專利名稱：腫瘤細胞專一表達免疫調(diào)節(jié)因子gm－csf的溶瘤性腺病毒重組體的構(gòu)建及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療，更具體地說是涉及構(gòu)建一種腫瘤細胞專一的、且能表達免疫調(diào)節(jié)因子、誘導機體針對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫反應的復制型腺病毒基因重組體。
背景技術(shù)：
利用病毒治療腫瘤可追溯到上世紀初。醫(yī)生在臨床上觀察到一些病人的腫瘤在病人經(jīng)歷一場病毒感染之后驚奇的消失了。這個謎團一直到上世紀二十年代才得以解開，并引起眾多科學家及臨床醫(yī)生的重視。由此也興起了利用病毒治療腫瘤的嘗試。到上世紀中葉，已有50多種病毒被用于人或動物腫瘤的治療[Mullen andTanabe(2002)The Oncologist 7106-119；McCormick F(2001)Nature Review Cancer1130-141]。1956年，在美國國家癌癥研究所，Smith先生領(lǐng)導的課題組[Smith et al.(1956)91211-1218]利用10種野生的人類腺病毒感染HeLa細胞或KB細胞產(chǎn)生的細胞裂解上清液對30多位患有子宮腫瘤的病人進行原位注射、肝動脈及靜脈給藥治療。所有的病人在接受注射之后沒有出現(xiàn)嚴重的副作用，只是出現(xiàn)類似于感冒的癥狀。有為數(shù)不少的病人在接受治療之后腫瘤腫塊縮小且出現(xiàn)腫瘤細胞裂解現(xiàn)象。由于當時技術(shù)水平的限制，病毒無法得到純化而使這項工作沒有得到進一步的深入研究。但Smith研究組的工作大大的激勵了科學家們利用病毒治療腫瘤的信心[Chiocca EA(2002)Nature Review Cancer 2938-950]。
隨著基因工程技術(shù)的進步，特別是對人類病毒研究的深入，在上世紀90年代，科學家們終于能夠有目的地利用腫瘤細胞基因表達的特性，用分子生物學技術(shù)對病毒基因組進行適當?shù)母脑欤軌蛴心康牡貥?gòu)建在腫瘤細胞中繁殖的專一型基因工程病毒[McCormick F(2001)Nature Review Cancer 1130-141]。如傾向于在腦腫瘤中復制的G207[Martuza et al.(1991)Science 252854-856]，在p53缺陷型腫瘤細胞中復制的Addl1520(Onyx-015)[Bischoff et al.(1996)Science 274373-376]和在前列腺腫瘤中復制的CV706[Rodriguez et al.(1997)Cancer Research 572559-2563]。這些工作漸漸形成了被稱為病毒腫瘤治療法(Virotherapy)的學科。目前有20多種病毒正在臨床試驗之中[Mullen and Tanabe(2002)The Oncologist 7106-119]。
構(gòu)建腫瘤細胞專一復制病毒的方法有好幾種。其中一類方法是利用腫瘤細胞特異的基因調(diào)控因子(如啟動子和增強子等)，去控制病毒基因組中決定病毒基因表達和病毒復制的幾個關(guān)鍵基因，如腺病毒基因組中的EIA、EIB、E2和E4基因[DeWeese et al.(2001)Cancer Research 617464-7472]。通過這樣改造，使病毒的關(guān)鍵基因的表達及病毒復制受控于安裝進去的腫瘤細胞專一的基因調(diào)控因子的控制之中，如前列腺專一抗原的啟動子和增強子(prostate-specific antigen，PSA，promoterand enhancer)、白球蛋白的啟動子和增強子(alpha-feto protein，AFP)及人類的E2F-1基因的啟動子等[McMcormick F(2001)Nature Review Cancer 1130-141]。
人端粒酶(telomerase)是一種控制細胞中染色體末端長度的重要酶，調(diào)節(jié)細胞在分裂分化過程中染色體末端的長度。人端粒酶主要有三部分組成，其中的RNA和具有催化作用的逆轉(zhuǎn)錄酶基因(telomerase reverse transcriptase gene，hTERT)控制著人端粒酶的活性。而hTERT的啟動子決定著端粒酶的表達水平和酶的活性。
進一步研究表明，人端粒酶在成年人的正常細胞中沒有活性或活性很低[Kim etal.(1994)Science 2662011-2015；Shay et al.(1997)European Journal of Cancer33271-282]。但在超過90％的腫瘤細胞中則有較高的表達(Hahn and Weinberg(2002)Nature Review Cancer 2331-341；Shay and Wright(1996)Current Opinion Oncology 866-71)。利用這個特點，科學家們已利用克隆到的hTERT啟動子構(gòu)建了好幾例基因表達載體，其中包括最近發(fā)表的利用hTERT去控制腺病毒復制的工作[Lanson etal.(2003)Cancer Research 637936-7941；Kawashima et al.(2004)Clinical CancerResearch10285-292；Kim et al.(2003)Oncogene 22370-380；Irving et al.(2004)CancerGene Therapy 11174-185]。
科學家同時也認識到，在早期胚胎發(fā)育和分化，特別是在一些細胞，如子宮內(nèi)膜細胞，造血祖先細胞和干細胞中仍有一定水平的端粒酶的表達[Wright et al.(1996)Development Genetics 18173-179；Sharma et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9212343-12346；Kolquist et al.(1996)British Journal Cancer 801156-1161；Tahara et al.(1999)Oncogene 181561-1567；Tanaka et al.(1998)American Journal ofPathology 1531985-1991]。這種低水平的端粒酶活性引起了想利用hTERT啟動子控制治療型基因表達載體，特別是利用hTERT啟動子去控制病毒關(guān)鍵基因制備腫瘤專一的復制型病毒的科研工作者的擔心[Hahn WC(2004)Clinical Cancer Research101203-1205]。因為如果這樣改造后的病毒如果在祖先細胞(progenitor)中由于低水平病毒關(guān)鍵基因的表達而使復制型病毒的大量繁殖，將在臨床上引起嚴重的毒副作用[Huang et al.(2004)Clinical Cancer Research 101439-1445；Hahn WC(2004)Clinical Cancer Research 101203-1205；Masutomi et al.(2003)Cell 114241-253]。因此提高hTERT啟動子對腫瘤細胞的專一性是研究的課題。
本發(fā)明通過對hTERT啟動子進行基因改造，提高了hTERT啟動子的腫瘤細胞的專一性。
在hTERT啟動子中，沒有常見的“TATA”這樣保守序列。但是兩個含有“CACGTG”的E-盒和5個“GC”豐富的Sp-I結(jié)合區(qū)。這些保守序列是通過C-Myc/Max復合體和Sp-I調(diào)控hTERT啟動子轉(zhuǎn)錄特別端粒酶活性表達的關(guān)鍵[Conget al.(1999)Human Moleular Genetics 8(1)137-142；Kyo et al.(2000)Nucleic AcidsResearch 28(3)669-677].很多實驗表明Myc是在細胞增殖和細胞周期過程中扮演重要作用，從而進一步通過hTERT啟動子而影響到端粒酶的轉(zhuǎn)錄和表達。
為了減少hTERT啟動子在正常細胞如造血祖先細胞中的活性，進一步提高hTERT啟動子的腫瘤細胞的特異性，我們對hTERT啟動子做了很詳細的序列計算機結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄蛋白因子結(jié)合的模擬。根據(jù)計算機對轉(zhuǎn)錄蛋白因子構(gòu)象的分析，我們對hTERT啟動子中多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位進行了系統(tǒng)的序列突變分析。在一系列突變體中，我們選擇了一個變體，這個變體中在第5個Sp-I結(jié)合序列之上變成了一個轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的結(jié)合位點。由原來的’...TTTCCGCGGCCCCGGCC...’(圖1)變成了’...TTTCCGCGGCAACGGCC...’(圖2).
