專利名稱：一種新的人分泌蛋白hZG16的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新的分泌蛋白hZG16蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
分泌蛋白是一類功能非常重要的蛋白，對(duì)多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。人體中分泌蛋白占人類蛋白質(zhì)組的十分之一，它們參與了信號(hào)途徑、血液凝固、免疫防御、癌癥發(fā)生等多種過(guò)程，如消化酶、胞外基質(zhì)與血漿中的很多主要因子，以及激素、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，并已在實(shí)際上得到了廣泛的應(yīng)用，如生長(zhǎng)激素、干擾素和白細(xì)胞介素等分泌蛋白是由信號(hào)肽(signal peptide)介導(dǎo)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后分泌到細(xì)胞外。蛋白質(zhì)分子中的信號(hào)肽研究開(kāi)始于20世紀(jì)60年代，這方面的工作是在研究分泌蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，當(dāng)時(shí)的研究旨在了解，在核糖體上合成的新生肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)何種途徑被分泌到細(xì)胞外的。德裔美國(guó)科學(xué)家布洛貝爾(G.Blobel)，因?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子中信號(hào)肽的開(kāi)創(chuàng)性研究，獲得了1999年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
分泌蛋白區(qū)別于其他胞質(zhì)蛋白的唯一共同的特征就是氨基末端信號(hào)肽序列。信號(hào)肽在各個(gè)蛋白中都不相同，但有一些較類似的性質(zhì)。起始的甲硫氨酸后是一些多為親水的帶正電荷的殘基，該區(qū)為n區(qū)，然后是7-15個(gè)殘基的疏水區(qū)h區(qū)，該區(qū)富含亮氨酸、丙氨酸和纈氨酸，最后的c區(qū)包含信號(hào)肽蛋白酶的剪切位點(diǎn)。在剪切位點(diǎn)的-1和-3多為傾向?yàn)楸彼峄蚱渌麕Ф虃?cè)鏈的氨基酸，而在-4和-6位則為有助于剪切的脯氨酸。因此針對(duì)信號(hào)肽發(fā)展了許多遺傳算法來(lái)進(jìn)行信號(hào)肽的分析預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)信號(hào)肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域近年來(lái)得到迅猛發(fā)展，這極大地歸功于機(jī)器學(xué)習(xí)方法的改善和更多的序列信息來(lái)訓(xùn)練這些算法。這其中比較有效的模型就是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱藏的馬科夫模型。
SignalP是目前最有效的預(yù)測(cè)信號(hào)肽和剪切位點(diǎn)的方法。該軟件綜合了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱藏的馬科夫模型，前者預(yù)測(cè)是否含信號(hào)肽蛋白，后者預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)。通過(guò)大量的序列樣本進(jìn)行訓(xùn)練(非同源的原核生物蛋白266個(gè)革蘭氏陰性菌序列，141個(gè)革蘭氏陽(yáng)性菌序列；真核生物蛋白1011個(gè)非同源蛋白序列)，得到較高的準(zhǔn)確性，真核生物準(zhǔn)確性為78％，原核生物為89％。
分泌蛋白約占人類蛋白質(zhì)組的十分之一，是一類功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。發(fā)現(xiàn)與研究新分泌蛋白是目前功能基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
用SignalP2.0對(duì)人蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)合pSORT分析，初步確定候選基因。RT-PCR獲得目的基因，構(gòu)建到真核表達(dá)載體中使其表達(dá)，WESTERN BLOT驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果，確定基因是否表達(dá)分泌蛋白。
