專利名稱：多酚及其氧化物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物化學和有機化學研究領域，具體涉及α-突觸核蛋白與多酚及其氧化物的反應機理以及在診斷探針和藥物開發(fā)中的應用。
背景技術：
帕金森病是一種除了阿爾次海默綜合癥以外，最為常見的神經(jīng)功能退化性疾病。它有兩個主要的病理特征一是患者大腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)細胞的程序性死亡；二是患者腦內(nèi)死亡的神經(jīng)細胞中有不溶性的Lewy體的出現(xiàn)，其主要成分為α-突觸核蛋白(α-Synuclein，α-Syn)的積聚形式。在臨床上，它主要表現(xiàn)為病人反應遲緩，震顫，機體僵硬，進一步失去平衡等癥狀。在65歲年齡的人群中，該病患者約占1％左右，而年齡達到85歲的人群中該病占的比例就上升到了4-5％。近年來，隨著人口老齡化的進一步到來，帕金森病給人們的生活帶來的壓力將顯得越加嚴峻。
目前，人們對帕金森病已經(jīng)有了廣泛的研究，但對其致病機理還不是完全清楚。雖然已經(jīng)知道遺傳突變和環(huán)境毒素等與帕金森病有關，但是導致細胞死亡的原因還不清楚。最近一些關于α-突觸核蛋白與膜的作用以及α-突觸核蛋白對多巴胺能神經(jīng)細胞具有選擇性毒性的研究讓我們在細胞退化的基礎上對帕金森病的致病機理有了更進一步的了解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，α-突觸核蛋白可與多酚及其氧化物(多酚極容易自氧化為醌)發(fā)生特異反應，形成共價的加合物抑制了α-突觸核蛋白的纖維化，從而完成了本發(fā)明。
具體而言，本發(fā)明第一方面涉及多酚類化合物及其氧化物在制備用于抑制α-突觸核蛋白纖維化的制劑中的用途。
本說明書中所用的術語“多酚”或“多酚類化合物”具有本領域技術人員通常認可和理解的含義，其通常是指具有2個或2個以上羥基的芳環(huán)類化合物。在一些較佳的實施方案中，所述多酚類化合物包括，但不局限于，鄰苯二酚，對苯二酚，多巴胺，左旋多巴，對苯二醌，茶多酚，EGCG，維生素C，對硝基苯酚或間苯三酚。如

圖1所示，所述多酚類化合物首先在空氣中氧化成為醌，然后與α-突觸核蛋白發(fā)生特異性結合，從而阻止了α-突觸核蛋白的纖維化。
在本發(fā)明中，術語“α-突觸核蛋白”的含義不僅包括全長蛋白，任何α-突觸核蛋白的片段也包括在其范圍內(nèi)，例如但不局限于，N-端片段α-Syn1-60。
基于α-突觸核蛋白與多酚及其氧化物之間的特異性反應，本發(fā)明還涉及用多酚及其氧化物來檢測α-突觸核蛋白的用途。例如，可用經(jīng)標記(如同位素標記)的多酚類化合物及其氧化物對樣品中α-突觸核蛋白存在與否、含量、以及在組織樣品中的位置等方面進行檢測。
本發(fā)明另一方面還提供了一種α-突觸核蛋白與多酚類化合物及其氧化物的加合物，在所述加合物中，多酚類化合物及其氧化物與α-突觸核蛋白中賴氨酸的側鏈氨基共價連接。所述加合物可以呈單體形式，也可以是寡聚體加合物形式，較佳的是2-8聚體形式。通過將α-突觸核蛋白與多酚類化合物及其氧化物混合，在合適的條件下培育一定時間(例如37℃下0-48小時)，就可獲得本發(fā)明的加合物。該方法具有操作簡單，反應迅速等優(yōu)點。
在較佳的實施方案中，所述多酚類化合物及其氧化物宜帶有標記(如同位素標記3H或18F等)，以便在放射性同位素檢測或PET(正電子斷層成像)用作探針。
另外，本發(fā)明的α-突觸核蛋白與多酚類化合物及其氧化物的加合物還可作抗原，來產(chǎn)生針對該加合物的抗體。如上所述，本領域技術人員應能理解還可利用α-突觸核蛋白與多酚類化合物及其氧化物之間的特異性反應，通過在含有賴氨酸殘基的α-突觸核蛋白的片段中引入多酚類化合物及其氧化物，例如多巴胺或多巴醌，以此作為抗原制備針對多巴胺加合物的單抗或多抗用于臨床診斷。
因此，本發(fā)明另一方面還提供了針對上述α-突觸核蛋白或其片段與多酚類化合物及其氧化物的加合物的抗體。
