專利名稱：小檗堿作為抗真菌藥物增效劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是小檗堿增強(qiáng)抗真菌藥物作用的新用途。
背景技術(shù)：
小檗堿，又名黃連素，是臨床上常用的抗菌藥，臨床治療作用廣泛，可用于治療腸道感染、細(xì)菌性痢疾、眼結(jié)膜炎、化膿性中耳炎、心率失常、充血性心力衰竭等，未見其有抗真菌作用的報(bào)道，更未見其與抗真菌藥物聯(lián)合使用治療真菌病的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種小檗堿作為抗真菌藥物增效劑的新用途。經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其對(duì)氟康唑、酮康唑、硫康唑、咪康唑等抗真菌化合物具有明確的增效作用，對(duì)于臨床耐藥性菌株和實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的耐藥性菌株，當(dāng)抗真菌藥物與小檗堿合用時(shí)，能明顯降低抗真菌藥物的用藥劑量，增強(qiáng)對(duì)耐藥真菌的抑制作用。因此可將小檗堿用作抗真菌藥物的增效劑，用于不同深部和淺表真菌感染的治療。
本發(fā)明為小檗堿開辟了新的用途，將其用于抗真菌藥物的增效劑，不僅能提高藥物的抗真菌作用，而且在臨床致病真菌耐藥性日趨普遍，耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用，其意義可想而知。


圖1為0.25μg/ml小檗堿和10μg/ml氟康唑合用時(shí)，治療深部白念珠菌感染小鼠的存活數(shù)與存活時(shí)間折線圖。
圖2為0.5μg/ml小檗堿和20μg/ml氟康唑合用時(shí)，治療深部白念珠菌感染小鼠的存活數(shù)與存活時(shí)間折線圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1小檗堿與氟康唑合用對(duì)不同臨床真菌株的作用材料和方法1.試藥鹽酸小檗堿上海利生制藥廠，批號(hào)Y-001-001007。
氟康唑常州第二制藥廠，批號(hào)20000928。
二甲亞砜中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)20011022。
鹽酸小檗堿用二甲亞砜分別配成1600、100、50、10μg/ml不同濃度，氟康唑用三蒸水配成6.4mg/ml的濃度，受試藥物于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)。
2.菌株臨床株白念珠菌(930612、9703154、960468、950812、010213)、煙曲霉菌(102163)、申克氏孢子絲菌(9912063-23)，均由上海長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供，分別采自該醫(yī)院不同科室臨床樣本，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。
所有實(shí)驗(yàn)用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)劃板活化，白念珠菌于30℃培養(yǎng)2天，煙曲霉菌和申克氏孢子絲菌于35℃培養(yǎng)1周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置SDA斜面，用上述方法培養(yǎng)后于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液RPMI1640(Gibco BRL公司)10.0g，NaHCO3 2.0g，嗎啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH調(diào)pH至7.0，定容至1000ml，濾過消毒，4℃保存。
沙堡葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，調(diào)整pH至7.0，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。
YEPD培養(yǎng)液酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高壓滅菌后4℃保存。
4.儀器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；THZ-82A臺(tái)式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；511型酶標(biāo)分析儀(上海第三分析儀器廠)；5.菌液制備(1)白念珠菌菌液從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白念珠菌少量，接種至1ml YEPD培養(yǎng)液，于30℃以200rpm振蕩培養(yǎng)活化，使真菌處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期。取該菌液至1mlYEPD培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化16小時(shí)后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至3×103～5×103個(gè)/ml的濃度。
