專利名稱：與半胱天冬蛋白酶－8相互作用的蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總地涉及半胱氨酸蛋白酶領域。更具體地說，本發(fā)明涉及與半胱天冬蛋白酶-8(MACH)相互作用和/或調節(jié)其在CD95(Fas/Apo-1)或CD120a(p55-TNF受體)介導的細胞死亡(或凋亡)通道中的功能的蛋白。
具體地說，本發(fā)明涉及與半胱天冬蛋白酶-8/MACH直接或間接相互作用的蛋白。本發(fā)明還涉及與半胱天冬蛋白酶-8/MACH相互作用的蛋白的制備和應用。
背景技術：
腫瘤壞死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)(在下文中TNF指TNF-α和TNF-β)是多功能促炎細胞因子，它們主要由單核吞噬細胞形成，對細胞有多種作用(Wallach，D.(1986)，Interferon 7(Ion Gresser編輯)，83-122頁，Academic Press，London；和Beutler和Cerami(1987))。TNF-α和TNF-β通過結合特異性細胞表面受體來啟動其作用。其中一些作用可能對生物體有利它們可能會破壞(例如)腫瘤細胞或感染了病毒的細胞，并增強粒細胞的抗菌活性。通過這種方式，TNF對于保護生物體抵御腫瘤和感染性因子以及從損傷中恢復有貢獻。因此，TNF可用作抗腫瘤劑，在該應用中，它結合腫瘤細胞表面上的受體，從而啟動了導致腫瘤細胞死亡的行為。TNF還可用作抗感染劑。
然而，TNF-α和TNF-β均有有害的作用。有證據表明，過度產生TNF-α會在幾種疾病中起主要致病作用。例如，已經知道，TNF-α主要作用于脈管結構，這是膿毒休克癥狀的主要病因(Tracey等，1986)。在一些疾病中，TNF可能會通過抑制脂肪細胞的活性和引起缺乏食欲而導致體重過度減輕(惡液質)，因此TNF-α稱為惡液質素。另外，它還被描述成是風濕性疾病中組織損傷的一種中介體(mediator)(Beutler和Cerami，1987)，以及移植物抗宿主反應中所見破壞的主要中介體(Piquet等，1987)。此外，已知TNF參與發(fā)炎過程和其它許多疾病。
兩種不同的、獨立表達的受體p55(CD120a)和p75(CD120b)TNF-Rs(它們與TNF-α和TNF-β特異性結合)啟動和/或介導了TNF的上述生物學效應。這兩種受體在結構上有不相似的胞內結構域，這暗示它們的信號傳導方式不同(參見Hohmann等，1989；Engelmann等1990；Brockhaus等，1990；Leotscher等，1990；Schall等，1990；Nophar等，1990；Smith等，1990；和Heller等，1990)。然而，例如涉及CD120a和CD120b胞內信號傳導的各種蛋白和可能存在的其它因子的細胞機制還沒有得到闡明。正是該胞內信號的傳導(通常在配體(即TNFα或β)結合受體后發(fā)生)致使級聯(lián)反應開始并最終導致所見的細胞對TNF的反應。
關于上述TNF的殺細胞作用，就目前研究的大多數(shù)細胞而言，該作用主要由CD120a引發(fā)?？笴D120a胞外結構域(配體結合域)的抗體本身能引發(fā)殺細胞效應(見EP 412486)，該效應與受體交聯(lián)抗體的效率相關，認為這是胞內信號傳導過程產生的第一步。而且，誘變研究(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993)已經表明，CD120a的生物功能取決于其胞內結構域的完整性，因此，已提出導致TNF殺細胞效應的胞內信號傳導啟動的發(fā)生是CD120a的兩個或多個胞內結構域締合的結果。而且，TNF(α和β)形成均三聚體，因此，已提出通過CD120a靠其結合和交聯(lián)受體分子(即引起受體聚集)的能力來誘導胞內信號傳導。
TNF/NGF受體超家族的另一個成員是FAS/APO1受體(CD95)(也稱為FAS抗原)，它是在各種組織中表達的一種細胞表面蛋白，它與許多細胞表面受體(包括TNF-Rs和NGF-R)同源。CD95以凋亡方式介導細胞死亡(Itoh等，1991)，并且好象是自身反應T細胞的陰性選擇物，即，在T細胞成熟期間，CD95介導了識別自身抗原的T細胞的凋亡性死亡。也已發(fā)現(xiàn)，CD95基因(lpr)中的突變在小鼠中引起了與人自身免疫疾病—系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)—相似的淋巴細胞增生疾病(Watanabe-Fukunaga等，1992)。CD95的配體看來是其它細胞中殺傷T細胞(或細胞毒性T淋巴細胞-CTL)中攜帶的細胞表面相關分子，因此，當該CTL接觸攜帶CD95的細胞時，它們能誘導攜帶CD95的細胞編程性細胞死亡。另外，已經制得對CD95有特異性的單克隆抗體，該單克隆抗體能誘導攜帶CD95的細胞(包括被編碼人CD95的eDNA轉化的小鼠細胞)凋亡性細胞死亡(Itoh等，1991)。
盡管淋巴細胞的一些細胞毒性效應是通過淋巴細胞產生的配體與廣泛存在的細胞表面受體CD95(它能引發(fā)細胞死亡)的相互作用而介導的，但是也已發(fā)現(xiàn)，除T淋巴細胞外的其它各種正常細胞也在其表面表達CD95，并且能通過觸發(fā)該受體而被殺死。懷疑是由于對該殺死過程的失控性誘導而導致了某些疾病中組織破壞(例如急性肝炎中的肝細胞破壞)。因此，尋找方法來抑制CD95的細胞毒性活性可能會有治療潛力。
相反，由于已經發(fā)現(xiàn)某些惡性細胞和HIV感染的細胞在其表面攜帶了CD95，因此可利用抗CD95的抗體或CD95配體來引發(fā)這些細胞中的CD95介導的胞毒作用，從而提供一種抵抗這些惡性細胞或HIV-感染的細胞的方法(見Itoh等，1991)。因此，尋求其它方法來增強CD95胞毒活性可能也會有治療潛力。
提供一種調節(jié)對TNF(α或β)和CD95配體的細胞反應的方法是人們長期以來的需求。例如，在上述病理場合下，當TNF或CD95配體過度表達時，就需要抑制TNF或CD95配體誘導的殺細胞效應，而在其它場合，例如傷口愈合的應用中，則希望增強TNF的效應，或在CD95的情況下，在腫瘤細胞或HIV感染的細胞中，希望增強CD95介導的效應。
申請人已經用了各種方法(例如參見歐洲專利申請No.EP 186833，EP 308378，EP398327和EP 412486)來調節(jié)TNF的有害作用，方法是用抗TNF抗體或可溶性TNF受體(基本上是此受體的可溶性胞外結構域)與TNF競爭和細胞表面結合的TNF-Rs結合，從而抑制TNF與其受體結合。另外，由于TNF與其受體的結合是TNF誘導細胞效應所需的，因此申請人已經設法通過調節(jié)TNF-Rs的活性來調節(jié)TNF的作用(例如參見EP 568925)。
例如，EP 568925涉及一種調節(jié)信號轉導和/或TNF-Rs中斷裂的方法，從而肽或其它分子可與受體本身或與該受體相互作用的效應蛋白相互作用，從而調節(jié)了TNF-Rs的正常功能。在EP 568925中，描述了在CD120a的胞外、跨膜和胞內結構域中有突變的各種CD120a突變體的構建和性質分析。這樣，CD120a的上述結構域內的區(qū)域被確定為受體發(fā)揮功能(即與配體(TNF)結合以及隨后的信號轉導和胞內信號傳導，最終導致所見的TNF對細胞的效應)所必需的。而且，該文還描述了許多分離和鑒定蛋白、肽或其它因子的方法，這些蛋白、肽或其它因子能結合CD120a上述結構域內的不同區(qū)域，可能參與了TNF-Rs活性的調節(jié)或調控。在EPO 368925中還描述了分離和克隆編碼這些蛋白和肽的DNA序列的方法；構建表達載體來產生這些蛋白和肽的方法；以及與CD120a或與結合CD120a不同區(qū)域的上述蛋白和肽相互作用的抗體或其片段的制備方法。然而，EP 568925沒有指明結合TNF-Rs(如CD95)胞內結構域的實際蛋白和肽，也沒有描述用來分離和鑒定結合TNF-Rs胞內結構域的這些蛋白和肽的酵母雙雜交方法。同樣，EP 568925也沒有公開能結合CD95胞內結構域的蛋白或多肽。
因此，當希望抑制TNF或CD95配體的作用時，需要減少細胞表面的TNF-Rs或CD95的數(shù)量或活性，而當需要增強TNF或CD95配體的作用時，希望增加TNF-Rs或CD95的數(shù)量或活性。出于這一目的，已經對CD120a和CD120b的啟動子進行了測序和分析，并且已經發(fā)現(xiàn)了許多對不同轉錄調節(jié)因子有特異性的一些關鍵序列基序，因此可以在其啟動子水平來控制這些TNF-Rs的表達，即通過抑制啟動子的轉錄來減少受體數(shù)量，增強啟動子轉錄來增加受體數(shù)量(EP 606869和WO 9531206)。
盡管已經知道腫瘤壞死因子(TNF)受體以及結構上相關的受體CD95，在受白細胞產生的配體刺激時，在細胞內引發(fā)了導致細胞自身死亡的破壞性活性，但是對該引發(fā)的機制仍知之甚少。突變研究表明，在CD95和CD120a中，細胞毒性的信號傳導涉及其胞內結構域的不同區(qū)域(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)。這些區(qū)域(“死亡結構域”)的序列相似。CD95和CD120a的“死亡域”均有自身締合(self-associate)的趨勢。它們的自身締合明顯促進了信號傳導作用啟動所需的受體聚集(見Song等，1994；Wallach等，1994；Boldin等，1995)，且在高水平受體表達下會導致引發(fā)不依賴于配體的信號傳導(Boldin等，1995)。
一些淋巴細胞的細胞毒性效應受淋巴細胞產生的配體和CD95相互作用所介導，CD95是一種廣泛存在的細胞表面受體，它能引發(fā)細胞死亡(另見Nagata和Golstein，1995)；而單核吞噬細胞殺死細胞作用涉及配體-受體配對—TNF及其受體CD120a，它們在結構上與CD95及其配體相關(另見Vandenabeele等，1995)。和其它受體誘導的效應一樣，TNF受體和CD95通過一系列蛋白-蛋白相互作用(從配體-受體結合到最終激活酶促效應功能)誘導細胞死亡，在研究中已經描述啟動細胞死亡信號傳導作用的非酶促蛋白-蛋白相互作用TNF或CD95配體三聚體分子與受體結合，其胞內結構域相互作用(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)由于死亡域基序自身締合的趨勢而增強(Boldin等，1995a)，以及兩種細胞質蛋白(這兩種蛋白也能相互結合)與受體胞內結構域受誘導結合—MORT-1(或FADD)與CD95結合(Boldin等，1995b；Chinnaiyan等，1995；Kischkel等，1995)，TRADD與CD120a結合(Hsu等，1995；Hsu等，1996)。用酵母雙雜交篩選程序鑒定出三種蛋白，這些蛋白與CD95和CD120a胞內結構域的“死亡結構域”結合，而“死亡結構域”通過同源區(qū)域的異質性締合來參與受體誘導細胞死亡，這些蛋白還能獨立地引發(fā)細胞死亡。它們中的一種蛋白是MORT-1(Boldin等，1995b)，也稱為FADD(Chinnaiyan等，1995)，它能特異性地結合CD95。第二種是TRADD(另見Hsu等，1995，1996)，它與CD120a結合，第三種是RIP(另見Stanger等，1995)，它與CD95和CD120a結合。這些蛋白除了能結合CD95和CD120a外，還能相互結合，從而在CD95和CD120a之間提供了功能性“串話(cross-talk)”。這些結合發(fā)生在受體及其締合蛋白中共有的保守序列基序—“死亡結構域組件”中。另外，盡管在酵母雙雜交測試中，MORT-1顯示出自發(fā)結合CD95，但是在哺乳動物細胞中，這一結合只有在受體受刺激后才會發(fā)生，這暗示MORT-1參與了CD95信號傳導的啟動行為。MORT-1不含酶活性特征的序列基序，因此，它引發(fā)細胞死亡的能力看來似乎并不是MORT-1本身固有的活性，而是激活了結合MORT-1的其它一些蛋白，并進一步作用于信號級聯(lián)反應的下游。分子缺少N端部分的MORT-1突變體的細胞表達已經顯示出阻斷CD95或CD120a誘導的細胞毒性(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)，這說明此N端區(qū)域通過蛋白-蛋白的相互作用傳遞了兩種受體殺細胞效應的信號。
最近的研究已經暗示了一組胞質硫醇蛋白酶，它們在各種生理性細胞死亡過程開始時與Caenorhabditis elegans蛋白酶CED3以及哺乳動物白介素-1β轉化酶(ICE)在結構上相關(綜述見Kumar，1995和Kenkart，1996)。也有一些跡象表明，該家族的蛋白酶可能參與了CD95和TNF-Rs誘導的細胞毒性。發(fā)現(xiàn)這些蛋白酶的特異性肽抑制劑以及封閉其功能的兩種病毒編碼的蛋白(牛痘蛋白crmA和桿狀病毒p35蛋白)為細胞提供了抗此細胞毒性的保護力(Enari等，1995；Los等，1995；Tewari等，1995；Xue等，1995；Beidler等，1995)。某些特異性細胞蛋白的迅速斷裂明顯是由CED3/ICE家族蛋白酶介導的，這可在CD95或TNF-Rs刺激后不久在細胞內得到證實。
最近，已經分離、克隆并鑒定出這樣一種蛋白酶及其各種同種型(包括抑制性的同種型)，命名為MACH(也稱為半胱天冬蛋白酶(caspase)-8)，它是一種MORT-1結合蛋白，作用是調節(jié)MORT-1活性進而調節(jié)CD95和CD120a的活性，可能還獨立地作用于MORT-1，關于其可能的用途在共同擁有的待批以色列專利申請No.IL 114615，114986，115319，116588和117932及其對應的PCT申請No.PCT/US96/10521和本發(fā)明者最近的出版文獻(Boldin等，1996)中有詳細描述，它們全部納入本文作參考。本發(fā)明者(未發(fā)表)和其它人(Fernandes-Alnemri等，1996；Srinivasula等，1996)最近還分離并鑒定出另一種此類蛋白酶及其各種同種型(包括抑制性同種型)，其命名為Mch4(也稱為半胱天冬蛋白酶-10)。半胱天冬蛋白酶-10也是一種MORT-1結合蛋白，其作用是調節(jié)MORT-1的活性，因此可能也能調節(jié)CD95和CD120a的活性，可能還獨立作用于MORT-1。因此，上述文獻中還描述了關于半胱天冬蛋白酶-10的所有方面、特征、性質和用途，所有這些文獻均全部納入本文作參考。
還應注意，半胱天冬蛋白酶、半胱天冬蛋白酶-8和半胱天冬蛋白酶-10具有相似的前域(prodomain)(見Boldin等，1996；Muzio等，1996；Fernandes-Alnemri等，1996；Vincent和Dixit，1997)，它們通過其前域與MORT-1相互作用，該相互作用是通過MORT-1N端部分中的、以及半胱天冬蛋白酶-8和半胱天冬蛋白酶-10中重復存在的“死亡域基序”或“死亡效應域”DED而發(fā)生的(見Boldin等，1995b；Chinnalyan等，1995)。
這些蛋白酶(現(xiàn)在稱為半胱天冬蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶))是一個數(shù)量漸增的具有幾個共同特征的半胱氨酸蛋白酶家族。已經發(fā)現(xiàn)大多數(shù)半胱天冬蛋白酶參與了編程性細胞死亡或凋亡的啟動和執(zhí)行，而其他的看來參與了促炎細胞因子的產生(Nicholson DW等人，1997，Salvesen GS等人，1997，Cohen GM 1997)。它們被合成作為無催化活性的前體，通?？拷Y構域間接頭中存在的特異性內部天冬氨酸殘基斷裂來激活。半胱天冬蛋白酶的斷裂位點用四肽序列(X-X-X-D)來確定，而斷裂總發(fā)生在天冬氨酸的下游。結果，某些成熟的活性半胱天冬蛋白酶就能加工并激活其自身以及其他無活性的前體(Femandes-Alnemri T等人，1996，Srinivasula SM等人，1996)。
編程性細胞死亡過程的激活通常是特異性的，涉及上游的半胱天冬蛋白酶(稱為“啟動”半胱天冬蛋白酶)對下游的半胱天冬蛋白酶(稱為“執(zhí)行半胱天冬蛋白酶”)的連續(xù)加工。這兩類半胱天冬蛋白酶的結構也反映了它們的功能特征。實際上，“啟動型半胱天冬蛋白酶”與“執(zhí)行型半胱天冬蛋白酶”相比具有更長的前域區(qū)域(SalvesenGS等人，1997，Cohen GM 1997)。長的區(qū)域允許“啟動物”或“頂端半胱天冬蛋白酶”能被TNF受體家族的死亡受體觸發(fā)激活。在配體誘導死亡受體發(fā)生三聚后，啟動半胱天冬蛋白酶通過其長的N-端前域被募集，與特異性銜接分子相互作用，形成了誘導死亡的信號傳導復合物(Cohen GM 1997，Kischkel FC等人，1995)。例如，半胱天冬蛋白酶-8/MACH以及可能的半胱天冬蛋白酶-10(它含有兩個死亡效應域(DED)或FADD結構域)被銜接分子FADD/MORT-1募集到受體復合物處，而半胱天冬蛋白酶-2通過CRADD/RAIDD以及RIP被募集(Nagata S等人，1997，Mac Farlane等人，1997，Ahmad M等人，1997，Duan H等人，1997)。由于激活的受體復合物的三聚特征，認為至少兩個半胱天冬蛋白酶分子相互毗鄰，從而使它們通過自身催化加工被激活(Yang等人，1998，Muzio等人，1998)。