本發(fā)明獲得的加合物具有以下用途(1)可用來研究具有多酚結構的化合物的引入對α-突觸核蛋白纖維化的影響；(2)通過α-突觸核蛋白與多酚類化合物的反應產(chǎn)物的更強毒性，制備帕金森病的藥物篩選模型，篩選抗帕金森病的藥物；(3)利用本發(fā)明的反應，在α-突觸核蛋白中引入3H或18F標記的多酚類化合物作為探針用于放射性同位素檢測或PET(正電子斷層成像)；(4)研究α-突觸核蛋白在多巴胺能神經(jīng)細胞程序性死亡過程中的作用；(5)利用本發(fā)明得到的多酚化合物-α-突觸核蛋白的共價交聯(lián)寡聚體加合物，結合其它生物工程技術，制備針對寡聚體的單抗或多抗用于實驗研究，并開發(fā)帕金森病診斷抗體。
所以，本發(fā)明另一方面還涉及本發(fā)明的α-突觸核蛋白與多酚類化合物及其氧化物的加合物在篩選抗帕金森病的藥物中的用途，以及在放射性同位素檢測或正電子斷層成像中作為探針的用途。
附圖簡述圖1顯示了多酚類化合物與α-突觸核蛋白反應的示意圖。多酚類化合物在空氣中先氧化為醌，再與α-突觸核蛋白的反應生成加合物。
圖2顯示了不同多酚類化合物抑制α-突觸核蛋白纖維化的結果，其中HQ，對苯二酚；CA，鄰苯二酚；L-dopa，左旋多巴；DA，多巴胺；Q，對苯二醌；pNP，對硝基苯酚；VC，維生素C；pXG，對苯二甲醇。對苯二甲醇不含酚羥基，作為負對照，它不能抑制α-突觸核蛋白的纖維化。
圖3顯示了分子排阻層析分離純化寡聚體的結果，其中1為未反應的α-突觸核蛋白；2，3，4分別為α-突觸核蛋白與對苯二酚、鄰苯二酚及對苯二醌反應1天后的樣品。在洗脫時間為30～35分鐘的峰為單體蛋白質(zhì)，在23～29分鐘的峰是寡聚體蛋白。
圖4顯示了寡聚體的MALDI-TOF質(zhì)譜分析，圖中M為單體，D為二聚體。
圖5顯示了SDS-PAGE電泳鑒定共價交聯(lián)的寡聚體的結果，其中左邊樣品溶解于常規(guī)的SDS-PAGE上樣緩沖液，右邊樣品溶解于含有8M尿素的上樣緩沖液中。
圖6顯示了寡聚體對PC12細胞的毒性結果，其中Monomer表示從分子排阻層析實驗中分離得到的單體；del DA表示α-突觸核蛋白與多巴胺反應1天后，通過脫鹽而除去剩余的多巴胺后的樣品，其為α-突觸核蛋白的單體和寡聚體的混合物。
具體實施例方式
實驗材料鄰苯二酚，對苯二酚，多巴胺，左旋多巴，EGCG，Thioflavin T購自Sigma公司，對苯二醌，茶多酚，維生素C，對硝基苯酚為國產(chǎn)的分析純試劑。
實施例1α-突觸核蛋白的表達和純化將人源α-突觸核蛋白的基因或片段克隆到pET-3a質(zhì)粒中，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中。從平板上挑取單菌落接種于50mL LB中，37℃過夜震蕩培養(yǎng)。次日將過夜菌按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到2L LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至A600達到0.6～0.8。加終濃度為0.01mM的IPTG，在220rpm轉(zhuǎn)速下繼續(xù)培養(yǎng)4小時。以后的操作皆在冰上進行。4000rpm離心10分鐘，收集菌體，經(jīng)冰上預冷的細菌緩沖液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)洗滌后，按每升LB培養(yǎng)基的菌體懸浮于40mL的比例加入破菌緩沖液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.5mM PMSF，pH8.0)。置于冰浴30分鐘后，用超聲波破菌(5×5分鐘)，15,000rpm離心20分鐘。測量上清體積，用30％飽和度的(NH4)2SO4溶液沉淀，在冰浴上攪拌1小時后，10,000rpm離心15分鐘。取上清，補加(NH4)2SO4到50％的飽和度后，在冰上攪拌1小時，10,000rpm離心15分鐘。將沉淀用盡可能少的平衡緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0)溶解，15,000rpm離心20分鐘去處不溶物。用Sephadex G-25柱脫鹽。將脫鹽后的蛋白溶液上樣于預先用緩沖液平衡的DEAE-Sephadex A-25陰離子交換柱，用同一緩沖液洗脫雜蛋白到A280＜0.02。用含有0～500mM NaCl的洗脫液(50mM Tris-HCl，pH8.0)梯度洗脫，用試管分部收集穿出組分。用15％SDS-PAGE鑒定蛋白條帶，把含有目標蛋白的組分合并，用Amicon濃縮后用FPLC superose-12柱層析進一步純化，可得到95％以上純度的蛋白質(zhì)。