通過(guò)上述生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合的方法，獲得了1個(gè)新分泌蛋白hZG16。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的人分泌蛋白hZG16；本發(fā)明的另一目的在于提供了上述新的人分泌蛋白hZG16的制備方法；本發(fā)明的再一目的在于提供了與上述新的人分泌蛋白hZG16特異結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明公開(kāi)了一種分離的人分泌蛋白hZG16，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。優(yōu)選的，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備上述的分離的人分泌蛋白hZ616的方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hZG16活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hZG16蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸7-510位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hZG16蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hZG16蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hZG16蛋白活性的多肽。
優(yōu)選的，上述步驟(a)中，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸7-510位的核苷酸。
本發(fā)明還公開(kāi)了能與權(quán)利要求1所述的人分泌蛋白hZG16多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的分泌蛋白hZG16是一種功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。該分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的SignalP2.0軟件分析SignalP-NN結(jié)果圖像；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的SignalP2.0軟件分析SignalP-HMM結(jié)果圖像；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的hZG16基因及蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的序列同源性比對(duì)結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的hZG16基因進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例2的hZG16基因瓊脂糖凝膠電泳圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例3搜索genecard網(wǎng)站得到的hZG16芯片雜交的表達(dá)譜；圖8是本發(fā)明實(shí)施例3搜索Gene Expression Atlas得到的hZG16在Human U95A芯片的原始雜交結(jié)果圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例3的人類多組織RNA印跡膜對(duì)hZG16基因的組織分布結(jié)果圖；圖10是本發(fā)明實(shí)施例3的RT-PCR與Northern印跡分析hZG16基因在肝癌及癌旁的表達(dá)變化結(jié)果圖，N癌旁，C肝癌；圖11是本發(fā)明實(shí)施例4的免疫熒光顯示hZG16蛋白在細(xì)胞中的分布圖像圖12是本發(fā)明實(shí)施例4的熒光共定位分析結(jié)果圖；圖13是本發(fā)明實(shí)施例5的菌落的PCR鑒定結(jié)果圖；圖14是本發(fā)明實(shí)施例5的蛋白電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1人hZG16基因生物信息學(xué)分析序列相似性比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析，采用軟件Alignment，GeneDoc，Treeview。信號(hào)肽、穿膜區(qū)域預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位分析分別采用網(wǎng)上的共享web軟件SignalP http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/，SOSUIhttp//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html及PSORT http//psort.nibb.ac.jp/。
功能結(jié)構(gòu)域和基元(motif)預(yù)測(cè)，采用了PROSITEhttp//us.expasy.org/prosite/，InterPro Scan http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html.
ProfileScan，http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN以及NCBI的CDART(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)，http//www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml。
修飾位點(diǎn)分析采用了http//au.expasy.org/tools/。
結(jié)果1.hZG16基因(NM 152338)在基因組上定位在16p11.2，成熟mRNA共632堿基，翻譯后蛋白由167個(gè)氨基酸組成，分子量為18177Da，核酸及蛋白序列見(jiàn)SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2。
