專利名稱：長(zhǎng)效的人干擾素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用血清白蛋白重組技術(shù)制造人干擾素類似物。生物實(shí)驗(yàn)證明這種新型的干擾素類似物與干擾素有相同的體內(nèi)及體外生物活性。干擾素類似物是酵母表達(dá)的由白蛋白和干擾素形成的融合蛋白，可用于組成長(zhǎng)效重組蛋白藥物，旨在提高重組蛋白藥物的療效。
背景技術(shù)：
1.白蛋白人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中蛋白總量的一半。白蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維持血壓的一個(gè)重要因素。血清白蛋白是一種球狀非糖基化的、分子量為65千道爾頓的血清蛋白質(zhì)。人血清白蛋白基因位于4號(hào)染色體上，有16961個(gè)堿基對(duì)，分為15個(gè)間隔區(qū)。經(jīng)RNA加工拼接后形成的mRNA可編碼一個(gè)具有585個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。這一蛋白(白蛋白前體)再通過(guò)高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除引導(dǎo)多肽，而分泌到細(xì)胞外。血清白蛋白有35個(gè)半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一個(gè)有17個(gè)二硫鍵的單體(參見Brown JR，“白蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用”Pergamon，紐約，1977)。當(dāng)沒(méi)有分泌多肽時(shí)，在酵母細(xì)胞內(nèi)的白蛋白產(chǎn)物是錯(cuò)配狀態(tài)，將失去90％的抗原性(與血漿中自然狀態(tài)白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合體。現(xiàn)在用于臨床的白蛋白均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達(dá)白蛋白(rHSA)的生產(chǎn)已在專利EP330 451和EP361991中公開。
白蛋白具有多種多態(tài)體及30種不同的遺傳雜分子(Weikamp，CR等，人類遺傳年報(bào)，37219-226，1973)。血清白蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)由X-光衍射法測(cè)定(Carter，科學(xué)，244，1195-1198，1989)。白蛋白是血液中的主要成分，在人體內(nèi)含量為每升血液含40克，半衰期壽命為14-20天。綜上所述，白蛋白具有極大的優(yōu)勢(shì)使之可抵御生物體內(nèi)酶的作用，并可使治療性蛋白質(zhì)以較高劑量使用。
利用基因工程技術(shù)，將人血清白蛋白與人生長(zhǎng)激素在酵母菌中表達(dá)為融合蛋白，該融合蛋白增加了人生長(zhǎng)激素在血清中和儲(chǔ)存時(shí)的穩(wěn)定性。該項(xiàng)技術(shù)已在中國(guó)的專利申請(qǐng)CN1207131中公開。同理，人血清白蛋白與CD4蛋白受體形成融合蛋白后融合蛋白對(duì)HIV-1病毒的親和性與CD4受體蛋白質(zhì)單體相比有相同或更高的結(jié)合度(美國(guó)專利6,165,470)。上述文獻(xiàn)均在此引為參考文獻(xiàn)。
2.干擾素干擾素是多功能細(xì)胞因子異源家族成員之一，其首先被發(fā)現(xiàn)的生物活性是抵抗病毒感染。多年以來(lái)，干擾素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今，發(fā)現(xiàn)干擾素有許多其它生物功能，如作用于細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫調(diào)節(jié)等活性可能具有更大的生物學(xué)意義。
干擾素有兩個(gè)完全不同的家族，超級(jí)家族干擾素-α/β(也稱I型干擾素)包括一組結(jié)構(gòu)相關(guān)基因和蛋白，可進(jìn)一步分為IFN-αIIFN-αII，和IFN-β(表1)亞族。另一亞族包括單一基因和其編碼的蛋白IFN-γ(也稱II型干擾素或免疫干擾素)。應(yīng)該清楚IFN-γ在結(jié)構(gòu)上與IFN-α/β超級(jí)家族無(wú)相關(guān)性，由于歷史的原因，才把它們放在一起討論。Isaacs和Lindenmann于1957年首先發(fā)現(xiàn)干擾素是被病毒感染的細(xì)胞的產(chǎn)物，并能誘導(dǎo)細(xì)胞抵抗同類或不同類的病毒的侵染。功能相關(guān)的病毒抑制蛋白(現(xiàn)稱干擾素-γ)是Wheelock于1965年發(fā)現(xiàn)并描述為“干擾素類似物”，它是有絲分裂原激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)。多年來(lái)，區(qū)分干擾素-γ和其它類型的干擾素的唯一特性是干擾素-γ缺乏Ph 2穩(wěn)定性(Wheelcok 1965)和不同的抗原特異性(Youngner andSalvin 1973)。直到20世紀(jì)80年代初期，各主要類型干擾素的基因和蛋白序列被揭示，才弄清楚不同類型干擾素之間的關(guān)系。人們才認(rèn)識(shí)到干擾素-γ是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，干擾素-α/β的潛在作用可以是更廣義的細(xì)胞和組織。
干擾素-α/β超級(jí)家族代表典型的干擾素。第一個(gè)清楚被闡述的是I類干擾素，研究表明它來(lái)源于人白細(xì)胞和纖維原細(xì)胞，具有不同的抗原性(Havell等，1975)。以后，源于白細(xì)胞和纖維原細(xì)胞的干擾素被分別命名為干擾素-α和干擾素-β(COMMITTEE ON INTERFERON NOMENCLATURE 1980)。基因克隆研究揭示了大多數(shù)干擾素的結(jié)構(gòu)，已確定至少24個(gè)非等位人干擾素-α基因和假基因?？蓪⑦@些基因分為二個(gè)不同的亞類IFN-αI和-αII(Weissmann and Weber 1986)。IFN-αI亞類包含一些有潛在功能的基因和數(shù)個(gè)假基因。IFN-αII亞類僅有一個(gè)功能基因和5至6個(gè)非等位假基因。干擾素-αI基因編碼的成熟蛋白包括165-166個(gè)氨基酸，干擾素-αII基因編碼的成熟蛋白有172個(gè)氨基酸。編碼N末端分泌信號(hào)肽序列，通常為23個(gè)氨基酸殘基，成熟干擾素在從細(xì)胞中釋放出來(lái)前，其信號(hào)肽序列被酶水解。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所有類型的人干擾素-αI基因和蛋白序列存在高度同源性，而干擾素-αII的序列則與干擾素-αI有很大的不同。據(jù)此，人們將它們分成不同的亞族(Capon等，1985)。實(shí)際上，干擾素-αII已經(jīng)被命名為干擾素-ω(Adolf 1987)。
干擾素-α由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞或成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，其它類型細(xì)胞如被病毒、核酸、糖皮質(zhì)激素以及其它低分子量物質(zhì)誘導(dǎo)也能產(chǎn)生的干擾素-α，其分子量在19道爾頓至26道爾頓之間。干擾素的作用廣泛，最主要的是抗病毒和抗寄生蟲。此外，干擾素-α還有抗某些腫瘤細(xì)胞的增殖作用。人干擾素-α缺乏潛在的N-糖基化位點(diǎn)，大多數(shù)天然形式的α亞族成員沒(méi)有糖基化(Pestka 1983)。有些天然的人干擾素-α已被純化到均一，分子量在16000～21000之間(Rubinstein et al.1981)。分子量存在明顯差別的原因還未完全弄清楚。
人干擾素-β的單一基因編碼166個(gè)氨基酸長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。干擾素-β和干擾素-α亞族成員之間氨基酸的同源性約為25％～30％，核酸序列的同源性約為45％(Taniguchiet al.1980)。另外，在其轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的5’端區(qū)域有高度同源性，表明干擾素-α和干擾素-β的基因常常是協(xié)同誘導(dǎo)的(Degrave等，1981)。
干擾素是一類重要的生物藥物，已被用于治療多種疾病，包括免疫性疾病、癌癥以及提高機(jī)體抗感染的免疫力。至今，已有5種人干擾素即α、β、γ、ω以及一種新的人類和鼠的干擾素ε已經(jīng)用于臨床診斷和治療。目前臨床使用干擾素治療乙型肝炎和丙型肝炎以及多種癌癥如慢性骨髓性白血病。
干擾素用于治療乙型肝炎和丙型肝炎以及多種癌癥如慢性骨髓性白血病。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染引起的肝臟炎癥。丙型肝炎病毒是最常見的與血液相關(guān)的慢性疾病，在中國(guó)有近八千萬(wàn)攜帶者，在美國(guó)有四百萬(wàn)攜帶者，導(dǎo)致全世界每年有一百萬(wàn)人死亡。慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的肝臟炎癥，乙型肝炎病毒能發(fā)展成肝癌和肝硬化。全世界有近五億人感染乙型肝炎病毒。
病毒感染過(guò)程中產(chǎn)生的干擾素-α/β能夠阻止病毒的擴(kuò)散并促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)(Gresser等，1976)。近年來(lái)，有幾類干擾素制劑已被批準(zhǔn)臨床使用。在美國(guó)，大腸桿菌表達(dá)的重組人干擾素-α2(IFN-α-2a)和干擾素-αA(IFN-α-2b)已被批準(zhǔn)用于毛細(xì)胞白血病的治療。干擾素-α2和干擾素-αA都是干擾素-α1亞族成員，兩者的區(qū)別僅在23位點(diǎn)的一個(gè)氨基酸差別(干擾素-α2是精氨酸，干擾素-αA是賴氨酸)。一種制劑被批準(zhǔn)用于治療尖銳濕疣，另一種制劑被一些國(guó)家批準(zhǔn)用于臨床，例如人淋巴細(xì)胞的Namalwa系產(chǎn)生的幾種IFN-α亞型的天然的混合物或培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的天然的人IFN-β。在某些國(guó)家，這些被批準(zhǔn)的干擾素制劑用于慢性活動(dòng)性乙型肝炎，急性病毒性腦炎以及鼻咽癌。在德國(guó)，大腸桿菌表達(dá)的重組人干擾素-γ已被批準(zhǔn)用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。批準(zhǔn)和試驗(yàn)的干擾素的治療應(yīng)用廣泛地涉及這一主題(Finter andOldham 1985)。低劑量的干擾素-β正用于刺激因紅細(xì)胞成熟障礙的紅細(xì)胞生成(Michalevicz，US5,104,653)。
利用人干擾素-α基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生的新的多肽經(jīng)過(guò)分離和鑒定，證明這些多肽具有干擾素活性，如抗病毒、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)以及細(xì)胞物質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。這些新干擾素被Innis在美國(guó)專利5,098,703中稱為干擾素-α-67，在美國(guó)專利4,975,276中稱為干擾素-α-54，在美國(guó)專利4,973,479中稱為干擾素-α-61。
純化的干擾素-γ和白介素-2的混合制劑可用于治療腫瘤。優(yōu)選地，干擾素-γ和白介素-2是由重組細(xì)胞合成得到(Palladino US5,082,658)。
Johnson等在美國(guó)專利6,174,996提到，由干擾素-τ多肽的N末端區(qū)域和另一類干擾素多肽的C末端區(qū)域如干擾素-α或干擾素-β的融合蛋白與相應(yīng)的未經(jīng)修飾的干擾素I型相比，具有減低對(duì)細(xì)胞的毒性。這是僅有的提到如何制備干擾素融合蛋白的專利。
Glue等在美國(guó)專利5,908,621中公開了一種將PEG12000與α干擾素共價(jià)結(jié)合來(lái)制備干擾素-α使之用于慢性丙型肝炎病人的治療。這里提到如何制備長(zhǎng)效和緩釋形式的干擾素。Shechter等報(bào)道(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001 January 30；98(3)1212-1217)通過(guò)共價(jià)連接FMS(2-硫代-9-氟芴基甲氧羰基(fluorenylmethoxycarbonyl)在干擾素-α2的氨基酸基團(tuán)上能延長(zhǎng)人干擾素-α2的半衰期。