體外試驗表明，經(jīng)過突變之后的hTERT啟動子，不但具有原有腫瘤細胞中的活性，而且使它在正常細胞中的“啟動”活性大大地降低了，從而阻斷了hTERT原始啟動子在造血祖先細胞等正常細胞中的轉(zhuǎn)錄活性。利用報導基因的轉(zhuǎn)染試驗證明，經(jīng)改造后的啟動子在腫瘤細胞中要比野生的啟動子高5到10倍，而在正常細胞中的活性則降低了(圖6)。利用它控制腺病毒關(guān)鍵基因表達，而構(gòu)建成的復制型腺病毒對干細胞已沒有毒性(圖7)。從而可能提高了這類復制型腺病毒在臨床上的安全性。
由于E2F-1啟動子能在pRb/E2F/p16通道途徑缺失的腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄連接的基因，而使E2F-1啟動子廣泛利用于基因治療，特別是用于構(gòu)建復制型腺病毒之中[Parr et al.(1997)Nature Medicine 3(10)1145-1149；Jakubczak et al.(2003)CancerResearch 631490-1499；Bristol et al.(2003)Molecular Therapy 7(6)755-763]。經(jīng)我們這樣的改造后的hTERT啟動子，不但有E2F-1基因結(jié)合位點，而且有E2F-1啟動子中具有的Sp-I和NF-1結(jié)合位點，從而使改造后的hTERT啟動子可以在端粒酶表達和Rb通道途徑變異的腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因。因此這個經(jīng)我們改造后的hTERT啟動子將在這兩類腫瘤細胞中有轉(zhuǎn)錄功能，而不能在正常細胞包括干細胞中表達，進而大大的提高了它的腫瘤細胞的專一性。
與此同時，我們還進一步將腺病毒的E1A和E1B基因用核糖體介入因子(internal ribosome entry site，IRES)連起來，一同受控于hTERT啟動子。這樣腺病毒的兩個重要基因E1A和E1B在轉(zhuǎn)錄上同時受到hTERT啟動子的控制，從而進一步提高了病毒的細胞特異性(KH-906)。
腺病毒的基因組當中有著自身控制基因表達調(diào)控的元件，如內(nèi)源的E1A啟動子和增強子，其中的增強子與病毒的包裝序列是重疊的。因此在一些已發(fā)表的文章中，有人將病毒的包裝序列從病毒基因組原來的左端搬到右端，以為這樣就可以降低病毒內(nèi)源調(diào)控元件對外源基因調(diào)控序列及其功能的影響，進而可能提高外源序列對病毒基因表達調(diào)控的控制[Bristol et al.(2003)Molecular Therapy 7(6)755-764；Jakubczak et al.(2003)Cancer Research 631490-1499]。但是這樣做的后果卻出乎設計者的預料。包裝序列經(jīng)搬家的病毒基因組在病毒復制過程中則變得不穩(wěn)定而產(chǎn)生一系列重組體病毒[WO 02/067861；ASGT 2003 annual meeting，MolecularTherapy]。因此，將病毒包裝序列從左端搬到右端的設計是不可行的。那么如何保證病毒基因組穩(wěn)定，不在放大生產(chǎn)過程產(chǎn)生重組體病毒又能減低病毒內(nèi)源等因調(diào)控元件對外源啟動子的影響呢？本發(fā)明在腺病毒的末端(ITR)和包裝序列(packagingsite)之后，和外源啟動子(如hTERT啟動子)之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列(transcription termination signal)。這些阻斷序列可以阻斷任何核糖核酸聚合酶(RNApolymerase)介導的基因轉(zhuǎn)錄。如SV40早期的多聚(A)信號序列(poly(A)terminalsequence)。體外試驗表明由于SV40 poly(A)序列的介入，腺病毒末端序列ITR和重疊于包裝序列之中具有增強子效應的序列對hTERT啟動子的影響變得很少。
本發(fā)明的重組體安裝有免疫調(diào)節(jié)基因。已知的幾個溶瘤性病毒當中，都安裝有細胞因子GM-CSF。本發(fā)明的重組體也安裝有GM-CSF，但不局限于只用GM-CSF，可以是其它細胞因子(cytokines)。但是GM-CSF是一種被認為是最具活力的免疫調(diào)節(jié)因子(Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903539-3543)。它是一種分泌型糖蛋白，能刺激粒性白細胞(granulocytes)，單核白細胞(monocytes)，巨噬細胞(macrophage)和樹狀細胞(dendritic cells)的分化，刺激抗原呈遞細胞上的MHC和B7輔助分子的高表達。同時GM-CSF還可促進免疫細胞的組織滲入及B細胞的分化。因此在過去的幾年里，科學家利用重組的GM-CSF蛋白和化療藥物一起治療腫瘤病人。同時，多個利用表達GM-CSF的腫瘤細胞作為腫瘤疫苗正在臨床試驗之中[Armitage Jo(1998)Blood 924491-4508；Mach et al.(2000)CancerResearch 603239-3246；Gilboa E(2004)Nature Reviews Cancer 4401-411]。表達GM-CSF的復制型溶瘤性病毒不但能通過病毒的復制殺死腫瘤細胞，而且由于感染的腫瘤細胞中也表達GM-CSF，在體內(nèi)建立起了腫瘤疫苗站(in situ cancervaccine/immunotherapy)，具有腫瘤免疫治療作用。這樣，不但省去了常規(guī)腫瘤免疫加工過程中的繁瑣流程，而且由于腫瘤細胞未經(jīng)體外分離培養(yǎng)，可以更好保存了腫瘤自身的特性，如抗原的表達，從而使這個“體內(nèi)”腫瘤疫苗更加有效。這樣設計的病毒可能通過原位給藥，不但對原位癌細胞具有殺傷作用，也能針對對轉(zhuǎn)移腫瘤產(chǎn)生治療效果。所以這是一個構(gòu)建溶瘤性腺病毒很特別的構(gòu)思和設計。
在本發(fā)明的系列病毒之中，有兩個病毒是表達一種膜結(jié)合型的細胞因子GM-CSF(membrane bound GM-CSF，mbGM-CSF)。在溶瘤腺病毒中利用膜結(jié)合型GM-CSF的構(gòu)思是基于已發(fā)表的工作。研究工作表明，膜結(jié)合型GM-CSF可以增進與皮下樹狀細胞(Dentritic cells)的作用，而產(chǎn)生比分泌型GM-CSF對樹狀細胞更強的調(diào)理作用作用[Soo Hoo et al.(1999)Journal of Immundogy 1697343-7349；Yei et al.(2002) Gene Therapy 61302-1311]。在溶瘤性病毒中表達膜結(jié)合型細胞因子GM-CSF的構(gòu)思和重組基因工程藥物未見報導。
本發(fā)明還提供不同于現(xiàn)有技術(shù)的構(gòu)建溶瘤病毒的制備方法?，F(xiàn)在已發(fā)表的工作在構(gòu)建溶瘤病毒或基因工程病毒載體時都是在一種基因工程改造的細胞中進行，如293細胞。由于這類細胞中表達E1已缺失或E1改造之后腺病毒復制繁殖所需的E1區(qū)編碼的蛋白基因。但這類細胞生產(chǎn)的腺病毒產(chǎn)品中常常是包含著一定水平的野生型腺病毒或重組性腺病毒。其道理是在293細胞一類的生產(chǎn)細胞中含有腺病毒的基因序列，這段“野生”的腺病毒序列，與需要生產(chǎn)的E1已缺失或E1已加工過的腺病毒在細胞內(nèi)就會產(chǎn)生重組而產(chǎn)生要么是野生型腺病毒，要么是重組型腺病毒。這樣就不但會降低產(chǎn)品質(zhì)量，也會引起可能想不到的毒副作用。我們介紹的生產(chǎn)用細胞將是一類不含腺病毒基因序列的細胞，從而避免了上述介紹的可能問題。
