專利名稱：一種抗血吸蟲病的童蟲細(xì)胞型疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于免疫預(yù)防血吸蟲病發(fā)生的疫苗制品，特別是一種童蟲細(xì)胞型疫苗。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是世界主要熱帶病，6億人受威脅。其中在我國(guó)嚴(yán)重流行的是日本血吸蟲病，屬人畜共患寄生蟲病。由于該病在人畜中流行傳播屬于自然環(huán)境造成，目前的防治措施尚不能達(dá)到控制其流行與傳播的要求。
迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)(日本/曼氏)血吸蟲病疫苗類型的研究涉及面包括1.減毒活疫苗用血吸蟲活尾蚴經(jīng)射線照射后用于接種/免疫動(dòng)物，可對(duì)攻擊感染蟲體產(chǎn)生60％到90％的(減蟲率)保護(hù)性免疫力，但很不實(shí)用；2.蟲體死疫苗包括用血吸蟲成蟲或童蟲的組織或可溶性復(fù)合成分免疫動(dòng)物，幾乎不能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗攻擊感染免疫力；3.天然分子疫苗從血吸蟲蟲體或蟲卵中分離出有效天然成分，添加佐劑后用于免疫動(dòng)物，僅可誘導(dǎo)部分保護(hù)性免疫力，其中用未成熟蟲卵分子抗原具有抗血吸蟲生殖或卵胚發(fā)育作用，但對(duì)抗攻擊感染蟲體作用差；4.重組疫苗將經(jīng)篩選鑒定出來有效的抗原分子或照射尾蚴免疫動(dòng)物后獲取抗血清，對(duì)血吸蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，用基因重組技術(shù)，表達(dá)出重組/融合蛋白免疫動(dòng)物，其保護(hù)性免疫效果均在40％(減蟲率)范圍內(nèi)；5.基因疫苗又稱DNA疫苗，經(jīng)文庫(kù)(含多肽庫(kù))篩選鑒定出來的片段，構(gòu)建成真核表達(dá)載體，直接免疫動(dòng)物，其保護(hù)性免疫效果均不理想；6.多肽疫苗根據(jù)有效分子的表位序列，設(shè)計(jì)合成分子抗原肽，一般將多個(gè)多肽分子用于免疫動(dòng)物，獲得較好的保護(hù)性，但未達(dá)到理想結(jié)果；7.多表位疫苗采用有效疫苗分子的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位合成cDNA片段，構(gòu)建成重組或基因疫苗后用于免疫動(dòng)物的研究，其效果不理想；8.復(fù)合疫苗又可稱“雞尾酒”疫苗，將多種疫苗侯選分子對(duì)動(dòng)物作聯(lián)合免疫，觀察抗攻擊感染的作用，目前報(bào)道的效果也都不理想；9.異源疫苗用肝片蟲或旋毛蟲抗原免疫宿主觀察抗血吸蟲攻擊感染的作用，其效果均為超出上述同源疫苗所達(dá)到的要求；10.抗獨(dú)特型疫苗以抗病原生物的抗體免疫動(dòng)物，作為抗原的模擬物Ab2免疫動(dòng)物后產(chǎn)生抗Ab2獨(dú)特型抗體，發(fā)揮保護(hù)作用，正處在探索中。
上述疫苗，存在照射尾蚴活疫苗有不安全性和消材量大等不實(shí)用的問題，除照射疫苗外，均需加佐劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效抗血吸蟲病的童蟲細(xì)胞型疫苗。
本發(fā)明所述童蟲細(xì)胞型疫苗的制備方法是以日本血吸蟲尾蚴經(jīng)腹部重感染健康家兔，經(jīng)14～24天后灌注沖蟲，收集蟲體洗滌后，在無菌條件下將蟲體經(jīng)快速切碎，加入含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化30分鐘，吸上清，加入含Ca2+，Mg2+的D-Hank’s液終止消化得活細(xì)胞；或?qū)⑹占礈旌蟮南x體作物理處理經(jīng)300目過篩獲取活細(xì)胞；或經(jīng)體外培養(yǎng)獲取活細(xì)胞。將所獲得的細(xì)胞，經(jīng)離心2000rpm×5min，用D-Hank’s，反復(fù)洗滌3次，棄上清非細(xì)胞成分，獲日本血吸蟲肝期童蟲活細(xì)胞疫苗，在活細(xì)胞中加少量PBS或D-Hank’s液作細(xì)胞計(jì)數(shù)，并定容為1.6×107/ml，用作免疫接種劑量濃度。