Leibowitz等在美國(guó)專利US4,892,743報(bào)道了一個(gè)發(fā)明，其特征是構(gòu)建一個(gè)新的干擾素雜合子，它由161和/或162個(gè)氨基酸組成。這個(gè)雜合子的新穎性不僅在于其結(jié)構(gòu)，還在于該雜合子是剪切縮短過(guò)的干擾素-α。因此，該干擾素雜合子并不存在于自然界中。
Chang等在美國(guó)專利US5,723,125中報(bào)道了融合重組蛋白，由人干擾素，優(yōu)選的是干擾素-α和人免疫球蛋白Fc片斷，優(yōu)選的是γ4鏈，通過(guò)由一個(gè)連接肽Gly GlySer Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser連接而組成的融合蛋白。
有些研究論文報(bào)道多種干擾素的聯(lián)合使用可對(duì)病人較有利。如Trotta在美國(guó)專利US5,190,751中提到人干擾素-α和干擾素-γ聯(lián)合使用，或是同時(shí)或是先后使用，能抑制白血病T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，干擾素-α優(yōu)先的是干擾素-α-2b。
然而，這些使用方式的一般特征是存在于各種組織體液中的干擾素-α快速失活(O′Kelly等，1985.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.178，407-411)，導(dǎo)致細(xì)胞因子在注射后的數(shù)小時(shí)內(nèi)從血漿中消失(Rostaing等，1998，J.Am.Soc.Nephrol.9，2344-2348)。與其它類型的蛋白藥物使用方法不同的是，在體內(nèi)，干擾素-α是通過(guò)在循環(huán)系統(tǒng)中的血清蛋白酶的蛋白質(zhì)水解進(jìn)行消除。因此，在臨床上用于治療病毒感染和癌癥，非常需要具有長(zhǎng)效性干擾素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及體外制備干擾素類似物的方法，特別是這種干擾素類似物能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗病毒侵染，刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答，提高疾病治療的水平。
本發(fā)明涉及干擾素類似物，即人干擾素與人血清白蛋白的融合蛋白，目的是解決使用傳統(tǒng)干擾素在治療上的不足?？傊?，與干擾素比較，本發(fā)明涉及的干擾素類似物具有下列優(yōu)點(diǎn)1)能刺激機(jī)體對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答；2)干擾素類似物在體內(nèi)的存留時(shí)間長(zhǎng)；3)起最大的治療作用以及減小傳統(tǒng)干擾素的潛在的副作用或毒性。
本發(fā)明還提供一種干擾素類似物的治療方法。這些方法包括由干擾素類似物組成的藥物制劑以及治療的有效劑量。藥物制劑可以是任何藥學(xué)可接受的能夠使干擾素類似物穩(wěn)定的任何賦形劑制劑形式。藥物制劑可以進(jìn)一步是天然的或重組的人白蛋白，和/或不同的干擾素類似物。
另外，本發(fā)明還涉及一種利用酵母生產(chǎn)干擾素類似物的高效低成本的方法。特別是用畢氏酵母生產(chǎn)人白蛋白分別與干擾素-α-1b，干擾素-α-2b，干擾素-ω、干擾素-β和干擾素-γ組成的融合蛋白，這種融合蛋白在血漿中的穩(wěn)定性非常高并且血漿半衰期長(zhǎng)，其體內(nèi)、體外的生物保護(hù)功能與傳統(tǒng)的干擾素相同。
1.血清白蛋白-干擾素融合蛋白本發(fā)明描述了編碼人血清白蛋白和一種干擾素所形成的融合基因，例如血清白蛋白-干擾素融合基因。還應(yīng)該提出的是其它類型的白蛋白也能用于制備本發(fā)明所提到的干擾素類似物。
干擾素可以包括干擾素家族的任何成員。在一具體實(shí)例中，干擾素是被病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生的天然細(xì)胞因子。這樣的干擾素在“肽生長(zhǎng)因子及其受體II”(Sporn andRoberts，Spring-Verlag Heidelberg，New York Inc.，USA.pp3-38)中被Vilcek(1991，)稱為“干擾素”，這一名稱一直沿用至今。
干擾素的特別實(shí)例包括，但不限于，干擾素-α-1(IFNA-1)、干擾素-α-2(IFNA-2)、干擾素-α-4(IFNA-4)、干擾素-α-5(IFNA-5)、干擾素-α-6(IFNA-6)、干擾素-α-7(IFNA-7)、干擾素-α-8(IFNA-8)、干擾素-α-10(IFNA-10)、干擾素-α-12(IFNA-12)、干擾素-α-13(IFNA-13)、干擾素-α-14(IFNA-14)、干擾素-α-16(IFNA-16)、干擾素-α-17(IFNA-17)、干擾素-α-21(IFNA21)、干擾素-β-1(IFNB-1)、干擾素-β-2(IFNB-2，也稱白介素-6)、干擾素-λ-1(白介素-29)、干擾素-λ-2(白介素-28A)或干擾素-ε。
在本發(fā)明中重點(diǎn)描述三種不同的干擾素類似物的制備。白蛋白-干擾素-α(包括-1b、-2a、-2b和-ω)，白蛋白-干擾素-β，以及白蛋白-干擾素-γ。其他種類的干擾素家族成員能用同樣的方法制備新的干擾素類似物。
干擾素可直接連接在白蛋白的N末端或C末端形成干擾素類似物。也可以，通過(guò)一個(gè)連接肽來(lái)連接白蛋白和干擾素以形成融合蛋白，血清白蛋白-連接肽-干擾素或干擾素-連接肽-血清白蛋白。連接肽長(zhǎng)度優(yōu)選是2-100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選是5-50個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為14-30個(gè)氨基酸。連接肽長(zhǎng)度可短至白蛋白大分子對(duì)干擾素形成的位阻保持最小，例如(G4S)3-4。連接肽有利于干擾素與其受體結(jié)合。但連接肽的加入可能使融合蛋白在作為藥物的使用時(shí)產(chǎn)生額外的免疫原性，最優(yōu)選的是沒(méi)有連接肽。
融合蛋白可以是分泌型蛋白，可與人的特異性血清白蛋白抗體相結(jié)合，優(yōu)選地，其與干擾素的特異性抗體相結(jié)合。
本發(fā)明提供體外制備人干擾素類似物的方法，用于疾病的治療以提高健康水平。特別是人血清白蛋白(HSA)和干擾素的重組融合蛋白能1)保持干擾素原有的在體內(nèi)、體外的生物學(xué)功能；2)在體內(nèi)緩慢釋放來(lái)維持最大的抗病毒效果；3)減少潛在的干擾素使用時(shí)伴隨的副作用或毒性。此外，利用酵母菌生產(chǎn)重組蛋白成本低、效率高。
本發(fā)明同時(shí)提供一種獨(dú)立的核苷酸編碼血清白蛋白和干擾素融合蛋白，本發(fā)明還包括所有在體內(nèi)體外具有干擾素生物功能的蛋白。特別是，包括，但不局限于，干擾素-α(1b、2a和/或2b)、干擾素-β、干擾素-ω和/或干擾素-γ以及其它的人干擾素。
優(yōu)選地，干擾素可與血清白蛋白的N端或C端直接連接。連接肽L可應(yīng)用于連接白蛋白和干擾素以形成融合蛋白。即白蛋白-連接肽-干擾素或干擾素-連接肽-白蛋白。連接肽的長(zhǎng)度優(yōu)選的是2至100個(gè)氨基酸，較優(yōu)選的是5至50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選的是14至30個(gè)氨基酸。連接肽的長(zhǎng)度應(yīng)以使白蛋白大分子與干擾素分子之間的空間阻隔最小，如(G4S)3-4。連接肽的加入可能使融合蛋白在作為藥物的使用時(shí)產(chǎn)生額外的免疫原性，最優(yōu)選的是沒(méi)有連接肽。
在實(shí)施例中，DNA核苷酸序列編碼干擾素類似物-α-1b(HSA-IFN-α-1b)，其核苷酸序列至少有90％與SEQ ID NO.1同源(圖1)。優(yōu)選地，多核苷酸序列至少有95％與序列SEQ ID NO.1同源。由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2[干擾素類似物-α-1b]。
在實(shí)施例中，核苷酸序列編碼干擾素類似物-α-2b(HSA-IFN-α-2b)，其核苷酸序列至少有90％與SEQ ID NO.3同源。優(yōu)選地，核苷酸序列至少有95％與SEQ ID NO.3同源。由該核苷酸編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.4[干擾素類似物-α-2b]。
在另一實(shí)施例中，核苷酸序列編碼干擾素類似物-β(HSA-IFN-β)，其核苷酸序列至少有90％與SEQ ID NO.5同源。優(yōu)選地，該核苷酸序列至少有95％與SEQ ID NO.5同源。由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.6[干擾素類似物-β]。
在另一實(shí)施例中，核苷酸序列編碼的干擾素類似物-ω(HSA-IFN-ω)，其核苷酸序列至少有90％與SEQ ID NO.7同源。優(yōu)選地，該核苷酸序列至少有95％與SEQ IDNO.7同源。由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.8[干擾素類似物-ω]。
在另一實(shí)施例中，核苷酸序列編碼干擾素類似物-γ(HSA-IFN-γ)，其核苷酸序列至少有90％與SEQ ID NO.9同源。優(yōu)選地，該核苷酸序列至少有95％與SEQ IDNO.9同源。由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.10[干擾素類似物-γ]。
在另一實(shí)施例中，核苷酸序列編碼人血清白蛋白(HSA)，其核苷酸序列至少有90％與SEQ ID NO.11同源。優(yōu)選地，該核苷酸序列至少有95％與SEQ ID NO.11同源。由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.12[人血清白蛋白]。
優(yōu)選地，干擾素的核苷酸序列進(jìn)一步至少有95％與SEQ ID NO.13、15、17、19或21同源。由這些核苷酸序列編碼的干擾素氨基酸序列為SEQ ID NO.14、16、18、20或22。
依據(jù)實(shí)施例，干擾素可以是，但不限于干擾素α-1(IFNA-1)、α-2(IFNA-2)、α-4(IFNA-4)、α-5(IFNA-5)、α-6(IFNA-6)、α-7(IFNA-7)、α-8(IFNA-8)、α-10(IFNA-10)、α-12(IFNA-12)、α-13(IFNA-13)、α-14(IFNA-14)、α-16(IFNA-16)、α-17(IFNA-17)、αa-21(IFNA21)；干擾素-β-1(IFNB-1)、干擾素-β-2(IFNB-2，也稱白介素-6，IL-6)，干擾素-λ-1(白介素-29)，干擾素-λ-2(白介素-28A)或干擾素-ε。
與上述的核苷酸有一定程度的序列相似性的核苷酸是指例如，能編碼一種干擾素類似物，并在相似的核苷酸序列之間具有至少95％的序列同源性的核苷酸。其包括核苷酸鏈上每百個(gè)核苷酸有5個(gè)點(diǎn)突變，并也是編碼干擾素類似物的核苷酸序列。換句話講，任何核苷酸鏈與上述編碼干擾素類似物的核苷酸鏈具有95％的序列同源性，即，即便有多達(dá)5％的核苷酸個(gè)體可以被替換、刪減或插入等，均與本發(fā)明所指的核苷酸序列相同。無(wú)論是在5’或3’端，或在兩端之間的任何位點(diǎn)發(fā)生的突變，還是以單體或多體發(fā)生的突變均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)踐上，任何特指的核酸分子，只要具有90％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性，就在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。而且由核苷酸序列編碼的干擾素類似物也可由常規(guī)已知的計(jì)算機(jī)軟件，如Bestfit軟件(Wisconsin)序列分析軟件包來(lái)獲得。Bestfit應(yīng)用區(qū)域同源性比較方法(文獻(xiàn)Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2482-489(1981)來(lái)尋找兩個(gè)序列之間最佳的同源序列。當(dāng)應(yīng)用該軟件或其它任何具有類似的DNA序列對(duì)比分析時(shí)，某一特定的序列如與本發(fā)明所提出的序列有95％以上的序列同源性，均視為與本發(fā)明所述的序列相同源。