本發(fā)明還對腺病毒的表面進行了改造，使它提高與腫瘤細胞的親和力，而增加感染腫瘤細胞的能力。最近的研究表明，不少腫瘤細胞不表達或在很低水平上表達腺病毒5型受體(the coxsackie virus B and adenovirus receptor，CAR)，而這些腫瘤細胞都表達CD46[Shayakhmetov et al.(2002)Cancer Research 621063-1068]。進一步研究指出腺病毒35型所用的受體正是CD46蛋白[Sirena et al.(2004)Journal ofVirology 78(9)4454-4462]。因此，我們提出將與CD46蛋白受體作用的腺病毒35型上的纖維蛋白基因(Fiber)頂結(jié)(knob)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)而構(gòu)建一個融合腺病毒與受體作用的重組體。根據(jù)推測，這樣的重組體將更廣泛且更有效地感染腫瘤細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種將腫瘤細胞特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件安裝到人類腺病毒的基因組中去控制腺病毒關(guān)鍵基因的表達的重組體。它是一種溶瘤性病毒與免疫調(diào)節(jié)基因的重組體，可以達到控制病毒只在腫瘤細胞中復制的目的。本發(fā)明的重組體，將具有誘導人體對腫瘤細胞產(chǎn)生特異免疫反應的細胞因子基因與上述腫瘤細胞專一的復制型病毒進行有機結(jié)合，能在特定細胞中繁殖、生產(chǎn)，并可直接在腫瘤細胞中復制、表達，具有殺死腫瘤細胞的功能，從而達到預防或和治療腫瘤的目的。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種腫瘤細胞專一的溶瘤性病毒體，以及這種病毒體與免疫調(diào)節(jié)基因結(jié)合的基因工程重組體。該重組體是通過DNA克隆技術(shù)將腫瘤細胞專一的啟動子和免疫調(diào)節(jié)基因安裝到腺病毒基因組中，構(gòu)建成一個能在特定腫瘤細胞中繁殖，也能在腫瘤細胞中表達免疫調(diào)節(jié)基因的融合序列。
本發(fā)明的重組體由載體病毒，腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件和免疫調(diào)節(jié)基因構(gòu)建而成。
所述載體病毒可以為DNA病毒或RNA病毒的任何一種，可以是腺病毒中各種血型型，如腺病毒5型、2型、35型、41型等。其優(yōu)選載體為腺病毒5型。也可以是改造的腺病毒改造體，如將腺病毒的E1A和E1B基因用核糖體介入因子(internal ribosome entry site，IRES)連起來的腺病毒。如用腺病毒35型上的纖維蛋白基因(Fiber)頂結(jié)(knob)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)而構(gòu)建一個融合腺病毒。如在腺病毒的末端(ITR)、包裝序列(packaging site)之后，和外源啟動子(如hTERT啟動子)之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列(transcription termination signal)。這些阻斷序列可以阻斷任何核糖核酸聚合酶(RNA polymerase)介導的基因轉(zhuǎn)錄。如SV40早期的多聚(A)信號序列(poly(A)terminal sequence)。如在腺病毒E3區(qū)中編碼10.4K，14.5K和14.7K的序列已刪除的腺病毒。
所述腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是任何癌細胞特異的啟動子，增強子，靜止子或他們的組合，優(yōu)選的是序列表中序列2所表示的經(jīng)過改造的hTERT啟動子，該啟動子有轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的結(jié)合位點。
所述免疫調(diào)節(jié)基因可以是任何具有刺激誘導免疫反應的基因或它們的變體，如IL-2，IL-10，IL-12，IL-15，IL-24，IL-25，GM-CSF，G-CSF和INF-alpha，INF-beta等。其最優(yōu)選免疫調(diào)節(jié)基因為GM-CSF包括分泌型和膜結(jié)合型GM-CSF或它們的變體。
本發(fā)明的重組體，優(yōu)選的是，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，將腺病毒的E1A和E1B基因用核糖體介入因子IRES連起來，并且用腺病毒35型上的纖維蛋白基因頂結(jié)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)，并且在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因。優(yōu)選為膜結(jié)合型GM-CSF基因。
本發(fā)明的重組體，優(yōu)選的是，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因，其DNA序列為序列表中序列3表示的序列(命名為KH-901)，其中的GM-CSF基因也可以是膜結(jié)合型GM-CSF基因(命名為KH-902)。
本發(fā)明的重組體，優(yōu)選的是，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，并且用腺病毒35型上的纖維蛋白基因頂結(jié)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因(命名為KH-904)，優(yōu)選是膜結(jié)合型GM-CSF基因(命名為KH-905)。
本發(fā)明的重組體，優(yōu)選的是，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列，在腺病毒E3區(qū)中編碼10.4K，14.5K和14.7K的序列已刪除的腺病毒，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因，優(yōu)選是膜結(jié)合型GM-CSF基因(命名為KH-903)。
本發(fā)明的重組體，優(yōu)選的是，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列，并將腺病毒的E1A和E1B基因用核糖體介入因子IRES連起來，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因(命名為KH-906)。
本發(fā)明的重組體包括但不限于以下重組體KH-901，KH-902，KH-903，KH-904，KH-905和KH-906。
其中重組體KH-901的基因序列如序列表中的序列3，其中1)1-103腺病毒左側(cè)臂(ITR)[腺病毒5基因組全序列Genbank NoBK000408]；
2)194-358腺病毒基因組包裝序列和E1增強子序列；3)362-534SV40多聚腺嘌呤核苷酸信號序列和連接序列(linker)(腺病毒5型中堿基從#362到#551已刪除)；4)525-811經(jīng)基因工程技術(shù)改造的hTERT啟動子序列和連接序列；5)812以右腺病毒序列包括E1A，E1B，E2等；6)28995-29436免疫調(diào)節(jié)基因人類GM-CSF基因；7)29437以右腺病毒序列包括E4已和右側(cè)臂。
重組體KH-900的基因組序列類似于序列3，只是其中的hTERT啟動子是野生型沒有堿基的改變，請參閱序列1和序列2。在病毒基因包裝區(qū)與hTERT啟動子之間沒有多聚腺嘌呤核苷酸信號序列。
重組體KH-902的基因組序列類似于KH-901，只是其中的免疫調(diào)節(jié)基因GM-CSF有KH-901種的分泌型變成了膜結(jié)合型，其序列見序列4。
重組體KH-903的基因組序列類似于KH-901，只是其中在E3區(qū)中編碼10.4K，14.5K和14.7K的序列已刪除。刪除的序列是與腺病毒堿基29804至堿基30857。這三個基因編碼的蛋白會抑制免疫反應，特別是腫瘤壞死因子介導的免疫反應。因此，刪除這三個基因的溶瘤性腺病毒可能會誘導產(chǎn)生更強的抗腫瘤的免疫反應。
重組體KH-904基因組序列類似于KH-901只是其中的纖維蛋白基因中編碼頂結(jié)(knob)的序列由腺病毒5型變成了35型。其詳細序列見序列5。最近的研究工作表明，很多腫瘤細胞不表達腺病毒5型的受體蛋白(CAR)，而高水平的表達CD46蛋白。CD46蛋白是腺病毒35型的受體。這樣，如果將與CD46蛋白作用的纖維蛋白上的相關(guān)序列嫁接到腺病毒5型上，形成的重組體將作用于CD46受體而增高感染腫瘤細胞的效率。