將上述肝期童蟲活細(xì)胞經(jīng)冰凍處理后，獲得肝期童蟲死細(xì)胞，用于免疫接種。
一種抗血吸蟲病的童蟲細(xì)胞型疫苗，利用該疫苗進(jìn)行免疫接種，其使用方法如下免疫接種對(duì)象小鼠；免疫接種部位與劑量腹股溝皮下和背頸部皮下注射，注射體積量為0.1ml，細(xì)胞量為1.6×105/ml～1.0×108/ml，共免疫接種1～4次，每隔2周1次。
本發(fā)明所制得的細(xì)胞疫苗是一種實(shí)用型疫苗，易于生產(chǎn)和制備，且安全有效，克服了照射尾蚴活疫苗不安全性和消材量大等不實(shí)用的問題，見效快。使用該童蟲細(xì)胞免疫接種小鼠，不須加佐劑均可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生顯著的抗日本血吸蟲攻擊感染和致病的免疫力，超出了目前已有其他類型疫苗的效果；該疫苗的發(fā)現(xiàn)將會(huì)對(duì)蠕蟲病疫苗研究與應(yīng)用產(chǎn)生積極影響。


圖1用日本血吸蟲肝期童蟲制備的活細(xì)胞照片；圖2用體外培養(yǎng)法對(duì)日本血吸蟲18d童蟲作原代培養(yǎng)出來的生長(zhǎng)細(xì)胞照片；圖3用體外培養(yǎng)法對(duì)日本血吸蟲18天童蟲作傳代培養(yǎng)出來的生長(zhǎng)細(xì)胞照片；其中A、B、C為染色細(xì)胞，A和B25X，C40X；D和E為HE染色，D100X，E40X；F為Brdu染色陰性對(duì)照；H為美蘭染色陽(yáng)性細(xì)胞；圖4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(小鼠)肝表面病變程度比較圖(照片)，A對(duì)照組，B童蟲碎片組，C童蟲細(xì)胞組；圖5第一批實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組獲取雄蟲的大小及數(shù)目的比較(照片)，其中A活細(xì)胞組，B蟲體組，C對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式
1.童蟲細(xì)胞疫苗的制備采用日本血吸蟲尾蚴，經(jīng)腹部重感染健康家兔后第14～24天灌注沖蟲，收集蟲體洗滌后，在無菌條件下將蟲體經(jīng)快速切碎，加入10倍含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化30min，吸上清，加入含Ca2+，Mg2+的D-Hank’s液終止消化；將所獲得的細(xì)胞，經(jīng)離心2000rpm×5min，用D-Hank’s，反復(fù)洗滌3次，棄上清非細(xì)胞成分，繼后加少量PBS或D-Hank’s液作細(xì)胞計(jì)數(shù)，并定容為1.6×107/ml，用作免疫接種劑量濃度。獲日本血吸蟲肝期童蟲活細(xì)胞，按上述方法獲取蟲體細(xì)胞后，經(jīng)冰凍處理后用于免疫接種動(dòng)物。
童蟲細(xì)胞疫苗的免疫接種a.接種對(duì)象用日本血吸蟲肝期童蟲活細(xì)胞和活組織碎片分別接種小鼠各1組及不作免疫對(duì)照1組，共3組，每組10只鼠；接種方法與攻擊感染在不加佐劑條件下分別(經(jīng)腹股溝皮下)免疫接種小鼠4次，末次免疫后1周攻擊感染。感染血吸蟲尾蚴30條/鼠，感后42天，比較觀察了二者抗攻擊感染的保護(hù)性免疫力及其機(jī)制。
觀察結(jié)果細(xì)胞接種組和蟲體萃片接種組分別與PBS注射組比，蟲體發(fā)育數(shù)分別下降67.6％％和46.3％，其中細(xì)胞接種組比蟲體接種組的蟲體下降為39.66％；肝組織中蟲卵數(shù)(LEPG)在細(xì)胞接種組和蟲體接種組中分別減少95.4％和64.8％，細(xì)胞接種組比蟲體接種組的LEPG下降為87.1％；在細(xì)胞組鼠肝表面蟲卵結(jié)節(jié)、肝組織中蟲卵肉芽腫大小和雄蟲長(zhǎng)度均顯著小于其他兩組的；特異性IgG2a/IgG1比值≥2，但總抗體水平低于蟲體碎片接種組。