在室溫或低溫條件下，干擾素類似物貯藏期比傳統(tǒng)干擾素在同樣條件下，具有2倍以上，優(yōu)選達(dá)4倍或6倍或更優(yōu)選達(dá)10倍以上的貯存期。
本發(fā)明還涉及用人血清白蛋白作為載體，攜帶治療性的蛋白質(zhì)藥物，如干擾素來(lái)處理和治療各種疾病或異常，或那些病毒性感染患者。在本發(fā)明中，干擾素類似物可以用于脊椎動(dòng)物，優(yōu)選地是人類，并通過(guò)不同途徑，包括但不局限于口服、非經(jīng)腸胃、腹腔膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、舌下、肌內(nèi)、腸內(nèi)、唾液腺、鼻內(nèi)、脂質(zhì)法，通過(guò)吸入、注射、陰道、眼內(nèi)方法給藥。干擾素類似物也可通過(guò)局部性釋放(如導(dǎo)管或支架管)，包括皮下、脂肪下、關(guān)節(jié)下及膜內(nèi)，并可以做成緩釋劑。具體地，干擾素類似物主要通過(guò)注射法和噴，滴法給藥。
當(dāng)在動(dòng)物體內(nèi)使用時(shí)，干擾素類似物的血漿半衰期與傳統(tǒng)干擾素相比可延長(zhǎng)2倍、優(yōu)選的是4倍、更優(yōu)選的是6倍、最優(yōu)選的是10倍。
本發(fā)明所述的干擾素類似物可以與天然或重組的白蛋白聯(lián)合使用，優(yōu)選的是以治療的有效劑量和比例聯(lián)合使用。
由血清白蛋白與干擾素融合后形成的干擾素類似物將有更長(zhǎng)的貯藏期和在血漿中更長(zhǎng)的半衰期，這便于運(yùn)輸，節(jié)省貯藏費(fèi)用以及減少藥物的使用量或使用次數(shù)。
相信其它的具有抗病毒功能的多肽或能夠阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的多肽與血清白蛋白形成融合蛋白時(shí)，在維持同樣生物學(xué)功能和治療功能的同時(shí)，使得多肽具有較長(zhǎng)的貯藏期及血漿半衰期，例如阻止HIV病毒侵入目標(biāo)細(xì)胞的T20多肽就可與血清白蛋白形成融合蛋白，而獲得具有長(zhǎng)效功能的多肽藥物。
2.用于表達(dá)干擾素類似物的宿主系統(tǒng)本發(fā)明中的干擾素類似物核苷酸序列可利用重組克隆技術(shù)引入宿主細(xì)胞，以使干擾素類似物得以表達(dá)。
一般來(lái)說(shuō)，宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)方法將攜帶有本發(fā)明中所提到的各種可能組合的干擾素類似物核苷酸序列的載體質(zhì)粒以侵入方式、病毒感染“噬菌體”等形式轉(zhuǎn)入宿主系統(tǒng)中。工程宿主細(xì)胞可以在含常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并經(jīng)過(guò)適當(dāng)修改以利于啟動(dòng)子。以適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞娇刂七x擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼干擾素類似物的核苷酸鏈的培養(yǎng)條件，如溫度、pH和選擇表達(dá)細(xì)胞。
按本發(fā)明所述，重組載體攜帶有包含編碼干擾素類似物的核苷酸。重組載體可以是一個(gè)表達(dá)載體，可在宿主細(xì)胞內(nèi)由攜帶的核苷酸編碼來(lái)表達(dá)融合蛋白。形式可為，但不局限于，HSA/IFN、IFN/HSA、HSA/L/IFN或IFN/L/HSA(L＝連接肽)。宿主生物體及體細(xì)胞包括，但不局限于，脊椎動(dòng)物(如人、猴、鼠、兔等)魚、雞、昆蟲、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等。
編碼干擾素類似物的核苷酸是在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子作用下表達(dá)干擾素類似物蛋白質(zhì)?？衫玫倪m合啟動(dòng)子包括，但不局限于，腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要的后期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子和RSV啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可有MMT啟動(dòng)子、熱刺激啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、ApoAI啟動(dòng)子和人球蛋白啟動(dòng)子；病毒胸腺嘧啶脫氧核苷酶啟動(dòng)子則有皰疹病毒胸腺激酶啟動(dòng)子；反轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子包括經(jīng)修飾后的LTR啟動(dòng)子；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。也可用天然啟動(dòng)子來(lái)控制核苷酸編碼表達(dá)干擾素類似物蛋白質(zhì)。
按本發(fā)明所述，重組載體攜帶有包含編碼HSA/IFN融合蛋白的核苷酸序列。重組載體可以是一個(gè)表達(dá)載體，可在宿主生物內(nèi)表達(dá)由其攜帶的核苷酸編碼的干擾素類似物，HSA融合蛋白，HSA-IFN，HSA-L-IFN，或IFN-L-HSA。形式可為，但不局限于，HSA/IFN、IFN/HSA、HSA/L/IFN或IFN/L/HSA(L＝連接肽)。宿主生物包括，但不局限于，哺乳動(dòng)物(例如人、猴、鼠、兔等)，魚、昆蟲、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等。
優(yōu)選的宿主生物為酵母屬，包括但不局限于，釀酒酵母屬(Saccharomyces)、畢氏酵母屬(Phichia)、漢遜酵母(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)、孢園酵母屬(Tarulaspora)和裂殖酵母屬等。更優(yōu)選地，宿主系統(tǒng)可為畢氏酵母屬巴斯德菌種。具體地講重組載體質(zhì)?？蔀閜PICZ-A，B或C。
根據(jù)選用不同的宿主用來(lái)表達(dá)融合蛋白，本發(fā)明中表達(dá)的蛋白可以是糖基化或非糖基化。優(yōu)選地，當(dāng)在一種宿主系統(tǒng)中得到表達(dá)時(shí)，HSA和干擾素的融合蛋白可以是糖基化的，其糖基化程度可以和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠(CHO)中表達(dá)的一致，或與在畢氏酵母菌中表達(dá)的一致。
如上所述，在本發(fā)明中提到的干擾素類似物，優(yōu)選的使用基因工程技術(shù)構(gòu)建來(lái)表達(dá)。獲得干擾素類似物蛋白的優(yōu)選方法是利用載體質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染或感染的方式來(lái)表達(dá)干擾素類似物蛋白。特別是利用可轉(zhuǎn)化酵母的表達(dá)載體，來(lái)轉(zhuǎn)化畢氏酵母，并使干擾素類似物蛋白分泌到培養(yǎng)液中。
利用酵母菌表達(dá)干擾素類似物的優(yōu)勢(shì)為，酵母菌系統(tǒng)允許產(chǎn)生高質(zhì)量成熟的干擾素類似物蛋白，并分泌到培養(yǎng)液中便于純化。
酵母菌遺傳工程的發(fā)展使外源基因可以在酵母菌中得到表達(dá)并分泌蛋白產(chǎn)品到細(xì)胞外。利用酵母菌表達(dá)分泌型蛋白的優(yōu)點(diǎn)為，但不局限于，高表達(dá)產(chǎn)量，蛋白質(zhì)為可溶性，正確的折疊和易于大規(guī)模生產(chǎn)和純化。
干擾素類似物，既HSA/IFN融合蛋白，可經(jīng)由白蛋白天然信號(hào)肽分泌到酵母菌培養(yǎng)液中。含有血清白蛋白融合蛋白的多肽可由信號(hào)肽主導(dǎo)并通過(guò)分泌途徑而得到加工。在一首選實(shí)例中，血清白蛋白的前導(dǎo)肽序列使干擾素類似物蛋白分泌到酵母菌外的培養(yǎng)基中。其它分泌肽，如天然的釀酒酵母的α-因子分泌信號(hào)肽，也可用于分泌本發(fā)明中的融合蛋白。
酵母表達(dá)的白蛋白是可溶性的并且顯示出與血漿中分離的白蛋白有相同的二硫健結(jié)構(gòu)。當(dāng)作為藥物使用時(shí)，白蛋白的用量為克級(jí)，因而重組白蛋白須與天然的白蛋白結(jié)構(gòu)一致。由酵母分泌到培養(yǎng)液中的HSA/IFN是通過(guò)與白蛋白表達(dá)一致的途徑來(lái)加工的，并避免了由酵母細(xì)胞抽提物中分離純化蛋白的難題，因?yàn)榻湍讣?xì)胞是難于裂解的。另外，分泌出的蛋白質(zhì)純度也易于提高，因?yàn)橛山湍阜置诔龅牡鞍變H占全部酵母蛋白的0.5-1％，而且酵母無(wú)毒性蛋白伴隨。
優(yōu)選實(shí)例為，應(yīng)用巴斯德酵母菌系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明中提及的HSA/IFN融合蛋白。巴斯德酵母菌是由SALK生物技術(shù)工業(yè)研究所與菲力蒲石油工業(yè)研究所協(xié)作發(fā)展出的一個(gè)高效重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。有關(guān)畢氏酵母菌的應(yīng)用技術(shù)已在有關(guān)美國(guó)專利中詳細(xì)闡述了(4,683,293；4,808,537；4,857,467)。
利用畢氏酵母菌來(lái)表達(dá)HSA、HSA融合蛋白或干擾素類似物優(yōu)于利用其它表達(dá)系統(tǒng)。畢氏酵母菌具有許多高等真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)點(diǎn)，例如蛋白質(zhì)的加工和折疊，轉(zhuǎn)錄后的修飾以及如同培養(yǎng)細(xì)菌或釀酒酵母一樣的易于大規(guī)模培養(yǎng)。其與其它系統(tǒng)如桿狀病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比更具有簡(jiǎn)捷、快速表達(dá)和產(chǎn)量更高的優(yōu)點(diǎn)。畢氏酵母還有另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以10-100倍高的異源蛋白表達(dá)。這些特性使得畢氏酵母變成十分有力的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
由于畢氏酵母與釀酒酵母的相關(guān)性，許多由釀酒酵母研究發(fā)展出的方法和技術(shù)均可用于畢氏酵母，包括轉(zhuǎn)化、基因插入、基因取代。更進(jìn)一步的在釀酒酵母上發(fā)展出的遺傳專用術(shù)語(yǔ)，也可用于畢氏酵母菌。如，組氨酸脫氫酶、在釀酒酵母和畢氏酵母中均是由HIS4基因編碼的。畢氏酵母作為甲醇利用酵母能夠以甲醇為單一碳源進(jìn)行代謝。其過(guò)程為首先甲醇的代謝是用乙醇氧化酶將分子氧加到甲醇分子上使甲醇氧化，變?yōu)榧兹?。這一反應(yīng)形成過(guò)氧化氫。為了避免過(guò)氧化氫的毒性。甲醇代謝發(fā)生在一個(gè)特殊的細(xì)胞組織中，叫做過(guò)氧質(zhì)體。其可將過(guò)氧化氫的毒性與細(xì)胞其它部分隔絕。乙醇氧化酶與氧的親和性極差，使得畢氏酵母菌為了代謝的進(jìn)行而大量生產(chǎn)乙醇氧化酶(AOX)，調(diào)控乙醇氧化酶生產(chǎn)的啟動(dòng)子被用來(lái)驅(qū)動(dòng)外源蛋白(如HSA、HSA融合蛋白或干擾素類似物)在畢氏酵母菌中的表達(dá)。
畢氏酵母菌與釀酒酵母菌相比，畢氏酵母菌在對(duì)分泌的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化的程度上有著更大的優(yōu)點(diǎn)。即畢氏酵母不會(huì)有過(guò)度糖基化現(xiàn)象。釀酒酵母和畢氏酵母均有N-連接的糖基甘露糖修飾。然而寡糖化物鏈加在表達(dá)的蛋白上，在畢氏酵母菌中只有8-14個(gè)糖基，而遠(yuǎn)短于在釀酒酵母中的50-150甘露糖鏈。在畢氏酵母菌中連接糖基化較少發(fā)生。釀酒酵母的核心糖化帶有α-1，3連接末端物。而在畢氏酵母菌則沒(méi)有。研究表明由釀酒酵母產(chǎn)生的糖基化蛋白具有較強(qiáng)的抗原反應(yīng)，而使得這些蛋白不適于用在特別是治療目的上的使用。當(dāng)然也表明這又減少了一個(gè)對(duì)畢氏酵母菌用來(lái)表達(dá)蛋白在糖基化上的擔(dān)憂。
Watanabe等(Pharm Res.Dec18(12)1775，2001)描述了一種省時(shí)的純化方法獲得的由畢氏酵母表達(dá)的人血清白蛋白在生物體內(nèi)外的特性。Kobayashi等(Ther Apher，Nov2(4)257-62.1998)討論了重組人血清白蛋白的研究進(jìn)展。
