專利名稱：一種sars冠狀病毒n蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種SARS冠狀病毒N蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2002年11月至2003年2月，我國廣東爆發(fā)病因不明的非典型肺炎(atypicalpneumonia)，隨后在我國香港、越南、加拿大、新加坡、美國和中國等世界各地陸續(xù)出現(xiàn)相似的病例，引起全球民眾恐慌和各國政府及科研人員的高度關(guān)注。2003年3月5日，世界衛(wèi)生組織(WHO)就非典型肺炎向全球發(fā)布了衛(wèi)生警報，并將此病命名為嚴重急性呼吸綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)?？茖W家研究表明，嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)是由一種新的冠狀病毒(sars)引發(fā)的。這種新的冠狀病毒是一個包膜的正鏈RNA病毒，基因組全長29,727核苷酸，有11個開放閱讀框，分別編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、M、N、E蛋白)、依賴于RNA的RNA聚合酶、5種未知蛋白。據(jù)報道，截至到2003年7月11日，全球32個國家和地區(qū)有8437個人感染了sars病毒，其中有813個人死亡。全世界致死率大約為10.5％。為了抑制病毒的傳播擴散，一種有效的診斷SARS病毒的試劑盒是必需的?，F(xiàn)有的幾種檢測方法大致可分為四類1分子檢測方法(PCR檢測)PCR檢測有較高的特異性但靈敏度較差，這意味著一個陰性的實驗結(jié)果并不能排除患者沒出現(xiàn)SARS病毒表達，且實驗過程較長約4-5小時，容易發(fā)生污染(即出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果)。而且由于病毒變種發(fā)生頻繁、引物設(shè)計等原因，分子檢測方法的檢出率還有待進一步提高。
2免疫學方法(抗體檢驗)它的檢測原理是基于用病毒蛋白去檢測患者或疑似患者血液中的抗體，而對血清抗體的研究表明，“非典”病人發(fā)病后，最早的抗體IgM出現(xiàn)要在7天左右，10天時達到高峰，15天左右下降，抗體IgG 10天后產(chǎn)生，20天左右達到高峰。一般患者在剛發(fā)熱時，血液里有病毒，但抗體還沒有生成。有時“非典”患者在潛伏期，尚未出現(xiàn)癥狀或是癥狀并不典型，令醫(yī)生難以判斷，等到體內(nèi)產(chǎn)生抗體，癥狀明確時，病情也隨之加重，延誤了治療和隔離。
3細胞學方法(細胞培養(yǎng))
細胞培養(yǎng)方法是最早發(fā)展的實驗室檢測手段，從SARS患者所采集的樣本(如呼吸道分泌物，血液或者糞便)中的病毒，可以通過感染性細胞培養(yǎng)并產(chǎn)生出病毒，能夠在電子顯微鏡下直接觀察到病毒顆粒，因而十分準確。但技術(shù)難度高，操作復雜，所需時間長，對設(shè)備要求高，不適于大量檢測。
4.蛋白質(zhì)芯片方法(抗體檢測)蛋白質(zhì)芯片方法也是來檢測抗體，與上述的免疫學方法檢測抗體一樣，都有一定的缺陷(見上述)。
現(xiàn)在的檢測方法都存在著一定的問題，仍需一種更早期、更靈敏、更快捷、更有效的檢測方法，進行早期鑒別診斷。因而我們迫切需要制備一種特異性高，親和力強的單克隆抗體及以雙抗體夾心法為基礎(chǔ)的ELISA檢測病毒抗原的診斷型試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗SARS病毒N蛋白的抗體，尤其是單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種早期檢測SARS病毒的免疫檢測方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種早期檢測SARS病毒的診斷試劑盒。
本發(fā)明的一方面，提供了一種抗SARS病毒的抗體，所述抗體特異性地與SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。較佳的，所述抗體為單克隆抗體。在一實施例中，所述抗體由保藏號為CCTCC NO-C200407的細胞株分泌。優(yōu)選的，所述抗體亞型為IgG1。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種分泌上述抗體的雜交瘤細胞株。優(yōu)選的，所述雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCC NO-C200407。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種早期檢測SARS病毒的免疫檢測方法，所述檢測方法使用上述單克隆抗體。較佳的，所述抗體由保藏號為CCTCC NO-C200407的雜交瘤細胞株分泌。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測SARS病毒的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有與標記物結(jié)合的上述單克隆抗體；標記物包括熒光標記物、放射性標記物和酶標記物。較佳的，所述抗體由保藏號為CCTCC NO-C200407的雜交瘤細胞株分泌。
