減毒、滅活疫苗(稱為第一代疫苗)和亞單位疫苗(稱為第二代疫苗),核酸疫苗作為第三代疫苗具有如下優(yōu)勢(shì)(1)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答,其保護(hù)性免疫應(yīng)答對(duì)不同亞型的病原體具有交叉抵御作用;(2)無減毒、滅活疫苗可能引起的致病作用,具有可靠的安全性;(3)能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原,具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性;(4)與亞單位疫苗共有的高產(chǎn)性;(5)可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中,或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用,制備多價(jià)核酸疫苗;(6)核酸疫苗既有預(yù)防作用,也有治療作用;(7)生產(chǎn)簡(jiǎn)便,成本低廉,穩(wěn)定性好,貯運(yùn)方便。因此,在不久的將來,核酸疫苗有望成為人類防治疾病的重要手段。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種抗GnRH的核酸疫苗。
      本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)該抗GnRH核酸疫苗的方法。
      本發(fā)明的還有一個(gè)目的是該抗GnRH核酸疫苗的用途。
      在本發(fā)明的第一個(gè)方面,提供了一種抗GnRH的核酸疫苗。該核酸疫苗所用的真核質(zhì)粒載體框架結(jié)構(gòu)如圖1所示,除具有真核表達(dá)載體基本元件外,還包含有編碼乙肝核心抗原(HBcAg)全基因的核苷酸序列,并在HBcAg的序列中引入一個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn),在此位點(diǎn)插入了編碼3段GnRH重復(fù)序列的基因片段,以GnRH3表示。另外,在質(zhì)粒載體的非編碼區(qū)域中,插入了含有8個(gè)CpG基元的免疫刺激序列,簡(jiǎn)稱(CpG)8,以增強(qiáng)該核酸疫苗的免疫原性。
      GnRH為自身抗原,單純的引入GnRH基因在體內(nèi)表達(dá)并不能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。所以,同蛋白疫苗一樣,其也必須與大分子載體物質(zhì)相偶聯(lián),在體內(nèi)一同表達(dá),以增強(qiáng)GnRH的免疫原性,打破免疫耐受。因此,我們采用HBcAg作為GnRH的免疫載體。HBcAg分子可自動(dòng)裝配成正二十面對(duì)稱結(jié)構(gòu)的顆粒,該顆粒由240個(gè)HBcAg單體組成,表面呈現(xiàn)有120個(gè)刺突,HBcAg主要的B細(xì)胞抗原決定簇即位于HBcAg顆粒刺突的尖部,稱為主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)(Maior Immunodominant Region,MIR)。在所有的HBV蛋白成分中,HBcAg顆粒具有很強(qiáng)的免疫原性,可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的B細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)免疫反應(yīng)。乙肝核心抗原獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)性質(zhì)是其作為免疫載體的重要因素,并且在沒有其它病毒成份的情況下,能夠于外源表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)并正確折疊成自然的顆粒狀。異源表位插入分子的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)可使其暴露在顆粒表面,大大增加異源表位局部空間的密度,通過致敏T細(xì)胞、抗原遞呈和Th細(xì)胞激活功能來增強(qiáng)弱免疫原的免疫反應(yīng),產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答,同時(shí)也能降低HBcAg自身的免疫原性。因此,HBcAg可作為理想的免疫載體應(yīng)用于核酸疫苗的研制中。由于HBcAg分子的第80-81位氨基酸位于其顆粒表面刺突的尖部,故在本質(zhì)粒載體中利用DNA重組技術(shù)將編碼HBcAg分子的第80-81位氨基酸的核苷酸序列突變?yōu)橐幌拗菩詢?nèi)切酶(AgeI)位點(diǎn),便可將編碼GnRH的基因序列方便的插入到HBcAg載體中,使得表達(dá)后目的多肽理想的呈現(xiàn)于顆粒表面。