2.利用SignalP2.0軟件分析該蛋白疏水性，根據(jù)結(jié)果(圖1和圖2)，該蛋白N端序列為信號(hào)肽的可能性為100％。信號(hào)肽剪切位點(diǎn)最可能是18位和19之間。軟件計(jì)算結(jié)果如下SignalP-NN result＞length＝70# Measure Position Value Cutoff signal peptide？max. C 19 0.709 0.33 YESmax. Y 19 0.739 0.32 YESmax. S 5 0.972 0.82 YESmean S 1-180.873 0.47 YES# Most likely cleavage site between pos.18 and 19GNA-IQSignalP-HMM result＞#PredictionSignal peptideSignal peptide probability1.000Signal anchor probability0.000Max cleavage site probability0.387 between pos.16 and 173.從SOSUIsignal Result的結(jié)果來(lái)看，hZG16的N端有一段長(zhǎng)18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽段，沒(méi)有穿膜區(qū)域。PSORT軟件分析預(yù)測(cè)hZG16的分布為66.7％位于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)，22.2％位于液泡，11.1％位于線粒體4.對(duì)hZG16基因成熟mRNA(632bp)BLAST人基因組序列得到基因在基因組上的分布，如圖3A所示，豎線代表基因的外顯子，共有3個(gè)，共跨越1,258bp。hZG16蛋白結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(圖3B)，N端1-19aa為信號(hào)肽區(qū)域，36-159aa為Jacalin-like lectin結(jié)構(gòu)域。
5.以hZG16的蛋白序列在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性搜索，得到97條有同源性的基因，選取前6個(gè)同源性較高的基因，見(jiàn)表1，進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖4。采用Alignment與GeneDoc軟件處理。
表1

對(duì)進(jìn)行序列比對(duì)的7條基因進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。
實(shí)施例2人hZG16基因的克隆和pcDNA3.1A-hZG16真核載體的構(gòu)建1.設(shè)計(jì)引物hZG16 pCDNA3.1A-FCCGGATCCATGTTGACAGTCGCTCTCCT(SEQ ID NO.3)(含BamH1限制性內(nèi)切酶切點(diǎn))hZG16 pCDA3.1A-RCCCGGTACCGCATCTGCTGCAGCTAGTG(SEQ ID NO.4)(含Kpn1限制性內(nèi)切酶切點(diǎn))2.PCR反應(yīng)

從自制的人肝cDNA庫(kù)中PCR獲得HZG16的全長(zhǎng)ORF片段。2％瓊脂糖凝膠電泳圖如圖6。
PCR條件94℃4min；94℃40s，60℃45s，72℃50min，35cycle；72℃7min.
3.BamH1 & Kpn1雙酶切PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒

37℃酶切5hr，70℃熱失活15min4.連接

16℃連接16hr。
5.電轉(zhuǎn)化以參數(shù)電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，將1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，37℃，250rpm于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)1hr，涂平板6.菌落PCR鑒定在長(zhǎng)有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個(gè)菌落作PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系與上述PCR的體系相同。
7.質(zhì)粒提取將經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-HZG16，采用VIOGENE公司的PlasmidDNA Miniprep System(Mini-M)試劑盒抽提。所得質(zhì)粒經(jīng)核酸測(cè)序驗(yàn)證插入片段正確(由申友公司完成)。
實(shí)施例3人hZG16基因的組織表達(dá)譜1電子Northern表達(dá)譜搜索genecard網(wǎng)站http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/，得到hZG16芯片雜交的表達(dá)譜與電子Northern表達(dá)譜，見(jiàn)圖7。
搜索SOURCEhttp//genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch，得到unigene的表達(dá)信息。結(jié)果表明hZG16是結(jié)腸特異表達(dá)基因搜索Gene Expression Atlashttp//expression.gnf.org/cgi-bin/index.cgi，得到hZG16在Human U95A芯片的原始雜交結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)圖8。