本發(fā)明的另一方面，提供了上述抗體在診斷SARS病毒感染所致疾病中的用途。優(yōu)選的，所述疾病為嚴重急性呼吸綜合癥。
本發(fā)明的另一方面，提供了上述單克隆抗體在制備檢測試劑盒中的用途，檢測試劑盒含有與標記物結(jié)合的單克隆抗體；標記物包括熒光標記物、放射性標記物和酶標記物。較佳的，所述抗體由保藏號為CCTCC NO-C200407的雜交瘤細胞株分泌。
本發(fā)明的另一方面，提供了上述單克隆抗體在制備治療SARS病毒感染所致疾病的藥物組合物中的用途，所述藥物組合物包含本發(fā)明的單克隆抗體，還包含藥學上可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選的，所述抗體由保藏號為CCTCC NO-C200407的雜交瘤細胞株分泌。
本發(fā)明所述SARS病毒N蛋白、N蛋白、sars N蛋白均指SEQ NO2所示序列的蛋白。抗SARS病毒的抗體，指與SEQ NO2所示序列的蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體可通過本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生，因此是可以從培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤的培養(yǎng)液中獲得的。然而，產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的方法不受特別限制，但如果基因工程化的抗體能與SARS病毒N蛋白特異性結(jié)合，它也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生識別SARS病毒N蛋白作為抗原的單克隆抗體，并可通過經(jīng)N蛋白免疫的動物的脾細胞或淋巴結(jié)細胞與骨髓瘤細胞融合獲得。本發(fā)明的雜交瘤細胞株已于2004年4月21日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)，保藏號為CCTCC NO-C200407。
本發(fā)明的雜交瘤可以用本領(lǐng)域已知的細胞融合技術(shù)產(chǎn)生。因此，用N蛋白作為免疫原免疫除了人以外的動物，將該動物的脾細胞或淋巴結(jié)細胞與骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤，從其選出產(chǎn)生識別N蛋白的單克隆抗體的雜交瘤，從而獲得了本發(fā)明的雜交瘤。
上述免疫原不受特別限制，但是可以是任何含有SARS病毒N蛋白的免疫原。例如可以通過在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達SARS病毒N蛋白的工程菌株，或者含有SARS病毒N蛋白的融合蛋白。
經(jīng)免疫產(chǎn)生本發(fā)明的雜交瘤的動物不受特別限制，包括但不限于山羊、綿羊、豚鼠、小鼠、大鼠和家兔。在其中優(yōu)選的是小鼠。
本發(fā)明的單克隆抗體可以檢測SARS病毒感染的存在與否。
本發(fā)明的單克隆抗體的應(yīng)用領(lǐng)域不受特別限制，但能用于免疫測定，用于判斷SARS病毒的感染。
基于上述單克隆抗體，本發(fā)明提出早期檢測SARS病毒的免疫測定法，本發(fā)明的免疫測定法用至少一種本發(fā)明的單克隆抗體進行，方法可僅用一種抗體進行。
通常作為用于免疫測定方法的單克隆抗體，考慮靈敏度高超的單克隆抗體作優(yōu)選抗體，因為與特異性低而背景噪聲高的多克隆抗體相比較，其特異性高而背景噪聲低。
作為本發(fā)明的免疫測定法，包括酶免疫測定(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、熒光免疫測定(FIA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫層析等技術(shù)。上述各種免疫測定法可用于以競爭法或夾心法，用標記物標記的抗原或抗體測定靶抗原或抗體。
在上述各種免疫測定法中，ELISA和免疫層析技術(shù)是優(yōu)選的。
上述競爭性方法基于測試標本中SARS病毒和已知量的標記的SARS病毒N蛋白與本發(fā)明的單克隆抗體定量競爭性結(jié)合反應(yīng)。在上述特別提到的競爭性方法中，在含有SARS病毒的標本溶液中加入預定量的固定在載體上的抗體和預定量的用標記劑標記的SARS病毒N蛋白。然后，測定保留在載體上的標記劑活性或未保留在載體上的標記劑活性。對此，優(yōu)選幾乎同時加入抗體和標記抗原。