      研究表明,細(xì)菌DNA中含有比例較高的由胞嘧啶核苷酸和鳥嘌呤核苷酸(CpG)為基元組成的免疫刺激序列(immunostimulatory sequences,ISS),而在脊椎動(dòng)物DNA中ISS的比例較低,并且,哺乳動(dòng)物中80%以上的CpG均被甲基化。哺乳動(dòng)物DNA和細(xì)菌DNA的這種顯著差別可能是使CpG成為免疫刺激信號(hào)的基礎(chǔ)。通過對(duì)CpG序列的識(shí)別,哺乳動(dòng)物區(qū)別于自身DNA把CpG作為一種“危險(xiǎn)信號(hào)”,激活防御機(jī)制,在感染組織中激活淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明,CpG不僅能調(diào)節(jié)B細(xì)胞和T細(xì)胞的功能,而且能激活單核細(xì)胞(monocytes)、巨噬細(xì)胞(macrophages)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells)和NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,并刺激IL-12、TNF-α、IL-6、IFN-γ等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生,非特異性的激活免疫系統(tǒng)。CpG的免疫學(xué)特性已使其在疫苗和基因治療方面得到廣泛的應(yīng)用,其可以作為一種有效的佐劑與抗原或質(zhì)粒載體一同免疫,產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。利用這一原理,可在真核質(zhì)粒載體中增加CpG以提高核酸疫苗的誘導(dǎo)效率。本核酸疫苗選用了六堿基序列GACGTT作為CpG基元,通過PCR的方法獲得了含有8個(gè)GACGTT堿基序列的DNA片段,即(CpG)8,插入到真核質(zhì)粒載體的非編碼區(qū)域內(nèi),以增強(qiáng)GnRH在體內(nèi)的免疫應(yīng)答。
      最新的研究顯示含有線性連接的自身肽多拷貝序列的免疫原能夠極大的提高免疫原性,由此受到啟發(fā),在研制GnRH的核酸疫苗中,把編碼有3段GnRH重復(fù)序列的基因插入到所用的真核質(zhì)粒載體內(nèi),以進(jìn)一步提高GnRH的免疫原性。
      綜上所述,我們以HBcAg為免疫載體,插入3段GnRH重復(fù)序列,整合到真核質(zhì)粒載體中的編碼區(qū)域,配以CpG的佐劑效應(yīng),提供了一種抗GnRH核酸疫苗。
      在本發(fā)明的第二方面,提供生產(chǎn)抗GnRH核酸疫苗的方法,其技術(shù)路線詳述如下1.含有HBcAg全基因和8個(gè)CpG基元的真核質(zhì)粒載體pCR3.1-C-CpG的構(gòu)建從乙肝病人血樣中通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得編碼HBcAg全長183個(gè)氨基酸的基因片段,插入市售的真核表達(dá)載體pCR3.1-Uni(Invitrogen,USA)的多克隆位點(diǎn)中,并在HBcAg序列中引入限制性內(nèi)切酶AgeI的識(shí)別位點(diǎn),以供異源表位的插入。通過重組PCR擴(kuò)增獲得含有8個(gè)CpG基元的DNA片段,即(CpG)8,并將其插入pCR3.1-Uni的骨架的非編碼區(qū)域中,8個(gè)CpG基元之間可直接相連,也可以間隔有若干個(gè)脫氧核苷酸序列,且由于CpG無位置限制性,故可以插入質(zhì)粒骨架非編碼區(qū)的任意位置。由此構(gòu)建成質(zhì)粒載體pCR3.1-C-CpG。
      2.抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建根據(jù)GnRH氨基酸的組成設(shè)計(jì)引物,通過PCR的方法擴(kuò)增獲得編碼3段GnRH重復(fù)序列的基因片段,插入到上述所構(gòu)建的質(zhì)粒載體的AgeI酶切位點(diǎn)中,組成融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α,篩選后獲得重組基因工程菌。
      3.基因工程菌的發(fā)酵及抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒的大量分離純化以LB培養(yǎng)基為種子和發(fā)酵培養(yǎng)基,于37℃,PH6.8-7.2下進(jìn)行菌體發(fā)酵,結(jié)束后離心收集工程菌,用SDS堿裂解法對(duì)工程菌中的質(zhì)粒DNA進(jìn)行粗提。粗品采用陰離子交換樹脂DEAE纖維素DE52純化,將質(zhì)粒DNA粗品進(jìn)樣后,以NaCl進(jìn)行階段洗脫,先用0.3mol/L NaCl將雜質(zhì)(少量蛋白質(zhì)、基因組DNA、低分子量RNA)洗脫除去,再用0.6mol/L NaCl將質(zhì)粒DNA洗脫收集,所得的收集液用兩倍乙醇沉淀,離心去上清后得沉淀即為純化的質(zhì)粒DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純化的質(zhì)粒純度。
      在本發(fā)明的第三方面是抗GnRH核酸疫苗的用途。將純化的抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒直接免疫動(dòng)物,通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)表達(dá)出表面呈現(xiàn)有3段GnRH重復(fù)多肽的重組HBcAg病毒樣顆粒,激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生GnRH的特異性抗體??笹nRH抗體能與體內(nèi)內(nèi)源的GnRH相結(jié)合,阻斷GnRH的生理作用。因此,在畜牧業(yè)上,GnRH核酸疫苗可以用來代替手術(shù)閹割對(duì)牲畜和家禽的生殖進(jìn)行控制;在醫(yī)學(xué)上,該疫苗能用于前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等性激素依賴型腫瘤的治療。另外,質(zhì)粒DNA骨架上的CpG序列一方面作為佐劑能增強(qiáng)由GnRH引發(fā)的體液免疫,提高抗體的水平;另一方面能誘發(fā)機(jī)體分泌一系列的細(xì)胞因子(如IL-12、TNF-α、IL-6等),作用于腫瘤,抑制腫瘤的生長。本核酸疫苗兩個(gè)方面發(fā)揮作用,共同起到抗腫瘤的作用。


