專利名稱：3，4’，5－三羥基茋－3－β－D－葡萄糖甙在抗心肌缺血藥物制備中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙的用途，尤其涉及該化合物在治療和/或預(yù)防缺血性心臟病藥物制備中的用途。
背景技術(shù)：
化合物3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(3，4’，5-trihydroxy-stilbene-3-β-D-glucoside，TSG)，又稱虎杖苷(polydatin)或云杉苷(peicin)，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示 20世紀(jì)60年代，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙首先發(fā)現(xiàn)于藥用植物虎杖(Polygonumcuspidatum Sieb.et Zucc.)，其后還發(fā)現(xiàn)于庫葉云杉、葡萄、花生等植物。
20世紀(jì)70年代之后，有關(guān)式(I)化合物的藥理學(xué)活性研究發(fā)現(xiàn)其具有(1)降血脂作用例如，高血脂癥患者舌下含化2.2mg/kg/d可以降低總膽固醇、低密度與高密度脂蛋白比值(張佩文等.3，4’，5-三羥基芪-3-β-D-葡萄糖甙對人血液流變學(xué)及膽固醇的影響，第一軍醫(yī)大學(xué)報，1995；15(1)47～48)；(2)抑制血小板聚集及血栓形成作用例如，TSG 6-100μmol/L可以抑制花生四烯酸、二磷酸腺苷以及腎上腺素誘導(dǎo)的血小板聚集以及血栓素B2產(chǎn)生(單春文等.3，4，5-三羥基芪-3-β-D-葡萄糖苷在體外對兔血小板聚集和產(chǎn)生血栓素B的影響，中國藥理學(xué)報，1990，11(6)527～530)；(3)正性肌力作用增強培養(yǎng)心肌細(xì)胞的收縮幅度及頻率(金春華等.虎杖苷對心肌細(xì)胞收縮性的影響，中國藥理學(xué)通報，2000；16(4)400～402)；(4)抗氧化作用TSG對PMNs呼吸爆發(fā)、黃嘌呤體系及VitC-Cu2+體系產(chǎn)生的自由基具有抑制或清除作用(田京偉等.白藜蘆醇苷的體外抗氧化活性，中草藥.2001，32(10)918～920)；
(5)改善微循環(huán)以及對休克的治療作用(趙克森，金麗娟主編.《休克和分子基礎(chǔ)》，科學(xué)出版社，北京，1989；319～323)。
缺血性心臟病(ischemic heart disease)是冠狀動脈粥樣硬化使血管狹窄或阻塞，或/和冠狀動脈功能性改變(痙攣)導(dǎo)致確血缺氧或壞死引起的心臟病，統(tǒng)稱冠狀動脈硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)，簡稱冠心病。冠心病是嚴(yán)重危害人體健康的常見病。冠心病可分為無癥狀性心肌缺血、心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭、瘁死等類型。
冠心病的治療方法包括藥物治療、介入治療和外科治療。目前，臨床最常用的抗心肌缺血藥物有硝酸酯類、β受體阻滯劑和鈣拮抗劑。其他抗心肌缺血藥還有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、特異性心率減慢藥等。這些藥物的共同特點是通過擴張血管和/或降低心臟負(fù)荷、減少心臟作功、降低心肌耗氧量，進(jìn)而起到緩解冠心病癥狀的作用。
硝基血管擴張藥(nitrovasodilators)，或稱硝酸酯類藥物，能夠釋放NO，通過升高cGMP松弛血管平滑肌。臨床使用的硝酸酯類藥物如硝酸甘油、硝酸異山梨酯等通常能夠迅速緩解各類心絞痛，在心絞痛的預(yù)防和治療中應(yīng)用最廣。然而，“硝酸酯類藥物只是一種緩解癥狀的藥物，沒有證據(jù)表明對轉(zhuǎn)歸有益，理論上講，該類藥物能夠反射性加快心率，可能對心肌缺血的遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸有負(fù)面影響”(胡大一等主編，《循證心血管病學(xué)》，天津科學(xué)技術(shù)出版社，2001)。此外，硝酸酯類藥物有增加顱內(nèi)壓、誘發(fā)青光眼等副作用，并且可迅速發(fā)生耐藥性。
鈣拮抗劑和β-受體阻滯劑的應(yīng)用在心血管藥物研究領(lǐng)域中曾具有里程碑式意義。迄今，這些藥物仍然是冠心病治療中最常用的藥物之一。鈣拮抗劑如硝苯吡啶等具有抑制心肌收縮、減少心肌耗氧量；解除冠脈痙攣、改善心肌供血；擴張周圍血管，降低心臟負(fù)荷等藥理學(xué)作用。然而第一代鈣拮抗劑臨床應(yīng)用20余年后發(fā)現(xiàn)，此類藥物可增加心肌梗死危險。臨床試驗表明“鈣拮抗劑對畸形心肌梗死、變異型心絞痛和心功能不全的預(yù)后均無改善作用”(蘇定馮主編，《心血管藥理學(xué)》，科學(xué)出版社，2001)。
總體上，“常規(guī)抗心肌缺藥(硝酸酯、β阻滯劑、鈣拮抗劑)雖能緩解心絞痛，但對勞力型心絞痛預(yù)后的影響還不清楚”；“目前還沒有抗心肌缺血藥對不穩(wěn)定型心絞痛轉(zhuǎn)歸影響的資料”；“短效硝苯吡啶增加急性冠脈綜合征的死亡率，而血管緊張素和他丁類降血酯藥有間接的抗心肌缺血作用”(胡大一等主編，《循證心血管病學(xué)》，2001)。
顯然，盡管臨床用于冠心病治療的藥物已經(jīng)相當(dāng)豐富，但是，臨床上仍然迫切需要安全、有效、能夠有效提高心肌缺血性心臟病預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的新的冠心病治療藥。
如前所述，既往文獻(xiàn)報道了3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙的心血管活性，但是，其體現(xiàn)的應(yīng)用價值主要表現(xiàn)在抗休克作用及降血脂活性。沒有文獻(xiàn)資料涉及或提示該化合物具有抗心肌缺血作用以及在冠心病治療和/或預(yù)防中的潛在應(yīng)用價值。究其原因應(yīng)當(dāng)在于冠心病的病因是冠脈狹窄致使心肌供血減少，由此產(chǎn)生心肌血液的供需矛盾并導(dǎo)致疼痛等一系列疾病癥狀。一般地，抗心肌缺血藥物大多著眼于改善患者的血流動力學(xué)特征，特別是降低心臟負(fù)荷并最終降低心肌耗氧量。上述臨床最常用的冠心病治療藥硝酸酯類藥物、鈣拮抗劑以及β-受體均具有此類作用特征。
而根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙能夠增強體外培養(yǎng)心肌以及離體心臟的收縮幅度和收縮頻率，增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度(金春華等，虎杖苷對心肌細(xì)胞收縮性的影響，中國藥理學(xué)通報，2000；16(4)400-402；金行中等，虎杖結(jié)晶4號對大鼠工作心臟功能的影響，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1992；12(1)31-33)；顯然，該化合物的正性肌力和正性頻率作用意味著可能導(dǎo)致用藥者的心律加快、心肌收縮力加強，其結(jié)果必然是增加心肌耗氧量，加重心肌負(fù)擔(dān)，加劇心肌血流的供需矛盾。因此，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，難以判斷3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對冠心病的治療價值，相反，表面上看，該化合物有可能加重冠心病心肌血流的供需矛盾。
現(xiàn)有文獻(xiàn)中關(guān)于3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對血管的影響的報道中，一方面，據(jù)報道，5.12mM的3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙可舒張兔離體頸動脈和肺動脈血管，而3.28mM下無顯著作用；1.71mM濃度下可拮抗去甲腎上腺素的血管收縮作用，而1.37mM濃度下無顯著作用(駱蘇芳等，虎杖結(jié)晶4號對兔血管的舒張作用，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1992；12(1)10-13)；另一方面，該化合物在0.02mM-2mM濃度下能夠顯著升高血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，因此，對血管平滑肌的直接作用是正性肌力作用和提高血管張力(金春華等，虎杖甙對正常大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響，中國病理生理雜志，1998，14(2)195-198；金春華等，虎杖苷對VSMC內(nèi)鈣信號的調(diào)節(jié)機制初探，中國藥理學(xué)通報，2000，16(2)151-154)。顯然，5.12mM的血藥濃度在常規(guī)給藥條件下不易實現(xiàn)本發(fā)明所進(jìn)行的犬藥代動力學(xué)研究表明，30mg/kg給藥劑量下，給藥后瞬間最大血藥濃度約100μg/ml，約0.25mM，據(jù)此，欲達(dá)5.12mM的血藥濃度，給藥劑量需達(dá)600mg/kg，根據(jù)本發(fā)明研究結(jié)果，此給藥劑量已經(jīng)達(dá)到動物的半數(shù)致死量(LD50)；相對而言，0.02mM-2mM的血藥濃度則是常規(guī)給藥可以達(dá)到的血藥濃度。因此，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)推斷，在常規(guī)給藥給藥條件下，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對血管的影響有可能是提高血管張力，倘若如此，心臟負(fù)荷應(yīng)當(dāng)是增加的，因此不利于冠心病癥狀的緩解。
根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，從血流動力學(xué)影響看，難以判斷3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對于缺血性心臟病的有益治療作用，相反，按照常規(guī)推測則可能得出相反論斷。因此迄今未見關(guān)于該化合物抗心肌缺血方面的試驗研究也就不難理解了。
另有文獻(xiàn)報道，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對氯丙嗪、內(nèi)毒素等因素所致體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用(駱蘇芳等，3，4’，5-三羥基芪-3-β-D-葡萄糖甙對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞搏動頻率及損傷的影響，中國藥理學(xué)報，1990，11(2)147～150；趙清等，虎杖甙對內(nèi)毒素性心肌細(xì)胞損傷的防治作用，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，3(4)364～365)。由于此類研究均為體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的化學(xué)性損傷，不同于冠心病的病理過程及治療機制，因此，與本發(fā)明所述3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對冠心病的治療價值無關(guān)。
此外，申請?zhí)枮?2134928.2的專利申請公開了一種具有改善微循環(huán)作用的含虎杖甙或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥用組合物，以及這些組合物在制備改善微循環(huán)的藥物中的用途。該專利涉及用于治療微循環(huán)障礙性心腦血管疾病。鑒于缺血性心臟病為冠狀動脈阻塞性疾病，而非毛細(xì)血管性的微循環(huán)障礙，因此，該專利申請與缺血性心臟病的治療無關(guān)。
申請?zhí)枮?2139335.4的專利申請在涉及虎杖苷降低肺動脈高壓時提及該化合物能擴張冠脈、增加冠脈血流量，由于該專利申請所列舉的實例僅說明該化合物對低氧和缺氧試驗?zāi)Ｐ蛣游锓蝿用}壓的影響以及對血液學(xué)活性因子(影響凝血過程的血液因子TXA2、PGI2)的影響，并未涉及冠脈及其血流量的影響，而迄今未見關(guān)于該化合物可以擴張冠脈、增加冠脈流量的任何研究文獻(xiàn)，因此，該專利所述擴張冠脈、增加冠脈流量可能僅僅是一種猜測，而非嚴(yán)格的科學(xué)研究結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供化合物3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙在制備治療或預(yù)防缺血性心臟病藥物中的用途。
本發(fā)明的另一個目的在于提供含有3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙的藥物組合物在制備治療或預(yù)防缺血性心臟病藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明所述的缺血性心臟病包括無癥狀性心肌缺血、心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭及瘁死等，在用于治療或預(yù)防缺血性心臟病時，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)的用量根據(jù)動物(大鼠)體內(nèi)實驗的治療有效量2mg-30mg/kg體重/次，按照體表面積換算得到人體的用藥劑量為20-300mg/60kg體重/次，更優(yōu)選的人體用藥劑量范圍為50-200mg/60kg體重/次，對應(yīng)于大鼠的5-20mg/kg體重劑量。治療時可以通過口服或靜脈輸注的方式給予TSG。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，以3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙為藥效成分，添加藥學(xué)上可接受的藥用輔料并通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法可以制備用于本發(fā)明的藥物組合物，因此本發(fā)明也包含該藥物組合物的用途。當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物制備成藥物制劑時，藥物制劑的劑型可以是口服給藥的劑型諸如片劑、膠囊(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊和微囊)、粉劑、顆粒劑和糖漿劑；非口服給藥的劑型諸如注射劑、栓劑、丸劑、凝膠劑和貼劑。除這些常規(guī)劑型外，還可以將口服的速釋固體制劑(例如片劑、顆粒劑等)和用于口服或非口服給藥的緩釋制劑(片劑、顆粒、精細(xì)顆粒、丸劑、膠囊、糖漿、乳劑、懸浮液、溶液)用于本發(fā)明。本發(fā)明中的制劑可以是包衣或未包衣的形式，視需要而定。本發(fā)明特別優(yōu)選的是將TSG用于口服給藥和靜脈用藥的劑型。