半胱天冬蛋白酶被合成作為由三個主要亞基組成的酶原，這三個亞基是N-端前域以及兩個亞基，兩個亞基有時被一個接頭肽隔開。兩個亞基稱為“長的”亞基或亞基1(含有活性酶促位點)和“短的”亞基或亞基2。為了完全激活酶，應使前域和兩個亞結構域斷裂。兩個斷裂的亞基形成了一個異二聚體，長的區(qū)域從N-端衍生獲得，短的亞基是半胱天冬蛋白酶前體的C-端區(qū)域衍生獲得。根據半胱天冬蛋白酶-3的推定的三維結構，看來長結構域的C-端和短亞基結構域的N-端必須被釋放，且短亞基的C-端必須與長亞基的N-端緊密毗鄰，以便產生一個正確折疊的有活性的酶(Rotonda等人，1996，Mittl等人，1997，Srinivasula等人，1998)。
N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶是一種已知參與葡糖胺胞內代謝的胞內酶。已經從產生殼多糖酶的細菌霍亂弧菌(Vibrio cholerae)中克隆了含有N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶的基因組DNA片段(Yamano等人，Biosci Biotechnol Biochem.61，p.1349-53，1997)。
編碼大腸桿菌N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶的nagA基因也是已知的[例如參見Peri等人，1990年1月68(1)，123-137頁]。目前還未報道對人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶作了克隆和測序。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白(簡稱半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白)，或其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，它能與半胱天冬蛋白酶-8的亞基1和/或亞基2相互作用。
本發(fā)明還提供了人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶，或其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物。
本發(fā)明還提供了包含圖2、3、5B或6的氨基酸序列的蛋白質。
本發(fā)明還提供了包含Tip-60蛋白的氨基酸序列但不包括氨基酸94至145的蛋白質。
還包括在本發(fā)明范圍內的蛋白質含有下文所述的克隆P27、P70、P79、L7、L12、M26、B4、B17、J40、B13、B37、B33或P74及其剪接變體P16和P43編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了如上所述的蛋白質，它被半胱天冬蛋白酶-8體外或體內切割。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明蛋白質的分離的DNA序列。包含在該范圍內的是圖2和圖3所示的DNA序列。另外還包括在本發(fā)明范圍內的是能在中等嚴謹條件下與所述DNA序列雜交的分離的DNA。
本發(fā)明還提供了一個載體，該載體包含如上所述的DNA序列。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明載體的真核或原核宿主細胞。
本發(fā)明還提供了一種產生本發(fā)明與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物的方法，該方法包括使本發(fā)明的宿主細胞在允許所述蛋白質產生的條件下生長，如所需的那樣影響翻譯后修飾，獲得所述蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，以及分離所述蛋白、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物。
本發(fā)明還提供所述方法，其中細胞是原核細胞。
本發(fā)明還提供所述方法，其中細胞是真核細胞。
本發(fā)明還提供所述方法，其中細胞是哺乳動物、昆蟲、或酵母細胞。
本發(fā)明還提供所述方法，其中細胞是HeLa或293 T HEK細胞。
本發(fā)明還提供所述方法，其中用人CMV啟動子作為啟動子。
另外，本發(fā)明還提供與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的肽，該肽含有本發(fā)明蛋白質的至少4個串聯(lián)的氨基酸。
所述肽的衍生物也包括在本發(fā)明范圍內。另外包括在本發(fā)明范圍內的是能在接觸所述半胱天冬蛋白酶-8時與半胱天冬蛋白酶-8形成共價鍵的所述肽的衍生物。
本發(fā)明還提供了對本發(fā)明DNA序列對應的核苷酸序列有特異性的核酶。
本發(fā)明還提供了一種反義寡核苷酸，它包含對應于本發(fā)明DNA序列的至少9個核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了針對本發(fā)明蛋白質表位的抗體。
本發(fā)明還提供了一種用來檢測與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白質的免疫試驗，該試驗包括本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明還提供了一種用來檢測半胱天冬蛋白酶-8的免疫試驗，該試驗包括本發(fā)明的肽。
本發(fā)明還提供了一種用來檢測半胱天冬蛋白酶-8的免疫試驗，該試驗包括本發(fā)明的蛋白質。
本發(fā)明還提供了鑒定與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白質的方法，該方法包括下列步驟a)提供含有與啟動子相連的含DNA序列基序的報道基因的酵母細胞；a)在所述酵母細胞中表達所述半胱天冬蛋白酶-8的p20亞基；b)在所述酵母細胞內表達DNA結合域與所述半胱天冬蛋白酶-8的p10和/或p20亞基的融合蛋白，其中所述DNA結合域能結合所述DNA序列基序；c)任選地，在所述酵母細胞內表達出未融合的所述半胱天冬蛋白酶-8的p10或p20亞基；d)用由驅動融合蛋白表達的表達載體所組成的文庫轉化所述酵母細胞培養(yǎng)物，該融合蛋白由cDNA文庫和轉錄激活子組成；e)從轉化的酵母細胞中篩選出報道基因激活的酵母細胞，和f)分離步驟e)的酵母細胞，并進一步分離出在其誘餌載體內表達的與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白質。
本發(fā)明還提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體、或衍生物，所述核酶、反義寡核苷酸或抗體調節(jié)半胱天冬蛋白酶-8活性的用途。
本發(fā)明還提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體、或衍生物，所述核酶、反義寡核苷酸或抗體調節(jié)TNF-受體或Fas介導的效應的用途。
本發(fā)明還提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體、或衍生物，所述核酶、反義寡核苷酸或抗體調節(jié)凋亡的用途。
本發(fā)明還提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體、或衍生物，所述核酶、反義寡核苷酸或抗體用作藥劑的用途。
本發(fā)明還提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體、或衍生物，所述核酶、反義寡核苷酸或抗體用作藥劑來治療有原發(fā)性少突神經膠質病(primary oligodendrogliopathy)的多發(fā)性硬化、自身免疫眼色素層視網膜炎(uveoretinitis)、糖尿病、狼瘡、自身免疫心肌炎I、HCV介導的慢性肝炎、慢性胃炎如甲型胃炎、混合結締組織疾病(MCTD)、Crohn疾病或潰瘍性結腸炎的用途。
本發(fā)明還提供了能結合半胱天冬蛋白酶-8相互作用基因啟動子區(qū)域中富含嘌呤的序列的形成三聯(lián)體的寡核苷酸。形成三聯(lián)體的寡核苷酸可含有化學修飾，如用陽離子N，N-二乙基-乙二胺、尿苷、苯并[g]-喹唑啉-2，4-二酮-(1H，3H)-二酮修飾核苷酸之間的磷酸鍵或用苯并[f]喹唑啉-2，4-二酮-(1H，3H)二酮殘基代替胸苷殘基。形成三聯(lián)體的寡核苷酸還可與對DNA有親和力的化學物質共價連接，較佳的是可嵌入DNA的那些試劑，如吖啶和補骨脂素。
本文描述內容中的術語“相互作用”與本發(fā)明蛋白和半胱天冬蛋白酶-8之間的相互作用有關，其意味著包括直接相互作用的形式，如結合、切割和間接的相互作用，如通過銜接蛋白。相互作用可能任選地導致調節(jié)半胱天冬蛋白酶-8介導的信號。
本文描述內容中的術語“結合”，當指半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的結合時，是指半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白與半胱天冬蛋白酶-8的物理結合。該物理結合可在半胱天冬蛋白酶-8或其亞基和本發(fā)明蛋白的混合物進行免疫試驗(如ELISA或RIA試驗)、雙雜交試驗、免疫沉淀試驗、體積分離為基礎的試驗(如非變性丙烯酰胺凝膠電泳或體積排阻凝膠層析)中測得。在采用雙雜交試驗時，認為半胱天冬蛋白酶-8或其亞基被表達成DNA激活結構域融合物，半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白表達成DNA結合域融合物，或反過來。
術語“雙雜交測試”指雙雜交試驗，其中通過在酵母細胞中導入編碼第一蛋白與DNA結合域的融合物的第一表達載體以及編碼第二蛋白與DNA激活結構域的融合物的第二表達載體，可以測定蛋白-蛋白的相互作用。酵母細胞必須含有至少一個被含有所述DNA結合域識別的DNA序列基序的啟動子所推動的報道基因。通常，采用兩個報道基因，如組氨酸合成酶和β-半乳糖苷酶。這使得研究者能避免由突變引起的假陽性。本申請人已經對該技術作了改進，用來篩選、分離和測試介導TNF-Rs和Fas信號的蛋白質，例如參見WO 97/03998及其中的參考文獻。雙雜交測試依靠兩種融合蛋白定位于細胞核。
本文所用的術語“雙雜交測試”還包括一種雙雜交技術的改進方法，其中采用了細胞生長信號傳導蛋白，如ras和sos(Broder等人，Curr Biol 1998，8，1121-4頁，Aronheim等人，Nucl.Acids Res.1997 25，3373-4頁及其參考文獻)。為了起作用，這些蛋白質需要重新定位于細胞膜。這是通過將細胞生長信號傳導蛋白和第一蛋白表達成融合物，將細胞膜定位信號(如十四烷基化信號序列)和第二蛋白表達成融合物來實現(xiàn)的。第一和第二蛋白之間的相互作用會使細胞生長信號傳導蛋白重新定位于細胞膜，從而觸發(fā)細胞生長。然后選出攻擊性生長的細胞作進一步研究。該系統(tǒng)與上述的雙雜交系統(tǒng)不同，因為它不依靠兩種雜交物定位于細胞核。
術語“誘餌”指上述雙雜交測試中的蛋白質，它和DNA結合域表達成融合蛋白。
術語“捕獲物”指上述雙雜交測試中與DNA激活域一起表達成融合物的蛋白質。
附圖簡述

圖1顯示了用作實施例1B描述的雙雜交篩選中的誘餌的半胱天冬蛋白酶-8單鏈構建物的示意圖。
圖2是從cDNA克隆獲得的編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的克隆32的初步部分核苷酸(SEQ ID NO1)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3顯示了由克隆J2的5′延伸區(qū)、EST克隆AA460869和外顯子誘捕克隆L48741組成的N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶的推定人核苷酸全長序列(SEQ ID NO3)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖4A顯示了在單用p55 TNF受體(標為p55 TNFR)、p55 TNF受體與p35、半胱天冬蛋白酶的桿狀病毒抑制劑(p55+p35)或克隆J2(p55+J2)、或p55 TNF受體與不能切割的J2突變體(標為J*，圖3的346位Asp置換成Glu)轉染HEK-293T細胞后克隆J2的功能活性，該活性用凋亡細胞百分數(shù)表示。這些突變體在體內和體外都不能被切割。
圖4B顯示了單獨的、或用p35或J2或J2*轉染后經TNF和環(huán)己酰亞胺處理的凋亡的HeLa細胞的百分數(shù)。
圖5A顯示了克隆P74 5′端的1725個編碼堿基對(SEQ ID NO5)。
圖5B顯示了從圖5A的克隆P74的序列推導出的574個氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖6顯示了從登錄號RPC15-1057I20的PAC克隆的推導氨基酸序列衍生的開放讀框的1428個氨基酸(SEQ ID NO7)。
圖7顯示了從克隆p74的推導氨基酸序列(稱為“克隆的”)衍生的開放讀框的574個氨基酸與從PAC克隆RPCI5-1057I20的推導氨基酸序列(稱為“推導的”)衍生的開放讀框的1428個氨基酸的序列對比。
圖8顯示了PAC克隆RPCI5-1057I20的推導氨基酸序列(頂部序列)(SEQ ID NO8)的開放讀框與組蛋白脫乙酰酶A序列(底部序列，Genebank登錄號NP-006028.1)(SEQID NO9)的序列對比。
圖9A顯示了Bid蛋白以及cDNA克隆J2、P16、P43、P70、P74或P79編碼的蛋白在35S甲硫氨酸存在時在網織紅細胞裂解物中產生并在SDS PAGE凝膠上分離的放射自顯影。
圖9B顯示了Bid蛋白以及cDNA克隆J2、P16、P43、P70、P74或P79編碼的蛋白如圖9A產生的放射自顯影，它們用來分析與在細菌中表達成其兩個亞基與GST融合的融合蛋白形式的半胱天冬蛋白酶-8的結合。分子量標記的位置顯示在凝膠左側。
圖10顯示了部分P43 cDNA克隆編碼的蛋白質被半胱天冬蛋白酶-8、半胱天冬蛋白酶-10、半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-9或半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-9、半胱天冬蛋白酶-10的突變體切割的結果。在所用大腸桿菌中所表達的重組半胱天冬蛋白酶的總細菌裂解物體積用相對單位(RU)表示。分子量標記的位置顯示在凝膠左側。感興趣的蛋白質用星號作標記實心箭頭顯示了大小完整的P43蛋白，空心箭頭顯示了切割產物。
圖11顯示了，在用p55 TNF受體和綠色熒光蛋白(稱為“PC”)有或沒有克隆J2、P16、P27、P43、P79、P74或P70的cDNA插入物下共轉染HEK-293T細胞后，雙雜交篩選鑒定出的cDNA克隆所編碼的蛋白質的功能活性，該活性表示成經歷凋亡的細胞百分數(shù)。
圖12顯示了野生型Tip60和不可切割的突變型Tip60在經p55 TNF受體和綠色熒光蛋白共轉染的HEK-293T細胞中的細胞死亡抑制活性，以及缺少N端頭32個氨基酸的Δ32-Tip60的作用。對照細胞單用pCGN載體轉染。
發(fā)明詳述本文沒有詳細描述分子生物學領域的許多方法，因為這些方法是本領域技術人員眾所周知的。這些方法包括定點誘變、PCR克隆、用寡核苷酸或cDNA探針的噬菌體文庫篩選、cDNA的表達、重組蛋白的分析、細菌和酵母細胞的轉化、哺乳動物的轉染等。描述這些方法的課本例如是Sambrook等人的《分子克隆實驗手冊》Cold SpringHarbor Laboratory；ISBN0879693096，1989，《分子生物學當代方法》，F(xiàn).M.Ausubel，ISBN047150338X，1988和《分子生物學簡短方法》，F(xiàn).M.Ausubel等人編輯，第3版，John Wiley和Sons；ISBN0471137812，1995。這些出版物均全部納入本文作參考。
為了用雙雜交篩選方法鑒定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白和潛在的底物，可以采用雙雜交或三雜交系統(tǒng)。
用于本發(fā)明方法的雙雜交系統(tǒng)基本上如Fields和Song，Nature 340，245頁，1989所述。較佳的，個別載體、酵母株和文庫可以作為配對雙雜交系統(tǒng)(Matchmaker two-hybrid system)(#PT1265-1)的組件購自Clontech(Palo Alto，USA)。