      圖1.真核表達(dá)質(zhì)粒載體pCR3.1-C-CpG的結(jié)構(gòu)框架圖(圖A)和抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3(圖B)的結(jié)構(gòu)框架圖。
      圖2.抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3中(CpG)8序列的測(cè)序結(jié)果。
      圖3.抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3中編碼區(qū)HBcAg-GnRH3序列的測(cè)序結(jié)果。
      圖4.各免疫組小鼠血清中抗GnRH抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果。表明只有抗GnRH核酸疫苗pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組能誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗GnRH抗體,而PBS陰性對(duì)照組和pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組的小鼠體內(nèi)均無抗GnRH抗體產(chǎn)生。圖例*PBS陰性對(duì)照組;◇pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組;◆pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組圖5.小鼠血清的Western檢測(cè)結(jié)果。在硝酸纖維素膜與pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清作用后,經(jīng)DAB顯色在膜上呈現(xiàn)相應(yīng)的印跡帶,表明pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組能誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗GnRH抗體。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白;2.AnsB-GnRH顯色條帶。
      圖6.各免疫組小鼠體內(nèi)腫瘤的平均大小(圖A)及平均重量(圖B)。以腫瘤與體重的質(zhì)量比(即每克小鼠體重中腫瘤的毫克數(shù)mg/g)來表示腫瘤的重量。結(jié)果表明PBS陰性對(duì)照組和pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組的前列腺癌腫瘤大小無明顯差異,而pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組腫瘤的生長得到了明顯抑制,其腫瘤大小與pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組相比下降了38.1%,與PBS陰性對(duì)照組相比下降了38.8%。圖例 PBS陰性對(duì)照組; pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組; pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組具體實(shí)施方式
      材料(1)菌株和質(zhì)粒宿主菌Escherichia coli DH-5a是基因工程常用工具菌種,與基因工程研究有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室一般都有保存。
      質(zhì)粒pCR3.1-Uni購自Invitrogen公司。
      質(zhì)粒AnsB-GnRH3內(nèi)含有編碼3段GnRH重復(fù)序列的基因片段,由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。
      (2)乙肝病毒提取自南京市第二醫(yī)院HBcAg陽性病人血清。
      (3)酶和試劑分子克隆工具酶購自MBI公司。
      PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。
      乙肝病毒基因組提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。
      其它試劑為上海生工生物工程有限公司訂購。