利用畢氏酵母做為表達(dá)系統(tǒng)有許多試劑盒可以使用。如Invitrogen的易選EasySelectTM畢氏酵母表達(dá)試盒。表達(dá)載體上有一個(gè)AOX1啟動(dòng)子可以使外源基因在畢氏酵母中利用甲醇來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)還有一個(gè)抗生素卓霉素(Zeocin)抗性基因，可做為選擇重組子的標(biāo)記。在本發(fā)明中，表達(dá)干擾素類似物的啟動(dòng)子是非常重要的因素。
在畢氏酵母系統(tǒng)中，AOX1基因啟動(dòng)子是十分強(qiáng)勁的啟動(dòng)子，特別是在畢氏酵母菌中。在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶，AOX1和AOX2。AOX1負(fù)責(zé)在細(xì)胞中產(chǎn)生合成巨量的乙醇氧化酶(AOX1)活性。AOX1基因的表達(dá)受到緊密控制并由甲醇誘導(dǎo)而達(dá)到極高的水平。典型地當(dāng)用甲醇作為唯一碳源時(shí)，在所有的可溶性蛋白中AOX1基因的產(chǎn)物就達(dá)30％。AOX1基因已分離得到。AOX1基因啟動(dòng)子也用于本發(fā)明的載體質(zhì)粒中用以驅(qū)動(dòng)編碼有目的基因的外源蛋白的表達(dá)(Ellis等，1985；Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而AOX2和AOX1基因有97％的同源性。在甲醇中的生長(zhǎng)速度比AOX1基因?yàn)槁?。這種緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)，可以分離到Mut+(AOX1)株。除了AOX1基因啟動(dòng)子外，在酵母菌中其它啟動(dòng)子也可用于起動(dòng)HSA融合蛋白的表達(dá)。這些啟動(dòng)子包括，但不局限于PGK1、GAPDH、Gal1、Gal10、CYC1、PH05、TRP1、ADH1或ADH2基因啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，特別闡述了一種制備在二個(gè)不同的位點(diǎn)插入雙表達(dá)盒的重組酵母的新方法。
表達(dá)質(zhì)粒也可以是細(xì)菌宿主如大腸肝菌DH5α(Gibcol/BRL)和酵母之間的穿梭質(zhì)粒?？股刈棵顾刈鳛檫x擇標(biāo)記已應(yīng)用在本發(fā)明的各實(shí)施例中。
表達(dá)載體含有編碼干擾素類似物蛋白的核苷酸。按Invitrogen試劑盒所描述的方法轉(zhuǎn)化酵母菌。經(jīng)過(guò)抗性選擇出轉(zhuǎn)化的酵母菌菌落，將這些表達(dá)目標(biāo)干擾素類似物蛋白的細(xì)胞接種于適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中，然后分析這些酵母菌表達(dá)分泌干擾素類似物蛋白于培養(yǎng)基中的能力。蛋白質(zhì)的收獲可在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)中進(jìn)行，或在批量培養(yǎng)結(jié)束后一并收獲。本發(fā)明所述的干擾素類似物蛋白經(jīng)培養(yǎng)的酵母菌表達(dá)后，以能維持蛋白活性，藥物活性的蛋白提純方法來(lái)加以分離純化。
在此還需提及的是，其它表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明中所提到重組蛋白和干擾素類似物蛋白的表達(dá)；包括，但不局限于細(xì)菌、枯草桿菌(B.Subtitis)、釀酒酵母(S.Cerevisiae)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)，漢遜酵母屬(Hansenula)、孢圓酵母屬(Tourlaspora)、裂殖酵母屬(Schizosaromyces)、固囊酵母屬(Citeromyces)、Pachysoler，德巴利酵母屬(Debaromyces)、梅奇酵母屬(Metschumikowia)、紅冬孢屬(Rhodosporidium)、無(wú)色擔(dān)子孢子屬(Leucosporiduum)、葡狀子囊菌屬(Botryoascus)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolcus)、擬內(nèi)孢霉屬(Endomyucopsis)、動(dòng)物、植物和昆蟲細(xì)胞等。
3.干擾素類似物的組合治療本發(fā)明還提供了不同干擾素類似物的組合應(yīng)用。這些干擾素類似物或傳統(tǒng)干擾素的特異組合給患者使用，可刺激機(jī)體的多種保護(hù)反應(yīng)以抵御病毒或具協(xié)同增效的保護(hù)細(xì)胞的抗病毒功能。研究表明特別是人白蛋白與有造血活性的細(xì)胞因子的融合蛋白的組合可有效地刺激多種血細(xì)胞和血小板的增生。僅一次注射，白蛋白-干擾素融合蛋白可作用于不同類型血細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)血小板、紅血球、巨噬細(xì)胞等血液功能細(xì)胞的增殖(YU and FU US20040063635，于在林，中國(guó)專利公開號(hào)CN1467224A)。
在本發(fā)明中，白蛋白的血漿轉(zhuǎn)運(yùn)功能和干擾素的治療功能因蛋白發(fā)生融合而得到整合。當(dāng)在血液中循環(huán)時(shí)，由于與白蛋白融合而賦予干擾素一個(gè)抵抗蛋白酶降解的超級(jí)穩(wěn)定性，結(jié)果大大延長(zhǎng)了干擾素在血液中的半衰期。由于大量白蛋白的存在，不同的干擾素與白蛋白形成融合蛋白，經(jīng)組合可以減少并形成較小的生物學(xué)功能上的相互干擾現(xiàn)象。這種干擾現(xiàn)象常出現(xiàn)在“干擾素單體”之間的組合。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，一個(gè)與白蛋白融合的干擾素可以在血液系統(tǒng)中停留相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間而得到緩慢釋放，因而減低了在常規(guī)方法下，單獨(dú)使用大劑量單一干擾素時(shí)，帶來(lái)的急性反應(yīng)，毒性及副作用。這種干擾素類似物的緩慢釋放作用形式，以本發(fā)明中的使用劑量，注射次數(shù)減少，而更進(jìn)一步降低傳統(tǒng)干擾素的副作用。特別是對(duì)乙肝病人實(shí)施大劑量，長(zhǎng)周期治療，這種組合式使用，在抑制病毒的復(fù)制和刺激肝細(xì)胞恢復(fù)上是十分有用的。乙肝病人常需忍受多次高劑量的干擾素注射，給病人帶來(lái)極大的損害。根據(jù)本發(fā)明，血清白蛋白與干擾素形成融合蛋白后，可在進(jìn)入體內(nèi)后因緩慢釋放而減少上述局限性。另外，這樣的融合蛋白可以與相對(duì)大量的白蛋白組合，可進(jìn)一步減輕直接注射干擾素進(jìn)入體內(nèi)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)強(qiáng)烈不良反應(yīng)。
已知，貯存“裸露”的細(xì)胞因子(例如細(xì)胞因子不與另一種蛋白如白蛋白融合)是相當(dāng)不穩(wěn)定的，在血液中的血漿半衰期較短。十分清楚地是，治療性蛋白質(zhì)的弱穩(wěn)定性是它的一大缺陷。事實(shí)上，重復(fù)注射蛋白產(chǎn)品或由灌注點(diǎn)滴法給藥來(lái)達(dá)到藥物的有效強(qiáng)度對(duì)病人來(lái)講是十分昂貴和不便的。由于血漿半衰期和穩(wěn)定性的提高，本發(fā)明的干擾素類似物和它們的組合，例如HSA和干擾素-α、干擾素-β、干擾素-ω以及干擾素-γ能用于刺激人血漿產(chǎn)生多種抗病毒多肽。
在本發(fā)明中，干擾素類似物-α可與干擾素類似物-γ組合用于病毒感染的患者可即刻刺激抗病毒多肽的分泌。例如，癌癥患者可在病毒感染前或感染后注射干擾素類似物-α和干擾素類似物-γ的組合以避免細(xì)胞和器官的損害。IFN-α能抵抗病毒而IFN-γ能抑制癌細(xì)胞的增殖。
另一方面，干擾素類似物蛋白也能與不同的干擾素類似物蛋白先后順序或同時(shí)使用于患者，這種組合治療方式有協(xié)同效應(yīng)。在一實(shí)例提供的方法是給予患者含有第一種干擾素類似物的藥物可接受的制劑有效劑量，再給予患者含有第二種干擾素類似物的藥物可接受的制劑有效劑量，這樣的組合治療方式具有協(xié)同效應(yīng)。
例如可先給予患者干擾素類似物-α-2b，然后給予有效治療劑量和比例的干擾素類似物-γ、干擾素類似物-ω和/或干擾素類似物-β可抑制不同癌細(xì)胞的增生并誘導(dǎo)抗病毒多肽的分泌。
本發(fā)明提供了成套的組合治療。成套組合包括第一個(gè)干擾素類似物與第二個(gè)干擾素類似物。例如，第一個(gè)干擾素類似物是干擾素類似物-α-2b和第二個(gè)干擾素類似物是干擾素類似物-γ；第一個(gè)干擾素類似物是干擾素類似物-ω和第二個(gè)干擾素類似物是干擾素類似物-γ；或第一個(gè)干擾素類似物是干擾素類似物-β和第二個(gè)干擾素類似物是干擾素類似物-γ等。
干擾素類似物和它們的組合可用于治療各種疾病，包括但不局限于病毒感染，如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳頭狀瘤病毒、SARS以及或愛滋病毒感染、腫瘤、腎衰竭、組織或器官移植。這些干擾素類似物優(yōu)選地不含有能引起人類免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)序列(連接肽)。干擾素類似物包括但不限于干擾素-α-1(IFNA-1)、干擾素-α-2(IFNA-2)、干擾素-α-4(IFNA-4)、干擾素-α-5(IFNA-5)、干擾素-α-6(IFNA-6)、干擾素-α-7(IFNA-7)、干擾素-α-8(IFNA-8)、干擾素-α-10(IFNA-10)、干擾素-α-12(IFNA-12)、干擾素-α-13(IFNA-13)、干擾素-α-14(IFNA-14)、干擾素-α-16(IFNA-16)、干擾素-α-17(IFNA-17)、干擾素-α-21(IFNA21)；干擾素-β-1(IFNB-1)、干擾素-β-2(IFNB-2，也稱白介素-6，IL-6)；干擾素-λ-1(白介素-29)，、干擾素-λ-2(白介素-28A)或干擾素-ε。


圖1.實(shí)施例人干擾素類似物，白蛋白和各種人干擾素的核苷酸序列以及氨基酸序列。
圖2.含有人血清白蛋白序列的質(zhì)粒DNA，作為制備干擾素類似物，白蛋白-干擾素融合蛋白的骨架載體圖3.蛋白印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。用鼠-抗人白蛋白單克隆抗體(Sigma Cat#A6684)每一泳道上樣量是10μl表達(dá)三天后的酵母上清液；A)，白蛋白(65Kd)；B)，干擾素-α-2a類似物(84Kd)；C)，干擾素-β類似物(84kd)；D)，干擾素-ω類似物(84kd)；E)，對(duì)照(酵母菌株培養(yǎng)液)。
圖4.蛋白印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。用兔多克隆抗人干擾素-α-2a抗體(ChemiconInternational Inc.，Cat#Ab-218-NA)進(jìn)行檢測(cè)，每一泳道包含100ng蛋白。A)大腸桿菌表達(dá)的人干擾素-2b(19kd)；B)干擾素-α類似物(84Kd)，(酵母菌表達(dá)的白蛋白-干擾素-α-2b融合蛋白)。
圖5.人干擾素-α和干擾素-α類似物的抗病毒感染實(shí)驗(yàn)，利用細(xì)胞病變抑制法，Wish細(xì)胞/VSV為檢測(cè)系統(tǒng)。
圖6.不同溫度條件下干擾素類似物蛋白穩(wěn)定性和細(xì)胞抗病毒活性結(jié)果A)37℃；B)50℃。
圖7.干擾素與干擾素類似物在動(dòng)物體內(nèi)的血液中存留時(shí)間比較。A)0-24小時(shí)；B)1-12天。
具體實(shí)施例實(shí)施例1 分子克隆技術(shù)簡(jiǎn)述常規(guī)分子克隆技術(shù)包括DNA、RNA的提取，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，DNA片段的連接，限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)均參照文獻(xiàn)(Maniatis等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約，1982)。DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(參照文獻(xiàn)Saikiet等，科學(xué)，2301350，1985)所用的酶及反應(yīng)所需PCR儀均為PerkinElmer產(chǎn)品。并參照廠家操作程序。DNA測(cè)序和DNA擴(kuò)增所需用的寡聚核苷酸引物由專門機(jī)構(gòu)完成。轉(zhuǎn)受態(tài)大腸桿菌由GIBCO/BRL公司購(gòu)得。質(zhì)粒DNA的純化，DNA片段的回收等均采用商品Qiagen純化柱制備。本發(fā)明所使用的酵母菌菌種均購(gòu)自Invitrogen公司的EasySelectTMPichia Expression Kit。所有的酵母菌是Pichia成員，特別是畢氏酵母菌(Invitrogen公司產(chǎn)品)。