2Northern印跡1.材料和試劑隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(random primer DNA labeling kit)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)人類多組織RNA印跡膜和快速雜交液(ExpressHyb hybridization solution)均購(gòu)自Clontech公司20×SSC(PH＝7.0)NaCl 175.32g檸檬酸鈉88.23g，同位素P32購(gòu)自PE公司。
洗膜溶液wash solution I2×SSC；0.05％SDS；加水到1000ml20×SSC--------100ml20％SDS--------2.5ml加水到1000ml洗膜溶液wash solution II0.1×SSC；0.1％SDS；加水到1000ml20×SSC--------5ml20％SDS--------5ml加水到1000ml2.方法步驟(1)雜交膜的預(yù)處理(第一次所用的膜不需要這樣的高溫去探針處理，第二、三次再用同一塊膜時(shí)才用此法，第一次僅用膜于2×SSC浸泡10分鐘)在0.5％SDS溶液中處理印跡膜100℃10min，從加熱爐上取下來(lái)，室溫冷卻10min。
(2)預(yù)雜交(prehybridization)68℃預(yù)熱ExpressHyb solution。將膜放入2×SSC中，浸泡10分鐘左右。把濕潤(rùn)好的膜貼雜交管管壁輕輕移入，避免產(chǎn)生氣泡。變性sperm DNA(100℃水浴5min，立即放入冰中，5min)。5ml ExpressHyb+50μl sperm DNA于15ml管子中充分混勻，然后再倒入雜交管中。雜交爐中，68℃，10rpm/min，大于2小時(shí)。
(3)標(biāo)記探針(labeling primer)探針是cDNA，PCR，切膠，純化cDNA片斷，形成模板。隨機(jī)引物標(biāo)記采用標(biāo)記試劑盒。

加EDTA終止反應(yīng)(終濃度30mM)室溫，1min。附0.5M EDTA用量在1.5-3.0μl。
(4)純化探針，用G25(或G50)柱子，原理凝膠過(guò)濾柱子平衡混勻柱子中的平衡液，掰掉柱子的封閉端，將柱子置于一新的離心管中，3000rpm，2min。倒掉平衡液在室內(nèi)的自來(lái)水池中，3000rpm，再離心1min。柱子置于一新的離心管中，加入標(biāo)記好的探針液，3000rpm，2min，收集探針于1.5ml離心管中。從而去除掉未標(biāo)記的[α-32P]dCTP，小片斷(小于300bp)，留下較大片斷約500bp。
(5)雜交純化后的探針應(yīng)立即變性100℃，5分鐘，立即冰上5分鐘。把收集后的探針(25μl左右)加入到雜交管中的預(yù)雜交液中，切記勿將探針直接加到膜上，輕輕混勻，把雜交管再移入雜交爐中。68℃，2hours，10rpm.
(6)洗膜低嚴(yán)緊度洗膜室溫，SDS 0.05％(wash solution I)A把雜交液倒入廢液缸中，用wash solution I洗膜1次(3×50ml)，全部倒入廢液缸中，再快速洗二次，廢液均倒入廢液缸中。
B室溫，40min，3×50ml，continuous agitation，洗液用自來(lái)水沖盡。
高嚴(yán)緊度洗膜50℃，SDS 0.1％(wash solution II)洗液用自來(lái)水沖盡。50℃，每次40min，于搖床中洗，換液5次。注意在洗膜的過(guò)程中，要經(jīng)常測(cè)一測(cè)同位素含量，只要?jiǎng)┝窟_(dá)到300左右或以下，就可以停止洗膜。
(6)封膜，壓片(保證膜在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都是濕潤(rùn)的)，用保鮮膜封膜，盡量無(wú)氣泡，以保證膜處在濕潤(rùn)狀態(tài)。膜放于磷屏上。(注意磷屏要事先消磁半小時(shí))，壓12小時(shí)左右即可。電腦掃描信號(hào)，使用的程序是arraytool-MCD-scan control。
采用Clontech公司的人類多組織RNA印跡膜對(duì)該基因的組織分布進(jìn)行研究。該印跡膜含12種組織，腦、心、骨骼肌、結(jié)腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤(pán)、肺、外周血白細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)圖9。
綜合以上表達(dá)譜分析，認(rèn)為hZG16基因主要分布在人的肝臟及結(jié)腸組織中。通過(guò)RT-PCR與Northern印跡的方法進(jìn)一步分析了hZG16基因在肝癌及癌旁的表達(dá)變化，結(jié)果見(jiàn)圖10，N癌旁，C肝癌。
RT-PCR與Northern印跡結(jié)果均表明hZG16基因在肝癌中的表達(dá)下調(diào)41例肝癌樣本中有31例下調(diào)，1例上調(diào)，9例變化不明顯。
實(shí)施例41hZG16蛋白的亞細(xì)胞定位1.1原理及目的將帶有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，外源基因以融合或非融合的形式在細(xì)胞中表達(dá)，用針對(duì)融合或非融合蛋白的抗體處理細(xì)胞，再用FITC標(biāo)記的二抗處理，隨后在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)結(jié)合有熒光二抗的部分會(huì)在單色光的激發(fā)下，發(fā)出熒光，從而可以判斷表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的分布。