      (4)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基,配方見參考文獻(xiàn)Sambrook J,F(xiàn)ristsh E F,Maniatis T.Molecular Cloning;ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press,1989。該書是基因工程技術(shù)的經(jīng)典著作,在許多高校圖書館都有收藏。
      (5)DEAE-Cellulose DE52為Whatman公司產(chǎn)品。
      (6)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗為武漢博士德公司產(chǎn)品。
      (7)3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國西格馬(Sigma)公司產(chǎn)品。
      (8)96孔酶標(biāo)板為美國康寧(Corning)公司產(chǎn)品。
      (9)硝酸纖維素膜為美國Millipore公司產(chǎn)品。
      方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌在基因工程研究領(lǐng)域,這些都是常規(guī)操作方法,參見Sambrook J,F(xiàn)ristsh E F,Maniatis T.MolecularCloning;A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press,1989,pp.16-340。
      核酸的定量測(cè)定參見Sambrook J,F(xiàn)ristsh E F,Maniatis T.Molecular Cloning;A LaboratoryManual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press,1989,方法進(jìn)行。
      實(shí)施例1含有HBcAg全基因和8個(gè)CpG基元的真核質(zhì)粒載體pCR3.1-C-CpG的構(gòu)建用QIAamp DNA Blood Mini kit從南京市第二醫(yī)院乙肝陽性病人血清中提取乙肝病毒基因組RNA,并用市場(chǎng)銷售的隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA。根據(jù)乙肝核心抗原核苷酸序列合成兩條引物P1和P4,并以反轉(zhuǎn)錄獲得的乙肝病毒DNA為模板進(jìn)行PCR,經(jīng)94℃預(yù)變性5min,然后以94℃變性40s、58℃復(fù)性40s、72℃延伸90s共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,再72℃保溫10min,獲得編碼HBcAg全長183個(gè)氨基酸的基因片段。然后分兩步在HBcAg序列中的第80、8l位氨基酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸處引入AgeI位點(diǎn),為此再次合成兩條引物P2和P3。引物P1、P2和P4的5’端分別含有HindIII、AgeI和XbaI酶切位點(diǎn),引物P3的5’端依次含有PstI和AgeI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。第一步以P1和P3為引物,HBcAg全基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR,經(jīng)94℃預(yù)變性5min,然后以94℃變性40s、58℃復(fù)性40s、72℃延伸50s共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,再72℃保溫10min,獲得編碼HBcAg N端第1-80個(gè)氨基酸的基因片段,將其和pCR3.1-Uni均用HindIII、PstI雙酶切,用連接酶進(jìn)行連接得含有HBcAg N端第1-80個(gè)氨基酸基因片段的重組質(zhì)粒。第二步以P2和P4為引物,HBcAg全基因?yàn)槟0暹M(jìn)行PCR,經(jīng)94℃預(yù)變性5min,然后以94℃變性40s、58℃復(fù)性40s、72℃延伸60s共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,再72℃保溫10min,獲得編碼HBcAg C端第81-183氨基酸的基因片段,將其和上述含有HBcAg N端第1-80個(gè)氨基酸基因片段的重組質(zhì)粒均用AgeI、XbaI雙酶切,用連接酶進(jìn)行連接得含有HBcAg全基因(第80、81位氨基酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸處引入AgeI位點(diǎn))的真核質(zhì)粒載體。
      選取六堿基序列GACGTT為CpG基元,設(shè)計(jì)含有8個(gè)CpG基元的DNA片段,即(CpG)8,每個(gè)CpG基元之間相互插入1-5個(gè)寡核苷酸作為間隔。根據(jù)此DNA片段設(shè)計(jì)合成兩條相互互補(bǔ)的引物P5和P6,5’端均含有DraIII酶切位點(diǎn)。以P5和P6互為引物和模板進(jìn)行PCR,經(jīng)94℃預(yù)變性5min,然后以94℃變性40s、58℃復(fù)性40s、72℃延伸30s共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,再72℃保溫10min,獲得(CpG)8的DNA片段,將其和上述構(gòu)建的HBcAg全基因真核質(zhì)粒均用DraIII單酶切,用連接酶進(jìn)行連接使(CpG)8引入HBcAg全基因真核質(zhì)粒,命名為pCR3.1-C-CpG,其結(jié)構(gòu)框架見圖1。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH-5α后篩選獲得相應(yīng)的基因工程菌DH-5α/pCR3.1-C-CpG,從該工程菌中抽提的質(zhì)粒送至上海博亞生物技術(shù)有限公司DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,以進(jìn)一步驗(yàn)證CpG序列的正確性,(CpG)8序列測(cè)序結(jié)果見圖2。