本發(fā)明中的藥用輔料包括用于固體制劑的賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、包衣劑等，或用于半固體制劑、液體制劑的溶劑、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖劑、潤膚劑、乳化劑等，此外，也可以根據(jù)需要使用其它藥用添加劑諸如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑和調(diào)味劑等。
在制備藥物組合物時，組合物中藥效成分TSG的含量為20mg-300mg，優(yōu)選的含量為50mg-200mg，該含量指單次使用的藥物中含TSG的總量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)該含量視制劑和使用的需要確定單位劑型(每片制劑或每支制劑)中TSG的含量。
本發(fā)明通過一系列的實驗研究證明，TSG多種原因所致實驗動物心肌缺血均有顯著的保護(hù)作用。
本發(fā)明實施例1觀察了口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對垂體后葉素引起的大鼠心肌缺血的影響。舌靜脈快速注射垂體后葉素6U/kg可導(dǎo)致大鼠心外膜及心內(nèi)膜心肌缺血，其主要表現(xiàn)是大鼠心電圖ST段迅速抬高，約15-30秒達(dá)高峰后逐漸下降，T波低平或倒置或表現(xiàn)為ST段顯著壓低，頻發(fā)室早，亦可見高度至完全房室傳導(dǎo)阻滯。試驗采用5、10、20mg/kg劑量連續(xù)3天給藥，發(fā)現(xiàn)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙10mg/kg和20mg/kg能顯著降低麻醉SD大鼠靜脈注射垂體后葉素引起心肌損傷造成的心電圖ST段抬高(與對照組比較，ΔST具有顯著或極顯著性差異)。表明該化合物10mg/kg和20mg/kgpo可以有效防止垂體后葉素引起的大鼠心肌缺血性損傷。
本發(fā)明實施例2觀察了3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈注射給藥對SD大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。該試驗以冠脈結(jié)扎法制備心肌缺血再灌注模型。實驗采用的3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈注射給藥劑量為7.5、15、30mg/kg(其中，根據(jù)體表面積法計算，犬7.5mg/kg相當(dāng)于體重70kg人用劑量為100mg/人)。試驗結(jié)果表明，心肌缺血再灌注后，血清LDH、CK活性明顯增加，心肌梗塞區(qū)重量明顯增加，與假手術(shù)對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低、中、高劑量(7.5、15、30mg/kg)給藥可以顯著降低血清CK活性、減少心肌梗塞區(qū)重量(與模型組比較，P＜0.05)；3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙中、高劑量(15、30mg/kg)給藥可以顯著降低血清LDH顯著低于模型組(與模型組比較，P＜0.05)；此結(jié)果說明3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈注射對缺血再灌注所致大鼠心肌損傷有保護(hù)作用，可明顯抑制缺血再灌注所致大鼠心肌損傷時LDH、CK溢出，降低血清LDH、CK活性，縮小心肌梗塞區(qū)重量，且其藥效具劑量依賴關(guān)系。
本發(fā)明實施例3觀察了3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對犬冠狀動脈結(jié)扎所致心肌梗塞模型的治療作用。該試驗也以冠脈結(jié)扎法制備心肌缺血再灌注模型。實驗采用的3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈注射給藥劑量為2.5、5、10mg/kg。試驗結(jié)果表明，冠脈結(jié)扎后5min，溶劑對照組心外膜電圖ST段總和(∑ST)明顯升高，30min時達(dá)峰(∑ST升高達(dá)18.2％)后緩慢回落；TSG 2.5～10mg/kg iv能劑量依賴性地抑制∑ST升高2.5mg/kg劑量組30～90min與溶劑對照組差異顯著；5mg/kg組各時間點與溶劑對照組比較均有顯著差異；10mg/kg高劑量組給藥后即有顯著作用并持續(xù)至120min。結(jié)果表明，TSG 2.5、5、10mg/kg靜注對狗冠脈結(jié)扎引起的急性心肌缺血程度有顯著的治療作用。
類似地，TSG可以劑量依賴性地縮小心肌缺血范圍，降低心外膜電圖N-ST值，作用可持續(xù)120min。2.5mg/kg劑量組各時間點N-ST值降低率與對照組同時間點比較，30～90min差異顯著(P＜0.05)；5mg/kg劑量組在15min～120min時N-ST值降低率與溶劑對照組同時間點比較有顯著差異；10mg/kg劑量組則在5～120min時間內(nèi)其降低心肌缺血范圍與溶劑對照組比較有非常顯著的差異。
用定量組織學(xué)檢測心肌梗塞范圍即用N-BT染色顯示TSG 2.5～10mg/kg靜注能劑量依賴性地減少心肌梗塞范圍，其結(jié)果與心外膜電圖測定結(jié)果一致。TSG 2.5、5、10mg/kg給藥后，其梗塞區(qū)/左心室的比值與對照組比較下降非常顯著(P＜0.01)；梗塞區(qū)/全心的比值與溶劑對照組比較亦顯著降低低(P＜0.05～0.01)。
冠狀動脈結(jié)扎后各實驗組動物的血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)均升高。而TSG 2.5、5、10mg/kg給藥可以顯著的降低血清LDH及CK的升高程度(P＜0.05～0.01)，其中高劑量(10mg/kg)藥效最強。
這些實驗結(jié)果表明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)靜注能顯著降低冠脈結(jié)扎犬的心肌缺血的程度，縮小心肌缺血范圍，作用強度呈劑量依賴性，定量組織學(xué)檢測與心外膜電圖測定的結(jié)果一致，證明TSG靜注對犬冠狀動脈結(jié)扎引起的心肌梗塞有明顯的治療作用。實驗結(jié)果還表明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙能顯著降低犬冠脈結(jié)扎后血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶升高的程度；提示其可減少急性缺血心肌細(xì)胞LDH、CK的溢出，減輕心肌缺血時的細(xì)胞損害，對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。
本發(fā)明實施例4觀察了3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙灌胃給藥對犬急性心肌梗死的保護(hù)作用。實驗?zāi)Ｐ屯瑢嵤├?。3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙采用口服給藥(灌胃)，給藥劑量分別設(shè)置為7.5、15及30mg/kg。試驗結(jié)果表明，TSG 7.5、15及30mg/kg po可降低由心肌缺血引起的ST段抬高，TSG 20mg/kg組效果顯著；TSG 7.5、15及30mg/kg po可不同程度地降低∑-ST，灌胃后大部分時間段ST段有明顯降低；TSG 7.5、15及30mg/kg給藥后N-ST均逐漸下降，與溶劑對照組同時間段比較在給藥后90分鐘顯著降低；TSG 10、20mg/kg po可顯著降低血清LDH活性；定量組織學(xué)(N-BT染色法)檢查表明，TSG 10、20mg/kg po可顯著縮小心肌梗塞范圍。實施例4的結(jié)果表明，口服TSG有減輕心肌缺血作用；對麻醉犬急性心肌梗死引起的心肌損傷有保護(hù)作用。
本發(fā)明實施例5觀察了3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈內(nèi)給藥對正常麻醉犬心肌耗氧量的影響。試驗結(jié)果表明3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)2.5、5、10mg/kg靜注后心肌耗氧量同溶劑對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；可顯著降低心肌氧攝取率，降低率與溶劑對照組同時間點相比，2.5mg/kg劑量組在15、60、90min時差異顯著；5、10mg/kg劑量組從15min至120min均顯著降低；TSG 2.5、5、10mg/kg靜注可增加冠脈流量，增加率與溶劑對照組同時間點相比，各劑量組則在15～120min內(nèi)差異均非常顯著。TSG 5、10mg/kg給藥120min時，冠脈阻力降低率與溶劑對照組同時間點相比差異非常顯著。TSG可增加犬心輸出量，心輸出量變化率與溶劑對照組同時間點相比，5mg/kg劑量組60、90min時，10mg/kg劑量組15、30min時差異顯著(P＜0.05)，60、90min時差異非常顯著(P＜0.01)。上述結(jié)果表明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙可明顯增加麻醉犬冠脈流量，增加心輸出量，可明顯降低心肌氧攝取率，降低冠脈阻力。
本發(fā)明實施例6觀察了3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜注給藥對正常麻醉犬心率、血壓、心臟收縮舒張功能等血流動力學(xué)指標(biāo)的影響。試驗結(jié)果顯示3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)2.5、5mg/kg iv后，心率、血壓、左心室壓力、左心室收縮壓最大變化速率均有波動，但與給藥前比較無顯著性差異。TSG 10mg/kg iv升高麻醉犬血壓，但與給藥前比無顯著性差異，其它各項指標(biāo)均無明顯的變化。
本發(fā)明實施例7觀察了3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)灌胃給藥對大鼠慢性心肌缺血的治療作用。試驗采用冠脈結(jié)扎致慢性心肌缺血實驗?zāi)Ｐ?，造模時間為6周，造模后，TSG給藥周期為6周，給藥劑量為20mg/kg。試驗結(jié)果表明，缺血對照動物的平均動脈壓較假手術(shù)降低，而TSG給藥動物的血壓恢復(fù)至假手術(shù)組水平；缺血對照動物左心室LVDP較對照組升高，LVESP、±dp/dtmax降低；而TSG給藥動物的相應(yīng)血流動力學(xué)指標(biāo)均顯著改善；此外，TSG給藥動物的缺血梗死組織較缺血對照動物顯著減少。試驗結(jié)果表明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)灌胃給藥對大鼠慢性心肌缺血具有顯著的治療作用。
本發(fā)明實施例8的研究表明，小鼠尾靜脈注射3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)的半數(shù)致死量(LD50)為648.94mg/kg，其95％的可信限為571.18mg/kg～726.70mg/kg。
本發(fā)明實施例9觀察了單劑量3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)iv在犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，健康Beagle犬靜注給TSG 10mg/Kg、20mg/Kg、30mg/Kg后，TSG的體內(nèi)過程符合二室模型，其藥代動力學(xué)參數(shù)藥時曲線末端相消除半衰期(t1/2)分別為168、152min、373min；AUC0～-分別為315、745和1552μg·min/ml，AUC與給藥劑量基本呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.985。
上述研究表明，TSG具有明顯的抗心肌缺血作用，因此，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠理解，該化合物對治療和/或預(yù)防缺血性心臟病即冠心病具有良好的應(yīng)用價值。
本發(fā)明人通過一系列試驗研究證明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈注射和/或口服給藥對垂體后葉素和/或冠脈結(jié)扎所致心肌缺血性心肌及心功能損傷有顯著的治療和/預(yù)防作用。其作用表現(xiàn)在降低缺血所致的心肌缺血損傷程度和范圍；減少急性心肌缺血所致血清LDH酶水平升高；恢復(fù)慢性心肌缺血所致心功能損害以及減輕慢性心肌缺血所致的心肌損傷。
與文獻(xiàn)報道的體外藥理學(xué)試驗結(jié)果有所不同的是，在本發(fā)明實施例劑量范圍內(nèi)，TSG對正常麻醉動物的心率、心功能沒有顯著影響。因此對于活體動物而言，在這些劑量范圍內(nèi)下，TSG并不存在因正性頻率和正性肌力作用而引起心肌作功增加，不引起心肌耗氧量的顯著改變。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，試驗劑量下的TSG能夠增加試驗動物的冠狀動脈血流量，減少冠脈阻力，降低冠脈血流氧攝取率，顯然，這些作用有利于TSG發(fā)揮其抗心肌缺血作用。而這些作用未見于已有文獻(xiàn)資料，也不能根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)直接推斷得出。