上述夾心法包括使SARS病毒夾在本發(fā)明固定的單克隆抗體和用標記劑標記的本發(fā)明的單克隆抗體或多克隆抗體之間，然后加入針對標記物(例如酶)的底物等，顯示顏色等，從而檢測標本中的SARS病毒。
上述提到的標記劑，可以是放射性同位素(例如125I)、酶、酶底物、磷光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、生物素和著色物質(zhì)。在將這些標記劑與抗原或抗體結(jié)合中，可使用馬來酰亞胺法(J.Biochem.(1976)，79，233)，活化生物素法(J.Am.Chem.SOC.(1978)，100，3585)或疏水鍵法。
上述提到的酶，包括過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對于用于該場合的底物，可選擇適合該場合所用的酶的底物，包括例如ABTS、魯米諾-H2O2、o-苯二胺一H2O2(針對過氧化物酶)、磷酸對硝基苯酯、磷酸甲基繳形酯、3-(2’-螺環(huán)金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，，2-二氧雜環(huán)丁烷(針對堿性磷酸酶)、對硝基苯基-BETA-D-半乳糖(針對β-半乳糖苷酶)。
可在4-40℃反應(yīng)1分鐘-18小時，然后測定結(jié)果顯示的顏色或熒光、磷光或顯色量，進行上述試驗。另外，可使用所謂的速率試驗，它在4-40℃范圍內(nèi)保溫進行。
用市售的Bolton-Hunter試劑可方便地對上述抗原或抗體的進行放射性標記。例如，可通過將Bolton-Hunter試劑加到溶液中(該溶劑是通過將抗原或抗體溶于0.1M碳酸氫鈉水溶液中制備的)，然后經(jīng)過1-2小時，用G-25脫鹽柱等除去未反應(yīng)的Bolton-Hunter試劑部分。
另外，可使用氯亞明T法、碘原法等，方便的進行125I放射性標記。
上述提到的磷光物質(zhì)，有例如異魯米諾和丫啶酯等，上述提到的熒光物質(zhì)，有例如熒光素和羅丹明等。對此，可方便地使用活化酯法或異氰酸酯法(“酶免疫測定技術(shù)”，IgakuShoin1987年出版)進行標記。上述提到的著色物質(zhì)，有例如著色乳膠顆粒和膠體金。
為了用上述競爭性方法進行本發(fā)明的免疫測定法，在本發(fā)明的單克隆抗體通過已知方法物理或化學結(jié)合的固相中加人含有未知量的SARS病毒標本，使反應(yīng)進行。同時，加入用標記劑標記的預定量的SARS病毒N蛋白，使反應(yīng)進行。
在用上述夾心法實施本發(fā)明的免疫測定法中，將本發(fā)明中的單克隆抗體通過已知方法物理或化學結(jié)合于固相上加人含有未知量的SARS病毒的標本中，使反應(yīng)進行。然后，加入用標記劑標記的本發(fā)明的單克隆抗體或多克隆抗體，使反應(yīng)進行。
在兩種情況下，需要充分洗滌固相，測量與標記試劑結(jié)合的活性。當標記劑是放射性同位素時，用孔計數(shù)器或液相閃爍計數(shù)器進行測量。當標記劑是酶時，加入底物，在染色后用比色和熒光測定酶活性。當標記劑是熒光物質(zhì)、磷光物質(zhì)或著色物質(zhì)時，可分別通過本領(lǐng)域已知的方法進行測量。
本發(fā)明的免疫測定法使用本發(fā)明的單克隆抗體，因此具有杰出的特性，即可識別存在于SARS病毒中的N蛋白表位，而沒有由于交叉反應(yīng)而錯誤檢測其他物質(zhì)，因此可進行特異性非常高的測定。
為了實施本發(fā)明的免疫測定法，本發(fā)明提出了一種診斷試劑盒。該診斷試劑盒含有至少一種本發(fā)明的單克隆抗體，并可只含一種單克隆抗體。用于該診斷試劑盒的單克隆抗體不受特別限制，可以是任何識別SARS病毒N蛋白的單克隆抗體，也可以是本發(fā)明的單克隆抗體的分解產(chǎn)物，如F(ab’)2、Fab’、Fab等。
本發(fā)明的診斷試劑盒可用免疫學方法檢測含SARS病毒的標本，如血液，口腔分泌物水或SARS病毒，因此可以判斷SARS病毒的感染。
在本發(fā)明的診斷試劑盒中，本發(fā)明的單克隆抗體可預先固定在固相上，本發(fā)明的單克隆抗體還可以用上述標記劑標記。
用于本發(fā)明診斷試劑盒的固相不受特別限制，包括但不限于聚合物(如聚苯乙烯)、玻璃珠、磁性顆粒、微量滴定板、免疫層析用濾紙、玻璃濾器或其他不溶性載體。
本發(fā)明的診斷試劑盒還可含有其他組件。
上述其他組件不受特別限制，包括但不限于標記用的酶、其底物、放射性同位素、磷光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、著色物質(zhì)、緩沖液和培養(yǎng)皿，以及上述提到的成分。
雖然本發(fā)明的診斷試劑盒的形式不受特別限制，但含有本發(fā)明的診斷試劑盒所有組分的整合形診斷試劑盒是優(yōu)選的，以便于快速、簡單和方便的進行診斷。
上述整合型診斷試劑盒不受特別限制，例如可以是盒型、芯型等。
作為上述盒型的實施例，使用免疫層析技術(shù)，可提到例如一種具體實施方式