用于本發(fā)明方法的酵母雙雜交系統(tǒng)的較佳實例在Boldin等人，Cell，85，803-15頁，1996中已有所描述。酵母雙雜交系統(tǒng)在Brent等人的美國專利5,580,736中有進一步的描述。因此，這些出版物均全部納入本文作參考。
所用的三雜交系統(tǒng)基本上如Tirode等人，J.Biol.Chem，272，22995-9頁，1997中所述的那樣。為了監(jiān)測本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，需要半胱天冬蛋白酶-8的兩個亞基獨立表達。出于那些目的，半胱天冬蛋白酶-8的兩個亞基宜在不同啟動子控制下分開表達。在一個較佳的實施方案中，在可在酵母中操作的弱啟動子控制下表達半胱天冬蛋白酶-8 p10亞基(絲氨酸375至天冬氨酸479)，其與DNA結合域的讀框符合。較佳的，該弱啟動子是酵母ADH啟動子，DNA結合蛋白是酵母轉錄激活物Gal-4或細菌LexA蛋白的DNA結合域。ADH啟動子和Gal4 DNA結合域例如存在于Clontech，Palo alto，USA出售的pGBD中。然而，本領域技術人員顯然可以采用其它啟動子，只要該啟動子在酵母細胞中有效即可。利用相同的標記可以采用其它DNA結合域，只要這些DNA結合域沒有轉錄激活功能。
長的有活性的半胱天冬蛋白酶-8 p20亞基(絲氨酸217至天冬氨酸374)在酵母細胞中可操作的可誘導啟動子的控制下表達成不融合的蛋白質。較佳的，可以采用在上文Tirode等人文章中描述的Met 25甲硫氨酸可阻遏的啟動子。可誘導啟動子的使用簡化了用免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝膠電泳對p10-p20復合物的檢測?？烧T導的啟動子還具有其它優(yōu)點，它使得對酵母細胞可能有毒性的蛋白質在酵母中得以表達，因為有可能限制表達潛在毒性蛋白的期間。
用本發(fā)明方法篩選的蛋白宜以cDNA文庫的形式提供。然而，也可采用基因組文庫或組合文庫。將文庫克隆在酵母中可操作的轉錄激活結構域的C端。較佳的，采用酵母Gal-4蛋白的轉錄激活結構域，然而，也可采用其它許多轉錄激活子。較佳的，用購自Clontech的pGAD GH載體來克隆文庫。
用于篩選的酵母株必須含有選擇標記如組氨酸合成酶，其在一啟動子的控制下，該啟動子含有上述DNA結合域特異性結合的DNA序列。較佳的，酵母細胞還含有在一啟動子控制下的報道基因，該啟動子含有上述DNA結合域特異性結合的DNA序列。購自Clontech的酵母株HF7c可用來篩選Gal-4結合域雜交物；當用lexA作為DNA結合域時，可以采用株L40。
轉化后，將酵母細胞置于選擇有活性細胞的條件下，接種到缺少某些氨基酸的培養(yǎng)基中，而這些氨基酸是其中導入質粒穩(wěn)定性所需的。
培養(yǎng)基對于上述選擇標記的基因被激活的酵母細胞是有選擇性的。較佳的，選擇標記是組氨酸合成酶基因。通過在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可選出表達該基因的酵母細胞。該系統(tǒng)的一個優(yōu)點是可以在生長培養(yǎng)基中加入組氨酸合成酶抑制劑3-氨基三唑。因此，可以抑制其中表達少量組氨酸合成酶的酵母細胞，該表達由含有上述DNA結合域特異性結合的序列的啟動子泄漏而引起。在一些克隆中，半胱天冬蛋白酶-8 p10和/或p20亞基與所述克隆之間的弱的、非特異性相互作用可能使所述啟動子假激活。因此，通過增加所述抑制劑在用來選擇相互作用克隆的培養(yǎng)基中的濃度，可以選出只與某些極小長度相互作用的克隆。3-氨基三唑的濃度宜為7.5毫摩爾。
通過定量測定其報道基因活性，對能在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中生長的克隆作進一步分析。較佳的，用lacZ基因作為報道基因。lacZ活性的定量測定宜在液體培養(yǎng)物中進行，如Boldin等人，J.Biol.Chem.270，7795-8，1995中所述的那樣。
上述篩選方法可以類似地用雙雜交試驗來進行。本質的差別在于半胱天冬蛋白酶-8的兩個亞基被表達成單個肽鏈，它是與上述DNA結合域的融合蛋白。如下所述，p20亞基在其活性位點突變(半胱氨酸360-絲氨酸360)。
較佳的，p10亞基與p20亞基通過一個接頭隔開，該接頭的長度宜在10至50個氨基酸之間。所述接頭宜包含小的不帶電荷的氨基酸，如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和纈氨酸。更佳的，接頭由絲氨酸和甘氨酸殘基組成。最佳的，甘氨酸殘基和絲氨酸殘基在所述接頭中的比例約為3∶1至4∶1。
用上述半胱天冬蛋白酶-8誘餌的雙雜交系統(tǒng)來獲得克隆與上述使用三雜交系統(tǒng)相似，只是結合僅僅一個亞基的克隆不易與結合兩個亞基的克隆或結合需要兩個亞基的復合物的克隆區(qū)分開來。然而，通過評價雙轉化子(即轉化了新鑒定的克隆和p10或p20半胱天冬蛋白酶-8亞基的酵母細胞，其中所述亞基與DNA結合域融合)的lacZ活性，在雙雜交方法中發(fā)現(xiàn)的任何克隆均易測試其與兩個亞基的結合。與p10和p20亞基的復合物的結合也很容易評價，方法是測定三聯(lián)轉化子的lacZ活性，其中半胱天冬蛋白酶-8的一個亞基表達成與DNA結合域的融合蛋白，另一個被表達成不融合的蛋白。因此，顯然上述三雜交系統(tǒng)也可用來測定在雙雜交系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的克隆的結合特征，因為其中使用的可誘導啟動子能快速地鑒定出僅與p10亞基或p10-p20亞基復合物相互作用的克隆。
然后，選出能在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中生長并表達lacZ活性的克隆作進一步研究。首先，測試克隆所編碼的蛋白結合不相關蛋白(如核纖層蛋白)的能力。通常，棄去結合核纖層蛋白的克隆。
然后，對發(fā)現(xiàn)與半胱天冬蛋白酶-8特異性相互作用的克隆作進一步分析。這用從上述篩選方法直接獲得的部分克隆以及根據所述部分克隆的序列獲得的全長克隆來進行。為了獲得全長克隆，獲得部分克隆的序列，用本領域技術人員已知的方法從酵母細胞中抽提出所述克隆的DNA。然后，將DNA轉化入細菌內，以獲得大量純化的可用于測序的DNA?；蛘撸捎孟拗菩悦盖邢螺d體內的插入物(宜為上述pGBD載體)，克隆到另一載體(如購自Stratagene的pBluescript)中，以便于測序。測序用鏈終止方法進行，較佳的是采用United States Biochemicals的測序試劑盒獲得的Sequenase2酶。
然后可將如此獲得的序列輸入數(shù)據庫搜尋程序，通過計算機搜尋鑒定出重疊的序列。所用的程序是本領域技術人員熟知的，例如包括GCG(genetics computer group″遺傳計算機組″)軟件包。較佳的是，采用搜尋工具，如從EMBL主機(例如http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/)獲得的Basic Local Aligment SearchTool(BLAST)。Blastn命令可用來搜尋在鑒定的克隆中重疊或相似的核苷酸序列。
用本發(fā)明方法鑒定的蛋白質與DNA結合域的融合蛋白形式提供。因此，核酸序列應被翻譯的讀框是已知的，因為它必須與DNA結合域編碼序列的讀框符合。因此，用本發(fā)明鑒定的克隆的DNA序列能被非歧義地翻譯成氨基酸序列。然后，可用從上述EMBL主機獲得的Blastp程序來鑒定重疊的蛋白序列或相似蛋白。
另外，除了上述搜尋數(shù)據庫的方法外，可以篩選文庫如基因組文庫或cDNA文庫，以便鑒定完整的克隆。這些篩選方法在上述Sambrook等人以及Ausubel等人的課本中有所描述。另外，可以采用以PCR為基礎的克隆技術，如迅速擴增cDNA末端(5′和3′RACE，Graham等人，Biochem Biophys Res Commun 177，8-16頁，1991及其參考文獻)。
然后，進一步研究在本發(fā)明的篩選試驗中鑒定的部分克隆，或用任一上述方法獲得的全長克隆。這是這樣實現(xiàn)的，例如測試這些克隆對于活性半胱天冬蛋白酶-8蛋白水解性消化的敏感性。該試驗可在體內進行。為此，用產生待測試克隆編碼的蛋白的表達載體以及編碼第二蛋白(其表達將誘導半胱天冬蛋白酶-8活性)的表達載體轉染哺乳動物細胞系。表達載體宜包含用于表達克隆和第二蛋白的強啟動子，如Rous肉瘤病毒(RSV，Yamamoto等人，Cell 22，787-97頁，1980)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV，Artelt P等人，Gene 68 213-9頁，1988)、巨細胞病毒(CMV，Thomsen，等人，PNAS 81659-63頁，1984)，或病毒或細胞來源的類似啟動子。
其表達誘導半胱天冬蛋白酶-8活性的第二蛋白選自Fas-胞內結構域、CD120a胞內結構域、Mort-1、半胱天冬蛋白酶-8、或能誘導半胱天冬蛋白酶-8活性的等價蛋白?；蛘?，可通過TNF或CD95-配體的處理將半胱天冬蛋白酶-8活性導入細胞內。詳細描述可能的機制以及此類實驗其它技術細節(jié)的實驗在上述Boldin等人，Cell 1996中能夠找到。
在將編碼第二蛋白和待測蛋白的上述表達載體導入哺乳動物細胞內后，培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物足夠長的時間，以使蛋白表達、半胱天冬蛋白酶-8激活或表達、以及待測試蛋白發(fā)生斷裂。所述時期通常為4至72小時，較佳的為16至30小時，最佳的為20至24小時。為了確定斷裂程度，制備全細胞裂解物?；蛘?，可用抗標記抗體或鎳-氮川三乙酸層析來純化標記的蛋白，其試劑和詳細方法可從Qiagen GmbH，Hilden，Germany獲得。免疫沉淀技術在上述Boldin等人Cell，1996中有所描述。免疫沉淀的試劑和說明能以試劑盒形式從Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany獲得。
現(xiàn)在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對純化蛋白的全細胞裂解物進行大小分辨。
現(xiàn)在，待測試蛋白或其標記的片段可通過Western印跡技術用抗標記的抗體來顯示。較佳的標記是組氨酸標記與抗多組氨酸抗體的組合。然而，可采用其它的標記序列與對其有特異性的抗體的組合，只要抗體保留對標記序列有特異性，即不識別全細胞裂解物中的其它蛋白。斷裂的特異性可通過運行對照反應來確認，其中在上述時間內將特異性的半胱天冬蛋白酶抑制劑加入到哺乳動物細胞培養(yǎng)物中。較佳的抑制劑是選自zVAD-fmk，zDEVD-fmk，zIETD-fmk(見Keppler-Hafkemeyer等人，Biochemistry37，16934-42頁，1998)。更佳的抑制劑是zVAD-fmk。可采用的其它抑制劑是起半胱天冬蛋白酶細胞抑制劑作用的Bclx或p35蛋白。當這些蛋白質在試驗中共同表達時的切割抑制表明切割是半胱天冬蛋白酶特異性的。
測試待測試蛋白是否能被半胱天冬蛋白酶-8切割的第二種試驗是體外試驗，在酶促反應中將重組產生的半胱天冬蛋白酶-8與待測試的標記的蛋白一起使用。待測試蛋白質可以如上所述生產，方法是將其編碼序列克隆到含有強啟動子的表達載體中，并轉染到哺乳動物細胞內。有利的是，如上所述對待測試蛋白質作標記，從而能通過抗標記抗體或能特異性結合標記序列的其它試劑將其從哺乳動物細胞抽提物中純化出來。另外，待測試的蛋白質可用體外翻譯系統(tǒng)來體外產生。體外翻譯技術是本領域技術人員所熟知的，其試劑和詳細方法可從例如Stratagene，La Jolla，USA獲得。
另外，待測試蛋白質可用例如放射性同位素來標記。有利的是，在采用同位素標記時，體外表達待測試的蛋白質，在體外翻譯反應期間加入同位素標記的氨基酸以及未標記的氨基酸。較佳的同位素是S35。更佳的，標記的氨基酸是S35-甲硫氨酸，標記的和未標記的氨基酸之間的比例為1∶1至大約1∶1000。
然后，將重組產生的待測試蛋白和重組產生的半胱天冬蛋白酶-8活性酶合并在合適的緩沖液內，放置足夠長的時間以產生切割。較佳的緩沖液和試驗的其它較佳參數(shù)在上文Boldin等人，Cell 1996中有所描述。較佳的時間通常為10分鐘至數(shù)小時，較佳的在30分鐘和1小時之間。
在使切割發(fā)生后，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使反應物按大小分離。如果采用了同位素標記，則可以干燥凝膠，用照相膠片或磷光顯影(phosphoimaging，F(xiàn)uji)來檢測同位素。對待測試蛋白質作標記，并可在Western印跡中用標記特異性抗體來檢測。
與沒有半胱天冬蛋白酶-8的對照反應相比，在加入了半胱天冬蛋白酶-8蛋白的反應物中出現(xiàn)其它低分子量條帶表明受測試蛋白質被半胱天冬蛋白酶-8切割。低分子量條帶的大小還表明了切割位點的大概位置。
本發(fā)明涉及編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA序列。
另外，本發(fā)明還涉及編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的生物活性同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物的DNA序列，以及該序列編碼的蛋白質、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物。這些類似物、片段、突變體和衍生物的制備是用標準程序(例如參見Sambrook等人，1989)，其中在編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA序列中，可以缺失、增加一個或多個密碼子或被其它密碼子取代，從而產生針對天然蛋白質有至少一個氨基酸殘基變化的類似物。
在編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物的上述本發(fā)明DNA序列中，本發(fā)明的一個實施方案還包括能與從天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的編碼區(qū)衍生的eDNA序列雜交的DNA序列，其中這種雜交在中等嚴謹條件下進行，且可雜交的DNA序列編碼了具有生物活性的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。這些可雜交的DNA序列包括與天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白cDNA序列有相當高度同源性的DNA序列，以及代表了半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白樣序列的DNA序列，這些序列例如是編碼各種半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白同種型的天然衍生的序列，或編碼屬于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白樣序列組的蛋白、且編碼的蛋白具有半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白活性的天然存在的序列。另外，這些序列還可以包括，例如，非天然存在的合成產生的序列，這些序列與天然的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白cDNA序列相似，但是摻入了許多需要的修飾。因此，這些合成的序列包括編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白類似物、片段和衍生物的所有可能的序列，所有這些均具有半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的活性。
如本文所用的，嚴謹條件是雜交試驗中所用的溫度、單價陽離子的摩爾濃度以及雜交溶液中甲酰胺百分數(shù)的函數(shù)。為了確定涉及任何給定系列條件的嚴謹程度，首先采用了Meinkoth等人(1984)的方程式來測定100％相同性的雜交物的穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性表示成DNA-DNA雜交物的解鏈溫度TmTm＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61％(form)-500/L，其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中G和C核苷酸的百分數(shù)，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分數(shù)，L是雜交物的堿基對長度。Tm從100％相同的雜交物計算值每減少1℃，允許錯配的數(shù)量就增加約1％。因此，如果在指定鹽濃度和甲酰胺濃度下的任何給定雜交實驗的Tm比100％雜交物根據Meinkoth方程式計算出的Tm低10℃，則即使有高達約10％的錯配，也會發(fā)生雜交。