本發(fā)明人通過藥代動力學(xué)研究試驗發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明所用最大劑量30mg/kg下，TSG靜脈注射所獲得的最高血藥濃度僅100μg/ml，約0.25mmol/L，與體外試驗中直接舒張血管所需的藥物濃度(5.25mM)相差一個數(shù)量級以上(駱蘇芳等，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，虎杖結(jié)晶4號對兔血管的舒張作用，1992；12(1)10～13)；而欲達(dá)到約5mM血藥濃度，給藥劑量應(yīng)當(dāng)需要達(dá)到600mg/kg，此給藥劑量實際上已經(jīng)接近本發(fā)明實施例9所述小鼠經(jīng)脈給藥的半數(shù)致死量(640mg/kg)，顯然，這在實際應(yīng)用中是不可能實現(xiàn)的。另一方面，根據(jù)文獻(xiàn)，TSG 0.02mM～2mM能夠顯著升高血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，因此，對血管平滑肌的直接作用應(yīng)當(dāng)是正性肌力作用和提高血管張力(金春華等，虎杖甙對正常大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響，中國病理生理雜志，1998，14(2)195～198；金春華等，虎杖苷對VSMC內(nèi)鈣信號的調(diào)節(jié)機制初探，中國藥理學(xué)通報，2000，16(2)151～154)。但是，本發(fā)明實施例整體動物實驗證明，實驗劑量下的TSG對外周阻力無顯著影響，說明在本發(fā)明抗心肌缺血劑量下，TSG對在體阻力血管并無顯著影響。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙連續(xù)口服給藥以及通過靜脈途徑給藥均具有抗心肌缺血作用。
由此，本發(fā)明人提出3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙作為抗心機缺血藥物在冠心病治療和/或預(yù)防藥物的制備中具有有益的應(yīng)用價值。
鑒于現(xiàn)有文獻(xiàn)資料中沒見與本發(fā)明內(nèi)容直接相關(guān)的報道；根據(jù)現(xiàn)有基礎(chǔ)研究資料不能體現(xiàn)TSG在抗心肌缺血方面雜潛在價值，相反，根據(jù)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的試驗研究結(jié)果(金春華等.虎杖苷對心肌細(xì)胞收縮性的影響，中國藥理學(xué)通報，2000，16(4)400～402；金春華等，虎杖甙對正常大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響，中國病理生理雜志，1998，14(2)195～198；金春華等，虎杖甙對正常人血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣和膜電位的調(diào)節(jié)作用，中國病理生理雜志，1999；5(3)233～205；金春華等，虎杖苷對VSMC內(nèi)鈣信號的調(diào)節(jié)機制初探，中國藥理學(xué)通報，2000，16(2)151～154)推測，則TSG可能不利于心肌缺血條件下的血流動力學(xué)改善，且可能加重缺血心肌的血流供需矛盾。而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在抗心肌缺血有效劑量下，文獻(xiàn)報道的正性肌力作用以及增加血管張力的現(xiàn)象并不發(fā)生。顯然，本領(lǐng)域內(nèi)一般專業(yè)技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明所述內(nèi)容是具有新穎性和創(chuàng)造性的。


圖1說明TSG對犬冠脈結(jié)扎后心肌缺血程度(心外膜電圖∑ST)的影響其縱坐標(biāo)表示∑ST的變化率，橫坐標(biāo)表示冠脈結(jié)扎后的時間。顯然，與溶劑對照組相比，陽性對照以及TSG各給藥組的心肌缺血程度均有降低。[詳見實施例2]圖2說明TSG對犬冠脈結(jié)扎后心肌缺血范圍(心外膜電圖N-ST)的影響其縱坐標(biāo)表示N-ST的變化率，橫坐標(biāo)表示冠脈結(jié)扎后的時間。顯然，與溶劑對照組相比，陽性對照以及TSG各給藥組的心肌缺血范圍均有縮小。[詳見實施例2]圖3表示TSG對麻醉犬心肌氧攝取率的影響其縱坐標(biāo)表示心肌氧攝取變化率(％)，橫坐標(biāo)表示給藥后時間。由圖可見，TSG各劑量組給藥后，麻醉犬的心肌氧攝取率均有降低。[詳見實施例5]圖4表示TSG對麻醉犬冠脈流量的影響其縱坐標(biāo)表示冠脈流量變化率(％)，橫坐標(biāo)表示給藥后時間。由圖可見，TSG各劑量組給藥后，麻醉犬的冠脈血流量均有增加。[詳見實施例5]圖5表示TSG對麻醉犬心輸出量的影響其縱坐標(biāo)表示心輸出量變化率(％)，橫坐標(biāo)為給藥后時間。由圖可見，TSG中、高劑量組給藥組給藥后，麻醉犬的心輸出量顯著增加。[詳見實施例5]圖6表示健康Beagle犬單劑量靜注給藥TSG 10、20、30mg/kg后的血藥濃度-時間曲線其縱坐標(biāo)表示血藥濃度(μg/ml)，橫坐標(biāo)為給藥后時間。[詳見實施例9]下文通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明內(nèi)容。
具體實施例方式
實施例1 口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對垂體后葉素致大鼠心肌缺血的影響本實施例目的在于證實口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對垂體后葉素引起的大鼠心肌缺血的影響。
藥品及試劑受試藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙顆粒劑(批號031011)，深圳海王藥業(yè)有限公司制備。給藥時用0.8％CMC配制濃度為1.25、2.5和5mg/ml的混懸液。
對照藥丹參片(批號030926)，300mg/片。上海雷允上藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。給藥時用0.8％CMC配制濃度為20mg/ml的混懸液。
試驗動物雄性SD大鼠50只，體重為300-425g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
分組與給藥試驗設(shè)5組，包括空白對照組，丹參片組(300mg/kg)，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(20mg/kg)劑量組。受試藥和對照藥均采用等容量不等濃度方式灌胃，灌胃容量均為3ml/kg。3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低、中、高劑量組給藥劑量為5、10和20mg/kg。丹參片組給藥劑量為300mg/kg；空白對照組給予等容量0.8％CMC。
試驗方法健康雄性SD大鼠50只隨機分成5組，連續(xù)三天分別灌胃給予藥物或?qū)φ杖軇?，每天一次。第三天給藥后1小時，以3％戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉，描記V3導(dǎo)聯(lián)正常心電圖(ECG-6511型心電圖機，上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)，標(biāo)記電壓定為1mV＝1cm，如基礎(chǔ)心電圖異常則棄之不用。穩(wěn)定15min后，舌靜脈快速注射垂體后葉素(上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批號020601。臨用前用生理鹽水配成0.6U/ml)6U/kg。記錄垂體后葉素注射前、注射完畢即刻、注射后0.5、1、2、5、10、15、20、30、40、50和60min各時間點V3導(dǎo)聯(lián)心電圖。取各時間點ST段高度統(tǒng)計處理，觀察ST段抬高程度(ΔST，mV)的變化及動物死亡情況。
試驗結(jié)果(1)靜脈注射垂體后葉素后一般心電圖變化 大鼠注射垂體后葉素后心電圖主要表現(xiàn)為ST段迅速抬高，約15-30秒達(dá)高峰，然后逐漸下降，T波低平或倒置或表現(xiàn)為ST段顯著壓低，提示為心外膜及心內(nèi)膜心肌缺血。頻發(fā)室早，亦可見高度至完全房室傳導(dǎo)阻滯。
(2)受試藥物對損傷性ST段抬高的影響以注射垂體后葉素誘發(fā)損傷引起的ST段抬高程度變化(ΔST，mV)為判斷指標(biāo)。結(jié)果表明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙10mg/kg和20mg/kg能顯著降低麻醉SD大鼠靜脈注射垂體后葉素引起心肌損傷造成的心電圖ST段抬高(表1)。
試驗結(jié)論3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙10mg/kg和20mg/kg能顯著降低麻醉SD大鼠靜脈注射垂體后葉素引起心肌損傷造成的心電圖ST段抬高。提示該化合物10mg/kg和20mg/kg po能較有效防止垂體后葉素引起的大鼠心肌缺血性損傷。
表1 TSG對垂體后葉素誘發(fā)SD大鼠ST段抬高(ΔST)的影響(x±s，mV，n＝10)丹參片TSGTSGTSG溶劑對照80mg/kg 20mg/kg10mg/kg5mg/kg給藥后30s0.096±0.063 0.056±0.047 0.110±0.055 0.066±0.220.075±0.070給藥后1min 0.103±0.071 0.078±0.059 0.086±0.062 0.081±0.063 0.078±0.072給藥后2min 0.093±0.062 0.076±0.061 0.075±0.051 0.070±0.055 0.083±0.070給藥后5min 0.121±0.071 0.080±0.054 0.068±0.060 0.069±0.067 0.056±0.048*給藥后10min 0.142±0.197 0.093±0.061 0.073±0.061 0.083±0.070 0.076±0.066給藥后15min 0.158±0.074 0.086±0.060*0.059±0.040**0.066±0.042**0.076±0.058*給藥后20min 0.135±0.089 0.065±0.032*0.049±0.047*0.055±0.046*0.072±0.054*給藥后30min 0.119±0.068 0.079±0.058 0.041±0.036**0.074±0.072 0.067±0.079給藥后40min 0.137±0.081 0.066±0.057*0.052±0.040**0.069±0.068 0.102±0.093給藥后50min 0.160±0.090 0.078±0.070*0.066±0.058*0.079±0.073*0.089±0.081給藥后60min 0.174±0.109 0.079±0.092 0.054±0.046**0.064±0.056**0.088±0.069*P＜0.05；**P＜0.01 vs對照組實施例2 3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙iv對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用本實施例的目的在于觀察3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈注射給藥對SD大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。
受試藥物受試藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙溶液(批號03030302)，100mg/10ml；深圳海王藥業(yè)有限公司。使用時以生理鹽水稀釋。
陽性對照藥硝酸異山梨醇酯注射液(異舒吉注射液，批號479210)，德國許瓦茲大藥廠生產(chǎn)，珠海許瓦茲制藥有限公司分裝。
試驗動物SPF級SD大鼠，雄性，體重250～300克。第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究中心提供。
分組與給藥試驗設(shè)假手術(shù)組、生理鹽水對照組、異舒吉注射液對照組(0.6mg/kg)、3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低(7.5mg/kg)、中(15mg/kg)、高(30mg/kg)劑量給藥組(體表面積法計算，低劑量7.5mg/kg相當(dāng)于體重70kg人用劑量為100mg)。股靜脈給藥。
實驗方法(1)動物手術(shù)和冠狀動脈結(jié)扎法雄性SD大鼠，戊巴比妥鈉(45mg/kg ip)麻醉，仰位固定。以心電圖機(ECG-6851C，上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖。氣管插管接人工呼吸機。胸左側(cè)肋間處切開胸壁并切斷第四/五肋骨，開心包膜，暴露心臟，于左冠狀動脈前降支下穿0/3號縫合線，穩(wěn)定10min(穩(wěn)定后心電圖不正常者棄去)。將兩個線頭穿過一小段細(xì)硅膠管，在另一小段細(xì)硅膠管上打結(jié)作為缺血結(jié)扎(無ST段及T波改變者淘汰)，缺血10min后從股靜脈緩慢注射給藥，40min后剪斷結(jié)扎線，使前降支再灌注30min。
(2)乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的測定再灌注結(jié)束后，腹主動脈取血，紫外分光法測定血清LDH、CK活性。
(3)心肌梗塞范圍測定法在冠脈結(jié)扎線下，平行于冠狀溝，等厚地切取心室肌5片并置于硝基四氮唑藍(lán)(N-BT)染液中振搖染色15min。正常心肌染為暗藍(lán)色，梗塞區(qū)心肌則不著色為淺黃色。在解剖鏡下分離梗塞區(qū)，分別稱重，以梗塞區(qū)心肌重量占心肌重量的百分比(％)作為衡量梗塞范圍的指標(biāo)。
(4)數(shù)據(jù)及統(tǒng)計學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以x±s表示，用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗。
試驗結(jié)果心肌缺血再灌注后，血清LDH、CK活性明顯增加，心肌梗塞區(qū)重量明顯增加，與假手術(shù)對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低、中、高劑量組(7.5、15、30mg/kg)血清CK活性、心肌梗塞區(qū)重量明顯低于模型組(P＜0.05)；3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙中、高劑量組(15mg/kg、30mg/kg)血清LDH顯著低于模型組(P＜0.05)；異舒吉注射液組與3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙給藥組相似，血清LDH、CK活性、心肌梗塞區(qū)重量明顯降低(P＜0.05)。(表2)試驗結(jié)論3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈注射對缺血再灌注所致大鼠心肌損傷有保護(hù)作用，可明顯抑制缺血再灌注所致大鼠心肌損傷時LDH、CK溢出，降低血清LDH、CK活性，縮小心肌梗塞區(qū)重量，并具有一定的量效關(guān)系。