，它包括一種膜、一端固定在所述膜上(下游側(cè))的本發(fā)明的單克隆抗體、固定在對側(cè)端(上游側(cè))的膜上的顯色溶液、含有針對上述標記劑并安排在顯色溶液附近并在其下游側(cè)的底物的襯墊，和安置在膜中間的襯墊上的含有用上述標記劑標記的單克隆抗體。
在使用上文舉例所述的具有盒型實施方式的診斷試劑盒中，將標本涂在含有用上述標記物標記的本發(fā)明的單克隆抗體的襯墊上，然后使標本中所含的SARS病毒和本發(fā)明的用標記劑標記的單克隆抗體進行結(jié)合，通過轉(zhuǎn)移在本發(fā)明單克隆抗體固定的位置形成的結(jié)合產(chǎn)物，使上文提到的顯色溶液顯色，在該位置固定有本發(fā)明的單克隆抗體，形成SARS病毒N蛋白、用標記劑標記的多克隆抗體和固定化的單克隆抗體形成復合物。然后，上述標記試劑與上述底物反應(yīng)以顯示顏色等。測定顯示的顏色等，從而進行SARS病毒感染的判斷。
對于用足量顯色溶液稀釋標本，并將得到的溶液滴到膜上的實施例而言，不需要預先將顯色溶劑置于膜上。當用著色乳膠顆粒等著色物質(zhì)作為上述標記物時，不需要底物，可根據(jù)著色物質(zhì)的顯色來判斷本發(fā)明的單克隆抗體固定的位點是否形成上述復合物。
例如，對于用上述競爭性方法進行反應(yīng)的上述芯型實施方式，可以使用具有多個孔的芯等，它們是整體形成的，包括(a)含有本發(fā)明單克隆抗體的孔，(b)含有液體試劑的孔(如緩沖溶液)，該液體試劑中含有上述標記試劑標記的SARS病毒N蛋白，和(c)含有液體試劑(如緩沖溶液)的孔，該液體試劑含有針對上述標記試劑的底物，為了用夾心法實施反應(yīng)，提到一種芯等，具有多個整體形成的孔，包括(a)含有不溶性載體的孔，在載體上固定有本發(fā)明的單克隆抗體，(b)含有液體試劑(如緩沖溶液)的孔，該試劑含有用上述標記試劑標記的單克隆抗體，和(c)含有液體試劑(如緩沖液)的孔，含有針對上述標記劑的底物。
在使用例如上述本發(fā)明的芯型診斷試劑盒中，反應(yīng)和試驗通常與進行競爭法或夾心法使用的相同方式進行。
本發(fā)明的診斷試劑盒可以是用于實施上述競爭性方法或上述夾心法的試劑盒。然而優(yōu)選的是使用夾心法的試劑盒。上述夾心法具有優(yōu)點，即靈敏度高，需要的反應(yīng)時間短，準確率高。用上述免疫層析技術(shù)，可以制備一種試劑盒，它使得測試方法方便而簡單，而且用它可以簡單的通過肉眼觀察判斷結(jié)果。當以ELISA技術(shù)使用上述夾心法時，酶反應(yīng)產(chǎn)物的形成由試驗目標物質(zhì)的量決定，因此可建立一種系統(tǒng)，可方便的通過顯色等，以肉眼觀察確定SARS病毒感染陽性。
本發(fā)明診斷試劑盒所用的標本不受特別限制，包括但不限于血液、漱口水和消化道排泄物，優(yōu)選血液。
因為本發(fā)明的診斷試劑盒使用單克隆抗體，具有高水平的檢測靈敏度，不產(chǎn)生假陰性或假陽性問題，在批與批之間沒有任何差異。
根據(jù)本發(fā)明，用單克隆抗體識別SARS病毒N蛋白作為抗原，可消除存在于樣品中的其它物質(zhì)的影響，從而可以非常高的靈敏度和特異性檢測SARS病毒的存在。由于已建立了產(chǎn)生針對SARS病毒N蛋白的單克隆抗體的雜交瘤，現(xiàn)在可以幾乎半永久性的產(chǎn)生同一單克隆抗體。使用本發(fā)明的單克隆抗體的診斷試劑盒可用漱口水作為標本，因此可簡單方便有效的檢測SARS病毒N蛋白感染，而不對病人造成任何痛苦。另外，在僅使用一種單克隆抗體的情況下，使用本發(fā)明的單克隆抗體的診斷試劑盒可穩(wěn)定地獲得非常高的準確率，而在批與批之間沒有任何差異，因此可以特異性的和高度準確的檢測SARS病毒感染。上述診斷試劑盒易于進行測定，操作簡單。
本發(fā)明實施例中使用的SARS抗原檢測試劑盒是通過雙抗體夾心ELISA原理檢測病人血清中的N蛋白，能夠?qū)崿F(xiàn)早期的診斷。SARS抗原檢測試劑盒檢測原理，用抗sars N蛋白的單克隆抗體和抗N蛋白的多克隆抗體作為固相化抗體和酶標抗體，如果待測樣品中存在sars病毒的N抗原，則形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之則無顯色反應(yīng)。SARS抗原檢測試劑盒能在病人感染病毒早期就能檢測出N抗原，從而及早的診斷出病毒感染者，及時發(fā)現(xiàn)及時治療隔離，防止疾病的蔓延。
SARS病毒N蛋白與病毒基因組RNA結(jié)合形成核衣殼，而且有許多功能提供進核的信號，干擾細胞的生長，病毒復制和RNA包裝。文獻報道，感染冠狀病毒后，N蛋白是數(shù)量最多的病毒有關(guān)蛋白，并且N蛋白的抗原性較強，這些特征使N蛋白成為一個很好的診斷候選靶點。而且，雙抗體夾心ELISA法是一種非常靈敏的病毒檢測技術(shù)，在檢測大多數(shù)病毒時比其它血清學方法特異性更高。并且ELISA敏感性高、操作簡便，配套儀器設(shè)備的發(fā)展使操作程序規(guī)范化和自動化，從而進一步提高了穩(wěn)定性。