實(shí)施例2 人血清白蛋白(HSA)基因表達(dá)及載體質(zhì)粒的構(gòu)建以人胎肝中提取的總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈聚合反映來(lái)合成、擴(kuò)增HSA基因。5微克總RNA在反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自GIBCO/BRL公司)的作用下，合成相對(duì)應(yīng)的DNA鏈，寡聚核苷酸引物為18個(gè)T+1N(N為隨機(jī)核苷酸)。反應(yīng)條件為45℃ 20分鐘，而后升溫至55℃，繼續(xù)保溫40分鐘。
其寡聚核苷酸引物序列為Seq.ID NO.235’-GAATTCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3’，和Seq.ID NO.245’-GAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT GC-3’用于擴(kuò)增HSA的寡聚核苷酸引物是按GenBank中V00494的DNA序列所設(shè)計(jì)。
兩個(gè)EcoR I識(shí)別位點(diǎn)分別加在HSA基因的兩端亞克隆入一表達(dá)載體。PCR反應(yīng)條件為94℃ 4分鐘以滅活反轉(zhuǎn)錄酶，編碼HAS的DNA進(jìn)一步用Taq DNA PCR(Perkin Elmer)擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)反應(yīng)94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃擴(kuò)增2分30秒。循環(huán)反應(yīng)結(jié)束時(shí)，再給予72℃ 10分鐘的延長(zhǎng)反應(yīng)。凝膠電泳顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)約1842堿基對(duì)。PCR產(chǎn)物利用TA克隆的方法插入PCRII載體(Invitrogen公司)。所得質(zhì)粒命名為PCR-HSA。DNA測(cè)序結(jié)果表明其與發(fā)表的人血清白蛋白DNA序列相同。附圖1 Seq ID NO.11為HSA基因DNA序列，Seq ID NO.12為HSA人白蛋白氨基酸序列。
用EcoR I酶限制性消化PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳分離純化HSA DNA片斷插入Invitrogen提供的pPICZ-A或pGAPZ-A載體或經(jīng)于在林修飾的新載體pYH。以編碼HSA的這個(gè)載體轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在含有抗生素卓霉素(25μg/ml)的低鹽LB-瓊脂平板上選擇出的細(xì)菌克隆，其基因插入方向經(jīng)Xho I/Nde I酶切決定。其經(jīng)檢定對(duì)HSA基因插入的質(zhì)粒命名為pYZ-HSA(Y酵母載體，Z含卓霉素抗生素抗性)，AOX1或GAP啟動(dòng)子或pYH-HSA(Y酵母載體，組氨酸抗性)，AOX1或GAP(GAPDH)啟動(dòng)子。pYZ-HSA載體質(zhì)粒的物理圖譜列于附圖2。
質(zhì)粒具有如下優(yōu)點(diǎn)1)帶有卓霉素抗性基因可使受其轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或酵母菌在含有卓霉素抗性素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。卓霉素抗性素是一種新型廣譜抗生素。在結(jié)構(gòu)上屬于博來(lái)霉素/腐草霉素家族，對(duì)于細(xì)菌、真菌(包括酵母菌)、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞均具較強(qiáng)的毒性。但卓霉素對(duì)真菌的毒性小于博來(lái)霉素。攜帶有卓霉素抗性基因的質(zhì)粒即可在細(xì)菌中，又可在真菌的轉(zhuǎn)化中做為選擇標(biāo)記。在HSA基因插入的下游，載體帶有多個(gè)酶切位點(diǎn)。這些酶切位點(diǎn)便于以基因工程方法直接插入功能蛋白基因，與HSA形成融合蛋白；2)一個(gè)myc抗原序列和多聚組氨酸標(biāo)簽序列可融入表達(dá)的融合蛋白的C-末端，便于檢測(cè)和/或用商品化的抗myc抗原和多聚組氨酸標(biāo)簽抗體進(jìn)行純化；3)AOX1啟動(dòng)子或GAPDH啟動(dòng)子有更多的選擇方便表達(dá)干擾素類似物。GAP啟動(dòng)子不被甲醇誘導(dǎo)，應(yīng)用GAPDH啟動(dòng)子比應(yīng)用AOX啟動(dòng)子的工業(yè)發(fā)酵規(guī)模更大(1,000公斤以上)，更安全，因?yàn)椴惶砑蛹状颊T導(dǎo)表達(dá)；4)來(lái)自二個(gè)載體的雙表達(dá)盒(啟動(dòng)子，被表達(dá)的基因，抗性基因)能直接插入同一酵母株制備高表達(dá)重組酵母。
應(yīng)用兩個(gè)載體質(zhì)粒，可分別含有相同或不同的啟動(dòng)子，相同或不同的待表達(dá)的基因，同時(shí)或先后轉(zhuǎn)導(dǎo)同一酵母菌以獲得高效表達(dá)外源蛋白的酵母菌株。例如pYZ-HSA質(zhì)粒線性化后可以直接插入在酵母菌染色體的AOX1基因啟動(dòng)子位點(diǎn)，這一酵母菌就帶有卓霉素抗生素抗性。應(yīng)用同一啟動(dòng)子可將線性化的pYH-HSA載體質(zhì)粒直接插入在酵母菌染色體的HIS基因位點(diǎn)處，使用不添加組氨酸的培養(yǎng)基進(jìn)行重組酵母菌的篩選。載體質(zhì)粒pYH和pYZ作為主要載體質(zhì)粒用于AOX1啟動(dòng)子以及pWZ和pWHKA作為主要載體質(zhì)粒用于GAPGH啟動(dòng)子的使用。本發(fā)明中干擾素類似物在酵母菌中的表達(dá)均使用這些載體質(zhì)粒。
實(shí)施例3. 人干擾素分子克隆3.1.人干擾素-α-1b分子克隆人干擾素-α-1b的分子克隆應(yīng)用相似于實(shí)施例2中所表述的RT-PCR方法，從人白細(xì)胞(單核細(xì)胞/巨嗜細(xì)胞/B淋巴細(xì)胞)的總RNA制備物中擴(kuò)增，寡聚核苷酸引物分別為SEQ ID NO.255’-CATATGTGTGATCTCCCTGAGACCC-3’SEQ ID NO.265’-GGATCCTTACTTCCTCCTTAATCTTTC-3’多聚核苷酸有579堿基對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，亞克隆入Invitrogen公司的pCRIITA載體中，DNA測(cè)序分析證實(shí)人干擾素-α-1b的閱讀框。Nde I限制性酶切位點(diǎn)形成5’末端，Bam HI限制性酶切位點(diǎn)形成3’末端(化線部分)。干擾素-α-1b的人工起始密碼子也包括在這個(gè)位點(diǎn)中(SEQ ID NO.25的化線部分)。圖1表示人干擾素α-1b的DNA序列(SEQ ID NO.13)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.14)。
3.2.人干擾素-α-2b分子克隆人干擾素-α-2b與人干擾素-α-2a的基因僅有一個(gè)核苷酸差別，這導(dǎo)致在#23位的一個(gè)氨基酸不同(干擾素-α-2b是精氨酸，而干擾素-α-2b是賴氨酸)。干擾素-α-2a是通過(guò)SEQ ID NO.275’-CATATGGCCTTGA CCTTTGCTTTAC-3’和SEQ ID NO.285’-GGATCCTCATTCCTTACTTC TTAAAC-3’克隆而來(lái)。干擾素-a-2b的基因是通過(guò)用Stratagene公司的一種試劑盒進(jìn)行點(diǎn)突變得到。一對(duì)突變引物用于序列中的一個(gè)核苷酸改變。它們是SEQ ID NO.295’-TGGCACAGATGAGGAAAATCTCTCTTTTCT CCTGC-3’，和SEQ ID NO.305’-CAGGAGAAAAGAGAGATTTTCCTCATCTGTGCCAGC-3’化線部分的核苷酸是點(diǎn)突變位點(diǎn)，即干擾素-α-2a的AGA(精氨酸)變?yōu)楦蓴_素-α-2b的AAA(賴氨酸)。實(shí)驗(yàn)是按照制造商提供的操作手冊(cè)進(jìn)行。pCR II載體的突變產(chǎn)物通過(guò)序列分析得到證實(shí)，圖1表示人干擾素α-2b的DNA序列(SEQ ID NO.15)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.16)。
3.3.人干擾素-β分子克隆下列引物用于克隆來(lái)自人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)的干擾素-β基因SEQ ID NO.315’-CATATGACCAACAAGTGTCTCC-3’，和SEQ ID NO.325’-GAATTCTCAGTTTCGGAGGTAACC-3’Nde I限制性酶切位點(diǎn)形成干擾素-β的5’末端，EcoR I限制性酶切位點(diǎn)形成3’末端。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化克隆至pCR2.1 TA載體，并進(jìn)行DNA序列確證。圖1表示人干擾素-β的DNA序列(SEQ ID NO.17)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.18)。
3.4.人干擾素-ω分子克隆人干擾素-ω克隆自人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)的總RNA，引物是SEQ ID NO.335’-CATATGGCCCTCCTGTTCCCTCTAC-3’，和SEQ ID NO.345’-GAATTCTCAAGATGAGCCCAGGTCTC-3’PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化克隆至pCR2.1 TA載體，并進(jìn)行DNA序列確證。圖1表示人干擾素-ω的DNA序列(SEQ ID NO.19)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.20)。
3.5.人干擾素-γ分子克隆人干擾素-γ克隆自有絲分裂原激活的T淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)的總RNA，引物是SEQ ID NO.355’-CATATGAAATATACAAGTTATATC-3’SEQ ID NO.365’-GAATTCTTACTGGGATGCTCTTCG-3’PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化克隆至pCR2.1 TA載體，并進(jìn)行DNA序列確證。圖1表示人干擾素-γ的DNA序列(SEQ ID NO.21)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.22)。
實(shí)施例4.人血清白蛋白與人干擾素-α-2a、干擾素-α-2b、干擾素-β、干擾素-γ及干擾素-ω的融合和干擾素類似物的表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建白蛋白基因與干擾素基因的融合來(lái)制備干擾素類似物。在白蛋白的C末端有Bsu36 I位點(diǎn)，實(shí)例中涉及的所有干擾素都是在這一位點(diǎn)與這種白蛋白直接融合，通過(guò)PCR引物延伸在干擾素DNA的N末端形成Bsu36 I限制性酶切點(diǎn)。干擾素DNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增克隆到經(jīng)線性化的pYZ-HSA載體或pYH-HSA載體的Bsu36 I和XhoI位點(diǎn)。
4.1.干擾素類似物α-1b載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)下列引物用于制備干擾素-α-1b和白蛋白的基因融合。