表2 TSG對缺血再灌注大鼠血清酶活性及心肌梗塞程度的影響(x±s，n＝10)組別 劑量 CK(IU/L) LDH(IU/L) 梗塞區(qū)比例(％)假手術(shù)組 1.0ml/kg 510.8±80.9655.5±78.3 --生理鹽水組1.0ml/kg 865.4±189.1△△△989.9±184.6△△△33.73±3.83△△△異舒吉組 0.6mg/kg 637.1±100.4***806.0±92.0**23.98±3.16***3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙組低劑量組7.5mg/kg 710.7±106.8**857.7±124.0 27.57±5.33***中劑量組15.0mg/kg 630.6±108.6***809.4±128.4**24.80±3.32***高劑量組30.0mg/kg 559.4±72.9***744.0±149.2***23.71±3.66*****P＜0.05，***P＜0.01與生理鹽水組比較；△△△P＜0.01與假手術(shù)組比較實施例3 3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙iv對犬冠脈結(jié)扎心肌梗塞模型的治療作用本實施例的目的在于觀察3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對犬冠狀動脈結(jié)扎造成心肌梗塞模型的治療作用。
受試藥物受試藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙溶液(批號03030302)，100mg/10ml；深圳海王藥業(yè)有限公司。使用時，以生理鹽水稀釋。
陽性對照藥硝酸異山梨醇酯注射液(異舒吉注射液，批號479210)，德國許瓦茲大藥廠生產(chǎn)，珠海許瓦茲制藥有限公司分裝。
試驗動物健康雜種犬，體重10-15kg，雄雌兼用，第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
分組與給藥試驗設(shè)假手術(shù)組、生理鹽水對照組、異舒吉注射液對照組(0.4mg/kg)、3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低(2.5mg/kg)、中(5mg/kg)、高(10mg/kg)劑量給藥組。靜脈注射給藥。給藥體積與缺血再灌注模型組給生理鹽水量一致，給藥容量2ml/kg。
試驗方法動物稱重后，戊巴比妥鈉30mg/kg iv麻醉。行氣管插管，接SC-M5型麻醉呼吸機(上海醫(yī)療儀器廠)，待開胸后行機械通氣(16-18次/分，潮氣量350-550ml)。胸骨左緣第4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包并作心包吊床。在左冠狀動脈前降支第二至第三分支間游離冠狀動脈，其下穿絲線，用于兩步結(jié)扎。心臟表面放置30點心外膜電極。四肢經(jīng)針形電極連接30點心外膜電極，經(jīng)多導(dǎo)轉(zhuǎn)換開關(guān)連至Powerlab system 8s生理記錄儀(ADInstruments)，記錄30點心外膜電圖。采用Harris兩步結(jié)扎法首次結(jié)扎前2分鐘，從股動脈靜注利多卡因5mg/kg預(yù)防心律失常。在結(jié)扎時將一段直徑1mm的鋼絲插入第一松結(jié)內(nèi)，將鋼絲與冠狀動脈一起結(jié)扎，而后抽出鋼絲。30分鐘后完全結(jié)扎第二結(jié)。
記錄完全結(jié)扎后10min的心外膜電圖作為用藥前對照值，而后從股靜脈給藥，陰性對照組給同體積溶劑對照。各組均在30min內(nèi)以電子恒流泵(SH-88AB可控靜脈注射推進(jìn)器，泉州市鯉中醫(yī)療電子儀器廠)恒速滴注完畢。分別記錄給藥后5、15、30、60、90及120min心外膜電圖的變化。以ST段升高或降低2mV以上的導(dǎo)聯(lián)數(shù)(NST)和ST段升高值的總和(∑ST)為指標(biāo)觀察給藥前后心外膜電圖變化，并計算心肌缺血程度(∑ST)和范圍(NST)。以用藥后不同時間實測值與用藥前進(jìn)行比較，用藥后不同時間變化百分率(用藥前為100％)進(jìn)行組間比較。結(jié)扎2小時后取心臟，稱取全心重量；切去心房及右心室，稱出左心室重量，并在冠脈結(jié)扎線下，將左心室切成等厚5片，用生理鹽水洗凈，置0.05％氯化硝基四氮唑藍(lán)(N-BT)液37℃染色30分鐘。梗死區(qū)不著色，非梗死區(qū)著暗藍(lán)色。剪取未著色梗死區(qū)稱重，計算出梗塞區(qū)重量占全心及左心室重量的百分比。冠脈結(jié)扎前及給藥后2小時各取右心室血3ml，3000rpm離心15分鐘，取血清測乳酸脫氫酶(LDH)、血清肌酸激酶(CK)。LDH的測定采用LDH測試盒方法(批號20020523，南京建成生物工程研究所)，CK(ENRU90625，Randox公司，UK)。在UV751GD型紫外/可見光分光光度計上進(jìn)行(上海分析儀器廠)。
試驗結(jié)果(1)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)對心肌缺血程度(心外膜電圖∑ST)的影響冠脈結(jié)扎后5min，溶劑對照組心外電圖ST段總和(∑ST)明顯升高。溶劑對照組30min時∑ST升高達(dá)18.2％，此后緩慢回落；TSG 2.5-10mg/kg靜脈給藥后能劑量依賴性地減輕心肌缺血程度，∑ST顯著下降低劑量組30-90min與溶劑對照組差異顯著；中劑量組各時間點與溶劑對照組比較均有顯著差異；高劑量組給藥后即有顯著作用并持續(xù)至120min。異舒吉注射液組在給藥后5至90min，∑ST下降，但90后至120min與溶劑對照組無顯著性差異。實驗結(jié)果表明，TSG 2.5、5、10mg/kg靜注對狗冠脈結(jié)扎引起的急性心肌缺血程度有顯著的治療作用。實驗結(jié)果見表3，圖1。
(2)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)對心肌缺血范圍(心外膜電圖N-ST)的影響TSG能劑量依賴性地縮小心肌缺血范圍，降低N-ST值，作用可持續(xù)120min。低劑量組2.5mg/kg各時間點N-ST值降低率與溶劑對照組同時間點比較，30-90min差異顯著(P＜0.05)；中劑量組5mg/kg在15min-120min時N-ST值降低率與溶劑對照組同時間點比較有顯著差異；高劑量組(10mg/kg)在5-120min時間內(nèi)其降低心肌缺血范圍與溶劑對照組比較有非常顯著的差異。異舒吉注射液組在給藥后5min心肌缺血范圍與溶劑對照組同時間點比較也有顯著下降。實驗結(jié)果見表4、圖2。
(3)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)對心肌梗塞范圍的定量組織學(xué)檢測的影響用定量組織學(xué)檢測心肌梗塞范圍即用N-BT染色顯示3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對心肌梗塞范圍的影響與心外膜電圖測定的結(jié)果一致。TSG 2.5～10mg/kg靜注能劑量依賴性地減少心肌梗塞范圍。TSG低、中、高劑量組(2.5、5、10mg/kg)梗梗塞區(qū)/左心室的比值與溶劑對照組比較下降非常顯著(P＜0.01)；梗塞區(qū)/全心的比值與溶劑對照組比較，低劑量組下降顯著(P＜0.05)，中、高劑量組下降非常顯著(P＜0.01)。其中高劑量組作用最強。異舒吉注射液組亦顯著縮小心肌梗塞范圍(P＜0.01)。實驗結(jié)果見表5。
(4)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)對冠脈結(jié)扎后血清生化指標(biāo)的影響冠狀動脈結(jié)扎后各組血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)均升高。TSG低、中、高劑量組及陽性對照藥組均能非常顯著的降低血清LDH的升高程度(P＜0.01)；中、高劑量組及陽性對照藥組均能非常顯著的降低血清CK的升高程度(P＜0.01)，低劑量組能顯著的降低血清CK的升高程度(P＜0.05)。其中高劑量組(10mg/kg)藥效最強。實驗結(jié)果見表6。
試驗結(jié)論實驗結(jié)果證明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)靜注能顯著降低冠脈結(jié)扎犬的心肌缺血的程度，縮小心肌缺血范圍，作用強度呈劑量依賴性，定量組織學(xué)檢測與心外膜電圖測定的結(jié)果一致，與溶劑對照對照組比較，梗塞區(qū)顯著縮小，證明TSG靜注對犬冠狀動脈結(jié)扎引起的心肌梗塞有明顯的治療作用。實驗結(jié)果還表明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙能顯著降低犬冠脈結(jié)扎后血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶升高的程度；提示其可減少急性缺血心肌細(xì)胞LDH、CK的溢出，減輕心肌缺血時的細(xì)胞損害，對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。
表3 TSG對犬冠脈結(jié)扎心外膜電圖ST段總和(∑ST)的影響(mV，x±s，n＝6)指給藥前 給藥后組別標(biāo) 0min 5min 15min 30min 60min 90min 120min溶劑對照 x±s 153.3±43.7 175.7±51.7 177.8±40.7 178.8±44.0 173.0±42.1 165.5±41.7 148.5±43.22ml/kg 變化％ 14.7±7.417.7±10.118.2±10.614.5±11.78.8±3.9 -3.1±7.8異舒吉 x±s 160.5±41.2 149.3±36.7 128.7±46.6 111.2±44.5 111.0±38.2 115.8±29.7 138.5±45.50.4mg/kg/h 變化％ -6.7±4.3**-20.9±13.8**-32.6±11.0**-31.4±7.6**-27.4±6.7**-13.7±18.0TSGx±s 154.5±60.4 154.7±55.0 149.5±52.8 129.2±57.7 122.7±59.6 128.3±55.1 130.2±54.12.5mg/kg變化％ 1.5±9.5 -1.1±20.3-17.4±8.5**-22.2±12.3**-17.3±12.4*-15.5±16.8TSGx±s 153.8±50.7 148.0±39.9 133.7±52.7 116.2±53.7 105.3±53.6 103.8±54.1 100.5±48.35.0mg/kg變化％ -1.7±10.3**-11.7±23.2*-25.4±17.8**-32.6±19.5**-33.2±21.9**-32.1±24.8*TSGx±s 155.0±46.4 151.7±35.6 132.0±43.1 115.2±50.9 104.7±45.5 102.0±51.8 103.3±46.410mg/kg 變化％ -0.7±7.7*-15.4±5.6*-28.0±12.8**-34.1±13.0**-37.1±15.7**-35.3±14.3*
*P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表4 TSG對犬冠脈結(jié)扎心肌梗塞范圍(N-ST)的影響(x±s，n＝6)給藥前給藥后組別指標(biāo)0min5min 15min 30min 60min 90min 120min溶劑對照 x±s 26.5±4.5 28.2±3.9 28.3±2.7 29.2±2.9 29.5±1.2 28.3±1.6 27.0±2.22ml/kg 變化％6.5±5.4 7.2±6.0 10.5±9.4 11.9±9.1 9.4±10.6 2.3±9.8異舒吉 x±s 28.2±3.2 26.2±2.7 23.2±6.7 20.0±5.9**21.5±1.5**22.2±2.4**22.8±2.40.4mg/kg/h 變化％-7.0±8.3*-17.9±10.7**-28.9±14.3**-23.6±3.9**-21.3±7.1**-18.8±8.5*TSGx±s 26.7±4.1 27.5±4.5 26.0±5.6 23.2±5.3*21.8±3.8**23.8±2.3 23.8±3.92.5mg/kg變化％3.4±11.7 -2.5±10.0-12.6±11.1*-18.4±10.3**-10.7±3.0*-10.8±11.1TSGx±s 26.7±3.9 25.8±3.7 24.3±5.1 21.0±8.2**19.0±4.2**19.7±5.2**17.8±4.0**5.0mg/kg變化％-3.0±7.4 -8.3±14.3*-20.6±17.9**-28.3±16.7**-25.4±21.2**-32.9±15.5**TSGx±s 27.8±3.1 24.8±6.4 22.2±8.4 18.7±6.8**18.7±2.5**19.2±1.9**20.2±1.8**10mg/kg 變化％-10.9±12.7**-20.5±12.7**-32.9±18.6**-32.8±9.1**-31.0±8.0**-27.6±4.9***P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表5 TSG對N-BT染色測定心肌梗塞范圍的影響(x±s，n＝6)組別 梗塞區(qū)/全心(％) 梗塞區(qū)/左心室(％)溶劑對照 2ml/kg 14.84±2.18 26.15±1.55異舒吉0.4mg/kg/h 9.57±2.48*15.47±3.80**TSG 2.5mg/kg11.70±0.93*21.68±1.88**TSG 5.0mg/kg9.03±1.16**15.25±1.41**TSG 10mg/kg 8.65±1.11**13.92±1.32***P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表6 TSG對冠脈結(jié)扎動脈血清生化指標(biāo)的影響(x±s，n＝6)LDH(IU/L) CK(IU/L)組別給藥前 給藥后后/前 給藥前 給藥后后/前溶劑對照 2ml/kg 326.8±55.1 919.6±211.2 2.81±0.35171.3±25.8 526.2±102.9 3.07±0.37異舒吉0.4mg/kg/h 330.0±78.4 663.1±133.3 2.03±0.22**172.7±13.2 360.2±51.9 2.09±0.25**TSG 2.5mg/kg359.7±70.5 823.3±186.3 2.28±0.21**176.7±18.8 446.6±39.4 2.54±0.27*TSG 5.0mg/kg281.2±80.9 587.1±170.6 2.09±0.16**180.8±13.2 356.2±64.8 1.98±0.38**TSG 10mg/kg 279.3±70.8 551.6±131.3 1.99±0.14**172.7±11.1 299.5±63.9 1.74±0.37***P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較實施例4 口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對麻醉犬急性心肌梗死的保護(hù)作用本實施例的目的在于觀察3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙灌胃對犬急性心肌梗死的保護(hù)作用。