此外，本發(fā)明還提出了上述單克隆抗體在制備治療SARS病毒感染所致疾病的藥物組合物中的用途。所述藥物組合物包含本發(fā)明的單克隆抗體，還包含藥學上可接受的載體或賦形劑。


圖1、三次免疫后兔子抗血清效價的檢測。
圖2、雙抗體夾心ELISA檢測不同濃度的N蛋白和JC蛋白檢測結(jié)果(見圖2)表明檢測的N蛋白濃度與OD值呈線形關(guān)系，其靈敏度為62.5ng/ml，即當N蛋白的濃度為62.5ng/ml時，檢測結(jié)果仍為陽性。而且與無關(guān)蛋白JC成陰性反應(yīng)。通過進一步優(yōu)化實驗條件，檢測靈敏度可能會進一步提高。
圖3、雙抗體夾心ELISA檢測三個不同稀釋度的10份正常人血清。
圖4、雙抗體夾心ELISA檢測三個不同稀釋度的10份腫瘤病人血清。
圖5、雙抗體夾心ELISA檢測三個不同稀釋度的10份SLE病。
圖6、雙抗體夾心ELISA檢測三個不同稀釋度的10份梅毒病人血清。
圖7、雙抗體夾心ELISA檢測三個不同稀釋度的10份HBV病人血清。
圖8、雙抗體夾心ELISA檢測三個不同稀釋度的10份HCV病人血清。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook、Russell等人，分子克隆實驗室手冊III(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1SARS N蛋白的表達將SARS N蛋白的全長基因(SEQ ID NO1)插入到表達載體pETs后，轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21(DE3)。加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L誘導細菌表達N蛋白，然后按照操作手冊經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后，SDS-PAGE檢測。
實施例2多克隆抗體的制備動物免疫用實施例1表達純化的N蛋白三次免疫家兔。第一次免疫用福氏完全佐劑與N蛋白等量混勻后乳化，皮下多點注射，1mg/只，第二、三次免疫用福氏不完全佐劑與N蛋白等量混勻后乳化，免疫方法與用量同第一次免疫。每次免疫間隔一個月左右，第三次免疫后一周取血。
間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(間接ELISA)檢測抗血清的效價用N蛋白包被ELISA檢測板，含10％牛血清、0.1％Tween的PBS封閉液封閉，然后加入不同稀釋度的抗血清，37℃孵育2小時，同時設(shè)相同稀釋度的免疫前兔血清做為陰性對照，最后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔Ig的抗體。37℃孵育1小時，充分洗滌后加入底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色并測定450nm處光吸收值。
檢測結(jié)果如圖1，間接ELISA檢測抗血清的效價為1,024,000，即當抗血清稀釋1,024,000倍時仍為陽性。
抗體的分離及HRP酶標記用硫酸銨鹽析法分離兔抗血清中的抗體，通過戊二醛兩步法將HRP與其偶聯(lián)，制備成酶標抗體。用ELISA標定其使用的最適稀釋度(方法同上)。ELISA結(jié)果顯示酶標抗體的最適稀釋度為1∶500。
實施例3抗N蛋白的雜交瘤細胞株的建立及其單抗的制備1、動物免疫用基因重組的N蛋白三次免疫BALB/C小鼠。免疫方法同兔，第三次免疫后一個月，回憶刺激小鼠。用間接ELISA法檢測抗血清的效價為64000。
2、雜交瘤的制備和篩選取回憶刺激3天后的小鼠脾臟細胞與NS-1、SP2/0骨髓瘤細胞按常規(guī)方法用50％PEG進行融合，經(jīng)間接ELISA方法篩選和克隆后，得到雜交瘤細胞株，其中S-39-2克隆用于本工作(保藏號為CCTCC NO-C200407)。該細胞株分泌的抗體亞型為IgG1。
3、腹水的制備及抗體的純化每只小鼠腹腔注射0.5ml pristane，7-10天后腹腔注射106個雜交瘤細胞，7-10天后取腹水。腹水先硫酸銨鹽析法初步純化后，再用protein G免疫親和層析法進一步純化。
4、單抗的親合常數(shù)測定參照Beatty的方法(Beatty JD，Beatty BG，VlahosWG.Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzymeimmunoassay.J Immunol Methods，100(1987)173-9)，將N蛋白分別以0.625、1.25、2.5、5ug/ml的濃度包被，加入倍比稀釋的純化單抗(見本實施例第3點)，再加入HRP酶標記的羊抗小鼠Ig的抗體，TMB顯色測OD450值。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標，OD450值為縱坐標，得一生長飽和曲線，4種抗原濃度得到4個不同的曲線，每個曲線的平坦部OD450值做為100％，求出50％OD450值對應(yīng)的抗體濃度，通過Beatty的公式計算出親和常數(shù)為Kaff＝3.1×109L/mol。