“中等嚴謹條件”是提供的Tm比含靶序列的理想雙鏈體的Tm(用上式計算出或實際測得)低不超過20℃的那些條件。沒有限制，中等嚴謹條件(比計算出的或測得的雜交物的Tm低15-20℃)是在低于計算出的雜交物的Tm的合適溫度下采用2×SSC(標準檸檬酸鹽溶液)和0.5％SDS(十二烷基硫酸鈉)的洗滌條件。條件的最終嚴謹度主要取決于洗滌條件，特別是如果所用的雜交條件是允許穩(wěn)定性較差的雜交物能和穩(wěn)定的雜交物一起形成的那些條件。然后，較高嚴謹度的洗滌條件除去了穩(wěn)定性較低的雜交物?？梢院蜕鲜鲋械葒乐斚礈鞐l件一起使用的常見的雜交條件是在比Tm低約20-25℃的溫度下，在6×SSC(或6×SSPE(標準磷酸鹽溶液-EDTA))、5×Denhardt′s試劑、0.5％SDS、100微克/毫升變性的、片段化鮭精DNA的溶液中雜交。如果采用混合的探針，則宜用四甲基氯化銨(TMAC)來代替SSC(Ausubel，1987，1999)。
為了獲得上述各種天然存在的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白樣序列，可以用天然的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白cDNA或其部分作為探針，采用從各種組織中篩選和分離天然衍生的DNA或RNA樣品的標準程序(例如參見Sambrook等人1989中提出的標準程序)。
本發(fā)明涉及可用上述篩選試驗鑒定的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。本發(fā)明還涉及基本對應于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的多肽或蛋白質。術語“基本對應于”不僅包括半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，也包括其類似物的多肽或蛋白。
基本對應于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的類似物，是半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的氨基酸序列中一個或多個氨基酸被另一氨基酸取代、或被刪除和/或插入而形成的多肽，只要所得的蛋白質基本上呈現(xiàn)出與其所對應的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白同樣或更高的生物活性。
為了基本對應于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，在半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白序列中的變化(如同種型)通常較小。雖然變化的數(shù)目可以多于10個，但較佳的不多于10個，更佳地不多于5個，最佳地不多于3個這樣的變化。盡管任何技術都可運用于發(fā)現(xiàn)基本對應于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的有潛在生物學活性的蛋白質，但是一種這樣的方法是對編碼該蛋白質的DNA運用常規(guī)的誘變方法，產生一些修飾形式。然后，根據它們與各種半胱天冬蛋白酶-8結合和在上述胞內通道的調劑/介導中調節(jié)半胱天冬蛋白酶-8活性的能力，對這些克隆表達的蛋白加以篩選。
“保守的”變化是預計不會改變蛋白質活性的那些變化，這些變化通常是首先要篩選的，因為這些變化預計不會明顯改變蛋白大小、電荷或構型，因而預計不改變蛋白質的生物特性。
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的保守取代形式包括一種類似物，其中多肽中至少一個氨基酸殘基被不同的氨基酸保守地取代。較佳地，這種取代是根據表1A中下列清單進行，這些取代可用常規(guī)實驗方法來確定，從而使合成的多肽分子在保持半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白生物活性的同時又具有變化的結構和功能性質。
表 IA原來的殘基 代表性的取代殘基AlaGly；SerArgLysAsnGln；HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyAla；ProHisAsn；GlnIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；Gln；GluMetLeu；Tyr；IlePheMet；Leu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu或者，另一類半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的取代形式是在多肽中刪去至少一個氨基酸殘基，然后再根據下表IB在其位置插入不同的殘基。多肽中可進行的取代類型可依據對不同種類中同源蛋白之間氨基酸變化頻率的分析結果，例如Schulz等，G.E.，“蛋白質結構原理”，Springer-Verlag，New York，NY，1978中的表1-2，以及Creighton，T.E.，“蛋白質結構和分子性能”，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA1983中的圖3-9中給出的分析結果。根據這一分析，本文另外定義了保守性取代，該取代能在下列5組之一組中進行互換。
表 IBl.小的脂族非極性或弱極性殘基Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；2.極性帶負電荷的殘基及其酰胺Asp、Asn、Glu、Gln；3.極性帶正電荷的殘基His、Arg，Lys；4.大的脂族非極性殘基Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和5.大的芳族殘基Phe、Tyr、Trp。
上述括號中的3個氨基酸殘基在蛋白質結構中有特殊作用。Gly是唯一沒有側鏈的殘基，因而它賦予鏈柔韌性。然而，這會傾向于促進形成除α-螺旋外的二級結構。Pro，因其不同尋常的幾何結構，會緊密地約束肽鏈，并且通常會促進類似于β-轉角的結構，而在一些例子中，Cys能夠參與二硫鍵的形成(二硫鍵的形成在蛋白質折疊中很重要)。應注意，Schulz等(同上)將上面的第1和第2組合二為一。還應注意，Tyr，因其有形成氫鍵的趨勢，因此與Ser和Thr等有顯著的親近關系。
根據本發(fā)明進行的保守性氨基酸取代，例如上面所陳述的，都是本領域中已知的，并且預期在氨基酸取代之后可以維持多肽的生物學和結構特性。本發(fā)明的大多數(shù)缺失和取代是那些不導致蛋白質或多肽分子特性發(fā)生根本變化的類型?！疤匦浴币员榕e方式(non-inclusive)定義為二級結構(如α-螺旋或β-折疊)的變化和生物活性(結合半胱天冬蛋白酶-8和/或介導半胱天冬蛋白酶-8對細胞死亡的效應)的變化。
可用于本發(fā)明來獲得半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白類似物的在蛋白質中產生氨基酸替換的例子包括任何已知的方法步驟，例如在授予Mark等的美國專利RE33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的美國專利5,116,943；授予Namen等的美國專利4,965,195；授予Chong等的美國專利4,879,111；授予Lee等的美國專利5,017,691中給出的方法；以及在美國專利No.4,904,584(Shaw等)中給出的用賴氨酸取代的蛋白質。
除了上述不會明顯改變半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白活性的保守性取代外，那些會增加半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白類似物生物活性的保守性取代或保守性稍低而隨機性較高的改變，也在本發(fā)明范圍之內。
當需要證實取代或缺失的確切效果時，本領域技術人員知道，可以通過常規(guī)的結合和細胞死亡試驗來評估取代、缺失等的效果。用該標準測試方法進行篩選并不需要過多的實驗。
可接受的半胱天冬蛋白酶-8類似物是至少保留和半胱天冬蛋白酶-8相互作用的能力從而介導半胱天冬蛋白酶-8在胞內通道中的活性、或調節(jié)半胱天冬蛋白酶-8本身活性的那些類似物。通過這種方式，可以產生具有所謂顯性陰性效應的類似物，即該類似物在結合半胱天冬蛋白酶-8方面或隨后的信號傳導或該結合后的其它活性方面有缺陷。例如，這些類似物可用來抑制半胱天冬蛋白酶-8的細胞毒性作用，或增強該作用，這取決于是希望增加細胞死亡還是細胞存活，并取決于這些活性中哪一個是受半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白與半胱天冬蛋白酶-8的相互作用所調節(jié)的主要活性(見上文)，這是通過這些類似物與天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白競爭與半胱天冬蛋白酶-8結合或相互作用而產生的。
在遺傳水平上，這些類似物通?？梢赃@樣制得對編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA中的核苷酸進行定點誘變，從而產生編碼類似物的DNA，隨后合成DNA并在重組細胞培養(yǎng)中表達多肽。類似物通常表現(xiàn)出與天然存在的蛋白相同或更高的定性生物活性，Ausubel等，《當代分子生物學方法》，Greene Publications and WileyInterscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，《分子克隆實驗手冊》，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。
制備本文所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或者制備能編碼相同多肽但與天然序列不同的其他核苷酸序列(因為遺傳密碼已知的簡并性允許這些變化)，都可以通過定點特異性誘變編碼早先制得的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白類似物或天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA來實現(xiàn)。定點特異性誘變可利用特異性的寡核苷酸序列來產生類似物，其中該特異性寡核苷酸序列編碼具有所需突變的DNA序列以及足夠數(shù)目的毗鄰核苷酸，以提供具有足夠大小和序列復雜度(complexity)的引物序列，從而在被橫跨的缺失相接處兩側形成穩(wěn)定的雙鏈體。通常，較佳的是長度約20-25個核苷酸的引物，在被改變序列的每一側有約5-10個互補核苷酸。一般，定點特異性誘變技術是本領域中眾所周知的，代表性的出版物例如是Adelman等，DNA，2183(1983)，該文獻的公開內容納入本文作參考。
正如人們所懂得的那樣，定點特異性誘變技術通常采用單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于定點誘變的典型載體包括載體如M13噬菌體，例如公開在Messing等，《大分子和重組DNA的第三屆Cleveland研討會″Third Cleveland Symposium onMacromolecules and Recombinant DNA″》，編者A.Walton，Elsevier，Amsterdam(1981)中，該文獻納入本文作參考。這些噬菌體易從商業(yè)上購得，它們的用法通常是本領域技術人員所熟知的?；蛘撸捎煤袉捂準删w復制起點的質粒載體來獲得單鏈DNA(Veira等，Meth.Enzymol.1533，1987)。
通常，本文所述的定點誘變這樣來進行先獲得一單鏈載體，該載體序列中含有編碼有關多肽的DNA序列。用自動化DNA/寡核苷酸合成法制得攜帶所需突變序列的寡核苷酸引物。然后將該引物與含有蛋白質編碼序列的單鏈載體退火，然后用有DNA聚合作用的酶(如大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段)作用，完成攜帶突變的鏈的合成。這樣，突變序列和第二條鏈就帶有所需的突變。然后用該異源雙鏈載體轉化合適的細胞(如大腸桿菌JM101細胞)，并選出含有攜帶突變序列重排的重組載體的克隆。
在選出了這樣的克隆后，可以取出有突變的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白序列，并置于合適的載體中，該載體通常是可用于轉染合適宿主的轉移載體或表達載體。
因此，利用已知的DNA或RNA擴增技術(如PCR和化學寡核苷酸合成技術)，也可在體外、原位和/或體內檢測、獲得和/或修飾編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的基因或核酸。PCR可以通過重復的DNA聚合酶反應來擴增(增加數(shù)目)特異性DNA序列。該反應可用作克隆的替代手段；而所需的只是有關核酸序列的知識。為了進行PCR，可設計與感興趣的序列互補的引物。然后通過自動化DNA合成法制得這些引物。因為引物可被設計成與基因的任何部分雜交，因此可創(chuàng)造一些能夠容忍互補堿基對存在錯配的條件。擴增這些錯配區(qū)域能導致合成出誘變的產物，從而產生具有新特性的肽(即定點誘變)。另見例如Ausubel，(同上)，第16章。此外，通過聯(lián)合互補DNA(cDNA)合成技術，并使用反轉錄酶和PCR反應，可將RNA用作原料來合成催乳素受體的胞外結構域，而不經過克隆。
此外，PCR引物可設計成結合新的限制性位點或具有其他特征，如在待擴增的基因片段末端有終止密碼子。在擴增的基因序列的5′和3′端安置限制性位點，可以使編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其片段的基因片段按需進行設計，以便連接載體中的其他序列和/或克隆位點。
PCR及擴增RNA和/或DNA的其它方法是本領域眾所周知的，并且根據此處所講述和給予的指導，無需過多試驗就可根據本發(fā)明進行使用。已知的DNA或RNA擴增方法包括(但并不限于)聚合酶鏈反應(PCR)和有關的擴增方法(例如參見授予Mullis等的美國專利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等的美國專利4,795,699和4,921,794；授予Innis的美國專利5,142,033；授予Wilson等的美國專利5,122,464；授予Innis的美國專利5,091,310；授予Gyllensten等的美國專利5,066,584；授予Gelfand等的美國專利4,889,818；授予Silver等的美國專利4,994,370；授予Biswas的美國專利4,766,067；授予Ringold的美國專利4,656,134；和Innis等編輯的《PCR方法方法和應用指南》)，以及RNA介導的擴增方法，其中使用對靶序列反義的RNA作為模板來合成雙鏈DNA(授予Malek等的美國專利No.5,130,238，其商品名為NASBA)；以及結合了DNA擴增和抗體標記技術的免疫-PCR(Ruzicka等，Science 260487(1993)；Sano等，Science 258120(1992)；Sano等，Biotechniques 91378(1991))。這些專利和參考文獻的全部內容納入本文作參考。
按類似的方式，半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的生物活性片段(例如任何半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其同種型的片段)，可參考上述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白類似物所述的方式進行制備。合適的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白片段是那些保留半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的能力，并能介導半胱天冬蛋白酶-8或其它蛋白質與半胱天冬蛋白酶-8直接或間接結合的生物活性的片段。因此，可以制得相對于類似物而言具有上述顯性陰性或顯性陽性效應的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白片段。應注意，這些片段代表了本發(fā)明的一類特殊的類似物，即，它們是衍生自全長半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白序列的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的確定部分(例如任何一種半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其同種型獲得的片段)，每個片段或這樣的部分具有上述任一所需活性。例如，這樣的片段可以是肽。