SEQ ID NO.375’-CTGCCTTAGGCTTATGTGATCTCCCTGAGA CCC-3’和SEQ ID NO.385’-TCTCGAGTTACTTCCTCCTTAATC TTTC-3’。(劃線部分是人干擾素-α-1b成熟蛋白序列)。在干擾素-α-1b基因的3’末端構(gòu)建一Xho I位點(diǎn)(SEQ ID NO.38劃線部分)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Bsu36 I和Xho I消化，所得片段經(jīng)凝膠電泳純化插入pYZ-HSA或pYH-HSA載體的Bsu36 I和Xho I位點(diǎn)之間形成一新質(zhì)粒pYZ-HSA/IFN-α-1b。圖1表示干擾素類似物-α-1b雜合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和干擾素類似物-α-1b氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。
4.2.干擾素類似物-α-2b載體的構(gòu)建干擾素-α-2a或干擾素-α-2b的基因通過(guò)下列PCR引物融合到白蛋白的C末端SEQ ID NO.395’-CTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCT CAAACCC-3’(劃線部分是人干擾素-α-2a和干擾素-α-2b成熟蛋白序列)和SEQ ID NO.405’-TCTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3’。
在干擾素-α基因的3’末端構(gòu)建一Xho I位點(diǎn)(SEQ ID NO.40劃線部分)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Bsu36 I和Xho I消化，所得片段經(jīng)凝膠電泳純化插入pYZ-HSA或pYH-HSA載體的Bsu36 I和Xho I位點(diǎn)之間形成一新質(zhì)粒pYZ-HSA/IFN-aα-2b。干擾素類似物-α-2b雜合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)和干擾素類似物-α-2b氨基酸序列(SEQ IDNO.4)。
4.3.干擾素類似物-β載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)下列引物用于制備干擾素-β和白蛋白的基因融合。SEQ ID NO.415’-CTGCCTTAGGCTTATACAACTTGCTTGGATTCC-3’(劃線部分是人干擾素-β成熟蛋白序列)和SEQ ID NO.425’-CACTCGAGTCAGTTTCGGAGGTAACC-3’(劃線部分是Xho I位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物插入pYZ-HSA或pYH-HSA載體的Bsu36 I和XhoI位點(diǎn)之間形成一新質(zhì)粒pYZ-HSA/IFN-β或pYH-HSA/IFN-β。圖1表示干擾素類似物-β雜合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。
4.4.干擾素類似物-ω，載體的構(gòu)建用下列二個(gè)引物將人干擾素-ω基因融合到白蛋白的DNA序列中SEQ ID NO435’-CTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAGAACCATGG-3’(劃線部分是人干擾素-ω成熟蛋白序列)和SEQ ID NO.445’-CTCGAGTCAAGATGAGCCCAGGTCTC-3’(劃線部分是干擾素-ω 3’末端)PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化克隆到pYZ-HSA或pYH-HSA載體的Bsu36 I和XhoI位點(diǎn)之間形成一新質(zhì)粒pYZ-HSA/IFN-ω或pYZ-HSA/IFN-ω。圖1表示干擾素類似物-ω、HSA-INF-ω雜合子的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)。
4.5.含有干擾素類似物-γ載體的構(gòu)建下列引物用于構(gòu)建干擾素類似物-γDNA序列，并克隆至pYZ-HSA載體中，SEQ ID NO.455’-ACTCCTTAGGCTTACAGGACCCATATG TACAAGAAGC-3’(劃線部分是人干擾素-γ成熟蛋白序列)和SEQ ID NO.465’-CTCGAGTTACTGGGATGCTCTTCG-3’(劃線部分是XhoI位點(diǎn))。
PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化并在Bsu36 I和Xho I位點(diǎn)酶切，插入到pYZ-HSA或pYH-HSA載體的Bsu36 I和Xho I位點(diǎn)之間，形成一新質(zhì)粒pYZ-HSA/IFN-g或pYH-HSA/IFN-γ。圖1表示干擾素類似物-γ、HSA-INF-γ雜合子的核苷酸序列(SEQ IDNO.9)和它的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。
實(shí)施例5 酵母菌的轉(zhuǎn)化表達(dá)盒包括一個(gè)啟動(dòng)子、干擾素類似物、一個(gè)終止子和一個(gè)選擇性標(biāo)記(卓霉素抗生素或組氨酸缺陷型)。酵母株GS115，SMD1168或ZY101是組氨酸合成缺陷型。當(dāng)用線性轉(zhuǎn)移穿梭載體轉(zhuǎn)化酵母時(shí)，表達(dá)盒將直接插入同源重組區(qū)。多數(shù)情況下，一個(gè)表達(dá)盒將插入一個(gè)酵母中。本發(fā)明闡明一種用有二種選擇性標(biāo)記的二個(gè)載體同時(shí)插入同一染色體的不同區(qū)域的新方法。
5.1.表達(dá)載體質(zhì)粒在酵母菌染色體上的單插入將畢氏酵母菌菌株GS115菌落接種于含5ml YPD培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)基中，以250轉(zhuǎn)/分的速度于30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。次日取0.2ml過(guò)夜培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)接入500ml YPD的培養(yǎng)液中，置于2升的三角培養(yǎng)瓶中。在30℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-3小時(shí)之細(xì)胞密度達(dá)到OD600＝1.3-1.5。離心收集酵母菌，再重懸于500ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水中洗滌兩次。然后酵母菌懸于20ml冰預(yù)冷的1M山梨醇的溶液洗滌一次。實(shí)例2中構(gòu)建的質(zhì)粒pYZ-HSA和實(shí)施例4中構(gòu)建的質(zhì)粒pYZ-HSA/IFN-α-1b、pYZ-HSA/IFN-α-2b、pYZ-HSA/IFN-β、pYZ-HSA/IFN-ω和pYZ-HSA/IFN-γ均經(jīng)Pme I限制性內(nèi)切酶處理后，形成線性質(zhì)粒分子。
取5μg線性質(zhì)粒DNA與80ul新鮮制備的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的電極杯內(nèi)，置于點(diǎn)脈沖儀上。電脈沖條件為電壓7500V/CM，電極間隔時(shí)間為5-10(ms)。電擊處理后，立即加入1ml冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液于酵母菌中，然后轉(zhuǎn)入15ml試管中。轉(zhuǎn)化的酵母菌置于30℃培養(yǎng)箱中放置2小時(shí)，然后接種涂布在含卓霉素抗生素的YPD平板培養(yǎng)基上。經(jīng)抗性選擇而生長(zhǎng)出的克隆，再用分子生物學(xué)方法鑒定其基因的插入。蛋白質(zhì)的表達(dá)與分泌則以SDS-PAGE或用特異抗體做蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)。不同的畢氏酵母菌菌株，如X-33，KM71以及蛋白酶缺陷型酵母菌株SMD1168和ZY101均可用來(lái)表達(dá)和分泌重組的融合蛋白。
5.2.表達(dá)載體質(zhì)粒在酵母菌染色體上的雙插入為了獲得對(duì)干擾素類似物具有高表達(dá)的酵母菌株，可以采用Invitrogen公司的多拷貝插入方法。但在實(shí)際上選擇并不是十分有效。本發(fā)明采用了一種二次轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，使同一酵母菌能攜帶有多個(gè)表達(dá)組件，它們分別被插入在染色體的不同部位。例如，首先使用在實(shí)施例5.1中所述方法，用線性化的pYZ-HSA/IFN-β轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母菌后干擾素類似物-β表達(dá)組件插入在染色體AOX1基因啟動(dòng)子的位點(diǎn)。酵母菌就帶有卓霉素抗生素的抗性。然后同一重組酵母菌再用線性化的pYHKA-HSA/IFN-β質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用不含有組氨酸的基本培養(yǎng)基來(lái)篩選重組酵母菌。干擾素類似物基因就在新的重組酵母菌染色體上坐落在兩個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)，AOX1啟動(dòng)子和HIS基因區(qū)域。新的重組酵母菌也就同時(shí)具有卓霉素抗生素基因和生長(zhǎng)在無(wú)組氨酸存在的培養(yǎng)基中。同時(shí)使用G418抗生素作為壓力選擇，可以獲得插入在HIS基因區(qū)域內(nèi)的多拷貝表達(dá)組件的重組酵母菌。
使用這種方法，不同的表達(dá)組件也可以插入在同一酵母菌染色體內(nèi)。例如，第一個(gè)表達(dá)組件可以是干擾素類似物-a，第二個(gè)表達(dá)組件可以是干擾素類似物-b。即第一個(gè)表達(dá)組件是蛋白質(zhì)-X，第二個(gè)表達(dá)組件是蛋白質(zhì)-X或蛋白質(zhì)-Y。啟動(dòng)子可以是相同也可以是不同的。
實(shí)施例6 酵母菌分泌干擾素類似物蛋白質(zhì)的方法及定性經(jīng)含有干擾素類似物的載體轉(zhuǎn)化的重組酵母菌落分別培養(yǎng)在含有甘油的基本緩沖培養(yǎng)液中，以300轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)至菌體密度達(dá)到OD600＝2-6。1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集菌體，菌體再重懸于不含甘油而含0.5％甲醇同種基本培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到OD600＝1.0。每24小時(shí)加入100％甲醇至最終濃度為0.5％，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。在不同的時(shí)間點(diǎn)分別收集培養(yǎng)上清液，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果證明人白蛋白和白蛋白-干擾素融合蛋白(干擾素類似物)都得到表達(dá)并分泌到培養(yǎng)液中。使用GAPDH啟動(dòng)子時(shí)，則使用含有葡萄糖的基本緩沖培養(yǎng)液。
鼠抗人血清白蛋白的單克隆抗體(Sigma)用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)確定表達(dá)的蛋白質(zhì)為與人血清白蛋白形成的融合蛋白。典型的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)是將SDS-PAG凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到尼龍或硝酸纖維膜上，與特異抗體(第一抗體)溫育，然后加抗第一抗體的抗體(第二抗體)與第一抗體結(jié)合。因?yàn)榈诙贵w是經(jīng)熒光標(biāo)記的，整個(gè)特異性結(jié)合的復(fù)合物經(jīng)X光膠片曝光后會(huì)留下印記。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量用于決定未知蛋白的分子量。圖3表示酵母菌表達(dá)重組蛋白、白蛋白及干擾素類似物α(HSA-IFN-α-2a)融合蛋白，其分子量與預(yù)計(jì)相符，并且與來(lái)源于人血清白蛋白(Sigma)的抗原相同。