1.2材料及試劑COS-7細(xì)胞或Hela細(xì)胞，100×PLA(多聚賴氨酸)一抗Tag抗體(mouse-anti-human c-myc 9E10)或特異抗體，1∶50-1∶200稀釋(PBS/5％BSA)，二抗FITC-goat-anti-mouse IgG，驢抗兔CyTM3IgG，1∶50稀釋(PBS/5％BSA)PBS(pH7.4)、BSA、Tween-20、Tritonx-100、8％PFA(多聚甲醛)
無(wú)色指甲油、固定液(mounting solution sigma)35mm dish、蓋玻片(corninglabware&equipment 22mm seq.)蠟筆(pappen polysciences co.)1.3方法步驟(1)鋪細(xì)胞蓋玻片可浸在酒精中，用時(shí)在酒精燈上燒去乙醇，鋪在35mm培養(yǎng)皿中，加入2ml 1×PLL(H2O)稀釋，(可以先在每個(gè)dish中加入無(wú)菌水980ul，再加入20ul 100×PLA)，放37℃培養(yǎng)箱，30mim；35mm培養(yǎng)皿用無(wú)菌水洗2次；接種細(xì)胞，對(duì)于COS-7，接種密度為1.0-1.5×105/35mm培養(yǎng)皿；37℃，5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)轉(zhuǎn)染同3.1.3(3)熒光抗體染色轉(zhuǎn)染48-60h后，取出培養(yǎng)皿，置冰上5min，用PBS(pH7.4)洗2次，每次2ml；加入2％PFA(w/v)/0.1％Triton-X-100/PBS 1ml，冰上30min固定；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；Blocking，PBS/5％BSA，1ml/dish，室溫，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2(可省略)；吸去dish中的洗滌液，用鑷子取出蓋玻片，有細(xì)胞的一面朝上，放在吸水紙上；用蠟筆沿蓋玻片的四周劃一個(gè)方框，并沿玻片的中心線劃一條線，使左右兩半大小相當(dāng)；擦干原dish，將蓋玻片放回，玻片的一半加40-50ul PBS/5％BSA，另一半加一抗稀釋液；置濕盒內(nèi)，4℃，過(guò)夜，或4℃，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，lml/dish，5min×2；玻片的兩半都加二抗稀釋液，4℃，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；取干凈的載玻片一塊，作上標(biāo)記，滴一滴mounting solution，約15-20ul；用鑷子取出蓋玻片，邊緣搭在紙巾上吸去多余液體，細(xì)胞面朝下，貼在載玻片上，不要有氣泡；蓋玻片的邊緣四周刷上無(wú)色指甲油，待干；擦去蓋玻片上表面析出的PBS鹽份(optional)；避光保存在干燥的容器內(nèi)。
結(jié)果見(jiàn)圖11。
2hZG16基因蛋白的分泌途徑分泌蛋白的一般分泌途徑有兩種經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器然后分泌；不經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器，直接分泌。為分析hZG16蛋白的分泌途徑，將pcDNA3.1-hZG16-Myc和pEYFP-Golgi(Clontech)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到CHO細(xì)胞中，進(jìn)行熒光共定位分析(圖12)(方法同上，二抗使用驢抗兔CyTM5 IgG)。pEYFP-Golgi質(zhì)粒有高爾基細(xì)胞器膜定位信號(hào)，使表達(dá)的融合蛋白定位在高爾基體上，通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡分析判斷hZG16蛋白是否定位在高爾基體內(nèi)。圖12A表示pEYFP-Golgi的YFP融合蛋白的細(xì)胞定位情況(綠色)，圖12B表示標(biāo)有Cy5的二抗對(duì)目的基因的亞細(xì)胞定位的檢測(cè)(紅色)，圖12C表示A與B圖的重疊。在C圖中黃色表示A、B圖中的蛋白共定位。如圖所示hGH，P28分別做為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。P28蛋白已知定位于細(xì)胞核內(nèi)，沒(méi)有黃色顯現(xiàn)，人生長(zhǎng)激素(hGH)是通過(guò)高爾基細(xì)胞器分泌的分泌蛋白。所以hZG16蛋白的確部分定位在高爾基體內(nèi)，說(shuō)明hZG16蛋白的分泌途徑是典型的或是依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器的分泌。
實(shí)施例5人hZG16基因原核細(xì)胞表達(dá)和純化在該實(shí)施例中，將全長(zhǎng)的人hZG16編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
1基因片段的克隆1.1材料表達(dá)載體pGEX-5x-1Pharmacia公司產(chǎn)品，全長(zhǎng)4969bp，為含谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione S-transferase，GST)的融合表達(dá)載體。含Ptac啟動(dòng)子，氨芐青霉素抗性，GST后接多克隆位點(diǎn)，含三個(gè)讀框的終止碼，GST與目的基因之間有Factor Xa識(shí)別位點(diǎn)。