重組體KH-905是在重組體KH-904的基礎上將其中的免疫調(diào)節(jié)蛋白GM-CSF由分泌型變成膜結(jié)合型。
重組體KH-906的基因組則是在KH-901的基礎上，用核糖體進入序列(Internal ribosome entry site，IRES)取代E1B的啟動子[Li et al.(2001)CancerResearch 621 Zhang J et al.(2002)Cancer Research 623743-3750]。
本發(fā)明還包括序列表中序列2所表示的經(jīng)過改造的hTERT啟動子，該啟動子有轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的結(jié)合位點。
本發(fā)明還包括該啟動子的制備，根據(jù)圖1中hTERT啟動子序列設計合成兩段引物A.5’-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3’B.5’-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3’作為引物，以激活的人體基因組核糖核酸作為模板，經(jīng)PCR方法擴增到人的hTERT啟動子。其中，反應條件為第一循環(huán)94℃變性5分鐘，81℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；以后個循環(huán)93℃變性1分鐘，68℃退火一分鐘，72℃延伸2分鐘，共35個循環(huán)。由此得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收得到hTERT啟動子片斷。經(jīng)測序分析，得到的啟動子片段與發(fā)表的一樣(圖1)。然后將這段DNA克隆到pUC19載體之中，利用定點突變的方法(Strategene定點誘導方法)將hTERT啟動子序列變成圖2所示的序列。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的重組體的制備方法，該方法包括以下步驟a)含有hTERT啟動子序列的腺病毒左側(cè)臂的制備；b)含有免疫調(diào)節(jié)基因的腺病毒右側(cè)臂的制備；c)將腺病毒左側(cè)臂和腺病毒右側(cè)臂轉(zhuǎn)染到293細胞、HeLa細胞、HeLa-S3細胞或A549細胞中，通過同源重組的方法得到權(quán)利要求1的重組體。
本發(fā)明的重組體具體可以通過如下方法獲得重組病毒是在真核細胞中同源重組獲得的。首先含有腺病毒左側(cè)臂序列的PXC.1(購于加拿大的Microbix)在體外通過DNA克隆技術(shù)將內(nèi)源E1A啟動子序列刪除，取而代之的則是多聚腺嘌呤核苷酸和端粒逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT啟動子序列而得到pKH-901a。同時，腺病毒的右側(cè)臂pBHGE3(購于加拿大的Microbix)通過類似的方法用免疫調(diào)節(jié)基因GM-CSF取代E3區(qū)中的gp19k基因而得到PKH-901b。
PKH-901a和PKH-901b一起轉(zhuǎn)化HeLa細胞，通過同源重組的方法而得到KH-901。同樣的，其他重組腺病毒包括KH-900，KH-902，KH-903，KH-904，KH-905和KH-906也通過類似方法而構(gòu)建而成。
實質(zhì)上，該重組體可在任何直接細胞或原核細胞中的同源重組的方式獲得。
根據(jù)上述方案，利用PCR擴增方法在pXC.1的堿基第362位到551位處分別加上內(nèi)切酶位點SspI和PinAI(AgeI)。hTERT啟動子則用PCR從人體基因庫中放大得到，并與多聚腺嘌呤核苷酸序列一起在體外經(jīng)PCR將兩個片端取接起來而變成一段DNA。在這段DNA的兩端加上內(nèi)切酶位點SspI和PinAI。經(jīng)酶切后分離到的DNA片段與多重同樣酶切的pXC.1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌株DH5-alpha細胞(Invitrogen，USA)。轉(zhuǎn)化后挑選10菌斑，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，提取DNA，經(jīng)酶切分析鑒定，將得到的序列命名為PKH-901a。
以5’-ATAACCATGTGGCTGC-3’和5’-AAATTACTCCTGGACTGG-3’作為引物，通過PCR從人的激活的巨噬細胞(macrophage)的cDNA中增擴免疫調(diào)節(jié)因子GM-CSF，將擴增的全長GM-CSF基因克隆到原核質(zhì)粒pUC19，進行測序驗證。隨后，利用運輸載體將GM-CSF的cDNA片段克隆到pBHGE3當中取代gp19k基因編碼區(qū)，經(jīng)測序和酶切檢驗，將得到的序列命名為pKH-901b。
將構(gòu)建好的重組載體pKH-901a和pKH-901b其轉(zhuǎn)染HeLa細胞，使二者發(fā)生同源共組。兩個純化的質(zhì)粒DNA用ClaI線性化，然后經(jīng)lipofectin[USA Invitrogen]介導轉(zhuǎn)化HeLa細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)化10天之后，細胞被刮下來，經(jīng)凍溶三次，取100微升，在HeLa細胞上進行病毒斑檢。8天之后，在低凝點凝膠之下開始看到病毒斑點。挑選6個病毒斑，接種到預先種好的HeLa細胞中，經(jīng)4天至6天之后，收集并低溫保存裂解的細胞液。這些裂解液被用來提取腺病毒的DNA[Qiagen’s kit]，經(jīng)酶切，PCR和Southern雜交確定病毒的分子結(jié)構(gòu)，將序列命名為KH-901。
本發(fā)明的重組體可用于制備治療和/或預防各種惡性腫瘤的藥物。本發(fā)明的重組體可以與放療和化療一起使用，取得更好的治療效果。
本發(fā)明的重組體可制備成靜脈注射，動脈注射，瘤內(nèi)注射，肌肉注射，皮下注射，器官注射，和胸、腹水內(nèi)注射的藥物組合物。
對于大規(guī)模制備，可利用本發(fā)明方法制備的重組體，轉(zhuǎn)染到HeLa細胞或HeLa-S3或A549細胞中，經(jīng)過培養(yǎng)，繁殖，濃縮，純化等方法制備，得到大批量的可用于制藥的本發(fā)明重組體原料，再進一步和/或與藥物可接受的載體混合，用藥物制劑的常規(guī)技術(shù)，制備成臨床上可利用的注射液。
以下通過實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果
實驗1、hTERT啟動子的活性及腫瘤細胞專一性的比較將野生型的hTERT啟動子(telo)和經(jīng)突變修飾之后hTERT啟動子(Mtelo)與報導基因luciferase(luc)相連。然后分別將這兩種質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化多種腫瘤細胞和人體正常細胞。48小時之后，轉(zhuǎn)化后的細胞被裂解并用于測定其中l(wèi)uc的表達情況。其中轉(zhuǎn)化效率用lacz報導基因質(zhì)粒來標準化。從相對的luc活性中可以看出，第一，在腫瘤細胞中，突變修飾之后的hTERT啟動子(Mtelo)要比野生型hTERT啟動子(telo)活性高很多(見圖6)。例如在Hep3B細胞中，Mtelo活性比telo高6倍多，在LNCap細胞中Mtelo啟動子比telo啟動子高18倍多。第二，在正常細胞中，telo啟動子有一定轉(zhuǎn)錄活性，而Mtelo啟動子則基本上只是背景水平的活性。如在MRC5細胞當中，Mtelo介導的luc活性比telo啟動子控制的luc活性要低6倍。這些結(jié)果表明，經(jīng)修飾改造的hTERT啟動子具有更強的腫瘤細胞專一性和轉(zhuǎn)錄能力。