以抗人干擾素-α的單克隆抗體為第一抗體所做的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，干擾素類似物-α蛋白和人干擾素-α(Chemicon International Inc.US)具有相同的抗原性，并顯示白蛋白和干擾素-α在融合蛋白中的摩爾比率與預(yù)期相同(YU and FU美國(guó)專利20040063635)。同理，以抗干擾素-β的單克隆抗體為第一抗體(CII，US)，干擾素類似物-β蛋白和人干擾素-β(CII，US)具有相同的抗原性，并顯示白蛋白和干擾素-β在融合蛋白中的摩爾比率與預(yù)期相同(圖4)。
實(shí)施例7.干擾素類似物的純化和分子特性在上清液中含有重組的畢氏酵母菌細(xì)胞分泌出的血清白蛋白或血清白蛋白的融合蛋白-干擾素類似物。培養(yǎng)液經(jīng)收集、濃縮并降低鹽濃度后，調(diào)整pH至7.5左右，濃縮液通過(guò)Bio-Rad公司制造的Affi-Gel Blue-Gel層析柱。HSA或融合蛋白則與層析柱上的功能集團(tuán)結(jié)合而掛在柱體上。經(jīng)過(guò)洗滌，HSA或干擾素類似物則可經(jīng)由1-5MNaCl梯度洗脫，得到具有75-85％純的蛋白制劑。如有需要?jiǎng)t進(jìn)一步通過(guò)分子篩層析柱，可得純度提高至95-99％或更純。用于動(dòng)物試驗(yàn)的樣品則將可能的熱源如內(nèi)毒素，借助Affi-Prep polymyxin Support層析柱(Bio-Rad)來(lái)去除，以符合體內(nèi)試驗(yàn)需要。利用常規(guī)方法來(lái)決定蛋白質(zhì)的濃度，如Bio-Rad生產(chǎn)的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒。最后純化的蛋白質(zhì)通過(guò)0.2uM濾膜以達(dá)無(wú)菌要求。
實(shí)施例8.干擾素類似物-α-2a的對(duì)病毒攻擊細(xì)胞的保護(hù)試驗(yàn)干擾素-α-2a及其衍生物的抗病毒活性由細(xì)胞因子保護(hù)人胎兒羊膜WISH細(xì)胞抵抗皰疹性口炎病毒(VSV)誘導(dǎo)引起的細(xì)胞病變程度來(lái)確定(Rubinstein等，1981，J.Virol.37，755-758)。WISH細(xì)胞(4.5×105細(xì)胞/ml)預(yù)先置于96孔板中(100μl/孔)，與二倍梯度稀釋的干擾素-α-2a或干擾素類似物α-2a一起在37℃下溫育18小時(shí)。在ELISA板內(nèi)測(cè)定結(jié)晶紫染色的細(xì)胞的吸收值可確定WISH細(xì)胞的活性。本分析方法中，天然干擾素-α-2a在半數(shù)有效劑量(ED50)0.45±0.04pM濃度時(shí)，其保護(hù)VSV誘導(dǎo)引起的WISH細(xì)胞病變的能力為50％；而干擾素類似物-α-2a則在半數(shù)有效劑量(ED50)1.13±0.3pM濃度時(shí)，具有天然干擾素抗病毒的25％(圖5)。由于白蛋白的分子量(65kd)約是干擾素(19kd)的4倍?？赏茰y(cè)如果按分子量比例計(jì)，干擾素類似物-α-2a與干擾素-α-2a具有相同的生物活性。
實(shí)施例9.應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析干擾素類似物應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)測(cè)定未知樣品中干擾素或干擾素類似物的活性并與已知生物活性的干擾素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較測(cè)定是一種常規(guī)方法。Chemicon公司出品的干擾素-αELISA試劑盒是雙抗體夾心方法。ChemiKineTM山羊抗兔抗體板捕獲特異的干擾素-α復(fù)合體，復(fù)合體中含有的干擾素-α抗體與干擾素-α結(jié)合。生物偶聯(lián)的干擾素-α(競(jìng)爭(zhēng)性配體)、樣品或標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)干擾素-α特異抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此當(dāng)樣品中干擾素α濃度增加時(shí)，被抗體捕獲的偶聯(lián)的干擾素α量降低。用streptavidin堿性磷酸酶偶聯(lián)的底物反應(yīng)分析可定量分析，樣品中干擾素-α的含量與使與標(biāo)準(zhǔn)品曲線相比較，可以計(jì)算出未知樣品中的干擾素-α生物活性及含量。計(jì)算方法參照“第二版國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)制備(WHO，67/343)。并以由尿液中分離的人干擾素-α、CHO細(xì)胞表達(dá)的人重組干擾素-α作為對(duì)照確定重組HSA/IFN-α融合蛋白的生物活性。
結(jié)果表明，干擾素類似物蛋白與天然的干擾素-α有相同的生物活性。當(dāng)樣品中干擾素類似物蛋白的濃度較高時(shí)可能是干擾素類似物蛋白分子太大，阻止干擾素-α抗體有效地與融合蛋白中的干擾素-α結(jié)合，因此使分析的靈敏度降低。在HSA-EPO的ELISA實(shí)驗(yàn)中也存在同樣現(xiàn)象(YU and FU，美國(guó)專利20040063635)實(shí)施例10 測(cè)定干擾素類似物在體外生物活性的穩(wěn)定性以干擾素類似物-α-2a為例，對(duì)干擾素類似物蛋白在37℃和50℃條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定。取50U(0.5ng)由細(xì)菌表達(dá)的人干擾素-α-2a或50U(19.6ng)重組HSA/IFN-α-2a融合蛋白，置于含有200微升，不含血清及其它組分的RPM1培養(yǎng)液于200微升薄壁試管中，試管封好置于水浴中。在不同時(shí)間點(diǎn)取出樣品，立即置于-80℃保存。待全部樣品收集后，按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程以病毒感染W(wǎng)ish細(xì)胞系進(jìn)行生物活性測(cè)定，并設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，“裸露”干擾素-α在37℃下10小時(shí)(圖6A)喪失全部生物活性；但在37℃下24小時(shí)后，干擾素類似物的生物活性沒(méi)有任何變化，甚至其抗病毒活性在10天后仍保持原有的生物活性的一半。在50℃下(圖6B)，“裸露”干擾素-α在一天內(nèi)完全失去了生物活性；而干擾素類似物蛋白的生物活性在5天后保持原有的生物活性的90％。結(jié)果顯示干擾素類似物儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境如溫度有更強(qiáng)的抗性。
實(shí)施例11.干擾素類似物在血漿中的存留時(shí)間測(cè)定了在動(dòng)物血漿中干擾素類似物-α-2b(HSA/IFN-α-2b)和干擾素-α-2b的存留時(shí)間。15ng(約1×103U)人干擾素-α-2b加45ng來(lái)自重組酵母表達(dá)的白蛋白或60g(約1×103U)人干擾素類似物-α-2b分別稀釋成100μl溶液注射入小鼠體內(nèi)，然后在不同時(shí)間分別采集血液樣品(0.05ml)。實(shí)驗(yàn)的最后一天，所有受試的小鼠都采集血液樣品0.5ml，在微型離心管中加EDTA一起離心，上清液置-80℃貯存。用Chemicon公司的ChemiKineTM人干擾素EIA試劑盒測(cè)試所有采自注射過(guò)干擾素-α-2b(對(duì)照)、干擾素類似物動(dòng)物的血清樣品。結(jié)果顯示干擾素類似物比“裸露”的干擾素-α-2b在血漿中保持更長(zhǎng)的未被降解的時(shí)間(圖7)。在注射后12天仍能檢測(cè)出干擾素類似物-α-2b的存在，這個(gè)結(jié)果與血清白蛋白有14-20天的血漿半衰期是一致的(Waldmann T.A.，in“Albumin Structure，F(xiàn)unction and Uses”，Rosenoer V.M等(eds)，Pergamon Press，Oxford，255-275，1977)。注射干擾素類似物的動(dòng)物血漿樣品在第12天時(shí)仍能測(cè)出保護(hù)WISH細(xì)胞的抗病毒活性。結(jié)果顯示對(duì)照樣品沒(méi)有保護(hù)細(xì)胞免受病毒攻擊的功能，這種長(zhǎng)效的生物學(xué)功能賦予干擾素類似物新的臨床用途。
實(shí)施例12 應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模表達(dá)制備干擾素類似物實(shí)驗(yàn)中表明應(yīng)用畢氏酵母表達(dá)和規(guī)?；a(chǎn)重組干擾素類似物蛋白質(zhì)比起其他任何系統(tǒng)都要容易的多。重組株分離到后，重組蛋白表達(dá)株可有Mut+和Muts兩種形式。從小規(guī)模培養(yǎng)開始，甲醇誘導(dǎo)或不需誘導(dǎo)，在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)試蛋白的表達(dá)。分泌型蛋白在細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中的含量均用SDS-PAGE方法進(jìn)行分析，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，表達(dá)水平和純度在每一步中均進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
序列表<110>美國(guó)福源集團(tuán)<120>長(zhǎng)效的人干擾素類似物<130>I04US053570<150>US60/483,984<151>2003-06-30<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2325<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag 1680cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740
aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800gctgcaagtc aagctgcctt aggcttatgt gatctccctg agacccacag cctggataac 1860aggaggacct tgatgctcct ggcacaaatg agcagaatct ctccttcctc ctgtctgatg 1920gacagacatg actttggatt tccccaggag gagtttgatg gcaaccagtt ccagaaggct 1980ccagccatct ctgtcctcca tgagctgatc cagcagatct tcaacctctt taccacaaaa 2040gattcatctg ctgcttggga tgaggacctc ctagacaaat tctgcaccga actctaccag 2100cagctgaatg acttggaagc ctgtgtgatg caggaggaga gggtgggaga aactcccctg 2160atgaatgcgg actccatctt ggctgtgaag aaatacttcc gaagaatcac tctctatctg 2220acagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg gaggttgtca gagcagaaat catgagatcc 2280ctctctttat caacaaactt gcaagaaaga ttaaggagga agtaa 2325<210>2<211>750<212>PRT<213>智人<400>2Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65 70 75 80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