試驗藥物受試藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙顆粒劑(批號031019)，深圳海王藥業(yè)有限公司制備。給藥時用0.8％CMC配制濃度為1、2、4mg/ml的混懸液。
對照藥丹參片(批號030926)，300mg/片。上海雷允上藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。給藥時用0.8％CMC配制濃度為9mg/ml的混懸液。
試驗動物健康雜種犬30只，雄雌兼用，體重12～14kg，第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
分組與給藥試驗設(shè)溶劑對照組、陽性對照組(丹參片45mg/kg)、3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙5、10及20mg/kg劑量組。給藥方式采用等容量不等濃度灌胃給藥，灌胃容積為5ml/kg。以上各組藥物均在所記錄的各項指標(biāo)穩(wěn)定30分鐘后灌胃給藥。
實驗方法動物稱重后以3％戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈注射麻醉。氣管插管，接麻醉呼吸機(SC-M5型，上海醫(yī)療儀器廠)，開胸后行機械通氣(18～20次/分，吸氣與呼氣之比為1∶2，潮氣量350～550ml)。以針狀電極插入四肢及胸前皮下，監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)肢導(dǎo)及V3、心電圖。沿胸骨左緣第3肋間開胸，并切斷第4肋骨充分暴露心臟。剪開心包并作心包吊床。在左冠狀動脈前降支第二至第三分支間游離冠狀動脈，其下穿絲線，用于兩步結(jié)扎。心臟表面放置30點心外膜電極。四肢經(jīng)針形電極連接30點心外膜電極，經(jīng)多導(dǎo)轉(zhuǎn)換開關(guān)連至Powerlab system 8s生理記錄儀(AD Instruments)，記錄心外膜電圖。
用二步結(jié)扎法造成急性心肌缺血模型，首次結(jié)扎前2分鐘，從股動脈靜注利多卡因5mg/kg預(yù)防心律失常。給生理鹽水或受試藥物后5、15、30、60、90、120、180min記錄30個標(biāo)測點的心外膜電圖，以ST段升高大于2mV為判斷標(biāo)準(zhǔn)，以此計算心肌缺血程度(ST段升高總毫伏數(shù)∑-ST)及心肌缺血范圍(ST段升高超過2mV總點數(shù)N-ST)。180min后從股靜脈抽血4ml，置離心機，10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，留取血清-18℃保存待測LDH(LDH試劑盒，批號20020523，南京建成生物工程研究所)。取心臟，稱全心重量，剪去心耳和右心室后稱重(左心重)。然后將左心切成0.5～1cm厚的心肌片，用生理鹽水洗凈，置37℃0.025％氯化硝基四氮唑藍(lán)(Nitro-tetrazoliumBlue chloride，N-BT，瑞士Fluka化學(xué)試劑公司生產(chǎn)NBT)液染色。梗死心肌不著色，非梗死心肌被染成著藍(lán)黑色，剪取未著色的梗死區(qū)稱重。
實驗結(jié)果以x±s表示，采用非配對t檢驗法統(tǒng)計，P＜0.05時認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。
試驗結(jié)果(1)TSG對麻醉犬心率(體表心電圖)影響溶劑對照組、陽性對照組和TSG3個劑量組用藥前后比較無明顯變化(表6)；表6 口服TSG對麻醉犬心率的影響(x±s，次/分，n＝6)丹參片組 TSGTSGTSG溶劑對照組45mg/kg5mg/kg 10mg/kg20mg/kg給藥前 164±15 170±12173±16169±12185±10給藥后5min 161±12 176±13174±18169±11186±13給藥后15min167±17 175±11168±17167±10182±11給藥后30min164±18 173±14170±16165±12184±12給藥后60min168±16 167±13167±12163±16178±16給藥后90min165±11 168±16165±12165±12177±15給藥后120min 166±18 172±13167±13162±11180±21給藥后180min 169±18 164±16163±12159±14168±19(2)TSG對心肌缺血犬體表心電圖ST段抬高程度(ΔST)的影響丹參片和TSG各劑量灌胃后可降低由心肌缺血引起的ST段抬高TSG 20mg/kg組效果顯著(表7)。
表7 口服TSG對犬ΔST的影響(x±s，mV，n＝6)丹參片組TSG TSG TSG溶劑對照組45mg/kg 5mg/kg 10mg/kg 20mg/kg給藥后5min1.10±0.60 0.41±0.34*0.66±0.45 0.55±0.40 0.58±0.30給藥后15min 1.04±0.63 0.77±0.42 0.70±0.50 0.68±0.51 0.45±0.17*給藥后30min 1.21±0.80 0.60±0.30 0.71±0.48 0.69±0.52 0.39±0.16*給藥后60min 1.09±0.48 0.71±0.43 0.73±0.51 0.69±0.45 0.35±0.19*給藥后90min 1.30±0.75 0.69±0.44 0.88±0.54 0.70±0.44 0.26±0.15**
給藥后120min 1.32±0.68 0.64±0.38 0.82±0.49 0.75±0.46 0.28±0.13**給藥后180min 1.40±0.71 0.55±0.33*0.86±0.52 0.81±0.52 0.23±0.16***p＜0.05，**P＜0.01 vs溶劑對照組(3)TSG對麻醉犬急性心肌缺血(心外膜電圖∑-ST)的影響與溶劑對照組比較，各給藥組∑-ST均有不同程度降低，灌胃后大部分時間段ST段有明顯降低(表8)。
表8 口服TSG對犬心肌缺血程度(∑-ST)的影響(x±s，mV，n＝6)丹參片組 TSGTSGTSG溶劑對照組45mg/kg5mg/kg 10mg/kg20mg/kg給藥前55.6±9.11 59.2±7.03 55.7±6.14 54.3±1.89 62.1±6.34給藥后5min92.1±12.8 82.0±13.7 77.3±15.0 77.9±10.6 78.7±5.68*給藥后15min 95.0±8.23 77.9±14.7*77.9±13.9*69.6±7.90***77.8±8.49**給藥后30min 93.0±6.81 72.2±12.7**71.6±8.71***69.8±7.32***70.6±4.79***給藥后60min 87.3±5.59 70.9±10.9**72.2±8.68**75.9±16.3 68.7±6.25***給藥后90min 90.6±11.4 69.1±12.4*70.5±8.46**68.8±7.83**65.7±7.12**給藥后120min 89.1±5.58 66.0±7.68***73.6±8.00**66.3±5.60***65.0±6.12***給藥后180min 82.4±8.82 61.7±5.17***67.4±8.19*64.2±5.45**62.5±3.03****P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs溶劑對照組(4)TSG對麻醉犬急性心肌缺血范圍(心外膜電圖N-ST)的影響以32個電極中ST段超過2mV的百分比(N-ST)表示。溶劑對照組給藥后N-ST變化不明顯，丹參片組和TSG各組用藥后N-ST均逐漸下降，與溶劑對照組同時間段比較在給藥后90分鐘顯著降低(表9)。
表9 口服TSG對犬N-ST的影響(x±s，％，n＝6)丹參片組TSG TSG TSG溶劑對照組45mg/kg 5mg/kg 10mg/kg 20mg/kg給藥前34.6±13.7 35.2±19.3 26.5±17.6 22.8±9.44 42.3±20.6給藥后5min85.6±19.3 86.4±13.69 70.3±21.4 79.5±19.5 89.2±20.3給藥后15min 79.6±14.3 81.1±16.3 66.9±19.8 72.3±15.9 78.9±13.7給藥后30min 81.0±15.5 76.1±16.2 70.3±16.3 69.4±13.2 74.9±12.9給藥后60min 85.2±8.03 66.3±19.8 69.5±15.8 68.0±18.8 67.2±16.5給藥后90min 86.3±9.89 68.9±16.6*63.0±18.7*68.6±15.6*59.2±18.9*給藥后120min 83.4±8.69 57.9±16.8*63.2±12.8*61.9±14.9*56.4±13.6**
給藥后180min 80.1±17.2 49.6±18.6**58.3±19.3 55.5±16.7*46.8±14.9**N-ST32個電極中ST段超過2mV的百分比；*P＜0.05，**P＜0.01 vs溶劑對照組。
(5)TSG對麻醉犬急性心肌梗死后血清酶學(xué)的影響 與溶劑對照組比較，灌胃給藥后，TSG 10、20mg/kg可顯著降低LDH活性(表10)。
表10 口服TSG對麻醉犬急性心肌梗死后LDH的影響(x±s，IU/L，n＝6)丹參片 TSG TSG TSG溶劑對照45mg/kg 5mg/kg 10mg/kg 20mg/kgLDH206±47.3173±81.4159±80.4140±47.6**120±40.0****P＜0.01 vs溶劑對照組(6)TSG對麻醉犬急性心肌梗死后心肌梗塞范圍的影響 定量組織學(xué)(N-BT染色法)檢查表明，與溶劑對照組比較，丹參片組、TSG各組心肌梗塞范圍均顯著縮小(表11)。
表11 口服TSG對麻醉犬急性心肌梗死范圍的影響(x±s，g，n＝6)丹參片組TSG TSG TSG溶劑對照組45mg/kg 5mg/kg 10mg/kg 20mg/kg心臟重量(g)68.3±11.6 78.7±15.6 79.7±6.68 68.8±6.05 80.6±13.3左心重(g) 46.2±9.26 53.8±10.8 55.1±4.15 48.2±4.84 56.2±9.58梗死心肌重(g) 4.58±0.83 3.67±0.98*5.98±1.71 3.17±0.66*2.31±0.70**梗死心肌重/左心重 9.96±1.68 6.94±1.67*10.8±2.81 6.61±1.31**4.03±0.61****P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs溶劑對照組試驗結(jié)論(1)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙按5、10和20mg/kg灌胃給藥可降低犬冠狀動脈結(jié)扎后心肌缺血引起的體表心電圖和心外膜電圖ST段抬高程度，說明口服該化合物有減輕心肌缺血作用；(2)N-BT染色法顯示，口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙10和20mg/kg可以顯著減輕麻醉犬急性心肌缺血程度并縮小心肌梗死范圍；LDH活性檢測顯示，口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙5、10和20mg/kg可劑量依賴性地抑制犬急性心肌梗死后LDH的活性，提示口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對麻醉犬急性心肌梗死引起的心肌損傷有保護(hù)作用。
實施例5 3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙iv對麻醉犬心肌耗氧量的影響本實施例的目的在于試驗觀察3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜脈內(nèi)給藥對麻醉犬心肌耗氧量的影響。
受試藥物受試藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙溶液(批號03030302)，100mg/10ml；深圳海王藥業(yè)有限公司。使用時，以生理鹽水稀釋。
對照藥硝酸異山梨醇酯注射液(異舒吉注射液，批號479210)，德國許瓦茲大藥廠生產(chǎn)，珠海許瓦茲制藥有限公司分裝。
試驗動物健康雜種犬，體重10～14kg，雄雌兼用，第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
分組與給藥試驗設(shè)溶劑對照組、異舒吉對照組(0.4mg/kg/h)、3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低(2.5mg/kg)、中(5mg/kg)、高(10mg/kg)劑量給藥組。異舒吉對照組連續(xù)靜脈滴注給藥，其它各組靜脈注射給藥。
試驗方法用3％戊巴比妥鈉30mg/kg給犬靜脈麻醉，氣管插管并連接到SC-M5型麻醉呼吸機(上海醫(yī)療設(shè)備廠，頻率16～18次/分，潮氣量350～550ml)。分離兩側(cè)股動脈，分別用于取血分析及測量平均血壓。左側(cè)第4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，做成心包床。游離升主動脈根部和左冠狀動脈前降支上部，分別放置適宜內(nèi)徑的電磁流量計探頭(MFV-1100/1200型，日本Nihon Kohden公司)測心輸出量和冠脈流量。分離右側(cè)頸靜脈，插入心導(dǎo)管并引導(dǎo)心導(dǎo)管插入冠狀靜脈竇，固定心導(dǎo)管。同步抽取取冠狀竇及股動脈血標(biāo)本(0.5％肝素抗凝)，用血氣分析儀(DH-1830型血氣酸鹼分析儀，南京分析儀器廠)測定pO2，pH，換算成動脈和靜脈血氧含量。靜滴給予溶劑對照或藥物，各組均在30min內(nèi)以電子恒流泵(SH-88AB可控靜脈注射推進(jìn)器，泉州市鯉中醫(yī)療電子儀器廠)恒速滴注完畢。分析給藥前及給藥后5、15、30、60、90、120min時動脈和靜脈血氣，并觀察0、5、15、30、60、90、120min時平均血壓和心輸出量。實驗結(jié)束時將心臟稱重，并以10-15ml 10％上海高級碳素墨水逆流灌注于電磁流量計測量部位以下區(qū)域，切下染黑區(qū)并稱重，用于計算心肌耗氧量。計算給藥前、給藥后5，15，30，60，90，120min心肌耗氧量指標(biāo)。公式為心肌耗氧量(ml/min/100g)＝冠脈血流量ml/min/100g×(動脈血氧ml％-冠狀竇血氧ml％)。