合成引物正向引物GGGAATTCATTCAGGCCAGGTCTTC(SEQ ID NO.5) 酶切位點(diǎn)EcoRI反向引物GGGCTCGAGTCAGCATCTGCTGCAGC(SEQ ID NO.6)酶切位點(diǎn)XhoI以上引物均由上海申友公司合成菌株E.coli DH5α1.2方法直接以先前構(gòu)建的pcDNA3.1A-hZG16質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)合適引物擴(kuò)增基因片段，設(shè)計(jì)引物時(shí)使擴(kuò)增出的片段去掉編碼信號(hào)肽的一段。這樣通過(guò)原核細(xì)胞表達(dá)出的蛋白才與真核細(xì)胞中分泌到胞外的蛋白相同。終止密碼子采用基因本身的終止密碼子。
(1)PCR反應(yīng)采用相應(yīng)引物根據(jù)下列組分進(jìn)行PCR反應(yīng)成分 體積


94℃3min；94℃變性30s，54℃退火40sec，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸7min。
(2)膠回收采用QIAGEN公司的Gel Extraction Kit參照操作手冊(cè)割膠回收。
(3)酶切載體片段和擴(kuò)增片段根據(jù)下列組分進(jìn)行酶切反應(yīng)成分體積

37℃酶切12hr，70℃熱失活15min(4)連接酶切好的載體和擴(kuò)增片段根據(jù)下列組分進(jìn)行連接反應(yīng)成分 體積

16℃連接12hr。
(5)轉(zhuǎn)化參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(6)菌落的PCR鑒定在長(zhǎng)有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個(gè)菌落作PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系與上述PCR的體系相同。結(jié)果見(jiàn)圖13。
(7)質(zhì)粒小抽采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)參照產(chǎn)品操作手冊(cè)抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒測(cè)序，插入片段正確。
2 hZG16蛋白的原核表達(dá)和純化2.1材料
Glutathione Sepharose 4B購(gòu)買(mǎi)自Pharmacia公司；Factor Xa購(gòu)買(mǎi)自Pharmacia公司；E.coli BL21；上述構(gòu)建好的pGEX5x-HZG16質(zhì)粒。
2.2方法(1)小量表達(dá)構(gòu)建的表達(dá)菌種接種于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm過(guò)夜培養(yǎng)。過(guò)夜培養(yǎng)的飽和菌1∶50接種子5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6。不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5hr。8000rpm離心10min，去上清，加500ml1×PBS，重懸菌體。取出20ul走SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
(2)大量表達(dá)及樣品處理根據(jù)小量表達(dá)的條件放大，菌體重懸。加入1M DTT至最終濃度為5mM，PMSF至最終濃度為100ug/ml。冰浴超聲裂解細(xì)胞成勻漿。加20％Triton X-100至終濃度1％，冰浴30min。12000rpm離心10min，分裝上清，-20℃儲(chǔ)存。
(3)純化將凍存細(xì)胞上清13000rpm，4℃，離心10分鐘，取上清。加入適量50％GlutathioneSepharose 4B Slurry，4℃搖動(dòng)混勻2hr。Glutathione Sepharose 4B的預(yù)處理方法見(jiàn)該試劑盒的操作手冊(cè)。3000rpm離心5分鐘，去上清，重懸于PBS中，重復(fù)洗滌四次，上柱。用PBS洗滌至所測(cè)OD值接近空白對(duì)照PBS。換用GST Elution buffer洗脫，測(cè)每一收集管的OD值。收集洗脫后的蛋白，裝入透析帶透析，期間適當(dāng)換透析液1×PBS。透析后收集袋內(nèi)液體，測(cè)蛋白濃度，并用蛋白電泳檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖14。
3hZG16蛋白的抗體制備和純化3.l材料Protein A Sepharose CL-4B購(gòu)自Pharmacia公司3.2方法(1)所得蛋白免疫兔子，制多克隆抗體。此部分工作由上海生物工程中心動(dòng)物房完成(2)收集的免疫后兔子血離心收集上清，得到抗血清，Western檢測(cè)所得抗體的效果和特異性。
(3)用Protein A Sepharose CL-4B純化所得抗血清，并用結(jié)合有GST蛋白的GlutathioneSepharose 4B出去其中的抗GST抗體。