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35 40 45Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His65 70 75 80Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr100 105 110Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val115 120 125Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys130 135 140Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro145 150 155 160Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu165 170 175Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu180 185<210>15<211>567<212>DNA<213>智人<400>15atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc120ctggcacaga tgaggaaaat ctctcttttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga180tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat240gagatgatcc agcagatctt caatctcttc agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat300gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc360tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga tgaaggagga ctccattctg420gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct480tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg540caagaaagtt taagaagtaa ggaatga567<210>16<211>188<212>PRT<213>智人<400>16Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser35 40 45Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His65 70 75 80Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr100 105 110Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val115 120 125Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys130 135 140Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro145 150 155 160Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu165 170 175Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu180 185<210>17<211>564<212>DNA<213>智人<400>17atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag120ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac180atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc240tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg300aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag360acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact catgagcagt420ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt480cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga540cttacaggtt acctccgaaa ctga 564<210>18<211>187<212>PRT<213>智人<400>18Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg20 25 30Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg35 40 45Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu50 55 60Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val100 105 110Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu115 120 125Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys130 135 140Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr165 170 175Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn180 185<210>19<211>588<212>DNA<213>智人<400>19atggccctcc tgttccctct actggcagcc ctagtgatga ccagctatag ccctgttgga 60tctctgggct gtgatctgcc tcagaaccat ggcctactta gcaggaacac cttggtgctt120ctgcaccaaa tgaggagaat ctcccctttc ttgtgtctca aggacagaag agacttcagg180ttcccccagg agatggtaaa agggagccag ttgcagaagg cccatgtcat gtctgtcctc240catgagatgc tgcagcagat cttcagcctc ttccacacag agcgctcctc tgctgcctgg300aacatgaccc tcctagacca actccacact ggacttcatc agcaactgca acacctggag360acctgcttgc tgcaggtagt gggagaagga gaatctgctg gggcaattag cagccctgca420ctgaccttga ggaggtactt ccagggaatc cgtgtctacc tgaaagagaa gaaatacagc480gactgtgcct gggaagttgt cagaatggaa atcatgaaat ccttgttctt atcaacaaac540atgcaagaaa gactgagaag taaagataga gacctgggct catcttga 588<210>20<211>195<212>PRT<213>智人<400>20Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr1 5 10 15Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu20 25 30Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu50 55 60Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser
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85 90 95Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg100 105 110Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val115 120 125Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser130 135 140Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg145 150 155 160Gly Arg Arg Ala Ser Gln16權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其是由人源的血清白蛋白核苷酸序列SEQ ID NO.11和一種人的干擾素核苷酸序列融合后所編碼的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其核苷酸序列含有與Seq ID No.1、3、5、7或9有至少90％序列同源性的序列；由Seq ID No.1、3、5、7或9編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列則與Seq ID No.2、4、6、8或10有至少90％序列同源性；優(yōu)選，其核苷酸序列含有與Seq ID No.1、3、5、7或9有至少95％序列同源性；由Seq ID No.1、3、5、7或9編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與Seq ID No.2、4、6、8、或10具有至少95％的序列同源性。
3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述干擾素選自[FN-α-1(IFNA-1)、IFN-α-2(IFNA-2)、IFN-α-4(IFNA-4)、IFN-α-5(IFNA-5)、IFN-α-6(IFNA-6)、IFN-α-7(IFNA-7)、IFN-α-8(IFNA-8)、IFN-α-10(IFNA-10)、IFN-α-12(IFNA-12)、IFN-α-13(IFNA-13)、IFN-α-14(IFNA-14)、IFN-α-16(IFNA-16)、IFN-α-17(IFNA-17)、IFN-α-21(IFNA21)；IFN-β-1(IFNB-1)、IFN-β-2(IFNB-2，也稱為白介素-6，IL-6)；IFN-λ-1(白介素-29)、IFN-λ-2(白介素-28A)和/或IFN-ε。
4.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述干擾素直接以N末端或C-末端與人血清白蛋白質(zhì)的C-末端或N末端相連以構(gòu)成融合蛋白質(zhì)；或所述干擾素通過(guò)一個(gè)連接肽與人血清白蛋白質(zhì)相連以構(gòu)成融合蛋白質(zhì)，優(yōu)選所述連接肽為(G4S)3-4。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是分泌型的。
6.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可與特異性識(shí)別抗人血清白蛋白質(zhì)的抗體相結(jié)合。
7.攜帶有如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列的載體。
8.含有如權(quán)利要求7所述的載體的宿主系統(tǒng)，其經(jīng)權(quán)利要求7所述的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得到，用于表達(dá)融合蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主系統(tǒng)，其包括脊椎動(dòng)物、昆蟲、植物的細(xì)胞、酵母菌、細(xì)菌或病毒。
10.如權(quán)利要求9所述的宿主系統(tǒng)，其中所述的酵母菌是釀酒酵母、畢氏酵母、念珠菌屬酵母、漢遜酵母、克魯維亞酵母、孢圓母屬酵母或裂殖酵母，優(yōu)選的是畢氏酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及長(zhǎng)效的人干擾素類似物及其制備方法和醫(yī)療用途。人干擾素類似物是干擾素和人血清白蛋白(HSA)通過(guò)基因工程方法重組形成的一種融合蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明這種新型的干擾素除具有干擾素的抗病毒作用外，其在體內(nèi)的半衰期是干擾素的3至10倍，從而延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的作用時(shí)間。長(zhǎng)效干擾素能用于治療病毒性感染疾病，如SARS、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎以及甲型肝炎，并且還可用于治療白血病和惡性黑素瘤。人干擾素類似物的貯存期是干擾素的3至5倍。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1583795SQ20041004281
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者富巖, 于在林 申請(qǐng)人:美國(guó)福源集團(tuán)