這個結(jié)論在隨后的病毒對細胞的殺傷作用實驗中得到進一步的確證。野生型腺病毒Ad5，缺陷型腺病毒d1312[E1A缺失]，重組體KH-900和KH-901被用來感染人體初生前皮膚細胞[foreskin keratinocytes，hFKs]和轉(zhuǎn)化人體乳頭狀瘤病毒血型16型(human papilloma virus type 16，HPV-16)的E6基因(hFKs-E6)。早先的研究工作表明轉(zhuǎn)化HPV16-E6基因細胞具有比父代細胞高許多的端粒酶活性[Horikawa etal.(2001)Journal Virology 75(9)4467-4472]。病毒感染之后，我們用定量的PCR方法對其中E1A信使mRNA的拷貝數(shù)進行分析，確定在hTERT啟動子控制之下的腺病毒關(guān)鍵基因E1A的轉(zhuǎn)錄表達情況。試驗的結(jié)果如圖7所示，在d1312感染的hFKs和hFKs-E6細胞中沒有檢測到E1A信使mRNA；在Ad5感染的細胞中檢測到高于4000拷貝mRNA；在hFKs和hFKs-E6兩種細胞中E1A mRNA的拷貝數(shù)差異不大。在KH-900感染的細胞中，hGKs細胞中只有少數(shù)信使E1A mRNA，而在hFKs-E6細胞中，則有比在hFKs中高出20倍的E1A信使核糖核酸。有趣的是，在KH-901感染的細胞中，hFKs-E6細胞中比在hFKs細胞中超過100倍的E1A信使核糖核酸，同時，KH-901感染的hFKs細胞中mRNA拷貝數(shù)比較低。這個實驗表明，Mtelo啟動子與報導基因相連時要比telo啟動子更強的活性，更高的腫瘤細胞專一性，而且在安裝入腺病毒基因組中時，仍表現(xiàn)出更高的專一性和更強的對下游基因的啟動轉(zhuǎn)錄控制能力。
這個結(jié)果在對體外培養(yǎng)的骨髓細胞的試驗中也得到進一步的論證。重組體KH-900和KH-901用來感染(每細胞1個感染單位)293細胞和骨髓干細胞，然后檢測細胞的存活力，如圖8所示，KH-900和KH-901殺傷293細胞的能力相當。KH-901對骨髓干細胞的殺傷能力幾乎等于零，但KH-900對骨髓干細胞則有一定殺傷作用。
實驗2重組溶瘤性復制型腺病毒對腫瘤細胞殺傷能力之比較重組體病毒KH-900，KH-901，KH-902和KH-903對腫瘤細胞殺傷能力的比較是通過測定病毒感染之后存活細胞的多少來確定的。肺癌細胞系A549預先接種在培養(yǎng)皿上等到85％左右飽和度時用病毒去感染，感染的濃度是每個細胞受到1個致斑單位(PFU)(M01＝1)。在病毒感染之后不同時間，對細胞的存活度進行測試[Hallenbeck et al.(1997)Human Gene Therapy 111172-1179]。所得的結(jié)果如圖9。四個重組體腺病毒當中，KH-904的殺死腫瘤細胞能力最強，KH-901和KH-902殺傷腫瘤細胞的能力相差無幾，都比KH-904要弱。KH-900殺傷能力最弱。
這個結(jié)果表明，經(jīng)基因工程改造的hTERT啟動子(Mtelo)比野生的啟動子(telo)要強。同時，帶有纖維溶合蛋白基因(Ad5/35)的重組腺病毒比野生的纖維蛋白基因(Ad5)的重組腺病毒要有更強的殺傷腫瘤細胞的能力。這個結(jié)論在更多腫瘤細胞和人體正常細胞的殺傷能力比較中得到了進一步的論證[表1]。表1是6種重組腺病毒在9種腫瘤細胞和5種人體正常細胞中所確定的EC50值大小比較。這個實驗操作如下腫瘤細胞在加病毒之前24小時，正常細胞在加病毒之后72小時接種在培養(yǎng)皿中，然后加不同MOI的腺病毒，再行培養(yǎng)。在培養(yǎng)8-10天之后，對培養(yǎng)皿中的細胞進行存活的測試。然后用軟件計算出EC50值。EC50值越小表示重組病毒殺死細胞的能力越強。在腫瘤細胞中，KH-901都表現(xiàn)出比KH-900更強的殺傷力。再次表明經(jīng)基因工程改選后的Mtelo啟動子要比野生的telo啟動子具有更強的轉(zhuǎn)錄活性，而使重組病毒具有更高的殺死腫瘤細胞的能力。KH-901的殺傷能力與KH-902，KH-903想比殺死腫瘤細胞的能力相似。在這6個病毒中，重組體腺病毒KH-904的殺傷腫瘤細胞的能力最強。這與前面得到的結(jié)果是相吻合的。
表1

更有意思的是，對人體正常細胞而言，裝有基因工程改選過的Mtelo啟動子的重組體病毒(包括KH-901，KH-902，KH-903，KH-904)都表現(xiàn)出比KH-900(裝有原始未改造的hTERT啟動子)弱得多的殺傷能力(因為EC50值更高)。
同時，在E1A基因和E1B基因之間裝有核糖體介入因子的重組體腺病毒KH-906(其中E1A和E1B基因在轉(zhuǎn)錄水平上都由經(jīng)改造的Mtelo啟動子控制)則表現(xiàn)出比其他重組體病毒都要高的腫瘤細胞專一性。雖然在對腫瘤細胞的殺死能力比其他重組體要弱一些。
實驗3重組體腺病毒KH-901在腫瘤細胞中表達較高的具有生物學活性的免疫調(diào)節(jié)因子GM-CSF重組體腺病毒KH-901用不同的M0I(1和10)感染5種腫瘤細胞和一種人體正常細胞(hFKs)。感染48小時之后，收集細胞，經(jīng)凍溶和ELISA測定細胞裂解液中的GM-CSFR濃度。結(jié)果如圖14所示，KH-901在所實驗的5種腫瘤細胞中都表達出很高的GM-CSF蛋白，如在前列腺腫瘤細胞中，每106細胞中，每24小時產(chǎn)生30至231納克的GM-CSF。在同樣的實驗中，KH-901在正常細胞中，GM-CSF表達很低或檢測不到。在如后的生物活性實驗中，進一步表明，這些用ELISA檢測到的GM-CSF具有生物學活性(結(jié)果見表2)。

實驗4重組體腺病毒在動物腫瘤模型上的抗腫瘤活性前列腺腫瘤細胞系LNeap細胞被用來在裸鼠上建立腫瘤模型，在皮下接種6百萬細胞，在4個星期之后可以看到腫瘤長到200立方微升左右。這個時候給藥，一共給三針(第1天，第5天和第9天)，每針給藥3×1010病毒顆粒。然后每個星期測量腫瘤體積兩次。所得的腫瘤生長數(shù)據(jù)如圖10。
在這個實驗中三種重組型腺病毒KH-901，KH-904和KH-907(沒有顯示，與KH-901一樣只是其中沒有GM-CSF基因)被用來注射腫瘤，同時Add1520作為對照，也包括在實驗之中。
從圖10中可以看出，不含病毒的制劑處理的腫瘤長得很快，48天之后的對照組的腫瘤體積是開始給藥時的百分之1200(1200％)。而經(jīng)病毒處理的腫瘤，腫瘤生長受到了一定的抑制，如經(jīng)KH-901處理的腫瘤remain the same as baseline，KH-904處理的腫瘤則使腫瘤體積縮小到開始給藥時的百分之15(15％)。這個時候，經(jīng)Addl1520處理的腫瘤則生長受一定影響，其體積是開始給藥時的百分之850(850％)。
這說明KH-901和KH-904的殺傷腫瘤的能力比Addl1520(Onyx-015)要強。其中KH-904又比KH-901要強，這與前面在細胞水平中得到的結(jié)果是吻合的。
需要指出的是，雖然這是在裸鼠上做的腫瘤模擬實驗，我們也看到KH-901的殺傷腫瘤的能力比KH-907(沒有GM-CSF基因)要強。
在這個實驗過程中，對腫瘤中GM-CSF表達情況也作了紀錄。經(jīng)給藥之后14天，在Addl1520處理和KH-907處理的動物血中沒有檢測到GM-CSF的表達，而在KH901和KH-904處理的動物血中，分別檢測到2.322微克/毫升和2.776微克/毫升的GM-CSF。這個結(jié)果表明，重組腺病毒中的GM-CSF不但在體外腫瘤細胞中表達，而且在動物身上的腫瘤中也有較高水平的表達。
這個程序組建重組腺病毒的效率高，可操作性強。其它的重組腺病毒將分別在本發(fā)明的重組溶瘤性復制型腺病毒重組體具有以下特點1.結(jié)構(gòu)特點
這些重組體是一些活的重組腺病毒，能在腫瘤細胞中復制繁殖。不同于現(xiàn)有的化學合成藥和基因工程藥物。能直接在腫瘤細胞中專一表達復制，生物學活性高，可達到有效治療作用。腺病毒中還攜帶免疫調(diào)節(jié)基因。這樣，這個基因能在感染的腫瘤細胞中表達定點誘導針對腫瘤細胞的免疫反應。且安全性好，致病性低，尤其是安裝腫瘤調(diào)控元件之后。
2.應用特點安裝的腫瘤調(diào)控元件在超過90％的腫瘤中都有活性，即在絕大多部分的腫瘤細胞中，這類腺病毒的關(guān)鍵基因可以表達而使病毒能夠復制繁殖，進而殺死腫瘤細胞。所以這些重組溶瘤性復制型腺病毒將是非常廣泛的，如頭頸癌、肺癌、直腸癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌等。