從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取絲狀菌少量接種至SDA斜面，于35℃培養(yǎng)一周后，再次挑取少量接種至SDA斜面，于35℃培養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)前加適量RPMI1640培養(yǎng)液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游離于RPMI1640培養(yǎng)液中，然后經(jīng)四層無菌紗布過濾。培養(yǎng)液經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，加RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整孢子濃度至3×103～5×103個(gè)/ml的濃度濃度。
6.藥敏板制備取無菌96孔板，于每排1號(hào)孔加RPMI 1640培養(yǎng)液100μl作空白對(duì)照；3～12號(hào)孔各加新鮮配制的菌液99μl；2號(hào)孔分別加菌液196μl和6.4mg/ml的氟康唑溶液2μl。在2號(hào)孔中加入相應(yīng)濃度的小檗堿2μl，而3～11號(hào)孔加入小檗堿1μl。
對(duì)2～11號(hào)孔進(jìn)行10級(jí)倍比稀釋，使2～11各孔的最終氟康唑濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，而小檗堿濃度保持恒定；1號(hào)孔為不含藥物的RPMI 1640培養(yǎng)液，作為陰性對(duì)照，12號(hào)孔為不含藥物的菌液，作為陽性對(duì)照。各藥敏板于30℃培養(yǎng)。
7.MIC80值判定白念珠菌和絲狀菌分別于30℃培養(yǎng)24小時(shí)和一周后，用酶標(biāo)分析儀于620nm測(cè)各孔OD值。與陽性對(duì)照孔比，以O(shè)D值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC80(真菌生長(zhǎng)80％被抑制時(shí)的藥物濃度)。
當(dāng)藥物的MIC80值超過測(cè)定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)MIC80值高于最高濃度64μg/ml時(shí)，計(jì)為“＞64μg/ml”；MIC80值低于最低濃度0.125μg/ml時(shí)，計(jì)為“≤0.125μg/ml”。
上述實(shí)驗(yàn)均平行操作2到3次，當(dāng)MIC80值能準(zhǔn)確重復(fù)時(shí)才被接受；當(dāng)MIC80值相差一個(gè)濃度以上時(shí)，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2表1 小檗堿與氟康唑合用對(duì)4株臨床白念珠菌的MIC80值白念 白念 白念白念編號(hào) 化合物(μg/ml)930612 9703154 960468 9508121 Flu+Ber(1.0)0.25 0.5 0.5 0.52 Flu+Ber(0.5)0.25 0.25 0.5 0.53 Flu+Ber(0.1)0.5 21 14 Flu 0.5 22 15 Ber(1) --- -注Flu表示氟康唑，Ber表示小檗堿(下同)表2 小檗堿與氟康唑合用對(duì)2株臨床孢子絲菌和煙曲霉菌的MIC80值化合物編號(hào).
孢子絲9912063-23 煙曲102163(μg/ml)1Flu+Ber(16)≤0.0625 ≤0.06252Flu＞32 ＞323Ber(16)--由表1和表2可見，1μg/ml的小檗堿可使5種臨床白念珠菌對(duì)氟康唑的MIC80值下降2-4倍，16μg/ml的小檗堿可使臨床孢子絲菌和煙曲霉菌的MIC80值從32μg/ml降為0.0625μg/ml，說明小檗堿能明顯增強(qiáng)氟康唑的抗真菌作用。
實(shí)施例2小檗堿與氟康唑合用對(duì)不同臨床和實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株的作用材料和方法1.試藥鹽酸小檗堿上海利生制藥廠，批號(hào)Y-001-001007。
氟康唑常州第二制藥廠，批號(hào)20000928。
二甲亞砜中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)20011022。
鹽酸小檗堿用二甲亞砜分別配成1600、1280、200、50μg/ml不同濃度，氟康唑用三蒸水配成6.4mg/ml，受試藥物于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)。
2.菌株臨床耐藥株白念珠菌(01、13、16、25、55)均由上海長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供，分別采自該醫(yī)院不同科室臨床樣本，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。