      6條引物寡核苷酸序列如下P15’AAA AAG CTT ATG GAC ATT GAC ACG TAT AAA GAA 3’P25’ATC ACC GGT CGG GAA TTA GTA GTC GGT TAT GTC AAT G 3’P35’TTT TTC TGC AGA CCG GTT GGG TCT TCC AAA TTA CTT CC 3’P45’TTG TCT AGA CTA ACA TTG AGA TTC CCG AGA TTG3’P55’GGT CAC GTA GTG ACG TTC CTG ACG TTT CCA TGA CGT TCC TGA CGT TTAGAC GTT CTC TG 3’P65’TTT CAC TAC GTG GAT CCA ACG TCG AAC GTC AAA CGT CAG AGA ACGTCT AAA CGT CAG GA3’實(shí)施例2抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒pCR3.1-C-CpG-GnRH3的構(gòu)建根據(jù)GnRH多肽的氨基酸序列(EHWSYGLRPG),設(shè)計(jì)合成兩條引物Gl和G2,5’端均含有AgeI酶切位點(diǎn)。以G1和G2為引物,AnsB-GnRH3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR,經(jīng)94℃預(yù)變性5min,然后以94℃變性40s、58℃復(fù)性40s、72℃延伸35s共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,再72℃保溫10min,獲得編碼3段GnRH重復(fù)序列的基因片段,將其和pCR3.1-C-CpG質(zhì)粒均用AgeI單酶切,用連接酶進(jìn)行連接使3段GnRH重復(fù)序列基因插入pCR3.1-C-CpG質(zhì)粒中,即構(gòu)建成質(zhì)粒載體pCR3.1-C-CpG-GnRH3,其結(jié)構(gòu)框架圖見圖1。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH-5α后篩選獲得相應(yīng)的基因工程菌DH-5α/pCR3.1-C-CpG-GnRH3,從該工程菌中抽提的質(zhì)粒送至上海博亞生物技術(shù)有限公司DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,以進(jìn)一步驗(yàn)證HBcAg-GnRH3整個(gè)序列及其閱讀框的正確性,測(cè)序結(jié)果圖3。
      2條引物寡核苷酸序列如下G15’AAG ATC TTC AAC CAG TAC ACC GGT CCG GAA CAT TGG AGC 3’G25’CTC CGG AGC AGG GCA CGG CGG ACC GGT ACC ACC CGG ACG CAG ACC 3’實(shí)施例3基因工程菌的發(fā)酵及抗GnRH核酸疫苗真核質(zhì)粒的大量分離純化從平皿中挑取工程菌的單菌落接入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振搖培養(yǎng)8h至對(duì)數(shù)期作為種子液,以1/250接種量接入到含250mlLB液體培養(yǎng)基的1000ml搖瓶中,37℃劇烈振搖培養(yǎng)12-16h。所得發(fā)酵液于5000rpm 4℃離心15min,然后將細(xì)菌沉淀物重懸于9ml溶液I[50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)]中,再加入100μlRNaseA溶液[10mg/ml RNase A,10mmol/L Tris-HCl(pH7.5),15mmol/L NaCl],充分混勻后冰浴10min。緩慢加入20ml新配制的溶液II
      ,輕輕混勻后于室溫放置5min。加入10ml用冰預(yù)冷的溶液III[5mol/L KAc 60ml,HAc 11.5ml,H2O 28.5ml],充分混勻內(nèi)容物,至不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相為止,然后冰浴10min。于4℃12000rpm離心30min,棄去沉淀物,上清液中加入0.6倍體積的異丙醇,充分混勻至不出現(xiàn)分層后室溫放置10min。室溫以12000rpm離心30min,棄上清,沉淀用70%乙醇洗滌,待乙醇揮發(fā)盡后用2ml的TE(pH8.0)緩沖液溶解沉淀,即得質(zhì)粒DNA粗品。粗品采用陰離子交換樹脂DEAE纖維素DE52純化,將質(zhì)粒DNA粗品進(jìn)樣后,以NaCl進(jìn)行階段洗脫,先用0.3mol/L NaCl將雜質(zhì)(少量蛋白質(zhì)、基因組DNA、低分子量RNA)洗脫除去,再用0.6mol/LNaCl將質(zhì)粒DNA洗脫收集,所得的收集液用兩倍乙醇沉淀,離心去上清后得沉淀即為純化的質(zhì)粒DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純化的質(zhì)粒純度并進(jìn)行定量。