由于在這腫瘤專一的腺病毒中裝有表達免疫調(diào)節(jié)因子的基因，正如前文中所述，這類產(chǎn)品將不但具有由于腺病毒復制感染而殺死腫瘤，而且在腫瘤細胞中表達的細胞因子，將調(diào)節(jié)免疫反應而通過加強免疫系統(tǒng)而對原位及擴散的腫瘤進行進攻，進而殺死腫瘤細胞。
不同于現(xiàn)有產(chǎn)品的特點還包括1)這些產(chǎn)品的腫瘤專一性提高了，不感染正常體細胞和干細胞；這些病毒在臨床使用之中的副作用更低。2)表達免疫調(diào)節(jié)因子，包括分泌型和膜結(jié)合型免疫調(diào)節(jié)因子；使機體產(chǎn)生免疫作用，可殺傷遠處腫瘤，減少復發(fā)；3)經(jīng)過病毒外殼的改變，這些腺病毒對大部分腫瘤細胞的感染力大大的提高了，進而使它成為有可能有更好的治療作用。
本發(fā)明的貢獻在于1)通過定向突變修飾腫瘤細胞基因調(diào)控元件hTERT啟動子，使之具有更高的腫瘤細胞特異性和轉(zhuǎn)錄活性，從而降低相連基因在部分成年體細胞特別是生殖細胞，造血祖先細胞和干細胞中表達的可能性，進而提高靶向作用效率。利用改造后的hTERT啟動子構(gòu)建成的溶瘤性復制型腺病毒不能在骨髓細胞中繁殖，而能有效殺滅多種腫瘤細胞。
2)利用腫瘤細胞專一的溶瘤性腺病毒表達可引起免疫反應的免疫調(diào)節(jié)基因GM-CSF，這樣構(gòu)件的病毒，不但可以通過原位給藥，溶瘤性病毒通過復制繁殖而裂解腫瘤細胞，同時又通過裂解細胞中產(chǎn)生的腫瘤抗原結(jié)合腫瘤細胞中表達的GM-CSF而產(chǎn)生強烈的針對腫瘤細胞的免疫反應(immune responses against cancer)。特別值得一提的是這種腫瘤專一的抗腫瘤免疫反應可以通過“教育”人體的免疫系統(tǒng)而對擴散的腫瘤發(fā)起攻擊而將它們殺滅。這種經(jīng)過“教育”的抗腫瘤特異免疫反應可以在病人體內(nèi)持續(xù)很長時間，從而在病人體內(nèi)起到預防腫瘤復發(fā)的作用。
3)通過對腺病毒表面的改變而使其對絕大部分腫瘤細胞有較強的感染力。由于很大一部分腫瘤細胞中不表達或低水平表達腺病毒血型型5(Ad5)的受體蛋白(CAR)，因此經(jīng)常會看到Ad5不能很好地感染腫瘤細胞的現(xiàn)象。通過將腺病毒血型35(Ad35)的受體作用的結(jié)合位點和序列接到Ad5基因組中去，就可以大大的提高其感染多數(shù)腫瘤細胞的效率。體外和體內(nèi)試驗都已證明了這種設計中構(gòu)建的重組體的優(yōu)越性(參見實驗例)。
序列表說明序列1人體hTERT啟動子的堿基序列及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點.SP-1(GC-boxes)SP1結(jié)合位點；E-boxesMyc的結(jié)合部位；NF-1和NF因子結(jié)合的位點。序列2經(jīng)修飾突變改造而具更高腫瘤細胞專一性及轉(zhuǎn)錄活性的hTERT啟動子.E2F-1E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。
序列3重組體KH-901的基因組序列1)1-103腺病毒左側(cè)臂(ITR)[腺病毒5基因組全序列Genbank NoBK000408]；2)194-358腺病毒基因組包裝序列和E1增強子序列；3)362-534SV40多聚腺嘌呤核苷酸信號序列和連接序列(linker)(腺病毒5型中堿基從#362到#551已刪除)；4)525-811經(jīng)基因工程技術(shù)改造的hTERT啟動子序列和連接序列；5)812以右腺病毒序列包括E1A，E1B，E2等；6)28995-29436免疫調(diào)節(jié)基因人類GM-CSF基因；7)29437以右腺病毒序列包括E4已和右側(cè)臂。
序列4重組體KH-902的基因組中免疫調(diào)節(jié)因子GM-CSF基因的膜結(jié)合型基因(mbGM-CSF)序列。
序列5重組體KH-904的基因組中含腺病毒血型35型的纖維蛋白基因序列(FiberknobAd5/35)。


圖1人體hTERT啟動子的堿基序列及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點.SP-1(GC-boxes)SP1結(jié)合位點；E-boxesMyc的結(jié)合部位；NF-1和NF因子結(jié)合的位點。
圖2經(jīng)修飾突變改造而具更高腫瘤細胞專一性及轉(zhuǎn)錄活性的hTERT啟動子.E2F-1E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。
圖3-1和圖3-2重組體腺病毒的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4-1，圖4-2和圖4-3重組腺病毒KH-901的構(gòu)建過程示意5重組腺病毒KH-901的技術(shù)路線框圖。
圖6hTERT啟動子的活性野生型啟動子(telo)與改造型啟動子(Mtelo)之比較。
圖7重組體腺病毒在人體初始hFK細胞和轉(zhuǎn)化乳頭狀病毒(HPV)E6基因的hFKs-E6細胞中E1A信使核糖核酸的表達。
圖8重組體病毒對體外培養(yǎng)的正常骨髓細胞(bone marrow stem cells)殺傷活性的比較。
圖9重組體腺病毒在A549細胞中殺死細胞能力之比較(存活細胞百分比)。
圖10重組體在前列腺腫瘤模型上殺死腫瘤能力之比較。
具體實施例方式下列實施例是對本發(fā)明的進一步解釋和證明，對本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。
實施例1構(gòu)建溶瘤性復制型腺病毒重組體KH-901及鑒定(如圖4和圖5所示)2.根據(jù)圖1中hTERT啟動子序列設計合成兩段引物A.5’-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3’B.5’-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3’作為引物，以激活的人體基因組核糖核酸作為模板，經(jīng)PCR方法擴增到人的hTERT啟動子。其中，反應條件為第一循環(huán)94℃變性5分鐘，81℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；以后個循環(huán)93℃變性1分鐘，68℃退火一分鐘，72℃延伸2分鐘，共35個循環(huán)。由此得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收得到hTERT啟動子片斷。經(jīng)測序分析，得到的啟動子片段與發(fā)表的一樣(圖1)。然后將這段DNA克隆到pUC19載體之中，利用定點突變的方法(Strategene定點誘導方法)將hTERT啟動子序列變成圖2所示的序列。
3.PCR擴增多聚腺嘌呤核苷酸信號序列。引物分別為C.5’-TAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGGATCTCTGC-3’D.5’-GGATCCAGACATGATAAGATACATTGAGAG-3’用pCMV/zero(Invitrogen，USA)作模板，同上的退火條件，擴增poly(A)序列，純化后測序驗證。
4.將純化后的hTERT啟動子片段和poly(A)DNA片段放在一起將95℃變性5分鐘，冷卻到室溫，然后用引物A和引物D做引物，以冷卻后的hTERT啟動子和poly(A)DNA片段混合物作模板，進行放大得到一段大小在500個堿基對左右的DNA片段。經(jīng)純化測序驗證。驗證正確之后用SspI和AgeI切割，純化得到所要的插入片段，這個片段含有poly(A)信號序列和hTERT啟動子。