心肌氧攝取率(％)＝(動脈血氧ml％-冠狀竇血氧ml％)/動脈血氧ml％體循環(huán)總外周阻力(dyn·s·cm-5)＝平均動脈壓[MAP(KPa)]×80/心輸出量[CO(L/min)]＝平均動脈壓[MAP(mmHg)]×10.6/心輸出量[CO(L/min)]冠脈阻力[Kpa/ml/min]＝平均動脈血壓[MAP(KPa)]/冠脈流量[(mL/min)]試驗結(jié)果(1)對麻醉犬心肌耗氧量的影響3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)2.5、5、10mg/kg靜注后心肌耗氧量同溶劑對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，結(jié)果見表12。
(2)對麻醉犬心肌氧攝取率的影響3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)靜注后可顯著降低心肌氧攝取率。降低率與溶劑對照組同時間點相比，小劑量組在15、60、90min時差異顯著；中、高劑量組從15min至120min與溶劑對照組比心肌氧攝取率均非常顯著降低。結(jié)果見表13、圖3。
(3)對麻醉犬冠脈流量的影響3，4’，5-羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)各劑量組可增加冠脈流量；增加率與溶劑對照組同時間點相比，小劑量組從15min起差異顯著(P＜0.05)，30～90min差異非常顯著(P＜0.01)；中、高劑量組則從15～120min差異均非常顯著。結(jié)果見表14、圖4。
(4)對麻醉犬冠脈阻力的影響TSG注射液各劑量組5～90min時冠脈阻力無顯著性變化，中、高劑量組冠脈阻力降低率與溶劑對照組同時間點相比120min時差異非常顯著(P＜0.01)。結(jié)果見表15。
(5)對麻醉犬心輸出量、外周阻力的影響TSG可增加犬心輸出量，心輸出量變化率與溶劑對照組同時間點相比，中劑量組60、90min時，高劑量組15、30min時差異顯著(P＜0.05)，60、90min時差異非常顯著(P＜0.01)。陽性對照組對心輸出量無顯著影響。TSG對外周阻力無顯著影響。結(jié)果見表16、17及圖5。
6結(jié)論3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙可明顯增加麻醉犬冠脈流量，增加心輸出量，可明顯降低心肌氧攝取率，降低冠脈阻力；對心肌耗氧量、外周阻力無明顯影響。
表12 TSG iv對犬心肌耗氧量的影響(mL/min.100g-1，x±s，n＝6)指給藥前 給藥后組別標(biāo) 0min 5min 15min 30min60min 90min 120min溶劑對照 x±s 214.6±7.34 216.2±7.51 217.0±6.78 214.4±7.48 217.3±4.87 219.4±7.65 217.0±6.382ml/kg變化％ 0.73±2.15 1.15±3.68 -0.10±2.28 1.31±3.252.29±4.981.1±1.67異舒吉 x±s 212.8±16.2 209.6±10.5 212.9±12.9 202.0±11.8*96.0±5.52**199.3±6.67**200.5±16.00.4變化％ -1.46±9.67 0.10±7.99 -5.0±19.1*-7.83±1.67**-6.3±2.38**-5.6±6.4mg/kg/hTSG x±s 214.6±5.24 215.5±8.73 217.0±6.75 218.2±6.85 218.0±8.95 214.1±8.39 214.0±6.872.5mg/kg 變化％ 0.40±3.16 1.11±1.44 1.66±1.48 1.57±2.94-0.25±2.84 -0.3±1.9TSG x±s 211.4±4.05 210.4±6.48 211.5±9.81 210.2±8.65 212.9±7.2209.6±9.01 211.7±8.075mg/kg變化％ -0.52±1.59 0.05±4.29 -0.59±2.68 0.68±1.74-0.91±2.81 0.14±4.0TSG x±s 214.1±6.66 211.0±5.44 215.0±3.39 208.0±5.3 210.3±6.32 209.1±6.38 208.7±7.7810mg/kg 變化％ -1.45±1.13 0.44±2.01 -2.77±3.75 -1.75±3.51 -2.28±3.5-2.5±4.33*P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表13 TSG iv對犬心肌氧攝取率的影響(％，x±s，n＝6)給藥前 給藥后組別指標(biāo)0min5min 15min 30min 60min 90min 120min溶劑對照 x±s 79.1±3.53 79.8±3.46 81.3±4.0980.7±3.6082.7±3.6183.9±4.2584.7±4.062ml/kg 變化％ 0.9±2.292.75±1.961.96±1.584.57±3.046.04±3.357.01±2.70異舒吉 x±s 75.4±4.31 74.6±2.99 73.3±3.59*66.0±3.6963.6±3.92**65.5±4.03**67.3±9.07**0.4mg/kg/h 變化％ -1.02±2.44 -2.71±1.08**-12.4±1.93**-15.7±1.68**-13.2±2.22**-11.0±8.2**TSGx±s 76.9±5.50 77.4±5.38 75.7±5.5374.2±5.1173.1±6.1675.0±6.2477.5±5.232.5mg/kg變化％ 0.72±1.72 -1.55±1.97*-3.47±1.59 -4.99±3.01**-2.58±2.67**0.78±3.24TSGx±s 79.5±6.93 79.6±5.92 77.5±4.2274.8±5.6874.5±6.0575.1±6.4876.6±7.075mg/kg 變化％ 0.15±1.81 -2.26±3.95**-5.76±5.34**-6.24±4.39**-5.51±4.5**-3.65±4.29**TSGx±s 80.0±6.55 78.7±5.83 76.8±5.7071.3±5.2871.7±5.71*72.4±5.51**73.4±5.24*10mg/kg 變化％ -1.46±3.92 -3.89±1.18**-10.7±4.01**-10.3±5.25**-9.32±3.22**-8.1±3.21***P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表14 TSG對犬冠脈流量的影響 (ml/min，x±s，n＝6)給藥前 給藥后組別指標(biāo)0min5min 15min30min 60min 90min120min溶劑對照 x±s 42.2±5.81 42.2±5.81 41.5±5.56 41.2±5.7341.3±4.9640.8±5.84 40.0±4.932ml/kg 變化％ 0.0±0.0 -1.52±1.09 -2.39±1.19 -1.73±2.11 -3.2±1.81 -4.94±1.86異舒吉 x±s 43.5±7.26 43.8±6.80 44.8±7.65 43.3±7.1748.0±7.5147.3±7.55 46.8±7.890.4mg/kg/h 變化％ 0.96±1.91 3.02±1.51**9.08±2.45**10.6±2.96**8.96±2.96**7.72±4.14**TSGx±s 44.2±7.57 44.0±7.32 45.2±8.04 46.2±8.0147.0±7.8745.5±7.40 43.8±7.362.5mg/kg變化％ -0.31±0.76 2.16±1.27*4.51±1.17**6.52±1.80**3.15±1.46**-0.70±1.09TSGx±s 40.8±5.85 40.7±5.50 41.8±5.42 43.3±5.8245.0±6.0744.3±6.09 43.3±5.925mg/kg 變化％ -0.33±0.80 2.6±1.68**6.23±2.19**10.3±1.97**8.65±2.56**6.21±2.78**TSGx±s 44.0±5.83 44.0±6.03 45.7±5.28 47.8±6.4648.7±6.1947.8±6.71 47.5±6.8310mg/kg 變化％ -0.05±2.50 4.01±2.75**8.68±0.97**10.7±3.53**8.65±3.62**7.85±3.77***P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表15 TSG對犬冠脈阻力的影響(Kpa/ml/min，x±s，n＝6)給藥前 給藥后組別指標(biāo)0min 5min 15min 30min 60min 90min 120min溶劑對照 x±s 0.271±0.024 0.275±0.032 0.275±0.037 0.282±0.030 0.276±0.023 0.281±0.026 0.288±0.0202ml/kg 變化％1.36±7.111.24±9.293.99±4.30 2.06±2.82 3.68±1.61 6.31±3.52異舒吉 x±s 0.295±0.016 0.280±0.025 0.272±0.022 0.253±0.016 0.248±0.020 0.254±0.017 0.267±0.0270.4mg/kg/h 變化％-5.00±3.71 -7.91±3.24**-14.28±1.96**-15.97±2.66**-13.75±0.99**-9.71±4.80**TSGx±s 0.268±0.050 0.269±0.050 0.266±0.049 0.257±0.054 0.261±0.051 0.267±0.054 0.271±0.0552.5mg/kg變化％0.81±6.09-0.34±2.36 -3.82±9.83-2.48±8.17-0.24±10.72 1.19±6.55TSGx±s 0.299±0.029 0.308±0.028 0.305±0.029 0.299±0.026 0.288±0.026 0.287±0.028 0.287±0.0315mg/kg 變化％3.03±1.602.18±2.460.02±3.86 -3.62±3.63-4.03±2.13-3.99±3.34**TSGx±s 0.273±0.032 0.286±0.036 0.278±0.028 0.274±0.035 0.267±0.037 0.270±0.040 0.263±0.03810mg/kg 變化％4.63±3.071.79±3.250.21±1.44 -2.64±2.78-1.69±4.78-4.10±5.44***P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表16 TSG對犬心輸出量(CO)的影響(L/min，x±s，n＝6)給藥前給藥后組別指標(biāo)0min5min15min 30min 60min90min120min溶劑對照 x±s 1.09±0.12 1.11±0.12 1.11±0.12 1.12±0.12 1.11±0.14 1.11±0.12 1.11±0.112ml/kg 變化％ 1.88±0.96 2.38±2.08 2.65±1.45 1.59±1.82 2.49±0.82 2.33±3.46異舒吉 x±s 1.11±0.12 1.14±0.12 0.14±0.11 0.15±0.11 1.16±0.12 0.14±0.11 1.14±0.120.4mg/kg/h 變化％ 3.05±2.86 3.08±1.75 4.31±1.87 4.86±2.26 3.55±2.82 3.36±1.94TSGx±s 1.06±0.13 1.09±0.12 1.09±0.14 1.10±0.13 1.11±0.13 1.11±0.13 1.10±0.142.5mg/kg變化％ 2.50±2.42 1.97±1.55 3.88±3.48 4.41±1.40 4.40±1.64 3.23±2.57TSGx±s 1.09±0.14 1.13±0.12 1.13±0.13 1.15±0.14 1.16±0.14 1.16±0.13 1.14±0.135mg/kg 變化％ 3.58±2.00 3.47±0.97 5.25±2.62 6.05±2.06*5.98±2.02*4.86±2.88TSGx±s 1.08±0.15 1.13±0.13 1.14±0.14 1.16±0.13 1.18±0.14 1.18±0.15 1.15±0.1610mg/kg 變化％ 4.60±3.19 5.74±2.02*7.43±3.40*9.41±4.82**9.05±2.24**6.53±2.43**P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較表17 TSG對總外周阻力的影響(TPR，dyn·s·cm-5，x±s，n＝6)給藥前 給藥后組別指標(biāo)0min 5min 15min30min 60min 90min 120min溶劑對照 x±s 845.3±146.3 841.7±160.9 815.0±96.0 832.0±117.6 834.5±149.2 830.3±166.7 830.5±109.82ml/kg 變化％-0.50±7.08 -2.56±9.55 -1.07±5.41 -1.26±3.04-2.06±3.27-1.16±4.82異舒吉 x±s 924.4±109.9 860.7±116.3 848.7±73.6 827.7±99.6 818.7±107.2 837.9±87.9868.8±113.30.4mg/kg/h 變化％-6.88±5.39 -7.97±2.92 -10.35±0.76*-11.43±1.49**-9.19±3.65-6.05±1.79TSGx±s 888.8±200.9 873.5±210.3 888.7±208.8 869.1±249.3 890.2±240.3 877.6±225.1 868.6±221.82.5變化％-1.89±6.74 -0.10±4.21 -3.22±9.65 -0.56±7.52-1.52±9.42-2.58±7.26mg/kgTSGx±s 906.3±193.9 897.1±184.7 916.6±186.2 915.2±199.9 907.8±194.0 891.7±188.6 881.8±188.95mg/kg 變化％-0.82±2.72 1.31±2.04 0.90±1.200.20±1.19 -1.59±3.63-2.75±3.55TSGx±s 891.8±93.4 890.5±82.2 891.3±78.1 903.4±76.9 878.7±90.9872.9±98.6863.7±80.010變化％ 0.02±4.070.09±2.251.49±3.81 -1.42±3.68 -2.16±2.50-3.00±4.04mg/kg*P＜0.05，**P＜0.01與溶劑對照組比較實施例6 3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙iv對麻醉犬血流動力學(xué)的影響本實施例的目的在于試驗觀察3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙靜注給藥對正常麻醉犬心率、血壓、心臟收縮舒張功能等血流動力學(xué)指標(biāo)的影響。