預(yù)處理Protein A Sepharose CL-4B，見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。用Wash/binding buffer(20mM磷酸鈉溶液，150mM NaCl，pH＝7.4)配制50％的Slurry。樣品準(zhǔn)備，血清樣品用Wash/bindingbuffer 1∶1稀釋。將平衡好的50％Slurry倒入柱子填充，使樹(shù)脂在重力作用下自然沉降。用10倍柱體積的Wash/binding buffer平衡柱子。上樣，樣品加至樹(shù)脂頂部。流出液重復(fù)上柱三遍。用10倍柱體積的Wash/binding buffer洗，直到280nm的光吸收接近空白。用4倍柱體積的Elution Buffer(100mM Glycine-HCl，pH＝3.0)洗脫，收集流出液，每管200ul，測(cè)定280OD值。直至無(wú)蛋白洗出。再生柱子，4倍Elution Buffer繼續(xù)洗脫后用Wash/bindingbuffer大量洗。
實(shí)施例6CHO hZG16蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建2μg真核表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞(35mm培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)48小時(shí)；消化至100mm培養(yǎng)皿，加G418至終濃度1000μg/ml(CHO)培養(yǎng)2-3星期直至有克隆形成；去培養(yǎng)皿內(nèi)的培液，PBS洗兩次，胰酶浸泡過(guò)的無(wú)菌濾紙片覆蓋于克隆上，消化數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)；Western blot鑒定表達(dá)目的蛋白的克隆。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>一種新的人分泌蛋白hZG16<130>NP-1347<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>632<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(7)..(510)<220>
<221>sig_peptide<222>(7)..(60)<220>
<221>polyA_signal<222>(586)..(59)<400>1cccaga atg ttg aca gtc gct ctc cta gcc ctt ctc tgt gcc tca gcc 48Met Leu Thr Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys Ala Ser Ala1 5 10tct ggc aat gcc att cag gcc agg tct tcc tcc tat agt gga gag tat 96Ser Gly Asn Ala Ile Gln Ala Arg Ser Ser Ser Tyr Ser Gly Glu Tyr15 20 25 30gga agt ggt ggt gga aag cga ttc tct cat tct ggc aac cag ttg gac 144Gly Ser Gly Gly Gly Lys Arg Phe Ser His Ser Gly Asn Gln Leu Asp35 40 45ggc ccc atc acc gcc ctc cgg gtc cga gtc aac aca tac tac atc gta 192Gly Pro Ile Thr Ala Leu Arg Val Arg Val Asn Thr Tyr Tyr Ile Val50 55 60
ggt ctt cag gtg cgc tat ggc aag gtg tgg agc gac tat gtg ggt ggt 240Gly Leu Gln Val Arg Tyr Gly Lys Val Trp Ser Asp Tyr Val Gly Gly65 70 75cgc aac gga gac ctg gag gag atc ttt ctg cac cct ggg gaa tca gtg 288Arg Asn Gly Asp Leu Glu Glu Ile Phe Leu His Pro Gly Glu Ser Val80 85 90atc cag gtt tct ggg aag tac aag tgg tac ctg aag aag ctg gta ttt 336Ile Gln Val Ser Gly Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Lys Leu Val Phe95 100 105 110gtg aca gac aag ggc cgc tat ctg tct ttt ggg aaa gac agt ggc aca 384Val Thr Asp Lys Gly Arg Tyr Leu Ser Phe Gly Lys Asp Ser Gly Thr115 120 125agt ttc aat gcc gtc ccc ttg cac ccc aac acc gtg ctc cgc ttc atc 432Ser Phe Asn Ala Val Pro Leu His Pro Asn Thr Val Leu Arg Phe Ile130 135 140agt ggc cgg tct ggt tct ctc atc gat gcc att ggc ctg cac tgg gat 480Ser Gly Arg Ser Gly Ser Leu Ile Asp Ala Ile Gly Leu His Trp Asp145 150 155gtt tac ccc act agc tgc agc aga tgc tga gcctcctctc cttggcaggg 530Val Tyr Pro Thr Ser Cys Ser Arg Cys160 165gcactgtgat gaggagtaag aactccctta tcactaaccc ccatccaaat ggctcaataa 590aaaaatatgg ttaaggctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa632<210>2<211>167<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Leu Thr Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys Ala Ser Ala Ser Gly1 5 10 15Asn Ala Ile Gln Ala Arg Ser Ser Ser Tyr Ser Gly Glu Tyr Gly Ser