5.pXC.1(購自加拿大的Microbix)在堿基對第339和第551的地方分別用定點突變的方法(Strategene定點誘導方法)加上酶切位點SspI和PinAI(AgeI)切口。經(jīng)突變之后的質(zhì)粒，用SspI和AgeI切開，跑膠分離作為載體。這個載體與第3步中純化到，并經(jīng)SspI和AgeI酶切割的poly(A)/hTERT啟動子片段相聯(lián)接。連接20小時之后，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，經(jīng)4℃孵育30分鐘，42℃熱休克30秒鐘，再在4℃孵育2分鐘，加1mL LB培養(yǎng)液在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45分鐘。然后轉(zhuǎn)到含安卡青霉素的瓊脂培養(yǎng)板上24小時之后，用滅菌牙簽挑取單個細菌克隆，然后放入干凈的含有LB的培養(yǎng)瓶中，24小時之后，按照常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA用酶切篩選所需質(zhì)粒，得陽性克隆，命名為pKH-901a，然后經(jīng)測序確定其序列是正確。含有腺病毒左側(cè)臂，已裝序列，poly(A)序列，hTERT啟動子(Mtelo)，E1A和部分E1B基因序列。
6.腺病毒右側(cè)臂部分的構(gòu)建。
pBHGE3(購于加拿大Microbix公司)用BsiWI和NotI酶切，然后接到pGEM-7載體上(Promega公司購得)。然后用兩對引物放大其中兩個片段。
引物設計如下E.5’-AACCAAGGCGAACCTT-3’F.5’-CCACATGGTTATCTTGG-3’G.5’-CCAGTCCAGGAGTAATTTAC-3’H.5’-TGCGCTTTAGGCAGCAGATG-3’利用這兩對引物和pBHGE3作模板放大得到兩段DNA序列。然后利用下面兩個引物M.5’-CCACCCAAGATAACCATGTGGCTGC-3’N.5’-AACTTAGTAAATTACTCCTGGACTGG-3’用激活的人體巨噬細胞的cDNA作模板根據(jù)上述類似的放大擴增條件，得到大量的GM-CSF基因的cDNA片段。純化之后測序確認序列，將這段cDNA和上面從pBHGE3放大得的兩段DNA一起作模板，已引物E和H進行擴增放大而得到一段DNA片段，純化之后測序確定其序列。經(jīng)BsiWI和NotI酶切割之后接到上述pGEM-7載體中。然后進一步轉(zhuǎn)接到pBHGE3之中，而得到右側(cè)端質(zhì)粒DNA命名為pKH-901b。這個質(zhì)粒含有部分EIB基因，E2基因，E3基因，GM-CSF和E4基因。
7.重組腺病毒KH-901的構(gòu)建。
pKH-901a和pKH-901b質(zhì)粒DNA分別用NdeI和ClaI酶切割使之線性化，經(jīng)純化后一起轉(zhuǎn)化HeLa細胞(Invitrogen轉(zhuǎn)化劑)。在37℃培養(yǎng)10天之后，將細胞收集起來，經(jīng)凍溶三次，取100微升細胞上清液進行病毒菌斑分離試驗，再加入細胞上清液之后8到12天之內(nèi)，可以在低凝點瓊脂膠之下，清晰看到很多分離的較好的病毒斑點。然后利用10微升的自動取樣槍吸取10微升，加到預先種植好的HeLa細胞之中。4-8天之后，可以看到所有的細胞都裂解了，收集此細胞裂解清液。凍溶三次取200微升，提取其中的病毒DNA。利用PCR方法和Southern雜交的方法確認病毒的結(jié)構(gòu)。然后在HeLa細胞重復分離3次，得到單克隆病斑在HeLa細胞中成長起來，保存在-80℃的冷凍箱中，取部分裂解液，確認病毒序列后命名為KH-901。
大批量產(chǎn)生KH-901的方法將在另文中介紹，簡要的操作步驟如下Hela-S3(HeLa細胞經(jīng)體外篩選變成能在無小牛血清的培養(yǎng)液中懸浮生長)。接種在3升的培養(yǎng)器皿中，然后等長到一定數(shù)目的細胞之后，接種KH-901，再培養(yǎng)2-3天，收集細胞，往CsCl2梯度離心方法或離子交換(ion exchange)的方法分離純化病毒，然后保存在適當?shù)闹苿┲?，如PBS和甘油。
實施例2KH-900的構(gòu)建類似于KH-901的流程，只是在pKH-901a質(zhì)粒中，沒有多聚腺嘌呤核苷酸序列，在hTERT啟動子片段中沒有突變，序列如同序列1。得到的新質(zhì)粒稱為pKH-900a。質(zhì)粒pKH-900a與pKH-901b在HeLa細胞中共轉(zhuǎn)化而得到KH-900。
實施例3KH-902的構(gòu)建類似于KH-901，只是將其中PKH-901b中的GM-CSF cDNA基因換成如序列4的膜結(jié)合型GM-CSF基因。此質(zhì)粒命名為pKH-902b。質(zhì)粒pKH-902b和pKH-901a在HeLa細胞中一起轉(zhuǎn)化而得到KH-902。
實施例4KH-903的構(gòu)建與KH-901類似，只是將pKH-901b中的編碼10.4k，14.5k和14.7k的編碼序列用常規(guī)的基因工程方法切除，得到的質(zhì)粒命名為pKH-903b。pKH-901a和PKH-903b在HeLa細胞中共轉(zhuǎn)化而得到KH-903。
實施例5KH-904的構(gòu)建與KH-901類似，唯一不同的是其中的pKH-901b中的纖維蛋白基因的端結(jié)(Knob)由腺病毒血型5型序列變成血型35型。如序列5，得到的質(zhì)粒命名為pKH-904b。
實施例6KH-905的構(gòu)建與KH-904類似，只是其中pKH-904b中GM-CSF基因由分泌型變成了膜結(jié)合型，如序列4。得到的序列命名為pKH-905b。pKH-901a和pKH-905b一起共轉(zhuǎn)化HeLa細胞而得到KH-905。PCR分析和序列測試確定病毒的結(jié)構(gòu)和序列。
實施例7
KH-906的構(gòu)建與KH-901相似，只是其中用到的質(zhì)粒pKH-901a中的E1B啟動子換成了核糖體進入序列。做得的質(zhì)粒稱為pKH-906a。然后pKH-906a與pKH-901b一起轉(zhuǎn)化HeLa細胞得到KH-906[Li et al.(2001)Cancer Research 622667-2674]。PCR分析和序列測試確定病毒的結(jié)構(gòu)和序列。
序列表<110>成都康弘科技實業(yè)(集團)有限公司<120>腫瘤細胞專一表達免疫調(diào)節(jié)因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重組體的構(gòu)建及其應用<160>5<210>1<211>252<212>DNA<213>人工序列<400>1ctagccccac gtggcggagg gactggggac ccgggcaccc gtcctgcccc ttcaccttcc 60agctccgcct cctccgcgcg gaccccgccc cgtcccgacc cctcccgggt ccccggccca 120gccccctccg ggccctccca gcccctcccc ttcctttccg cggccccgcc ctctcctcgc 180ggcgcgagtt tcaggcagcg ctgcgtcctg ctgcgcacgt gggaagccct ggccccggcc 240acccccgcga tg 252<210>2<211>253<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>2ctagccccac gtggcggagg gactggggac ccgggcaccc gtcctgcccc ttcaccttcc 60agctccgcct cctccgcgcg gaccccgccc cgtcccgacc cctcccgggt ccccggccca 120
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<400>3catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc aggaaaactg aataagagga 300agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360ggatctctgc aggaatttga tatcaagctt atcgataccg tcgaaacttg tttattgcag 420cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 480cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcc 540gctagcccca cgtggcggag ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc 600cagctccgcc tcctccgcgc ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc 660agccccctcc gggccctccc agcccctccc cttcctttcc gcggcaacgc cctctccttc 720gcggcgcgag tttcaggcag cgctgcgtcc tgctgcgcac gtgggaagcc ctggccccgg 780