類似地，衍生物還可通過對半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白及其類似物或片段的一個或多個氨基酸殘基側鏈基團進行標準修飾，或者通過將半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白及其類似物或片段偶聯(lián)于其他分子(如抗體、酶、受體等)來制得，這些技術都是本領域中熟知的。因此，本文所用的術語“衍生物”覆蓋了用本領域已知手段對位于殘基側鏈的官能團或N-端或C-端基團進行修飾而制得的衍生物，這些衍生物均包括在本發(fā)明內。衍生物可以具有化學分子部分，例如碳水化合物或磷酸殘基，只要這樣的組份具有與半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白相同或更高的生物活性。
例如，衍生物可包括羧基的脂族酯、羧基的酰胺(通過與氨或與伯胺或仲胺反應獲得)、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠?例如烷?；?alkanoyl)或碳環(huán)類的芳酰基)形成的N-?；苌?，或游離的羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基)與酰基部分形成的O-?；苌?。
術語“衍生物”只包括那些沒有一個氨基酸變成20種常見的天然氨基酸中的某一種氨基酸的衍生物。
如上所述，可用切割試驗來確定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白是否被半胱天冬蛋白酶-8切割。對切割片段進行大小分離，近似地指示出切割位置。
還可進一步確定切割位點，方法是制備待測試蛋白質的缺失突變型，并如上所述測試每個缺失突變型對于半胱天冬蛋白酶-8切割的敏感性。缺失突變體可通過PCR克隆待測蛋白的所需片段來構建，用編碼所述待測試蛋白質的克隆的DNA序列作為模板。然后將PCR擴增的片段克隆到表達載體中，因而必須提供ATG起始密碼子，較佳的是Kozak序列(Kozak，M，Nucleic Acids Res.12 857-72頁，1984)。關于表達蛋白質的進一步詳細情況可在上述Qiagen有關組氨酸標記的蛋白質中找到，也可在蛋白質表達概述中找到。蛋白質表達的另一參考文獻是上述的《當代方法》，具體是其中第16章。
因此，待測試蛋白質的切割位點可以這樣確定從其制備各種缺失突變體，測定被半胱天冬蛋白酶-8切割的最小的此類缺失突變體。
鑒定切割位點的另一種方法是采用根據待測試克隆的預計蛋白質序列產生的肽。該肽可用化學方法合成，例如Bodanszky和Bodanszky，《肽合成實踐》，Springer，NewYork，ISBN 0-387-13471-9和Bodanszky，《肽合成實踐》，Springer，New York，ISBN 0-387-12359-4。常規(guī)肽合成還可從幾家商業(yè)公司(例如SynPep Corp.，Dublin，CA USA和California Peptide Research，Inc.，Napa，CA，USA)獲得。肽還能以與其它蛋白的融合物形式或非融合形式通過表達編碼它的重組DNA來產生，詳述見上文《當代方法》的第16章。
為了用肽對待測試蛋白質的切割位點作圖譜，將所述蛋白質的預計氨基酸序列分成區(qū)域，合成對應于每個區(qū)域的肽。另外，合成一多肽，它含有一個區(qū)域約一半氨基酸，毗鄰還含有直接相鄰區(qū)域的約一半氨基酸，從而重疊了兩個區(qū)域之間的邊界。該區(qū)域含有5-100個氨基酸，較佳的9-40個氨基酸，最佳的20-30個氨基酸?，F(xiàn)在如上所述測試整個一組肽被半胱天冬蛋白酶-8切割的敏感性?？商峁┐罅考兊闹频玫碾?。切割反應后，可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳以及UV檢測或染色顯色(例如用考馬斯藍)來直接分析。另外，為了更容易檢測，可用同位素末端標記來標記肽(例如參見，Shevchnko A，等人，Rapid Commun Mass Spectrom，11，1015-24頁，1997)。
在完成上述肽篩選后，進一步研究現(xiàn)在已知包含半胱天冬蛋白酶-8切割位點的肽，可以重復相同的方法，但是從鑒定的肽序列中選出較小的區(qū)域。
肽的實際切割位點應符合半胱天冬蛋白酶切割序列XXXD(見Boldin等人，Cell1996和Nicholson等人，《殺傷型半胱天冬蛋白酶》，Trends in Biochem Sci.22，299-306，1997)。通過制備一個氨基酸突變的肽并測試這些突變肽對半胱天冬蛋白酶-8切割的敏感性，可以評價肽中每個氨基酸的構型。待突變的氨基酸宜被選自帶電荷非極性氨基酸組的氨基酸(見Lehninger，Biochemistry，Worth，NY，1979，第4章)、最佳的是選自甘氨酸或丙氨酸的氨基酸代替。
通過使關鍵的氨基酸發(fā)生突變，就可產生結合半胱天冬蛋白酶-8、但不對其切割敏感的肽。結合可在非變性條件下用丙烯酰胺凝膠電泳通過肽-半胱天冬蛋白酶-8復合物的大小分離來測試。
還可以構建能與半胱天冬蛋白酶-8的活性半胱氨酸反應從而共價結合所述半胱氨酸的修飾的肽?；瘜W領域技術人員已知的與巰基反應的試劑可用于此目的。這些試劑能可逆地結合。例如，含有巰基的試劑可以和半胱天冬蛋白酶-8活性半胱氨酸的SH基團反應。形成的共價S-S鍵可通過還原來切割，例如在胞質溶膠中生理條件下，或用使S-S基團還原的試劑(如二硫蘇糖醇)。與巰基基團反應的試劑也能不可逆地結合半胱天冬蛋白酶-8。這些試劑也容易在本領域已知的能與巰基反應的交聯(lián)劑(如PIERCE Life Sciences目錄(PIERCE，Rockford，IL，USA)pO-90以及下頁)中找到。
與巰基反應的合適基團例如是吡啶二硫基、碘乙酰氨基或馬來酰亞氨基。這些基團可通過接頭與肽連接，這些接頭包含任選的不飽和的脂肪烴鏈、-O-、-S-、-NH-或芳族基團。接頭可被任選地取代。
與巰基反應的基團可通過本領域已知的化學合成方法與肽連接；肽的官能團可以和與巰基反應的基團接頭分子的官能團反應。例如，肽序列中存在的或為了產生合適官能團而加入(在賴氨酸情況下是ε-氨基)的賴氨酸殘基可以異雙官能交聯(lián)物(例如N-γ-馬來酰亞氨丁酰氧-琥珀酰亞胺酯)反應，以產生一個肽，其中所述賴氨酸ε-氨基與交聯(lián)劑的N-羥基琥珀酰亞胺基團反應，而交聯(lián)劑的馬來酰亞氨基保持不反應，在所述肽特異性結合所述半胱天冬蛋白酶-8時發(fā)生的與半胱天冬蛋白酶-8半胱氨酸接觸時它與所述半胱氨酸的巰基反應，從而滅活了所述半胱天冬蛋白酶-8。
肽中用來和巰基反應性試劑反應的位置可以選擇，以靠近發(fā)生半胱天冬蛋白酶-8切割的氨基酸(通常是天冬氨酸)。巰基反應性基團與肽結合所依靠的接頭在長度、極性基團(如羥基)、帶電荷基團(如硝基和磺基基團)、芳族基團(如苯撐或苯基殘基)的存在方面可以不同。接頭結構中的這些差異將導致產生含有肽并與巰基反應性試劑共價結合的試劑，該試劑將特異性地結合半胱天冬蛋白酶-8并與其活性半胱氨酸的巰基有效地反應。
通過將所述蛋白質或肽導入哺乳動物細胞中并測定誘導凋亡的試劑在所述細胞中的效果，還可對待測試蛋白質或其肽片段作進一步特性分析。
通過將編碼待測試蛋白質的DNA插入載體中，可實現(xiàn)蛋白質或肽在哺乳動物細胞中的表達，其中該載體含有啟動子、任選的內含予序列以及剪接供體/受體信號、還任選地包含終止序列。這些技術在上述《當代方法》16章中有綜述。
上述啟動子、內含子和終止序列可在哺乳動物細胞中操作。啟動子宜為強啟動子，如上述的RSV、CMV或MPSV啟動子。啟動子也可以是SV40早期啟動子(Everett等人，Nucl.Acids Res.11 2447-64頁，1983及其參考文獻)或細胞啟動子，如β-肌動蛋白啟動子或ELF-1啟動子(Tokushige等人，J Virol Methods.64 73-80頁，1997)。另外，還可采用雜交啟動子，如Edamatsu等人(Gene 187，289-94頁，1997)描述的lac操縱子和人ELF-1α啟動子之間的雜交物、Akagi等人(Kidney Int.51，1265-9頁，1997)描述的CMV-β肌動蛋白雜交啟動子、或tet操縱序列與CMV啟動子的雜交物(Furth等人，PNAS 91，9302-6頁，1994及其參考文獻)。
在需要表達的蛋白質的編碼序列中可以插入內含子序列，該序列可以完整的序列形式(即包括剪接供體和受體位點)插入。這些內含子序列的插入能增強RNA穩(wěn)定性，從而增強了所需蛋白質的產生。盡管理論上，合適的內含子序列可以選自任何含有內含子的基因，但是較佳的內含子序列是β-肌動蛋白內含子、SV 40內含子以及p55 TNF受體內含子。
內含子序列可含有增強上述啟動子轉錄的增強子元件。
通常，內含子序列還含有賦予組織特異型表達的轉錄或翻譯控制序列。因此，當希望以組織特異性方式表達本發(fā)明的蛋白質，可以有利地采用這些內含子序列。含有組織特異性增強子元件的內含子例子是位于人5-氨基乙酰丙酸合成酶2基因內含子8中的紅細胞樣特異性增強子(Surinya等人，J.Biol.Chem.273 16798-809頁，1998)，Huang等人，Nucl.Acids Res.18，937-47頁，1990中提供了關于用內含子序列增強蛋白質產生的理論的討論以及內含子序列的例子。
轉錄終止序列和聚腺苷酸化信號可以加在編碼希望表達的蛋白質的DNA的3′端。這些序列可以在許多或甚至大多數(shù)基因中發(fā)現(xiàn)。有利的是，采用SV 40聚腺苷酸化信號(Schek等人，Mol Cell Biol.，5386-93頁，1992及其參考文獻)。
用來在哺乳動物細胞中表達蛋白質的較佳載體是pcDNAHis載體(Invitrogen)，它含有用來驅動編碼所需蛋白質的基因表達的CMV啟動子?？刹捎玫钠渌d體包括pCDNA3或pMPSVEH載體。這些載體分別含有CMV和MPSV啟動子。
利用待測試的蛋白質的重組表達，現(xiàn)在可以評價所述蛋白質對于半胱天冬蛋白酶-8介導的凋亡信號的作用。為此，凋亡可通過誘導凋亡蛋白(如CD120a胞內結構域、CD95胞內結構域、Mort-l蛋白、半胱天冬蛋白酶-8或其等價物)的過度表達來誘導；或通過觸發(fā)CD120a、CD95、TRAMP/DR3或其等價受體來激活凋亡信號。受體激活可通過使受體與配體接觸或使受體與抗體(較佳的是多克隆抗體)交聯(lián)來實現(xiàn)(見Engelmann等人，J.Biol.Chem.265，14497-504頁，1990)。
盡管受體樣CD120a的觸發(fā)通常需要加入蛋白質合成抑制劑如環(huán)己酰亞胺以便得到強的凋亡信號，但是受體胞內結構域或涉及凋亡信號轉導的蛋白質的過度表達卻不是這樣(見Boldin等人，Cell 85，803頁，1996)。關于凋亡的檢測、培育時間以及其它細節(jié)和該試驗的參數(shù)在上文Boldin等人的文獻中已有描述。
表達待測試蛋白質的細胞相對于不表達的細胞死亡可以用多種方法來評價，例如基于DNA片段化或檢測凋亡特異性抗原和表位的方法。用來檢測凋亡的試劑盒形式的試劑和方法可從上述Boehringer Mannheim和其它公司購得。
還可通過評價細胞的形態(tài)學外觀來確定細胞死亡。凋亡性細胞死亡的特征是有波狀細胞膜，且在沒有細胞裂解下細胞收縮。
有利的是，在哺乳動物細胞中表達報道基因，以便提供成功轉染的標記。由于轉染程序本身產生一些細胞死亡(包括未被轉染細胞的死亡)，因此有利的是只評價被轉染的細胞。用于此目的的較佳的報道基因是lacZ基因，它很容易通過用Xgal或表現(xiàn)為活性β-半乳糖苷酶的類似試劑培育轉染的細胞來檢測。然而，還可采用任何其它已知的報道基因，較佳的是產物容易用簡單的顏色反應(其結果可用顯微鏡來評價)來檢測的基因。例如，綠色熒光蛋白可用來直接檢測而不需要顏色反應。該報道基因需要使用熒光顯微鏡。
因此，通過只考慮已被轉染的細胞(即表達報道基因的細胞)、計數(shù)表現(xiàn)出凋亡形態(tài)的細胞百分數(shù)，就可以評價特定的轉染克隆以及從中表達的蛋白質對凋亡的影響。
哺乳動物細胞宜為HeLa細胞或人胚腎(HEK)293-T細胞。轉染宜用上述《當代方法》中描述的磷酸鈣方法進行。細胞形態(tài)在轉染后1-150小時評價，較佳的在4-35小時內評價，最佳的在轉染后20小時評價。
抗體的產生多克隆抗體宜在家兔、雞、小鼠、大鼠、綿羊或類似的哺乳動物中產生。為了產生針對本發(fā)明蛋白或肽的抗體，如上所述通過重組DNA技術在哺乳動物細胞中產生蛋白質或肽。還可如上述《當代方法》16章中所述在細菌或昆蟲細胞中產生蛋白質。
將蛋白質或肽從產生它們的細胞中純化出來。蛋白質純化方法是本領域技術人員已知的，在上述《當代分子生物學方法》16章以及《蛋白質科學當代方法》(Wiley andSons Inc.)第5和6章中有詳細描述。有利的是，蛋白質可以與第二蛋白(如谷胱苷肽-S-轉移酶等)或序列標記(如組氨酸標記序列)的融合物形式產生。融合或標記蛋白質的使用簡化了純化程序(如上述《當代分子生物學方法》16章以及上述Qiagen組氨酸標記蛋白表達和純化試劑盒說明書中所述)。
如果蛋白質或肽已經被表達成融合蛋白的形式，則希望在用蛋白質產生抗體前切割融合伙伴，以避免產生針對融合伙伴的抗體。切割融合伙伴以及分離所需蛋白質在上述《當代分子生物學方法》16章中有所描述。用來表達并純化麥芽糖結合蛋白融合的重組蛋白質的載體、方法和試劑也可從商業(yè)途徑獲得。
在生產本發(fā)明的肽時，可能希望不除去融合伙伴，因為融合蛋白可能會刺激針對該肽的抗體產生。通常當從肽產生長度少于50個氨基酸的抗體時，這種考慮是恰當?shù)摹?br> 如上所述，肽還可用化學領域已知的化學方法合成。
針對蛋白質的多克隆抗體的產生在《當代免疫學方法》Wiley and Sons Inc.的第2章中有所描述。針對肽的抗體的產生可能需要在方法中作些改變，因為肽與蛋白質相比抗原性通常較低。針對肽的多克隆抗體的產生在上述《當代免疫學方法》第9章中有所描述。
單克隆抗體可以從受免疫動物(尤其是大鼠或小鼠)的脾或淋巴結的B細胞制得，方法是在有利于雜交細胞生長的條件下與無限增殖的B細胞融合。對于鼠B細胞的融合，細胞系Ag-8是較佳的。
產生單克隆抗體的技術在許多文章和課本中有所描述，例如上述的《當代免疫學方法》第2章。該書的第9章中描述了用肽免疫動物。這些動物的脾細胞或淋巴結細胞能以經蛋白質免疫的動物的脾或淋巴結細胞那樣使用，來產生書中第2章描述的單克隆抗體。
用來產生單克隆抗體的技術在Kohler和Milstein，Nature 256，495-497以及USP4,376,110中有進一步的描述。
從抗體超變區(qū)被幾乎隨機的序列取代的人抗體基因庫中制備抗體的方法在USP5,840,479中有所描述。如果很難用給定的肽或蛋白質對動物免疫的話，則這些抗體是較佳的。一些結構的免疫原性很弱，即使加入佐劑和與其它蛋白質連接成融合構建物，免疫原性也很弱。如果希望使用結構與人抗體相似的抗體(例如當希望抗體在人體內具有低的免疫原性時)，則USP 5,840,479中描述的抗體是更佳的。
一旦鑒定出合適的抗體，就可能需要改變其特性。例如，嵌合抗體可在生產中獲得較高的得率。當希望抗體在人體內免疫原性低時，恒定區(qū)被人抗體恒定區(qū)取代的嵌合抗體是較為需要的。嵌合抗體的產生在許多出版物中有所描述，例如Cabilly等人，PNAS 81，3273頁，1984；Morrison等，PNAS 81，6851，1984，Boulianne等人，Nature 312，643頁，1984，EP 125023，EP 171496，EP 173494，EP184187，WO86/01533，WO 87/02671以及Harlow和Lane，《抗體實驗指南》，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。
另一類抗體是抗獨特型抗體?？躬毺匦?抗-Id)抗體是這樣一種抗體，它識別通常與抗體的抗原結合位點相關的獨特決定簇。Id抗體可這樣制得，免疫與單克隆抗體來源動物相同的物種和基因型的動物(例如小鼠品種)，其中該單克隆抗體就是制備的抗-Id所針對的。受免疫動物會識別免疫用抗體的獨特型決定簇，并通過產生針對這些獨特型決定簇的抗體(抗-Id抗體)而進行應答。例如參見美國專利No.4,699,880，該專利全部納入本文作參考。
抗-Id抗體還可用作“免疫原”，在另一動物中誘導免疫應答，產生所謂的抗-抗-Id抗體。該抗-抗-Id與最初誘導抗-Id的單克隆抗體在表位上相同。因此，通過使用針對mAb獨特型決定簇的抗體，就可鑒別出表達具有相同特異性的抗體的其它克隆。