受試藥物受試藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙溶液(批號03030302)，100mg/10ml；深圳海王藥業(yè)有限公司。使用時，以生理鹽水稀釋。
對照藥硝酸異山梨醇酯注射液(異舒吉注射液，批號479210)，德國許瓦茲大藥廠生產(chǎn)，珠海許瓦茲制藥有限公司分裝。
試驗動物健康雜種犬，體重10～14kg，雄雌兼用，第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
分組與給藥溶劑對照組、異舒吉對照組(0.4mg/kg/h)、3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙低(2.5mg/kg)、中(5mg/kg)、高(10mg/kg)劑量給藥組。異舒吉對照組連續(xù)靜脈滴注給藥，其它各組靜脈注射給藥。
試驗方法犬以戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥固定，行氣管插管；分離股動脈導(dǎo)管記錄動脈血壓，心導(dǎo)管自右側(cè)頸總動脈逆行插入左心室。兩導(dǎo)管連壓力傳感器，壓力信號經(jīng)載波放大之后連至Powerlab system 8s生理記錄儀(ML785/8S，AD Instruments，澳大利亞)。四肢皮下插入針形電極監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)二導(dǎo)聯(lián)心電圖。計算機(chart4.12軟件，ML785/8S，AD Instruments，澳大利亞)實時監(jiān)測并存儲數(shù)據(jù)。手術(shù)后穩(wěn)定30分鐘，記錄給藥前基礎(chǔ)值。陰性對照組靜脈推注溶劑對照2ml/kg，陽性對照組靜滴注0.4mg/kg/h，給藥組靜脈推注TSG溶液(SH-88AB可控靜脈注射推進(jìn)器，泉州市鯉中醫(yī)療電子儀器廠，于30min內(nèi)恒速滴注完畢)。記錄給藥后10、30、60、120min各項指標(biāo)值。
觀察指標(biāo)包括察心率(HR)、收縮壓(BPs)、舒張壓(BPd)、平均動脈壓(BPm)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張壓(LVDP)、左心室收縮壓最大變化速率(±dp/dtmax)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、心電圖。
試驗結(jié)果以x±s表示，用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析，作差異顯著性檢驗。
試驗結(jié)果結(jié)果顯示3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)2.5mg/kg、5mg/kg iv后，心率、血壓、左心室壓力、左心室收縮壓最大變化速率均有波動，但與給藥前比較無顯著性差異。TSG10mg/kg iv升高麻醉犬血壓，但與給藥前比無顯著性差異，其它各項指標(biāo)均無明顯的變化。結(jié)果見表18～22。
表18 溶劑2ml/kg iv對麻醉犬的血液動力學(xué)影響(x±s，n＝5)時間 0 10 30 60 120HR(次/分) 169.5±29.5 171.8±28.4 170.6±24.9 179.7±42.6 168.0±32.4BPs(KPa) 23.0±3.9 22.6±3.3 23.1±3.0 24.2±2.8 23.3±2.2BPm(KPa) 19.0±3.7 19.0±2.9 19.5±3.0 20.5±2.8 19.6±2.1BPd(KPa) 16.7±3.4 16.6±2.6 17.2±3.1 18.1±3.1 17.1±2.3LVSP(KPa) 23.5±4.5 24.4±3.8 24.7±3.8 23.1±5.8 23.5±6.5LVDP(KPa) 0.24±1.49 0.34±1.58 0.45±1.44 0.34±1.44 0.49±1.59LVEDP(KPa) 1.23±1.70 1.11±1.40 1.21±1.31 1.00±1.41 1.06±1.66+dp/dt max(Kpa/s) 801.1±284.0836.3±185.7731.4±172.3802.0±334.0847.1±266.5-dp/dt max(Kpa/s) 815.0±105.3733.1±201.3746.8±124.3759.4±207.7786.5±180.0表19 異舒吉0.4mg/kg/h iv對麻醉犬的血液動力學(xué)影響(x±s，n＝5)時間 0 10 30 60 120HR(次/分) 197.3±36.5 198.6±30.3 209.8±31.7 204.7±33.7 171.5±34.6BPs(KPa) 26.8±1.2 25.3±1.7 24.8±1.3*24.9±0.7*25.4±1.0BPm(KPa) 21.5±0.7 20.6±1.0 20.4±0.8 20.5±0.7 20.7±0.8BPd(KPa) 18.9±0.6 18.4±0.7 18.1±0.7 18.2±0.7 18.4±0.8LVSP(KPa) 24.1±0.9 22.9±1.3 23.0±0.4 23.0±0.8 22.7±0.6LVDP(KPa) -0.29±0.42 -0.37±0.39 -0.17±0.34 -0.42±0.26 -0.47±0.21LVEDP(KPa) 0.51±0.13 0.58±0.20 0.63±0.16 0.39±0.21 0.41±0.08+dp/dt max(Kpa/s) 1081.0±334.0 1047.5±266.3 1123.9±225.3 1124.6±228.4 972.5±925.8-dp/dt max(Kpa/s) 816.1±121.2786.5±128.2718.2±103.5751.1±153.7741.9±102.4表20 TSG 2.5mg/kg iv對麻醉犬的血液動力學(xué)影響(x±s，n＝5)時間 0 10 30 60 120HR(次/分) 163.7±21.1 160.4±18.4 161.7±18.0 171.1±18.8 170.5±16.1BPs(KPa) 25.3±3.0 24.5±2.0 24.7±1.3 25.5±1.623.7±3.3BPm(KPa) 21.1±2.0 20.7±2.1 20.8±1.7 21.6±2.020.2±2.3BPd(KPa) 18.5±1.7 18.3±2.3 18.5±2.2 19.1±2.518.1±1.8LVSP(KPa) 24.9±4.0 25.2±4.2 25.7±3.8 26.5±2.526.7±2.3LVDP(KPa) 0.39±2.20 0.45±2.40 0.28±2.40 0.26±2.35 0.50±2.06LVEDP(KPa) 1.14±2.18 1.00±2.33 1.11±2.50 0.78±2.37 1.09±2.16+dp/dt max(Kpa/s) 853.1±321.1829.1±308.3869.6±235.9993.9±206.2 957.9±190.0-dp/dt max(Kpa/s) 772.0±201.0777.3±241.8873.9±236.8905.9±2077.8852.5±159.6
表21 TSG 5mg/kg iv對麻醉犬的血液動力學(xué)影響(x±s，n＝5)時間0 15 30 60 120HR(次/分) 177.2±35.5171.0±35.6170.0±35.5178.0±29.5170.2±37.1BPs(KPa)25.4±6.4 25.4±5.8 26.1±5.3 26.6±4.1 25.0±5.0BPm(KPa)21.1±4.7 21.1±4.7 21.7±4.2 22.1±3.3 21.0±4.4BPd(KPa)18.9±4.2 18.7±4.4 19.2±4.0 19.8±3.3 18.8±4.4LVSP(KPa) 24.1±4.4 24.3±4.6 24.6±4.6 25.6±3.0 25.1±5.2LVDP(KPa) 0.31±1.31 -0.09±2.030.18±1.64 0.09±1.29 0.27±1.50LVEDP(KPa) 1.05±1.34 1.08±1.62 1.19±1.76 0.99±1.19 0.98±1.42+dp/dt max(Kpa/s) 822.6±353.8 793.8±299.0 855.5±296.5 936.1±199.9 921.4±327.1-dp/dt max(Kpa/s) 866.2±350.7 812.2±308.9 912.3±318.8 891.5±261.8 872.0±291.7表22 TSG 10mg/kg iv對麻醉犬的血液動力學(xué)影響(x±s，n＝5)時間 0 10 30 60 120HR(次/分) 212.5±31.3 209.7±33.4 210.2±33.8 207.1±38.1 205.6±50.2BPs(KPa) 28.5±7.5 32.4±8.2 33.2±8.5 33.6±5.5 29.0±4.8BPm(KPa) 22.5±4.8 24.5±5.9 25.1±5.9 24.4±5.1 22.7±3.0BPd(KPa) 19.6±3.7 21.0±5.1 21.4±5.5 20.6±4.8 20.2±3.0LVSP(KPa) 30.1±5.9 32.4±6.3 32.4±6.8 31.7±5.5 29.5±2.7LVDP(KPa) -1.18±1.71 -1.30±2.12 -1.25±2.47 -1.87±2.00 -1.04±2.11LVEDP(KPa) 0.99±0.60 0.93±0.50 0.78±0.43 0.63±0.44 1.69±2.78+dp/dt max(Kpa/s) 1455.5±637.7 1646.2±807.8 1623.9±729.5 1518.5±708.1 1266.6±334.8-dp/dt max(Kpa/s) 1164.1±488.8 1200.6±447.6 1120.4±357.8 1189.6±461.6 1068.5±208.6實施例7 口服3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙對大鼠慢性心肌缺血的治療作用本實施例的目的在于觀察3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)灌胃給藥對大鼠慢性心肌缺血的治療作用。
試驗藥物3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙顆粒劑(批號031011)，深圳海王藥業(yè)有限公司制備。給藥時用0.8％CMC配制濃度為2和4mg/ml的混懸液。
試驗動物SD大鼠，雄性，體重250～300克。第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究中心提供。
實驗方法(1)動物手術(shù)和冠狀動脈結(jié)扎雄性SD大鼠60只，分兩組，假手術(shù)組15只，手術(shù)組45只。烏拉坦(100mg/kg ip)麻醉，仰位固定。心電圖機(ECG-6851C，上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖。氣管插管接人工呼吸機。皮膚消毒后，胸左側(cè)第4肋間開胸，暴露心臟，于左冠狀動脈前降支根部3～4mm處結(jié)扎。心電圖同步監(jiān)測，以心電圖S-T段明顯抬高或壓低、T波高聳作為冠脈結(jié)扎成功指標(biāo)。結(jié)扎后，關(guān)閉胸腔，抽出胸腔內(nèi)氣體。術(shù)后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后1周內(nèi)肌注青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組行開胸手術(shù)，但不結(jié)扎冠脈。
(2)分組與給藥 術(shù)后5周，假手術(shù)組存活動物11只。手術(shù)組存活動物24只。將手術(shù)組再隨機分為兩組，即缺血對照組、3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙20mg/kg給藥組。第6周開始給組動物連續(xù)給藥6周，每周給藥6天，周日停藥。給藥容量為5ml/kg。
(3)療效檢測 術(shù)后第12周檢測。末次給藥30min后，大鼠仰臥固定，行氣管插管；分離股動脈導(dǎo)管記錄動脈血壓，心導(dǎo)管自右側(cè)頸總動脈逆行插入左心室。兩導(dǎo)管連壓力傳感器，壓力信號經(jīng)載波放大之后連至Powerlab system 8s生理記錄儀(ML785/8S，AD Instruments，澳大利亞)記錄。四肢皮下插入針形電極監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)二導(dǎo)聯(lián)心電圖。計算機(chart4.12軟件，ML785/8S，AD Instruments，澳大利亞)實時監(jiān)測并存儲數(shù)據(jù)。手術(shù)穩(wěn)定30min后，觀察心率(HR)、平均動脈壓(BPm)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張壓(LVDP)、左心室收縮壓最大變化速率(+dp/dtmax)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、心電圖。1小時后，處死動物，摘取左心室，將左心切成～5mm厚的心肌片，用生理鹽水洗凈，置37℃0.025％氯化硝基四氮唑藍(lán)(Nitro-tetrazolium Blue chloride，N-BT，瑞士Fluka化學(xué)試劑公司生產(chǎn)NBT)液染色。。正常心肌染為暗藍(lán)色，梗塞區(qū)心肌則不著色為淺黃色。在解剖鏡下分離梗塞區(qū)，分別稱重，以梗塞區(qū)心肌重量占心肌重量的百分比(％)作為衡量梗塞范圍的指標(biāo)。