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1.一種腫瘤細胞專一的，可以表達一種免疫調(diào)節(jié)細胞因子的溶瘤性復制型病毒重組體，其特征在于，該重組體由載體病毒，腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件和免疫調(diào)節(jié)基因構(gòu)建而成。
2.權(quán)利要求1的重組體，其特征在于，所述載體病毒為DNA病毒或RNA病毒的任何一種。
3.權(quán)利要求2的重組體，其特征在于，所述載體病毒為腺病毒或其改造型。
4.權(quán)利要求3的重組體，其特征在于，所述腺病毒選自腺病毒5型、2型、35型、41型。
5.權(quán)利要求3的重組體，其特征在于，所述腺病毒改造體為，將腺病毒的E1A和E1B基因用核糖體介入因子IRES連起來的腺病毒。
6.權(quán)利要求3的重組體，其特征在于，所述腺病毒改造體為，用腺病毒35型上的纖維蛋白基因頂結(jié)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)而構(gòu)建的腺病毒。
7.權(quán)利要求3的重組體，其特征在于，所述腺病毒改造體為，在腺病毒的末端、包裝序列之后，外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列的腺病毒。
8.權(quán)利要求3的重組體，其特征在于，所述腺病毒改造體為，在腺病毒E3區(qū)中編碼10.4K，14.5K和14.7K的序列已刪除的腺病毒。
9.權(quán)利要求3的重組體，其特征在于，所述腺病毒改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，將腺病毒的E1A和E1B基因用核糖體介入因子IRES連起來，并且用腺病毒35型上的纖維蛋白基因頂結(jié)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)，并且在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列。
10.權(quán)利要求9的重組體，其特征在于，所述阻斷序列為SV40早期的多聚(A)信號序列。
11.權(quán)利要求1的重組體，其特征在于，所述腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是任何癌細胞特異的啟動子，增強子，靜止子或他們的組合。
12.權(quán)利要求11的重組體，其特征在于，所述啟動子是序列表中序列2表示的hTERT啟動子。
13.權(quán)利要求1的重組體，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)基因是是能提高人體免疫能力的任何一種細胞因子基因。
14.權(quán)利要求13的重組體，其特征在于，所述能提高人體免疫能力的細胞因子基因選自IL-2，IL-10，IL-12，IL-15，IL-24，IL-25，GM-CSF，G-CSF和INF-alpha，INF-beta基因或它們的變體。
15.權(quán)利要求13的重組體，其特征在于，所述能提高人體免疫能力的細胞因子基因是GM-CSF基因或它的變體。
16.權(quán)利要求15的重組體，其特征在于，所述能提高人體免疫能力的細胞因子基因GM-CSF基因是膜結(jié)合型GM-CSF基因。
17.權(quán)利要求1的重組體，其特征在于，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，將腺病毒的E1A和1B基因用核糖體介入因子IRES連起來，并且用腺病毒35型上的纖維蛋白基因頂結(jié)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)，并且在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因。
18.權(quán)利要求17的重組體，其特征在于，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是膜結(jié)合型GM-CSF基因。
19.權(quán)利要求1的重組體，其特征在于，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因，其DNA序列為序列表中序列3表示的序列。
20.權(quán)利要求19的重組體，其特征在于，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是膜結(jié)合型GM-CSF基因。
21.權(quán)利要求1的重組體，其特征在于，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，并且用腺病毒35型上的纖維蛋白基因頂結(jié)序列代替腺病毒5型的頂結(jié)，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因。
22.權(quán)利要求21的重組體，其特征在于，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是膜結(jié)合型GM-CSF基因。
23.權(quán)利要求1的重組體，其特征在于，其中的載體病毒是腺病毒改造體，該改造體是這樣一種改造體，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端、包裝序列之后，和外源啟動子之前安裝一個轉(zhuǎn)錄的阻斷序列，在腺病毒E3區(qū)中編碼10.4K，14.5K和14.7K的序列已刪除的腺病毒，其中的腫瘤細胞專一的基因調(diào)節(jié)元件是序列表中序列2表示的hTERT啟動子，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是GM-CSF基因。
24.權(quán)利要求23的重組體，其特征在于，其中的免疫調(diào)節(jié)基因是膜結(jié)合型GM-CSF基因。
25.一種啟動子，其特征在于，具有序列表中序列2表示的核苷酸序列。
26.一種藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1-24的重組體。
27.權(quán)利要求26的組合物，是注射劑。
28.權(quán)利要求26的組合物，其特征在于，可以聯(lián)合用于腫瘤的放療和化療。
29.權(quán)利要求1的重組體在制備治療和/或預防腫瘤的藥物中的應用。
30.權(quán)利要求1的重組體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a.含有hTERT啟動子序列的腺病毒左側(cè)臂的制備；b.含有免疫調(diào)節(jié)基因的腺病毒右側(cè)臂的制備；c.將腺病毒左側(cè)臂和腺病毒右側(cè)臂轉(zhuǎn)染到293細胞、HeLa細胞、HeLa-S3細胞或A549細胞中，通過同源重組的方法得到權(quán)利要求1的重組體。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療，更具體地說是涉及構(gòu)建一種腫瘤細胞專一表達免疫調(diào)節(jié)因子GM－CSF的溶瘤性腺病毒重組體的構(gòu)建及其應用。
文檔編號A61K35/76GK1706955SQ20041004623
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月7日
發(fā)明者柯尊洪 申請人:成都康弘科技實業(yè)(集團)有限公司