因此，針對本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其類似物、片段或衍生物而產生的單克隆抗體可用于在合適的動物(如BALB/c小鼠)中誘導抗-Id抗體?？捎迷摫幻庖咝∈蟮钠⒓毎a生分泌抗-Id單克隆抗體的抗-Id雜交瘤。此外，抗-Id單克隆抗體還可與載體(如匙孔血藍蛋白(KLH))偶聯(lián)，并用于免疫其他的BALB/c小鼠。這些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗體，該抗體具有最初單克隆抗體的結合特性，對上述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、或其類似物、片段或衍生物的表位有特異性。
這樣，抗-Id單克隆抗體具有它們自己的獨特型表位，或有結構上與被評價表位相似的“獨特位”。
術語“抗體”還包括完整的分子及其片段，例如能夠結合抗原的Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗體的Fc片段，能夠更迅速地從循環(huán)系統(tǒng)中清除，并且與完整抗體相比具有更低的非特異性組織結合性(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。
應理解，根據本文公開的用于完整抗體分子的方法，本發(fā)明中有用的Fab和F(ab′)2以及其他抗體片段也可用于檢測和定量測定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。這些片段通?？捎媚竟厦?產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab′)2片段)通過蛋白酶水解切割產生。
如果抗體能特異性地與某分子反應從而使該分子與抗體結合，那么就稱該抗體“能夠結合”該分子。術語“表位”指任何分子中能被抗體識別且還能被抗體結合的部分。表位或“抗原決定簇”通常由分子表面化學活性基團(如氨基酸或糖側鏈)構成，而且具有特異的三維結構特征和特異的電荷特征。
“抗原”是能被抗體結合、并且還能誘導動物產生能與該抗原表位結合的抗體的分子或分子的一部分?？乖删哂幸粋€或多個表位。上述特異反應指抗原會以高度選擇性的方式與其相應的抗體反應，而不會與大量由其他抗原引起的其他抗體反應。
本發(fā)明中有用的抗體(包括抗體片段)可用于定量或定性檢測樣品中的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或檢測表達本發(fā)明半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的細胞存在與否。這可以用免疫熒光技術，利用熒光標記的抗體(見下文)并結合光學顯微術、流式細胞計量術或熒光計量術檢測而實現(xiàn)。
用于本發(fā)明的抗體(或其片段)可在組織學上被采用，例如在免疫熒光或免疫電子顯微術中，用來原位檢測本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。原位檢測可這樣來實現(xiàn)從患者體內取一份組織樣品，然后將經標記的本發(fā)明抗體供給該樣品?？贵w(或其片段)的提供最好是通過將經標記的抗體(及其片段)施加或覆蓋在生物樣品上。通過采用這種步驟，不僅可以確定是否存在半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，而且能確定其在受檢組織中的分布。采用了本發(fā)明，一般技術人員容易知道，可對各種組織學方法(例如染色步驟)加以改動來實現(xiàn)這種原位檢測。
對于本發(fā)明半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的這些試驗方法通常包括使生物樣品(如生物液體、組織抽提物、新收獲的細胞(如淋巴細胞或白細胞)、或已在組織培養(yǎng)基中培育過的細胞)在能夠鑒別半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的可檢測標記抗體存在下進行培育，然后用本領域熟知的眾多方法中的任一種方法檢測抗體。
生物樣品可以用固相支持物或載體(如硝酸纖維素)、或能固定細胞、細胞顆粒或可溶蛋白的其他固相支持物或載體來處理。然后用合適的緩沖液洗滌支持物或載體，再根據本發(fā)明上述那樣用可檢測的標記的抗體處理。再用緩沖液第二次洗滌固相支持物或載體，除去未結合的抗體。然后可用常規(guī)方法檢測所述固相支持物或載體上所結合的標記的量。
“固相支持物”、“固相載體”、“固體支持物”、“固體載體”、“支持物”或“載體”指能結合抗原或抗體的任何支持物或載體。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍淀粉酶、天然的和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵石。出于本發(fā)明的目的，載體的特性可以是不溶的，或在某種程度上可溶。載體材料可以有實際上所有可能的結構構型，只要偶聯(lián)的分子能夠結合抗原或抗體。因此，支持物或載體的結構可以是球形(如在玻珠內)、圓柱形(如試管的內表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、測試條帶等。較佳的支持物或載體包括聚苯乙烯珠。本領域技術人員可知道用于結合抗體或抗原的其他許多合適的載體，或者能夠通過常規(guī)實驗來確定這些載體。
如上所述的本發(fā)明給定量抗體的結合活性可以用眾所周知的方法來測定。本領域技術人員能夠通過常規(guī)實驗來確定每次測定的操作條件和最佳試驗條件。
其他的步驟，諸如洗滌、攪拌、振蕩、過濾等，可增加到試驗方法中，這些步驟都是常規(guī)的或是具體情況下所需的。
本發(fā)明的抗體能夠被可檢測地標記的一種方法是將該抗體與酶相連，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，當該酶與合適的底物接觸時，酶會與底物反應，從而產生可被檢測(例如通過分光光度分析、熒光分析、或肉眼觀察)的化學物?？捎糜诳蓹z測地標記抗體的酶包括(但不局限于)蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。采用酶的生色團底物，利用比色方法就可以完成檢測。檢測還可以通過將酶與底物反應的程度與類似制備的標準物進行肉眼比較來實現(xiàn)。
檢測可用其他各種免疫試驗實現(xiàn)。例如，通過放射性標記抗體或抗體片段，就可以通過采用放射免疫分析(RIA)來檢測R-PTP酶。關于RIA的清楚描述可在《分子生物學中的實驗技術和生物化學》(Laboratory Techniques and Biochemistry in MolecularBiology)，Work，T.S.等，North Holland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其參見Chard，T.所寫的標題為“An Introduction to Radioimmune Assay and RelatedTechniques(放射免疫分析和相關技術的介紹)”的章節(jié)，該文獻納入本文作參考。放射性同位素可用g計數(shù)器或閃爍計數(shù)器等設備或通過放射性自顯影來進行檢測。
還可以用熒光化合物來標記本發(fā)明的抗體。當熒光標記的抗體被暴露于適當波長的光時，就能因熒光而檢測出它的存在。最常用的熒光標記化合物有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白(pycocyanin)、別藻藍蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
抗體還可用發(fā)出熒光的金屬(如152E或其他鑭系金屬)進行可檢測地標記。這些金屬可通過這些金屬的螯合基團(如二乙三胺五乙酸(ETPA))與抗體連接。
還可以將抗體偶聯(lián)化學發(fā)光化合物，對抗體進行可檢測標記。然后，檢測在化學反應過程中發(fā)光的存在來檢測帶有化學發(fā)光標記的抗體的存在。特別有用的化學發(fā)光標記化合物的例子是魯米諾、異魯米諾(isoluminol)、熱吖啶鎓酯(theromatic acridiniumester)、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。
同樣，還可以用生物發(fā)光化合物來標記本發(fā)明抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種化學發(fā)光，其中催化性蛋白提高了化學發(fā)光反應的效率。生物發(fā)光蛋白的存在可通過檢測發(fā)光來確定。用于標記目的的重要的生物發(fā)光化合物是螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白。
本發(fā)明的抗體分子可用于免疫計量試驗，也稱為“雙位點”或“夾心”試驗。在典型的免疫計量試驗中，將一定量的未標記抗體(或抗體片段)結合于固相支持物或載體上，加入一定量的帶可檢測標記的可溶抗體，從而可以檢測和/或定量分析在固相抗體、抗原和標記抗體之間形成的三元復合物。
典型的且較佳的免疫測量試驗包括“正向”試驗，在該試驗中與固相結合的抗體先與待測試樣品接觸，通過形成二元固相抗體-抗原復合物從而將抗原從樣品中抽提出。在培育合適的時間后，洗滌固相支持物或載體以去除液體樣品殘余物(包括未反應的抗原，如果有的話)，然后再與含有未知量的標記抗體(其功能為“報道分子”)的溶液接觸。在第二次培育使標記抗體通過未標記抗體與結合于固相支持物或載體上的抗原復合之后，第二次洗滌固相支持物或載體，除去未反應的標記抗體。
在另一種“夾心”試驗(該試驗可與本發(fā)明的抗原一起使用)中，使用所謂的“同時”和“反向”試驗。同時試驗涉及一次培育步驟，因為和固相支持物或載體結合的抗體以及標記抗體被同時加入到測試樣品中。在培育結束后，洗滌固體支持物或載體以除去液體樣品殘余物和未復合的標記抗體。然后象常規(guī)的“正向”夾心試驗那樣，測定與固相支持物或載體結合的標記抗體的存在。
在“反向”試驗中，分步先將標記抗體溶液加至液體樣品中，然后在培育適當時間后，再加入結合在固相支持物或載體上的未標記抗體。在第二次培育后，以常規(guī)方式洗滌固相載體，使其不含被測試樣品的殘余物和未反應的標記抗體溶液。然后再象“同時”和“正向”試驗那樣，測定與固相支持物或載體結合的標記抗體的存在。
免疫試驗免疫試驗(如RIA或ELISA)的建立在許多文章、課本和其它出版物中已有描述。參見WO 97/03998，48頁第4行至52頁第27行。本發(fā)明的免疫試驗有兩種通用形式，第一，采用固定化半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或等價肽的免疫試驗可用于定量測定半胱天冬蛋白酶-8。第二，采用針對半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白表位的固定化抗體可用來定量測定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。
這些試驗可用于診斷，因為在可能涉及這些途徑的許多疾病或綜合征中需要評價參與凋亡通道的半胱天冬蛋白酶-8以及其它蛋白質的水平。
核酸預計在本發(fā)明篩選中獲得的克隆是部分克隆。如果需要，在上文已經描述了完整克隆的獲得。完整克隆以及本發(fā)明篩選中最初找到的部分克隆的DNA序列可能有各種用途。
例如，為了控制半胱天冬蛋白酶-8相互作用的表達，可能需要在細胞內產生反義RNA。為了這個目的，將編碼半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的完整或部分cDNA插入上述含有啟動子的表達載體中。插入cDNA的3′端與啟動子的3′端毗鄰，cDNA的5′端與啟動子的3′端被所述cDNA隔開。當cDNA在細胞中表達時，產生了不能編碼蛋白的反義RNA。反義RNA存在于細胞中減少了半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白基因的細胞(基因組)拷貝數(shù)。
為了生產反義RNA，可采用完整的cDNA。或者，可采用它的片段，其長度宜在9和2000核苷酸之間，更佳的在15和500個核苷酸之間，最佳的在30和150個核苷酸之間。
片段宜對應于cDNA 5′半側內的區(qū)域，更佳的對應于含有5′非翻譯區(qū)和/或第一外顯子區(qū)域的5′區(qū)域，最佳的含有ATG翻譯起始位點。另外，片段可以僅僅對應于5′非翻譯區(qū)的DNA序列。
合成的寡核苷酸可用作反義寡核苷酸。寡核苷酸宜為DNA寡核苷酸。反義寡核苷酸的長度宜為9至150核苷酸，更佳的為12至60個核苷酸，最佳的為15至50個核苷酸。反義寡核苷酸覆蓋的區(qū)域宜包括cDNA的3′非翻譯區(qū)，更佳的含有聚腺苷酸化信號或翻譯終止密碼子或兩者。
Kumar等人在Microbiol Mol Biol Rev.62，1415-1434頁中評述了反義RNA的作用機理和反義工具使用的目前狀況。Yeh等人在J Bone Miner Res.13，.1870-9，1998中描述了反義寡核苷酸在抑制BMP受體合成中的用途。Meiri等人已經在PNAS 95，15037-15402頁，1998中描述了反義寡核苷酸抑制壓敏鉀通道基因Kvl.4合成的用途。Kondo等人在Oncogene 17，2585-91頁，1988中描述了反義寡核苷酸抑制Bcl-x合成的用途。
反義藥物的治療用途在Stix，Sci Am.279，46頁，50頁，1998，F(xiàn)lanagan在CancerMetastasis Rev 17，169-76頁，1998；Guinot和Temsamani在Pathol Biol(Parais)46，347-54頁，1998及其參考文獻中有所討論。
在設計反義寡核苷酸時，通常采用增強所需性能的寡核苷酸修飾。例如，用硫代磷酸鍵代替天然存在于DNA中的磷酸酯鍵，這主要是因為這些硫代磷酸酯寡核苷酸較不易被細胞酶分解。Peng等人指出，當采用磷酸二酯-硫代磷酸酯混合骨架時，可能會減少硫代磷酸酯寡核苷酸的不希望的體內副作用。較佳的，在60％的寡核苷酸中采用2′-甲氧基核糖核苷酸修飾。這些修飾的寡核苷酸能引起與硫代磷酸酯寡核苷酸所見可比的反義效果。Peng等人還指出，不能支持核糖核酸酶H活性的寡核苷酸類似物沒有活性。
因此，本發(fā)明的較佳的反義寡核苷酸具有磷酸二酯-硫代磷酸酯混合骨架。較佳的是，在約30-80％、最佳的約60％的寡核苷酸中采用2′-甲氧基核糖核苷酸修飾。
反義寡核苷酸還可引入其它修飾。例如，寡核苷酸分子可以與一基團相連，該基團任選地含有部分不飽和的脂肪族烴鏈以及一個或多個極性或帶電荷基團如羧酸基團、酯基團和醇基團。另外，寡核苷酸可以和肽結構連接，該肽結構宜為膜親性(membranotropic)肽。這些經修飾的寡核苷酸更容易穿透膜，而這對于它們的功能是關鍵的，因此可能會顯著增強它們的活性。希望到達大腦的反義藥物尤其需要膜滲透率。Gerster等人已經在Anal Biochem.262，177-84頁，1998中描述了棕櫚基連接的寡核苷酸。Shoji等人已經在J Drug Target 5，261-73頁，1998中描述了香葉醇連接的寡核苷酸。Soukchareun等人已經在Bioconjug Chem 9，466-75頁，1998中描述了與肽(例如膜親性肽)相連的寡核苷酸及其制備。Wang在J Controlled Release 53，39-48頁，1998中描述了反義分子或將分子靶向某些細胞并增強所述細胞攝取寡核苷酸作用的其它藥物的修飾。
核酶給出基因的已知mRNA序列，就可設計核酶，它是特異性結合并切割所述mRNA序列的RNA分子(例如參見Chen等人，Ann.NY Acad.Sci.660，271-3，1992，Zhao和Pick，Nature 365，448頁，1993，Shore等人，Oncogene 8，3183，1993，Joseph和Burke，J.Biol.Chem.268，24515，1993，Shimayama等人，Nucleic Acids Symp Ser 29，177頁，1993，Cantor等人，PNAS 90，10932頁，1993)。
因此，可以設計出切割本發(fā)明半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白mRNA的編碼核酶的RNA序列。切割位點宜位于編碼區(qū)內或5′非翻譯區(qū)內，更佳的在靠近AUG翻譯起始密碼子的編碼區(qū)5′部分。
編碼本發(fā)明核酶的DNA可通過DNA吸收、吸收修飾的DNA(見下文所述的導致膜通透性增強的寡核苷酸修飾和蛋白質修飾)或下文所述的病毒載體介導基因轉移來導入細胞。