實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥株白念珠菌(resis-Y01、resis-010213、resis-5314)分別為白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC76625、長(zhǎng)海臨床株01021、國(guó)際通用株SC5314經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)形成的耐藥株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。
其它實(shí)驗(yàn)步驟與方法同實(shí)施例1。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3、表4表3小檗堿與氟康唑合用對(duì)3株實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)白念珠菌耐藥株的MIC80值編號(hào) 化合物(μg/ml)resis-Y01 resis-01023 resis-53141Flu+Ber(16) 0.5 ≤0.1252Flu+Ber(12.8) 0.5 ≤0.125 0.253Flu+Ber(2)0.5 ≤0.1254Flu+Ber(0.5) 15Flu ＞64＞64 ＞326Ber(16) - --表4小檗堿與氟康唑合用對(duì)5株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值白念白念白念 白念 白念編號(hào).化合物(μg/ml)01 13 1625 551Flu+Ber(2)32 1 2 2 12Flu+Ber(1)＞6416 164 ＞643Flu+Ber(0.5) ＞6432 ＞64 ＞64 ＞644Flu ＞6464 ＞64 ＞64 ＞645Ber(2)- - - - -由表3、表4可以看出，原先對(duì)氟康唑耐藥的臨床白念珠菌株MIC80值＞64，合用2μg/ml的小檗堿即可使氟康唑的MIC80值下降為1-2μg/ml，對(duì)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的耐藥白念珠菌，合用2μg/ml的小檗堿即可使氟康唑的MIC80值下降為0.5-0.125μg/ml，說明小檗堿能使菌株恢復(fù)對(duì)藥物的敏感性，大大增強(qiáng)氟康唑的抗真菌效力，且具有劑量依賴性。
實(shí)施例3小檗堿與其他唑類抗真菌藥的聯(lián)合用藥材料和方法1.藥物硫康唑第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)教研室合成，批號(hào)19991005。
咪康唑第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)教研室合成，批號(hào)19990716。
酮康唑第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)教研室合成，批號(hào)19970407。
硫康唑、咪康唑、酮康唑分別用二甲亞砜配成6.4mg/ml濃度，鹽酸小檗堿用二甲亞砜分別配成1600、800、400、200、100、50和0.25μg/ml不同濃度。受試藥物于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將藥物貯存液取出置35℃溫箱融化，充分混勻，分別進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)。
其它實(shí)驗(yàn)步驟和方法同實(shí)施例1。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5、6、7表5小檗堿與硫康唑合用對(duì)3株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值編號(hào) 化合物(μg/ml)白念55 白念13白念161Sulcon+Ber(16)≤0.125≤0.125 ≤0.1252Sulcon+Ber(8) 0.25 ≤0.125 13Sulcon+Ber(4) 0.25 ≤0.1254Sulcon+Ber(2) 0.25 0.55Sulcon+Ber(1) 1 26Sulcon+Ber(0.5) 1 27Sulcon+Ber(0.25) 1 28Sulcon(64)8 ＞64 2注Sulcon表示硫康唑，Ber表示小檗堿表6小檗堿與咪康唑合用對(duì)2株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值編號(hào) 化合物(μg/ml) 白念55 白念131Micon+Ber(16)0.25 ≤0.1252Micon+Ber(8) 0.25 ≤0.1253Micon+Ber(4) 1 0.54Micon+Ber(2) 2 15Micon+Ber(1) 4 16Micon+Ber(0.5) 4 27Micon+Ber(0.25) 4 28Micon(64)8 32注Micon表示咪康唑，Ber表示小檗堿表7小檗堿與酮康唑合用對(duì)3株臨床白念珠菌耐藥株的MIC80值編號(hào) 化合物(μg/ml) 白念55 白念13 白念161Ketocon+Ber(16) ≤0.125 ≤0.125 ≤0.1252Ketocon+Ber(8) ≤0.125 ＞64≤0.1253Ketocon+Ber(2) ≤0.125 ＞64≤0.1254Ketocon 4 ＞64≤0.125注Ketocon表示酮康唑，Ber表示小檗堿由表5、6、7可見，小檗堿不但可與氟康唑合用產(chǎn)生協(xié)同作用，而且與硫康唑、咪康唑、酮康唑等抗真菌藥同樣具有抗菌增效作用。合用16μg/ml的小檗堿即可使硫康唑、咪康唑、酮康唑?qū)δ退幇啄钪榫腗IC80值從8-64μg/ml下降為0.25-0.125μg/ml，且隨小檗堿劑量增加效用增強(qiáng)，具有劑量依賴性。