實施例4檢測本試劑盒的靈敏度及特異性1、雙抗體夾心ELISA法檢測基因重組的N蛋白和一種無關(guān)的植物蛋白JC蛋白用含0.01％Thimerosal的PBS稀釋純化后的抗N蛋白單抗(約5ug/ml)包被ELISA檢測板，100ul/孔，4℃過夜。在Thermol洗板機上用洗滌液(1M Tris-HCl，含0.1％Tween，0.01％Thimerosal)洗5次。用稀釋液(含10％小牛血清、0.01％Thimerosal的PBS)封閉，200ul/孔，37℃，2小時。再洗滌，加入不同稀釋度的基因重組的N蛋白和JC蛋白(用含0.01％Thimerosal的PBS稀釋)，100ul/孔，37℃，2小時。洗滌后，加入1∶500稀釋的酶標抗N蛋白的多克隆抗體(用稀釋液稀釋)，100ul/孔，37℃，1小時。然后洗滌，加入TMB底物，100ul/孔，反應(yīng)10分鐘后加入2M H2SO4，100ul/孔，終止反應(yīng)。在Thermol酶標儀上讀取OD450值。
檢測結(jié)果(見圖2)表明檢測的N蛋白濃度與OD值呈線形關(guān)系，其靈敏度為62.5ng/ml，即當N蛋白的濃度為62.5ng/ml時，檢測結(jié)果仍為陽性。而且與無關(guān)蛋白JC成陰性反應(yīng)。通過進一步優(yōu)化實驗條件，檢測靈敏度可能會進一步提高。
2、雙抗體夾心ELISA法檢測人血清單克隆抗體包被、洗滌、封閉和酶標多抗反應(yīng)等同實施例4.1，只是在加入抗原時是加了不同稀釋度的人血清，血清用含0.01％Thimerosal的PBS稀釋。以下圖的陰性對照為稀釋液，陽性對照為1ug/ml的基因重組N蛋白。
結(jié)果(圖3-8)表明無論正常人血清還是非SARS病人血清(包括腫瘤、過敏性患者、感染病毒的病人如HBV、HCV以及梅毒)與本檢測系統(tǒng)均呈陰性反應(yīng)，顯示了本檢測試劑盒有較好的臨床應(yīng)用前景。
實施例5ELISA檢測試劑盒的制備抗N蛋白的多克隆抗體包被的ELISA檢測板(48人份)，HRP標記的單抗5ml，TMB底物10ml，10％小牛血清稀釋液20ml，1M Tris-HCl洗滌液100ml。
實施例6ELISA檢測試劑盒的制備抗N蛋白的單克隆抗體包被的ELISA檢測板(48人份)，HRP標記的多抗5ml，TMB底物10ml，10％小牛血清稀釋液20ml，1M Tris-HCl洗滌液100ml。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>一種SARS冠狀病毒N蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用<130>040521<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1266<212>DNA<213>SARS病毒N蛋白<400>1atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga 60cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag120cgccgacccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat180ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt240ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc300aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct360tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg420aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta480caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc540agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct600ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc660gcgctattgc tgctagacag attgaaccag cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa720caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc780
caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac gtcactcaag catttgggag acgtggtcca 840gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa 900cattggccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc 960attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg 1020gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca 1080tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct 1140cagcctttgc cgcagagaca aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac 1200atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact 1260caggca 1266<210>2<211>422<212>PRT<213>SARS病毒N蛋白<400>2Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly
65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr100 105 110Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser
245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly325 330 335Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile340 345 350Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu355 360 365Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro370 375 380Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp385 390 395 400Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser405 410 415Ala Asp Ser Thr Gln Ala
420
權(quán)利要求
1.一種抗SARS病毒的抗體，其特征在于，所述抗體特異性地與SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體為單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由保藏號為CCTCC NO-C200407的細胞株分泌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于，所述抗體亞型為IgG1。
5.一種分泌權(quán)利要求2所述抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株的保藏號為CCTCCNO-C200407。
6.一種早期檢測SARS病毒的免疫檢測方法，其特征在于，使用權(quán)利要求2或3所述的單克隆抗體。
7.一種早期檢測SARS病毒的檢測試劑盒，其特征在于，至少含有一種如權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體與標記物結(jié)合，該標記物包括熒光標記物、放射性標記物和酶標記物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測試劑盒，其特征在于包括一種膜、一端固定在所述膜上的本發(fā)明的單克隆抗體、固定在對側(cè)端的膜上的顯色溶液、含有針對上述標記劑并安排在顯色溶液附近，在其下游側(cè)的底物的襯墊，和安置在膜中間的襯墊上的含有用上述標記劑標記的單克隆抗體。
10.一種如權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備治療SARS病毒感染所致疾病的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對SEQIDNO2所示序列的蛋白有特異性的單克隆抗體，產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其制備方法。本發(fā)明的單克隆抗體可以用于診斷和治療SARS病毒感染所致疾病，特別是嚴重急性呼吸綜合癥。作為一種應(yīng)用，本發(fā)明還提出了至少含有一種本發(fā)明單克隆抗體的診斷試劑盒。
文檔編號A61P31/14GK1673231SQ20041005287
公開日2005年9月28日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者孫兵, 尚勃, 季永鏞, 田林, 李林 申請人:中國科學院上海生命科學研究院