將半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、肽和DNA導入細胞本發(fā)明提供了半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、從其衍生的肽、反義DNA分子和寡核苷酸。這些工具與治療或研究有關的用途必需將它們導入活生物的細胞內。出于這個目的，希望改善肽、蛋白質和寡核苷酸的膜通透性。改善寡核苷酸的膜通透性的方法在上文已有討論。相同的原理，即用親脂性結構衍生，也可用來產生膜通透性增強的肽和蛋白質。例如，上述的已知的膜親性肽的序列可以加到肽或蛋白質的序列中。另外，可以用部分親脂性的結構如上述的烴鏈(被至少一種極性或帶電荷基團取代)來衍生肽或蛋白質。例如，Muranishi等人在Pharm.Research 8，649，1991已經描述了肽的月桂酰衍生物。肽和蛋白質的其它修飾包括氧化甲硫氨酸殘基，從而產生亞砜基團，如Zacharia等人，Eur.J.Pharmacol.203，353頁，1991所述。Zacharia及其同事還描述了相對疏水性的肽鍵被其酮亞甲基異酯(COCH2)代替的肽或衍生物。蛋白質和肽化學領域技術人員已知的這些和其它修飾增強了膜的通透性。
增強膜通透性的另一種方式是在細胞表面采用受體，例如病毒受體，以誘導肽或蛋白質的細胞吸收。特異性結合某些細胞表面分子的病毒常采用這種機制。結合后，細胞將病毒帶入其內部。細胞表面分子稱為病毒受體。例如，整聯(lián)蛋白分子CAR和AdV已被描述成腺病毒的病毒受體，見Hemmi等人，Hum Gene Ther 9，2363-73頁，1998及其參考文獻。CD4、GPRl、GPR15和STRL33分子已被鑒定為HIV的受體/共受體，見Edinger等人，Virology，249，367-78頁，1998及其參考文獻。
因此，將已知結合細胞表面受體的分子和肽、蛋白質或寡核苷酸偶聯(lián)將增強所述肽、蛋白質或寡核苷酸的膜通透性。形成偶聯(lián)物的合適基團例子是糖、維生素、激素、細胞因子、運鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白等分子。Low等人美國專利5,108,921描述了用這些分子來增強肽、蛋白質和寡核苷酸的膜通透性以及所述偶聯(lián)物的制備。
Low及其同事還進一步指出，可用諸如葉酸或生物素之類的分子來將偶聯(lián)物靶向生物體內的多個細胞，因為這些分子的受體表達是豐富的、非特異性的。
在將本發(fā)明的肽、蛋白質或寡核苷酸靶向某些種類的細胞或組織時，也可采用上述的細胞表面蛋白來增強本發(fā)明所述肽、蛋白質或寡核苷酸的膜通透性。例如，如果希望靶向癌細胞，則宜采用在那些細胞表面上更豐富表達的細胞表面蛋白。例子有葉酸受體、粘蛋白抗原MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B和MUC7、糖蛋白抗原KSA、癌胚抗原、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、HER-2/neu、以及人慢性β-促性腺激素。Wang等人(同上，1998)指出采用葉酸來靶向癌細胞，Zhang等人ClinCancer Res 4，2669-76頁，1998指出上述其它抗原的每一種均相對豐富存在于各種癌細胞和正常細胞中。
因此，利用上述偶聯(lián)技術，本發(fā)明的蛋白質、肽或寡核苷酸可以如需要的那樣靶向某一類型的細胞。例如，如果需要增強淋巴細胞譜系細胞的凋亡性，則例如可利用在這些細胞上表達的MHC II類分子，使本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8陽性調節(jié)蛋白或肽靶向這些細胞。這可通過將針對所述MHC II類分子恒定區(qū)的抗體或其抗原結合位點與本發(fā)明的蛋白質或肽偶聯(lián)來實現(xiàn)。另外，還描述了各種細胞因子的眾多細胞表面受體以及其它細胞通訊分子，這些分子中有許多或多或少地以局限于組織或細胞類型的方式表達。因此，當希望靶向T細胞亞組時，可用CD4 T細胞表面分子來制備本發(fā)明的偶聯(lián)物。CD4-結合分子由HIV病毒提供，其表面抗原gp42能特異性結合CD4分子。在治療患有基于T細胞的自身免疫反應的患者(如紅斑狼瘡患者)中，本發(fā)明的增強凋亡作用的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或肽能有利地靶向T細胞。
病毒介導的細胞靶向本發(fā)明的蛋白質、肽和反義序列可利用病毒載體來導入細胞。在上述的《當代分子生物學方法》第16章中詳細描述了為此目的而采用牛痘載體。腺病毒載體的應用在例如Teoh等人，Blood 92，4591-4601頁，1998；Narumi等人，Am J Respir Cell MolBiol 19，936-941頁，1998；Pederson等人，J Gastrointest Surg 2，283-91，1998；Guang-Lin等人，Transplant Proc 30，2923-4頁，1998及其參考文獻；Nishida等人，Spine 23，2437-42，1998；Schwarzenberger等人，J Immunol 161，6383-9頁，1998和Cao等人，JImmunol 161，6238-44，1998中有所描述。用逆轉錄病毒轉移反義序列在Daniel等人，JBiomed Sci.5，383-94頁，1998中有所描述。
當采用病毒作為載體時，通常用病毒表面蛋白來靶向病毒。由于許多病毒(如上述的腺病毒)在其細胞向性方面是相當非特異性的，因此可能希望通過使用細胞類型或組織特異性啟動子來進一步賦予特異性。Griscelli等人，Hum Gene Ther.9 1919-28頁，1998指出用心室特異性心肌球蛋白輕鏈2啟動子將由腺病毒介導轉移的基因特異性地靶向心臟。
或者，對病毒載體進行工程改造，使其表面上表達其它蛋白質，或將病毒載體的表面蛋白改成插入所需的肽序列。這樣可將病毒載體加工成能表達一種或多種附加的表位用來靶向所述病毒載體。例如，根據本發(fā)明的指導，可用細胞因子表位、MHC II類結合肽或衍生自歸巢分子的表位來靶向病毒載體。
上述工具的應用本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白與涉及半胱天冬蛋白酶-8蛋白水解活性的半胱天冬蛋白酶-8亞基特異性地相互作用。盡管不希望受理論的束縛，本發(fā)明者認為，本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白是半胱天冬蛋白酶-8所涉及的信號傳導通道的“下游”元件。上游因子看來通過半胱天冬蛋白酶-8前域(介導蛋白-蛋白相互作用的結構域)結合?？磥砼c眾多因子廣泛通訊共同形成凋亡反應可能是通過涉及死亡效應結構域(DED)和相關結構域(如位于半胱天冬蛋白酶-8前域內的結構域)的蛋白-蛋白相互作用而介導的。與這些蛋白質相反，本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白可能是細胞死亡過程的直接執(zhí)行者之一。例如，Tip-60，一種本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，是組蛋白脫乙酰酶。因此，該蛋白質可能直接參與染色質結構的變化。
本發(fā)明蛋白質與半胱天冬蛋白酶-8的相互作用可能有幾種后果第一，調節(jié)半胱天冬蛋白酶-8的活性。這顯示在本文一體內試驗中，其中本發(fā)明的J2克隆抑制了半胱天冬蛋白酶-8介導的凋亡。
第二，半胱天冬蛋白酶-8相互作用可能通過阻止半胱天冬蛋白酶-8分解而增加其活性，或是通過起抑制劑作用而減少其活性。
第三，半胱天冬蛋白酶-8相互作用的活性可以調節(jié)。在本文中通過半胱天冬蛋白酶-8切割半胱天冬蛋白酶-8相互作用的能力而證明了這一點。這些蛋白中的一些可能通過切割而失活。然而，也有可能是蛋白質的活性發(fā)生改變，誘導出了新的活性，或是半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白通過切割被激活，正如半胱天冬蛋白酶本身那樣。
因此，本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、肽、寡核苷酸和抗體可用來調節(jié)半胱天冬蛋白酶-8的活性。在凋亡導致過度的細胞死亡的情況下，希望下調半胱天冬蛋白酶-8。例如，在原發(fā)性少突神經膠質疾病引發(fā)的多發(fā)性硬化、自身免疫眼色素層視網膜炎、糖尿病、狼瘡、I型自身免疫心肌炎、急性肝功能衰竭(不管病因)、HCV-介導的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合結締組織病(MCTD)、Crohn疾病、和潰瘍性結腸炎中，已提出凋亡信號會引起體組織的破壞。因此，對于患有這些疾病的患者，下調被凋亡性細胞死亡破壞的那些細胞中的半胱天冬蛋白酶-8活性是有益處的。
例如，在上述少突神經膠質疾病中，希望抑制少突神經膠質細胞中的半胱天冬蛋白酶-8活性。細胞表面G蛋白偶聯(lián)的磷脂溶血磷脂酸受體在少突神經膠質細胞和其它各種腦細胞中表達，但是不在體內其它組織中表達。因此，將本發(fā)明的肽或蛋白質靶向這些細胞?？梢赃@樣實現(xiàn)將所述肽或蛋白質與磷脂溶血磷脂酸偶聯(lián)，或是將特異性識別所述磷脂溶血磷脂酸受體的抗體序列導入病毒載體，從而時使所述病毒載體特異性地結合所述磷脂溶血磷脂酸受體。
類似地，可將本發(fā)明的肽或蛋白質靶向參與上述其它疾病以及凋亡性細胞死亡顯示介導體內所見組織損傷的其它疾病的其它細胞類型。
同樣，本發(fā)明的反義RNA、反義寡核苷酸以及核酶可以類似方式靶向上述少突神經膠質細胞或其它疾病中的相應細胞。這樣，半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的表達被抑制，而不是半胱天冬蛋白酶-8本身的表達被抑制。許多半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白表達的抑制可能減少了半胱天冬蛋白酶-8的凋亡效應。然而，減少某些半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的表達實際上可能會增加半胱天冬蛋白酶-8的效應，因為某些半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白能起半胱天冬蛋白酶-8活性的負調節(jié)劑作用。因此，在考慮用反義寡核苷酸和反義RNA以及核酶進行治療前，必須首先測試這些試劑在例如上述體內試驗中的效應。
另一方面，某些情況可能需要增加半胱天冬蛋白酶-8活性。這可能是上述同一疾病的情況，例如在全身性紅斑狼瘡場合。然而，待靶向的細胞類型是不同的。例如，在狼瘡中，T細胞群可能在胸腺內含有未被破壞的自身反應性細胞。因此，應將本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8上調劑靶向T細胞。最好是將半胱天冬蛋白酶-8上調劑靶向自身反應性細胞。在某些疾病中，例如多發(fā)性硬化，估計某些T細胞克隆在疾病發(fā)展中起關鍵作用。因此，可通過使用特異性針對自身反應性T細胞克隆的T細胞受體可變區(qū)的一個或多個抗體，用來靶向本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8上調劑(可以是本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或肽)，將本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8上調劑靶向這些細胞。
綜上所述，本發(fā)明包括含有活性物質的藥物制劑，該活性物質含有本發(fā)明的一種或多種半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、肽、抗體、核酶、反義RNA或反義寡核苷酸。
本發(fā)明還包括一種藥物組合物，它含有能感染哺乳動物細胞的病毒載體，其中所述載體含有操作性相連的啟動子以及編碼本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或肽、核酶、反義RNA、反義寡核苷酸或抗體的DNA序列。病毒載體任選地含有與啟動子操作性相連的編碼序列，該序列編碼位于病毒表面并能結合哺乳動物細胞表面蛋白的肽或蛋白質。表面蛋白宜為能使病毒載體被吸收的蛋白質，最好能以組織或細胞類型特異性方式表達，這樣就使病毒載體的靶向得以實現(xiàn)。
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其類似物、片段或衍生物還可用來分離、鑒定和克隆同類的其它蛋白質，即參與胞內信號傳導過程、結合半胱天冬蛋白酶-8或功能上相關的蛋白酶或蛋白質的那些蛋白質。在本申請中，可采用上述酵母雙雜交系統(tǒng)，或可采用最近開發(fā)的利用非嚴謹性Southern雜交然后PCR克隆的系統(tǒng)(Wilks等人，1989)。在Wilks等人的出版物，描述了兩種推定蛋白質-費氨酸激酶的鑒定和克隆，方法是采用非嚴謹性southern雜交，然后根據激酶基序的已知序列(一種假想的激酶序列)進行PCR克隆。可采用該方法，根據本發(fā)明使用半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的序列來鑒定并克隆有關的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的那些序列。
利用本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、或其類似物、片段或衍生物的另一種方法是在親和層析方法中用它們來分離并鑒定它們能結合的其它蛋白或因子，例如參與胞內信號傳導過程的其它蛋白質或因子。在本申請中，可將本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其類似物、片段或衍生物與親和層析基質個別連接，然后與細胞抽提物或懷疑參與細胞內信號傳導過程的分離的蛋白質或因子接觸。親和層析步驟后，就可洗脫、分離并鑒定出與本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其類似物、片段或衍生物結合的其它蛋白質或因子。
如上所述，本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、或其類似物、片段或衍生物還可用作免疫原(抗原)來產生它的特異性抗體。這些抗體也可用于從細胞抽提物或產生半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其類似物或片段的轉化細胞系中純化半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白(例如人N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶或其任一種同種型)。另外，這些抗體可用于診斷目的，用來鑒定與半胱天冬蛋白酶-8介導的FAS-R配體或TNF系統(tǒng)功能異常相關的疾病。因此，如果這些疾病與涉及半胱天冬蛋白酶-8蛋白或半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的功能異常胞內信號傳導系統(tǒng)有關，則這些抗體可用作重要的診斷工具。
應注意，本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的分離、鑒定和特性分析可用任一熟知的標準篩選程序來進行。例如，用這些篩選程序中的一種(下文所述的酵母雙雜交程序)來鑒定半胱天冬蛋白酶-8蛋白(見Stanger等人1995)，隨后是本發(fā)明的各種半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白(除了上述的以及下述共有待批專利申請中的其它各種新蛋白)。同樣，如上下文所述，可采用其它程序如親和層析、DNA雜交程序等本領域熟知的技術，來分離、鑒定和特性分析本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或來分離、鑒定和特性分析能與本發(fā)明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白結合的其它蛋白質、因子、受體等。
實施例IA用來鑒定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的雙雜交篩選用描述成“酵母-三雜交系統(tǒng)”(Tirode F.等人，1997)的改進的酵母雙雜交系統(tǒng)篩選半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白及其潛在的底物。采用的個別載體、酵母株和文庫是從Clontech(Palo Alto，USA)購得的Matchmaker雙雜交系統(tǒng)(#PT1265-1)的組件。