實驗結(jié)果以x±s表示，采用非配對t檢驗法統(tǒng)計，P＜0.05時認(rèn)為具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。
試驗結(jié)果假手術(shù)組、缺血對照組動物與給藥組動物之間心率無顯著差異；缺血對照組動物的平均動脈壓叫假手術(shù)降低，而TSG給藥組動物血壓恢復(fù)假手術(shù)組水平。缺血組與給藥組動物的心電圖中的ST段均出現(xiàn)不同程度的抬高或壓底，說明存在心肌缺血。缺血對照組動物L(fēng)VDP較對照組升高，LVESP、±dp/dtmax降低；而給藥組的相應(yīng)血流動力學(xué)指標(biāo)均有所改善，且缺血梗死組織顯著減少。試驗結(jié)果表明，3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)灌胃給藥對大鼠慢性心肌缺血具有顯著的治療作用。試驗結(jié)果見表23。
表23 TSG灌胃給藥對大鼠慢性心肌缺血的治療作用(x±s)假手術(shù)組 缺血對照組 TSG給藥組n1112 12HR(次/min) 364±32 383±52 354±45△BP(KPa) 19.7±1.2 17.5±1.3*19.2±1.8△LVSP(KPa)20.6±1.8 17.7±1.6*19.8±2.1△LVEDP(KPa) 0.68±0.161.09±0.25*0.82±0.19△+dp/dt max(Kpa/s)1456±223 1106±164*1389±142△梗塞區(qū)比例(％) --14.5±2.35.9±1.2△△*P＜0.05 vs假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs缺血對照組實施例8 小鼠靜脈注射3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙的急性毒性試驗本實施例的目的在于觀察小鼠靜脈注射3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙后的急性毒性反應(yīng)。
受試藥物 3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙溶液(TSG溶液，批號03030302)，100mg/10ml；深圳海王藥業(yè)有限公司。使用時，以生理鹽水稀釋。
試驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，由第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
給藥方式 本試驗采用等容量不等濃度方式靜脈注射給藥。注射體積為20ml/kg。
試驗方法 選擇健康昆明小鼠40只，隨機分為4組，劑量分別為300mg/kg、425mg/kg、600mg/kg及850mg/kg，一次性尾靜脈注射給藥。給藥后連續(xù)觀察4小時，此后每天上午、下午各觀察一次，連續(xù)7天。記錄小鼠中毒表現(xiàn)及死亡時間，Bliss法計算LD50及95％的可信限。
試驗結(jié)果 小鼠一次性尾靜脈注射給藥后可出現(xiàn)身體搖晃、間或出現(xiàn)燥動、抽搐等反應(yīng)，癥狀隨劑量增加而加重。動物死亡發(fā)生在注射給藥后5分鐘后至1天內(nèi)。未死亡動物2天后恢復(fù)正常，其后生長良好，一般活動及攝食正常。所有死亡動物大體解剖主要臟器未見異常。LD50及95％的可信限見表1。
表24 小鼠靜脈注射TSG的急性毒性實驗結(jié)果(n＝10)劑量(mg/kg) 對數(shù)劑量(x) 死亡數(shù)(只) 死亡率(％) LD50及95％的可信限(g/kg)360 2.5560 0LD50＝648.94510 2.7081 1095％的可信限為720 2.8577 70571.18～726.701020 3.00910 100試驗結(jié)論 小鼠靜脈注射TSG的LD50為648.94mg/kg，其95％的可信限為571.18mg/kg～726.70mg/kg。
實施例9 犬單劑量靜注3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙的藥代動力學(xué)本實施例的目的在于觀察單劑量3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)iv在犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)。
受試藥品3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙溶液(批號03030302)，100mg/10ml；深圳海王藥業(yè)有限公司。使用時，以生理鹽水稀釋。
實驗動物成年、健康Beagle犬，雌雄兼用，體重10.8～10.5Kg；由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
實驗方法試驗設(shè)置10mg/Kg、20mg/Kg、30mg/Kg三個劑量組進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。每一個劑量組選用5條成年、健康Beagle犬。受試Beagle犬禁食過夜(禁食14小時)后，于早上8:00靜脈注射給藥TSG 10mg/Kg、20mg/Kg、30mg/Kg，給藥容量0.5ml/Kg，在狗一側(cè)前肢5min內(nèi)緩緩?fù)谱⑷胙?。靜注給藥后3小時方可給受試Beagle犬進(jìn)食。試驗中，于給藥前及給藥后0、5、10、20、40、60、90、120、180、240、300、360和480min在Beagle犬另一側(cè)前肢靜脈取血3ml，置肝素化試管中，離心，分取1.0ml血漿。按Beagle犬血漿樣品預(yù)處理方法操作(其中單劑量靜注給藥TSG后高濃度血漿樣品需經(jīng)空白Beagle犬血漿稀釋)，測定血漿中TSG濃度。
數(shù)據(jù)分析采用非房室模型法分析(統(tǒng)計矩法)，相應(yīng)的參數(shù)估算公式如下AUC0～τ＝∑(Ci+Ci-1)×(ti-ti-1)/2AUC0～∞＝∑(Ci+Ci-1)×(ti-ti-1)/2+Cn/λAUMC0～∞＝∑(Citi+Ci-1ti-1)×(ti-ti-1)/2+Cn(1/λ2+tn/λ)MRT＝AUMC0～∞/AUC0～∞Cl/F＝D/AUC0～∞t1/2＝0.693/λVss＝D×AUMC0～∞/(AUC0～∞)2式中λ為藥時曲線末端相消除速率常數(shù)，tn和Cn分別為最后取血點時間和血漿藥物濃度。藥代動力學(xué)參數(shù)tmax、Cmax取相應(yīng)血漿樣品實測值。
實驗結(jié)果采用高效液相色譜法分別測定了5條成年、健康Beagle犬靜注給藥TSG 10mg/Kg、20mg/Kg、30mg/Kg三個劑量組后不同時間的體內(nèi)TSG血藥濃度，其中血藥濃度-時間數(shù)據(jù)見表25。圖6、圖7和圖8分別表示Beagle犬靜注給藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)10mg/Kg、20mg/Kg、30mg/Kg后的平均血藥濃度-時間曲線。采用非房室模型法估算的5條成年、健康Beagle犬單劑量靜注給藥TSG 10mg/Kg、20mg/Kg、30mg/Kg三個劑量組后的藥代動力學(xué)參數(shù)列于表26。
試驗結(jié)果表明，健康Beagle犬靜注給藥3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)后，TSG的體內(nèi)過程符合二室模型，其藥代動力學(xué)參數(shù)藥時曲線末端相消除半衰期(t1/2)分別為167.87±170.90min、151.05±57.32min、373.09±372.98min。10mg/Kg、20mg/Kg、30mg/Kg三個劑量組的AUCC0～∞分別為315.42±60.82μg·min/ml、745.75±175.84μg·min/ml和1552.71±227.28μg·min/ml，AUC與給藥劑量基本呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.985。
表25 單劑量靜注給藥TSG后不同時間的血藥濃度(μg/ml，x±s)時間(min)劑量0 5 10 20406090120 180 240 300 360 48022.35 6.84 3.88 2.17 1.45 0.93 0.52 0.35 0.30 0.24 0.17 0.10 0.0210± ±±± ± ± ± ± ± ± ± ±m(xù)g/Kg4.92 1.89 0.66 1.19 0.52 0.55 0.20 0.10 0.06 0.04 0.06 0.04 0.0447.68 21.82 13.07 8.25 3.48 2.36 0.84 0.68 0.46 0.35 0.29 0.20 0.0720± ± ± ± ± ± ± ± ±± ± ± ±m(xù)g/Kg6.51 4.59 4.17 4.90 1.23 1.12 0.60 0.40 0.11 0.13 0.08 0.05 0.06100.72 49.29 26.10 15.21 8.02 5.01 1.67 1.08 0.62 0.50 0.33 0.29 0.2130± ± ± ± ± ± ± ± ±± ± ± ±m(xù)g/Kg5.85 19.52 11.10 7.11 2.95 1.63 0.66 0.54 0.30 0.22 0.05 0.05 0.02表26 Beagle犬單劑量靜注給藥TSG的藥代動力學(xué)參數(shù)(x±s)t1/2MRT Cl AUC0～480AUC0～∞Vss劑量(min)(min)(L/min)(μg·min/ml) (μg·min/ml)(L)167.87 140.06 0.03 283.05 315.42 4.2110± ±±±±±m(xù)g/Kg170.90 124.87 0.01 49.85 60.823.06151.05 78.080.03 718.32 745.75 2.2420 ± ± ± ±±±m(xù)g/Kg57.3212.240.01 179.10 175.84 0.78373.09 184.08 0.02 1432.171552.71 4.2530± ± ± ±±±m(xù)g/Kg372.98 240.08 0.00 349.97 227.28 6.35
實施例10 實施例1～8之3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)試驗樣品制備本發(fā)明中的3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙(TSG)采用申請?zhí)枮?00310112538.3的中國專利申請“虎杖苷和白藜蘆醇的新制備方法”中的方法制備所得。
(1)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙顆粒劑(實施例1、4、7所用樣品)制備處方3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙 20g淀粉40g微晶纖維素(PH301) 40g顆粒劑重量 100g制備3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙與乳糖、微晶纖維素(PH301)混合直至形成均一的混合物。加入適量的乙醇-水并將粉末制粒，干燥后，即得。
(2)3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙溶液(實施例2、3、5、6、8、9所用樣品)制備處方3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙 100g無水乙醇8LpH9的NaOH水溶液加至 10L分裝成 1000支制備將40g3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙加熱溶解于8L無水乙醇中，加入pH8.5的NaOH水溶液至總體積為10L，φ0.2μm微孔濾膜過濾后，分裝到1000支安瓿瓶或西林瓶中。
權(quán)利要求
1.3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙在制備治療或預(yù)防缺血性心臟病藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述缺血性心臟病為無癥狀性心肌缺血、心絞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭及瘁死。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙的給藥劑量范圍為20mg-300mg/60kg體重/次。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述3，4’，5-三羥基芪-3-β-D-葡萄糖甙的給藥劑量范圍為50mg-200mg/60kg體重/次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙以口服制劑或靜脈用藥制劑的形式使用。
6.含有3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙的藥物組合物在制備治療或預(yù)防缺血性心臟病藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述藥物組合物含有20～300mg的3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙以及藥學(xué)上可接受的藥用輔料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述藥物組合物含有50～200mg的3，4’，5-三羥基茋-3-β-D-葡萄糖甙以及藥學(xué)上可接受的藥用輔料。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所以藥物組合物的劑型為口服制劑或靜脈用藥制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物3，4’，5－三羥基茋－3－β－D－葡萄糖甙在藥物制備中的新用途，特別是該化合物作為活性成分在治療和/或預(yù)防缺血性心臟病的藥用組合物中的用途，該藥用組合物通過靜脈注射或口服給藥缺血性心肌及心功能損傷有顯著的治療或預(yù)防作用。
文檔編號A61P9/00GK1650875SQ200410052470
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月1日
發(fā)明者趙金華, 徐江平, 康暉, 王兵, 李靖, 馮漢林, 于琳 申請人:深圳海王藥業(yè)有限公司