      實(shí)施例4抗GnRH核酸疫苗免疫動(dòng)物用無菌的PBS(磷酸緩沖液)將核酸疫苗或載體質(zhì)粒稀釋至終濃度為1μg/μl。取5周齡C57BL/6雄性小鼠,pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組、pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組和PBS陰性對(duì)照組各12只。每次免疫前在每只小鼠的兩側(cè)脛骨前肌各注射50μl的0.25%布比卡因,共100μl,進(jìn)行預(yù)處理,5天后于每只小鼠兩側(cè)脛骨前肌各注射50μl的PBS或相應(yīng)組質(zhì)粒溶液(1μg/μl),共100μl,每隔2周加強(qiáng)免疫1次(免疫前5天仍注射布比卡因),共3次,第2次免疫后1、2、4、6、8、10周眼底靜脈叢取血,離心取血清-20℃冷凍保存,留待檢測(cè)。
      實(shí)施例5抗GnRH抗體的ELISA檢測(cè)以純化的AnsB-GnRH融合蛋白為包被抗原4℃過夜包被96孔ELISA酶標(biāo)板,每孔100μg融合蛋白。包被后,用5%牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉1小時(shí)。實(shí)施例4中所得的抗血清用pH7.5的PBS(含5%BSA)稀釋50倍,然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時(shí)。用PBST(含0.05%Tween-20)洗滌6次后每孔加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記),37℃作用1小時(shí)。PBST洗滌6次后,每孔加入100μl過氧化氫尿素和3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液于37℃顯色20分鐘后,加入50μl 2MH2SO4終止反應(yīng),并于450nm波長下,測(cè)定各孔吸光度值。小鼠血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果見圖4,可以看出,只有核酸疫苗pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗GnRH抗體。
      實(shí)施例6抗GnRH抗體的Western檢測(cè)將純化的AnsB-GnRH融合蛋白與標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白經(jīng)15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,于30V電壓電泳過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上;用PBS漂洗膜數(shù)次后在室溫下將膜放入5%BSA封閉液中攪動(dòng)孵育2小時(shí),再用PBS漂洗2次,每次5min;實(shí)施例4中所得的抗血清稀釋10倍后與硝酸纖維素膜37℃下攪動(dòng)孵育1小時(shí),用PBS將膜漂洗4次,每次5min;加入稀釋400倍的羊抗小鼠IgG-HRP(辣根過氧化物酶)二抗,再與硝酸纖維素膜37℃下攪動(dòng)孵育1小時(shí)后,用PBS將膜漂洗4次,每次5min;最后加入DAB顯色試劑顯色10min。小鼠血清的Western檢測(cè)結(jié)果見圖5,在硝酸纖維素膜與pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清作用后,經(jīng)DAB顯色在膜上呈現(xiàn)相應(yīng)的印跡帶,表明pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組能誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗GnRH抗體。
      實(shí)施例7抗GnRH核酸疫苗的藥效學(xué)研究用無菌的PBS將核酸疫苗或載體質(zhì)粒稀釋至終濃度為1μg/μl。取5周齡C57 BL/6雄性小鼠,pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組、pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組和PBS陰性對(duì)照組各7只。每次免疫前在每只小鼠的兩側(cè)脛骨前肌各注射50μl的0.25%布比卡因,共100μl,進(jìn)行預(yù)處理,5天后于每只小鼠兩側(cè)脛骨前肌各注射50μl的PBS或相應(yīng)組質(zhì)粒溶液(1μg/μl),共100μl,每隔2周加強(qiáng)免疫1次(免疫前5天仍注射布比卡因),共3次。3次免疫結(jié)束后兩周每只小鼠接種RM-1前列腺癌細(xì)胞。
      用戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠,解剖,暴露前列腺,于每只小鼠前列腺內(nèi)接種0.02ml(2×107個(gè)/ml)RM-1小鼠前列腺癌細(xì)胞后,用手術(shù)針線縫合小鼠。30天后,處死每組小鼠,剝離腫瘤,稱重,用福爾馬林溶液固定,比較各組腫瘤大小情況。