20 25 30Gly Gly Gly Lys Arg Phe Ser His Ser Gly Asn Gln Leu Asp Gly Pro35 40 45Ile Thr Ala Leu Arg Val Arg Val Asn Thr Tyr Tyr Ile Val Gly Leu50 55 60Gln Val Arg Tyr Gly Lys Val Trp Ser Asp Tyr Val Gly Gly Arg Asn65 70 75 80Gly Asp Leu Glu Glu Ile Phe Leu His Pro Gly Glu Ser Val Ile Gln85 90 95Val Ser Gly Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Lys Leu Val Phe Val Thr100 105 110Asp Lys Gly Arg Tyr Leu Ser Phe Gly Lys Asp Ser Gly Thr Ser Phe115 120 125Asn Ala Val Pro Leu His Pro Asn Thr Val Leu Arg Phe Ile Ser Gly130 135 140Arg Ser Gly Ser Leu Ile Asp Ala Ile Gly Leu His Trp Asp Val Tyr145 150 155 160Pro Thr Ser Cys Ser Arg Cys165<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ccggatccat gttgacagtc gctctcct 28<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cccggtaccg catctgctgc agc tagtg 28<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gggaattcat tcaggccagg tcttc 25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gggctcgagt cagcatctgc tgcagc 2權(quán)利要求
1.一種分離的人分泌蛋白hZG16，其特征在于，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的人分泌蛋白hZG16，其特征在于，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
3.一種制備權(quán)利要求1的分離的人分泌蛋白hZG16的方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hZG16活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hZG16蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸7-510位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hZG16蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hZG16蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hZG16蛋白活性的多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的一種制備人分泌蛋白hZG16的方法，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸7-510位的核苷酸。
5.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權(quán)利要求1所述的人分泌蛋白hZG16多肽特異性結(jié)合的抗體。
6.一種含有權(quán)利要求1的人分泌蛋白hZG16的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人類新的分泌蛋白hZG16。本發(fā)明的分泌蛋白是一種功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。并且hZG16基因主要分布在人的肝臟及結(jié)腸組織中，并在肝癌中的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。因此該分泌蛋白具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1721535SQ20041005284
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者周宇波, 朱智東, 朱弘, 黃健, 韓澤廣 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心