結(jié)論本研究在國(guó)內(nèi)外首次建立了一種血吸蟲細(xì)胞型疫苗研究模型，結(jié)果表明，在不加佐劑條件用血吸蟲童蟲活細(xì)胞可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的抗攻擊感染和抗致病的保護(hù)性免疫力，其機(jī)制可能為Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
b.用日本血吸蟲肝期重蟲活細(xì)胞和死細(xì)胞(作第二批實(shí)驗(yàn)，3組小鼠，每組10只)在不加佐劑條件下分別(經(jīng)頸背部皮下)免疫接種小鼠3次，末次免疫后2周攻擊感染血吸蟲尾蚴30條/鼠，感染后42天，比較觀察了二者抗攻擊感染的保護(hù)性免疫力和機(jī)制，結(jié)果見表1。在細(xì)胞免疫兩組小鼠肝表面卵結(jié)節(jié)明顯少于對(duì)照組的。
表1第二批實(shí)驗(yàn)的保護(hù)性效果(減蟲率和減卵率)

c.用血吸蟲童蟲活細(xì)胞在不用佐劑條件下作不同免疫次數(shù)的保護(hù)性效果觀察(結(jié)果見表2)。
表2 第三批實(shí)驗(yàn)的保護(hù)性效果(減蟲率及蟲體發(fā)育程度)

結(jié)論在不加佐劑條件下用血吸蟲童蟲活/死細(xì)胞均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的抗攻擊感染保護(hù)性免疫力，2～4次免疫的保護(hù)力差異無顯著。此類疫苗屬天然材料、制備簡(jiǎn)單、成本不高、接種宿主由于不用佐劑而不會(huì)產(chǎn)生毒副作用，故具很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種抗血吸蟲病的童蟲細(xì)胞型疫苗，其特征在于利用該疫苗進(jìn)行免疫接種，其使用方法為腹股溝皮下和背頸部皮下注射，注射體積量為0.1ml，細(xì)胞量為1.6×105/ml～1.0×108/ml，共免疫接種1～4次，每隔2周1次。
2.一種權(quán)利要求1所述童蟲細(xì)胞型疫苗的制備方法，其特征在于以日本血吸蟲尾蚴經(jīng)腹部重感染健康家兔，用感染后14～24天的血吸蟲童蟲，經(jīng)洗滌后，在無菌條件下將蟲體經(jīng)快速切碎，加入10倍含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化30分鐘，吸上清，加入含Ca2+，Mg2+的D-Hank’s液終止消化得活細(xì)胞，將所獲得的細(xì)胞，經(jīng)離心2000rpm×5min，用D-Hank’s，反復(fù)洗滌3次，棄上清非細(xì)胞成分，獲日本血吸蟲肝期童蟲活細(xì)胞疫苗，在活細(xì)胞中加少量PBS或D-Hank’s液作細(xì)胞計(jì)數(shù)，并定容為1.6×107/ml，用作免疫接種劑量濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于還可以將收集洗滌后的蟲體作物理處理經(jīng)300目過篩獲取活細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于還可以經(jīng)體外培養(yǎng)獲取活細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述童蟲活細(xì)胞經(jīng)冰凍處理后，得肝期童蟲死細(xì)胞，用于免疫接種。
全文摘要
一種抗血吸蟲病童蟲細(xì)胞型疫苗。其制備方法是收集日本血吸蟲重感染家兔第14～24天童蟲，經(jīng)無菌快速切碎，用胰酶消化30分鐘，吸上清，加含Ca
文檔編號(hào)A61P33/00GK1778388SQ20041004698
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者曾慶仁, 林雪遲, 蔡立汀, 龔燕飛, 張祖萍 申請(qǐng)人:中南大學(xué)