實(shí)施例4小檗堿與氟康唑合用對(duì)小鼠系統(tǒng)性真菌感染的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)用小鼠種系為ICR小鼠，由中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。
耐藥白念珠菌(25號(hào)臨床株)經(jīng)小鼠體內(nèi)毒力恢復(fù)后，重新在SDA培養(yǎng)基上活化，YEPD液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整濃度為3.2×107個(gè)/ml，給予小鼠尾靜脈注射，造成小鼠深部真菌感染模型。
48只小鼠分兩批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第一批18只小鼠，分成對(duì)照組、氟康唑(0.25mg/kg)組、氟康唑(0.25mg/kg)合用小檗堿(10mg/kg)組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6只，雌雄各半。在造成小鼠深部真菌感染后，開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，共觀察14天，對(duì)照組給予等量的生理鹽水。第二批30只小鼠，分成對(duì)照組、氟康唑(0.5mg/kg)組、氟康唑(0.5mg/kg)合用小檗堿(20mg/kg)組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10只，雌雄各半。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天，共觀察21天，對(duì)照組給予等量的生理鹽水。計(jì)算各組小鼠的平均存活天數(shù)，并以感染天數(shù)為橫坐標(biāo)，以小鼠存活只數(shù)為縱坐標(biāo)作折線圖，折線下降的緩急程度表示小鼠死亡的快慢程度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表8、圖1和表9、圖2表8小檗堿與氟康唑合用對(duì)白念珠菌深部感染小鼠存活時(shí)間的影響鼠號(hào)\組別 生理鹽水氟康唑(0.25mg/kg)合用小檗堿(10mg/kg)1 3.5天 4天 ＞14天2 3.5天 3.5天4天3 3天 5天 4天4 3.5天 2天 12天5 3天 5.5天11天6 3天 9天 13天平均存活時(shí)間(天)3.254.83 8.80標(biāo)準(zhǔn)差 0.272.38 4.44P 0.1370.013表9小檗堿與氟康唑合用對(duì)白念珠菌深部感染小鼠存活時(shí)間的影響鼠號(hào)\組別 生理鹽水氟康唑(0.5mg/kg) 合用小檗堿(20mg/kg)1 7天 6天 6天2 3天 4天 9天3 3天 9天 6天4 7天 6天 3天5 3天 6天 9天6 3天 12天 12天7 5天 14天 13天8 7天 12天 15天9 3天 13天 19天10 3天 11天 20天平均存活時(shí)間(天)4.409.30 11.20標(biāo)準(zhǔn)差 1.903.56 5.65P 0.0010.002
由上述表和圖可見，0.25μg/ml的小檗堿和10μg/ml的氟康唑合用治療深部白念珠菌感染小鼠，與單獨(dú)使用氟康唑相比較，可使小鼠的平均存活時(shí)間從4.8天延長(zhǎng)到8.8天；0.5μg/ml的小檗堿和20μg/ml的氟康唑合用治療深部白念珠菌感染小鼠，與單獨(dú)使用氟康唑相比較可使小鼠的平均存活時(shí)間從9.3天延長(zhǎng)到11.2天，說明小檗堿和氟康唑合用，均可延長(zhǎng)白念珠菌深部感染小鼠的存活時(shí)間，顯示了小檗堿對(duì)抗菌藥的增效作用。
權(quán)利要求
1.小檗堿用作抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于所說抗真菌劑為氟康唑、酮康唑、硫康唑、咪康唑，小檗堿在抗真菌劑有效濃度中加入量不低于0.5μg/ml。
2.按權(quán)利要求1所述小檗堿用作抗真菌藥物增效劑的用途，其特征在于小檗堿的加入量為0.5～16μg/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是將小檗堿用作抗真菌藥物增效劑的新用途。經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，小檗堿與氟康唑、酮康唑、硫康唑等抗真菌藥合用，能不同程度地提高對(duì)淺表部或深部真菌感染的治療效果，并能使抗真菌藥物恢復(fù)對(duì)耐藥真菌的作用。因此可用作抗真菌藥物的增效劑。
文檔編號(hào)A61K31/4375GK1596894SQ200410052989
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者徐錚, 曹永兵, 高平揮, 張軍東, 曹穎瑛, 權(quán)華, 姜遠(yuǎn)英 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)