實施例2多酚及其氧化物抑制α-突觸核蛋白的纖維化將鄰苯二酚，對苯二酚，多巴胺，左旋多巴，對苯二醌，茶多酚，EGCG，維生素C，對硝基苯酚，間苯三酚等配成儲液，分別以不同的濃度和200μMα-突觸核蛋白一起在37℃保溫，在第0，1，2，4，6天，每天取出20μl蛋白，保存于-20℃。用Thioflavin T(ThT)與蛋白質(zhì)結合后482nm的熒光強度值來表征α-突觸核蛋白纖維化的快慢。在凍存的20μl蛋白中加入5μM的ThT，然后補加50mM的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)到1mL，以446nm為激發(fā)波長，測定482nm的熒光強度。作482nm的熒光強度與保溫時間曲線圖(圖2)。從圖2可以看出，隨著保溫時間的延長，加入化合物的樣品的482nm的熒光強度的增幅遠遠小于α-突觸核蛋白獨自積聚樣品的熒光強度。這說明這些化合物都能顯著抑制α-突觸核蛋白的纖維化。
實施例3α-突觸核蛋白或N-端片段α-Syn1-60與多酚及氧化物的反應將鄰苯二酚，對苯二酚，多巴胺，左旋多巴，對苯二醌，茶多酚，EGCG，維生素C，對硝基苯酚等以0.05～10mM的濃度，分別和200μM的α-突觸核蛋白或α-Syn1-60在37℃保溫0～48小時。用下列方法鑒定紫外-可見光譜分析。將不同保溫時間的反應混合物取出60μL，加入緩沖液稀釋到600μL后，進行波長范圍為265nm-450nm的紫外-可見光譜掃描。從譜圖上可以看出，在波長280nm和345nm處出現(xiàn)了兩個吸收峰。280nm的吸收光譜的增加，表明有酚加成到了α-突觸核蛋白上；而345nm吸收光譜的增加，則表明有新的化合物生成。
α-突觸核蛋白，賴氨酸，酪氨酸，甘氨酸和N-乙酰甘氨酸分別與對苯二醌在37℃反應0-24小時后，在不同的時間各取出60μL，加緩沖液到600μL后，進行波長范圍為265nm-450nm的紫外-可見光譜掃描。α-突觸核蛋白，賴氨酸，酪氨酸，甘氨酸與對苯二醌反應后，其345nm的吸收值隨著反應時間的延長而增加；而N-乙酰甘氨酸與對苯二醌反應后或?qū)Ρ蕉氉员睾螅?45nm的吸收值隨著反應時間的延長卻不增加，這說明與對苯二醌反應的是游離的氨基。α-突觸核蛋白中，有15個賴氨酸殘基和一個N-端的氨基，因此，α-突觸核蛋白與多酚及其氧化物的反應，是α-突觸核蛋白的賴氨酸側鏈的氨基與多酚的氧化物的反應。
將反應混合物進行分子排阻分析，收集單體蛋白質(zhì)進行電噴霧質(zhì)譜測定，其分子量比α-突觸核蛋白或α-Syn1-60增加104n+16m，其中n，m為整數(shù)(1≤n≤6，0≤m≤4)。104n表明有n個對苯二醌分子共價交聯(lián)到α-突觸核蛋白上。16m表明蛋白中的甲硫氨酸側鏈可能被氧化為亞砜結構，而使分子量增加為16的倍數(shù)。
核磁共振波譜分析。將400μMα-突觸核蛋白用換為92％D2O的PBS緩沖液后，進行1H-1H COSY圖譜掃描。然后加入4mM的對苯二醌反應48小時后，進行1H-COSY圖譜掃描。對比兩個圖譜發(fā)現(xiàn)，在芳環(huán)區(qū)域(化學位移在6.0到8.0之間)沒有新的位點出現(xiàn)，這排除了酪氨酸殘基與對苯二醌反應的可能。用300μM的15N標記的α-突觸核蛋白進行HSQC圖譜掃描。然后加入3mM對苯二醌或3mM多巴胺反應24小時后，進行HSQC圖譜掃描。將反應前后的圖譜重疊發(fā)現(xiàn)，有三個新的點出現(xiàn)。由于與溶劑的快速交換，賴氨酸側鏈的氨基不在HSQC譜中出現(xiàn)，說明α-突觸核蛋白與多酚及其氧化物反應后生成了仲胺鍵。
實施例4寡聚體蛋白的制備將對苯二醌或多巴胺與α-突觸核蛋白在37℃保溫1～2天后，取出100μL反應混合物，注射到預先用100mM PBS溶液平衡好的Superose-12HR 10/30柱(Pharmacia公司產(chǎn)品)中，以0.4mL/min的流速進行洗脫。A280與洗脫時間圖(圖3)上可以看出，未保溫的α-突觸核蛋白只在30～35分鐘出現(xiàn)一個峰，這是單體蛋白的峰；而于對苯二醌或多巴胺反應1～2天后，除了在30～35分鐘出現(xiàn)一個峰外，還在23～29分鐘出現(xiàn)了一個峰，這就是寡聚體蛋白的峰。收集23～29分鐘洗脫出的蛋白，即得到含多酚化合物的寡聚體蛋白。