      以腫瘤與體重的質(zhì)量比(即每克小鼠體重中腫瘤的毫克數(shù))來表示腫瘤的重量,經(jīng)稱量,每組腫瘤平均大小及平均重量見圖6??梢钥闯?,PBS陰性對(duì)照組和pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組的前列腺癌腫瘤大小無明顯差異,而pCR3.1-C-CpG-GnRH3實(shí)驗(yàn)組腫瘤的生長得到了明顯抑制,其腫瘤大小與pCR3.1-C-CpG載體對(duì)照組相比下降了38.1%,與PBS陰性對(duì)照組相比下降了38.8%。
      權(quán)利要求
      1.一種抗促性腺激素釋放激素(GnRH)核酸疫苗,其特征為真核質(zhì)粒載體內(nèi)含有編碼乙肝核心抗原(HBcAg)的DNA序列,并在該序列中插入編碼3段GnRH多肽重復(fù)序列的基因片段。同時(shí)在該核酸疫苗真核質(zhì)粒載體的非編碼區(qū)域中引入具有免疫刺激作用的CpG序列。
      2.權(quán)利要求2所述的核酸疫苗,其特征為HBcAg顆粒表面插入了3段GnRH重復(fù)多肽,以增強(qiáng)GnRH自身的免疫原性。GnRH為一10肽激素,因此插入的3段GnRH重復(fù)多肽的氨基酸序列為GluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyGluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGly。
      3.權(quán)利要求1所述的核酸疫苗,其特征為用于核酸疫苗的真核質(zhì)粒載體非編碼區(qū)內(nèi)插入了由8個(gè)CpG基元組成的免疫刺激序列,簡(jiǎn)稱(CpG)8。該核酸疫苗選用了六堿基序列GACGTT作為CpG基元,每個(gè)CpG基元之間相互插入1-5個(gè)寡核苷酸作為間隔。由于CpG沒有位置限制性,故可以插入質(zhì)粒骨架非編碼區(qū)內(nèi)的任意位置,發(fā)揮其免疫刺激作用,增強(qiáng)GnRH在體內(nèi)的免疫應(yīng)答。
      4.一種生產(chǎn)該抗GnRH核酸疫苗的方法,包括用化學(xué)合成法和PCR法合成編碼3段GnRH重復(fù)序列、乙肝核心抗原及(CpG)8的DNA片段,將這些片段分步插入真核質(zhì)粒載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選獲得相應(yīng)的基因工程菌。工程菌經(jīng)發(fā)酵后用SDS堿裂解法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行粗提,得到的粗品經(jīng)陰離子交換樹脂DEAE纖維素DE52純化后,用乙醇沉淀得質(zhì)粒DNA純品。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸疫苗,其特征在于免疫動(dòng)物后能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗GnRH抗體,該抗體與體內(nèi)的GnRH結(jié)合,阻斷GnRH發(fā)揮其生理作用,可用于前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等性激素依賴型腫瘤的治療,也可用于對(duì)牲畜和家禽進(jìn)行生育控制。
      6.根據(jù)權(quán)力要求1所述的抗GnRH核酸疫苗,其特征在于可與藥物載體組合制成藥物組合物。
      7.根據(jù)權(quán)力要求1所述的抗GnRH核酸疫苗,其特征在于可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
      全文摘要
      本發(fā)明提供一種抗促性腺激素釋放激素(GnRH)核酸疫苗及制備方法。該核酸疫苗以乙肝核心抗原為免疫載體,插入3段GnRH重復(fù)序列,以增強(qiáng)GnRH的免疫原性。同時(shí)在該核酸疫苗真核質(zhì)粒載體的非編碼區(qū)域內(nèi)引入了多個(gè)未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鳥嘌呤核苷酸(CpG)基元組成的免疫刺激序列。該核酸疫苗免疫機(jī)體后能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗GnRH抗體,并能與體內(nèi)內(nèi)源的GnRH相結(jié)合,阻斷GnRH發(fā)揮其生理作用,可用于前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等性激素依賴型腫瘤的治療,也可用于對(duì)牲畜和家禽進(jìn)行生育控制。
      文檔編號(hào)A61P35/00GK1596977SQ20041004144
      公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月21日
      發(fā)明者劉景晶, 朱政, 端鵬, 徐進(jìn)署, 茅丹, 吳潔, 曹榮月 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)
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