實施例5寡聚體的鑒定將收集的寡聚體蛋白進行激光基質(zhì)解離吸附質(zhì)譜測試，在譜圖(圖4)上接近30,000Da有一個主要的峰，在接近15,000Da有一個小峰，這表明有二體的共價加合物。將收集的寡聚體蛋白用冷凍干燥凍干后，用含8M尿素或不含尿素的SDS上樣緩沖液溶解，然后加樣到膠濃度為15％的SDS-PAGE上進行電泳分析，用馬斯亮藍R250染色。電泳結果顯示(圖5)，除36KDa和54KDa的條帶外，還有更大分子量的條帶。單體的α-突觸核蛋白在SDS-PAGE電泳圖譜上的分子量為18KDa，這說明形成了二體，三體甚至更大分子量的共價交聯(lián)寡聚體。
實施例6寡聚體的毒性用DMEM培養(yǎng)基(另含有60％馬血清，10％牛胎血清，100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)在37℃下于5％CO2培養(yǎng)箱中增殖PC12細胞(大鼠嗜鉻細胞瘤細胞，rat pheochromocytoma)，顯微鏡下檢測細胞的生長情況，以每孔1×105個活細胞的密度接種于48孔培養(yǎng)板中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，把培養(yǎng)基換成200μL不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基。在細胞培養(yǎng)板中加入終濃度為10μM的蛋白質(zhì)積聚物(樣品為α-突觸核蛋白與多巴胺反應1天后除去過量的多巴胺，以及從分子排阻層析中分離得到的多巴胺-α-突觸核蛋白的單體加合物)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，加入終濃度為0.5mg/mL的MTT溶液，三小時后加入相同細胞培養(yǎng)液體積的細胞裂解液(20％SDS，50％DFM，pH4.7)，并過夜培養(yǎng)。利用MTT被活細胞還原的能力讀取570nm下的可見光吸收值(圖6)。從圖上可以看出，單體加合物對PC12細胞的MTT的還原率在90％以上，而去除多巴胺的樣品對PC12細胞的MTT的還原率在75％左右。多巴胺與α-突觸核蛋白反應后主要形成單體加合物以及少量的寡聚體。因此說明寡聚體對細胞是具有毒性的。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.多酚類化合物及其氧化物在制備用于抑制α-突觸核蛋白纖維化的制劑中的用途。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多酚類化合物選自鄰苯二酚，對苯二酚，多巴胺，左旋多巴，對苯二醌，茶多酚，EGCG，維生素C，對硝基苯酚或間苯三酚。
3.多酚類化合物及其氧化物在用于檢測α-突觸核蛋白中的用途。
4.一種α-突觸核蛋白與多酚類化合物及其氧化物的加合物，其特征在于，在所述加合物中，多酚類化合物及其氧化物與α-突觸核蛋白中賴氨酸的側鏈氨基共價連接。
5.根據(jù)權利要求4所述的加合物，其特征在于，所述多酚-α-突觸核蛋白加合物呈單體或寡聚體加合物形式。
6.根據(jù)權利要求5所述的加合物，其特征在于，所述多酚類化合物及其氧化物帶有標記。
7.一種抗體，其特征在于，它針對權利要求4所述的α-突觸核蛋白或其片段與多酚類化合物及其氧化物的加合物。
8.權利要求4所述的α-突觸核蛋白與多酚類化合物及其氧化物的加合物在篩選抗帕金森病的藥物中的用途。
9.權利要求4所述的α-突觸核蛋白與經(jīng)標記的多酚類化合物及其氧化物的加合物在放射性同位素檢測或正電子斷層成像中作為探針的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了多酚類化合物及其氧化物在制備用于抑制α－突觸核蛋白纖維化的制劑中的用途，以及在用于檢測α－突觸核蛋白中的用途。本發(fā)明還涉及一種多酚類化合物及其氧化物與α－突觸核蛋白中賴氨酸的側鏈氨基共價連接而形成的單體或寡聚體加合物及其用途和針對該加合物的抗體。
文檔編號A61K31/375GK1723878SQ20041005294
公開日2006年1月25日 申請日期2004年7月19日 優(yōu)先權日2004年7月19日
發(fā)明者胡紅雨, 李洪濤 申請人:中國科學院上海生命科學研究院