使兩個半胱天冬蛋白酶-8亞基在不同啟動子控制下分別表達。將短的p10亞基(絲氨酸375至天冬氨酸479)克隆到載體pGBT9(Clontech)中，與酵母Gal4蛋白的DNA結合域(氨基酸1-147，序列編號按Laughon等人，分子和細胞生物學，4，260-267，1984)讀框相符。長的有活性的p20亞基(絲氨酸217至天冬氨酸374)在360位突變，即將該位置的半胱氨酸變成絲氨酸(C360S)，使酶的蛋白酶活性失去。使突變從C360Sp20亞基在正調節(jié)的Met25啟動子控制下在缺少甲硫氨酸的培養(yǎng)基中表達成不融合的蛋白(Sangsoda，Mol Gen Genet.200，407-14頁，1985)?？梢酝ㄟ^調節(jié)酵母細胞生長培養(yǎng)基中的甲硫氨酸濃度來控制啟動子推動p20亞基表達的活性，這樣就能(1)用毒性蛋白亞基作為誘餌，和(2)控制蛋白-蛋白相互作用對于第三方(即p20亞基)的依賴性。p10和p20表達單元可以位于不同載體內。它們也能在同一載體內。在現(xiàn)在描述的實施例中，采用改進的pGBT9載體pGBT9-3H(見上述Tirode等人)。p20亞基宜和核定位信號一起表達成融合物。
在表達時，在不存在甲硫氨酸時，兩個亞基在酵母細胞中相互結合。兩個亞基的結合用共免疫沉淀和Western印跡實驗證實。
克隆到pGAD GH載體(Durfee等人，Genes Dev 7，555-569)中的B細胞cDNA文庫由S.Elledge博士贈與。該載體含有Gal4激活結構域(氨基酸768-881)。該GAL4激活結構域在與GAL4 DNA結合域融合后足以誘導大量的GAL4基因轉錄活性，見Ma和Ptashne，Cell，48，847-853(1987)。
Keegan等人(1986，同上)描述的GAL上游激活位點(UAS.sub.G)在報道基因(lacZ)以及允許在酵母株HF7c中選擇(His)的基因(購自Clontech)的上游區(qū)域內。
用上述含有半胱天冬蛋白酶-8的質粒轉化HF7c培養(yǎng)物，并如Clontech酵母程序所述的，在缺少色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸的選擇培養(yǎng)基中生長來選擇轉化子酵母細胞。任選地加入高絲氨酸至80毫克/升。
然后用含有載體的B細胞文庫進一步轉化所述轉化子培養(yǎng)物，然后接種到缺少組氨酸的上述培養(yǎng)基(選擇培養(yǎng)基)中。
在選擇培養(yǎng)基中任選地添加3-氨基三唑(組胺合成酶抑制劑)。加入抑制劑的作用是控制驅動該基因的啟動子在不含半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的酵母細胞中的泄漏。在一些情況下，弱的非特異性的相互作用可能會產生亂真的Gal4-UAG-his啟動子轉錄，從而導致酵母克隆在選擇培養(yǎng)基中生長。
選出在選擇培養(yǎng)基中生長的轉化子，抽提中其中的DNA質粒。然后將DNA轉化到能在缺少亮氨酸的培養(yǎng)基中選擇的HB101細菌內。
在細菌生長并從中抽提純化出質粒DNA后，將質粒DNA轉化到SFY526酵母細胞內。然后，將SFY526轉化子接種到包括組氨酸并含有Xgal的選擇培養(yǎng)基上，測試其lacZ活性。然后用Whatman 3MM No.50濾紙?zhí)嵘?lift)酵母菌落(關于菌落提升的描述參見上述Sambrook等人的課本)，然后在鋁箔上放置約20秒，轉移到液氮中約25秒以冷凍酵母細胞，置于室溫下約1分鐘以使酵母細胞融化，置于培養(yǎng)皿中Whatmann 3MM No.1濾紙上，該濾紙預先浸泡在含有Xgal和β-巰基乙醇的Z緩沖液(β-半乳糖苷酶反應緩沖液，例如參見Clontech程序、上述Sambrook等人的課本或上述的《當代分子生物學方法》)中。菌落出現(xiàn)藍色表明有活性的β-半乳糖苷酶。使半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白在該試驗中放置數(shù)分鐘至過夜，較佳的5分鐘至3小時，最佳的5分鐘至1小時，它通常會顯示出藍色。另外，β-半乳糖苷酶活性可以這樣定量測定，即在含有Xgal的培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)，離心除去細胞，并用分光光度計測定培養(yǎng)基的吸收值。
然后進一步測試上述篩選過程中鑒定的cDNA克隆與其它蛋白的相互作用。測試這樣進行將待測試克隆與不相關的蛋白(該蛋白與DNA激活結構域表達成融合物)一起轉化到pGAD GH載體中。
能在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中生長或顯示lacZ活性的雙轉化子表明文庫克隆是非特異性結合的。
至于不相關的蛋白，可以采用已知有“粘性”的蛋白(即與其它蛋白非特異性相互作用的蛋白)以及其它不相關的蛋白。例如，測試蛋白質與核纖層蛋白、RIP、RAIDD、TRAF2和MORTl的結合。通常，棄去與核纖層蛋白結合的蛋白質。
還用與lexA DNA結合域融合的半胱天冬蛋白酶-8亞基p10來進行上述三雜交測試。較佳的載體是購自Clontech的pLexA載體。當采用lexA作為DNA結合域時，應采用酵母L40菌株或其等價物。
在上述篩選方法中鑒定出半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，然后用下述的體內或體外切割試驗和信號轉導試驗作進一步分析。
實施例1B用來鑒定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的改進的雙雜交篩選誘餌用改進的半胱天冬蛋白酶-8誘餌通過酵母雙雜交系統(tǒng)(Fields和Song，1989)來進一步篩選半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。誘餌載體pGBT9(Clontech)表達出單鏈蛋白質形式的半胱天冬蛋白酶-8。為了產生與活性半胱天冬蛋白酶構型類似的誘餌蛋白，除去前域，使小的亞基2(從絲氨酸375開始到天冬氨酸479為止)與Gal4 DNA結合域融合。小亞基的C端與大亞基1(從絲氨酸217開始到天冬氨酸374為止)的N端間隔有一個16氨基酸的甘氨酸-絲氨酸-接頭(GGGGSGGGGSGGGGSG)。這樣，通過一個分子的自發(fā)折疊，衍生得到活性半胱天冬蛋白酶的兩個亞基。將亞基1中活性位點的半胱氨酸突變成絲氨酸(sub 1C360S)。當象半胱天冬蛋白酶-8一樣從pcDNAHis載體中過度表達時，通過測定其誘導HEK 293-T細胞凋亡的能力，顯示出該單鏈半胱天冬蛋白酶-8的過度表達在功能上與野生型半胱天冬蛋白酶-8的過度表達相似。單鏈半胱天冬蛋白酶-8的活性可通過半胱天冬蛋白酶抑制劑p35的共表達來封閉。
如上進行雙雜交篩選，只是pGBT9載體(Clontech)表達出上述的單鏈半胱天冬蛋白酶-8。
實施例2半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的鑒定用實施例1A所述的改進的雙雜交篩選鑒定出數(shù)個編碼特異性半胱天冬蛋白酶-8結合蛋白的克隆。酵母中的雙雜交測試確證了克隆的結合特異性，但沒有檢測到與對照蛋白結合。如下所述，分離選出的cDNA克隆，測序，將其核苷酸序列與Genbank中發(fā)現(xiàn)的序列比較。
實施例2.1發(fā)現(xiàn)克隆L1含有部分cDNA序列與Stat 1的氨基酸690-750相同。Stat 1被鑒定為結合干擾素-刺激應答元件(ISRE)和γ激活序列(GAS)元件的轉錄因子(綜述見IfficSN，1998)。最近，Stat 1已顯示參與組成型半胱天冬蛋白酶水平的調節(jié)(Kuiner等人，1997)并起半胱天冬蛋白酶-3體外底物的作用(King P.等人，1998)。提示切割Stat 1可能在調節(jié)凋亡反應本身中起作用。
實施例2.2發(fā)現(xiàn)克隆L7編碼的部分cDNA與Genbank中發(fā)現(xiàn)的EST克隆(登錄號AA608733，未給予功能)C端部分幾乎完全匹配。
實施例2.3發(fā)現(xiàn)克隆L20與NEFA(登錄號462693)的氨基酸104-420相同。NEFA是一種新的蛋白質，它含有堿性氨基酸推定的DNA結合域和潛在的核靶向信號、兩個螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)基序區(qū)域，并行的EF-手型基序、EF-手之間富含酸性氨基酸的區(qū)域以及亮氨酸拉鏈基序(Barnikol-Watanabe等人，1994)。還發(fā)現(xiàn)NEFA是一種鈣結合蛋白，發(fā)現(xiàn)它定位于細胞質內和細胞表面上，還可在培養(yǎng)基中檢測到。NEFA屬于核結合蛋白(nucleobindin)亞家族。然而，還未明確NEFA的生物學作用?？寺20在體外和體內均被半胱天冬蛋白酶-8所切割。
實施例2.4發(fā)現(xiàn)克隆L12編碼的部分cDNA與數(shù)據庫中發(fā)現(xiàn)的人EST克隆(登錄號M62097)幾乎完全匹配。體外蛋白酶試驗顯示，克隆L12被半胱天冬蛋白酶-8體外切割。簡言之，使體外合成的35S標記蛋白在細菌產生的半胱天冬蛋白酶-8的存在下在蛋白酶緩沖液中培育30-60分鐘。在SDS-PAGE上分離蛋白質及其片段，結果用放射自顯影或磷顯影顯示。蛋白酶活性可以用特異性全半胱天冬蛋白酶(pancaspase)抑制劑z-VAD-氟甲基酮封閉。
實施例2.5發(fā)現(xiàn)克隆L5編碼的cDNA與Tip60蛋白(登錄號3024755)相同。Tip60(Tat相互作用蛋白60kDa)開始時被描述成細胞HIV-Tat反式激活相互作用蛋白(Kamine等人，Virology 216，357-366，1996)，后來顯示其具有組蛋白乙酰轉移酶活性(Yamamoto和Horikoshi，1997)。除了增強Tat介導HIV啟動子激活的作用外，Tip60的生物學作用還有待確定。
在酵母中的雙雜交測試中，發(fā)現(xiàn)克隆L5與單獨的半胱天冬蛋白酶-8亞基2以及p10-p20復合物結合。在實施例2.4所述的體外蛋白酶試驗中，克隆L5被半胱天冬蛋白酶-8體外切割。Tip60在與p55 TNF-受體在HeLa和HEK293-T細胞內共同過度表達后，Tip60也以半胱天冬蛋白酶依賴型方式被切割。即使沒有蛋白合成抑制劑的存在，在用TNF處理后，它也在HeLa細胞中被切割。簡言之，將蛋白質克隆到pcDNAHis載體(Invitrogen)中并和凋亡誘導蛋白(例如p55 TNF-R或半胱天冬蛋白酶-8)一起在HEK 293-T細胞或HeLa細胞中表達。24小時后，收獲轉染細胞，將0.5-1×106細胞的全細胞裂解液施加到SDS-PAGE上，隨后用抗poly-His抗體(Sigma)進行Western印跡。結果用ECL顯色。分離出編碼與Tip60蛋白匹配的插入物的數(shù)個cDNA克隆。發(fā)現(xiàn)所有克隆(包括Tip60的“野生型全長”克隆)均缺少從氨基酸94(脯氨酸)延伸至145(蘇氨酸)的片段。該部分蛋白質不是乙酰轉移酶活性位點部分，認為不是蛋白功能所必需的。發(fā)現(xiàn)位置200和203的天冬氨酸殘基被丙氨酸殘基替換的Tip-60突變體不能被切割。
實施例2.6發(fā)現(xiàn)克隆M26編碼的部分cDNA與Genbank中發(fā)現(xiàn)的人EST克隆(登錄號C18037)幾乎完全匹配。在酵母中的雙雜交測試中，發(fā)現(xiàn)克隆M26單與半胱天冬蛋白酶-8亞基2結合。
實施例3半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的分離用實施例1B描述的雙雜交篩選鑒定出其它幾個編碼特異性半胱天冬蛋白酶-8結合蛋白的克隆。如下所述，分離選出的cDNA克隆，測序并將其核苷酸序列與Genbank中找到的序列比較。
篩選B細胞文庫(Durfee T等人，1993)和Jurkat T-細胞文庫。表2顯示了第一組克隆的初始特性分析。
表2
體內293-T細胞和/或HeLa細胞用實施例1A描述的酵母雙雜交方法來分離出編碼部分NEFA的部分克隆和克隆B8.1。
實施例3.1克隆B4(登錄號3327044)、B17(登錄號H23509)、B27(登錄號AA936350)和J40(登錄號2887413)編碼的cDNA插入物與各自EST的末端同源。
實施例3.2克隆B11編碼的cDNA插入物與CTP-磷酸乙醇胺胞苷基轉移酶(ET，登錄號D84307)的C端同源。ET是參與磷脂代謝的酶，它催化磷酸乙醇胺轉變成CDP-乙醇胺(Nakashima等人，1997)。經上述實施例2.4所述試驗證實，克隆B11被半胱天冬蛋白酶-8體外切割。
實施例3.3克隆B13和B37編碼的cDNA插入物與編碼EBV基因組一部分的克隆(登錄號V01555)的C端同源。
實施例3.4克隆B22編碼的cDNA插入物與T細胞親環(huán)蛋白(登錄號Y00052)的C端同源。T-細胞親環(huán)蛋白被鑒定為是環(huán)孢菌素A和FK506的胞內受體，并且具有內在的肽基脯氨酸順反異構酶活性(Haendler B.等人，1987)。
實施例3.5克隆B33編碼的cDNA插入物與核結合蛋白(登錄號2506255)的C端同源。核結合蛋白是一種分泌型蛋白，具有與DNA和CA2+結合的性質，它與實施例3.3所述的NEFA蛋白非常相似。核結合蛋白最初被描述成是增強自身免疫lpr小鼠脾細胞中抗DNA抗體產生的55kDa蛋白(Mirua K.等人，1992)。通過上述實施例2.4和2.5的試驗證實，B33能在體外和體內被半胱天冬蛋白酶-8切割。
實施例3.6克隆J2含有的600bp插入物所編碼的部分蛋白質序列在體外無細胞系統(tǒng)中以及細胞內表達時產生了約20kDa的多肽。在上述實施例2.4和2.5的試驗中，當其與p55TNF-Rs或半胱天冬蛋白酶-8共同表達時，克隆J2編碼的多肽在體外以及在體內HEK 293-T細胞和HeLa細胞中被半胱天冬蛋白酶-8切割。
圖2提供了克隆J2的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
圖3提供了PCR獲得的克隆J2的5′延伸序列與公開在數(shù)據庫中的序列的比較和序列對比，結果揭示克隆J2與人EST(登錄號)AA460869同源，對應于推定的人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶和另一個克隆(L48741)，并能組成推定的全長人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰酶。
實施例4克隆J2的功能特性分析克隆J2最初的功能特性分析揭示它對半胱天冬蛋白酶-8和人p55TNF-Rs誘導的HEK293-T和HeLa細胞凋亡有抑制活性。J2的表達使共轉染p55 TNF受體的HEK293-T細胞或經TNF和環(huán)己酰亞胺處理的HeLa細胞的凋亡阻遏/延遲25-50％，如圖3所示。凋亡性細胞死亡的定量測定這樣來進行，方法是在所示構建物轉染后20小時表現(xiàn)出凋亡形態(tài)的表達β-半乳糖苷酶的細胞部分。數(shù)據表示成顯示凋亡特征的藍色細胞占藍色細胞總計數(shù)(每份樣品約500個細胞)的平均百分數(shù)?；蛘撸镁G色熒光蛋白作為標記，用熒光共焦顯微鏡檢測。
實施例5半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的克隆用上述實施例1B中描述的誘餌，通過雙雜交篩選方法，篩選出pACT2載體(購自Clontech，Palo Alto，USA)表達出的人胎盤cDNA文庫。利用該篩選程序鑒定出編碼特異性半胱天冬蛋白酶-8結合蛋白的數(shù)個克隆。進一步研究克隆P16、P27、P43、P70、P74和P79。
cDNA克隆P43、P16和P74的cDNA插入物測序表明，它們共享某些同源序列?？寺74具有最長的cDNA插入物，約3000bp，看來它編碼的蛋白質具有574個氨基酸的推定開放讀框，預計分子量約為68-70kDa。將上述三個cDNA插入物的序列與公眾數(shù)據庫中找到的序列比較。發(fā)現(xiàn)克隆P43、P16和P74的cDNA克隆與Genbank中找到的兩個EST克隆(W04418和N64095)的序列有一些同源性。所有三個cDNA插入物的序列看來構成了同一蛋白的不同剪接同種型的3′端。對三個cDNA插入物的序列進行序列對比，確認了P74序列中574氨基酸的開放讀框(如圖5所示)。在另一公眾數(shù)據庫(RPCI5-1057I20；Roswell Park Cancer Institute Human PAC文庫)中鑒定的定位于人染色體12q31的基因組克隆中也找到了相似的序列。該PAC克隆的序列推導出的開放讀框有1428個氨基酸(如圖6所示)，它含有上述具有574氨基酸的開放讀框。圖7顯示了克隆P74(稱為“克隆的”)的cDNA插入物推定氨基酸序列的開放讀框與PAC克隆(稱為“推導的”)序列推導的開放讀框的序列對比。
通過克隆P74的推導氨基酸序列與全長PAC克隆的推導序列的比較，看來對應于P74的全長蛋白的5′端較長，可能從圖6所示PAC序列的第一個甲硫氨酸和開頭的甲硫氨酸中的一個開始。
還發(fā)現(xiàn)克隆P74的序列顯示出與小鼠和人組蛋白脫乙酰酶的高度同源區(qū)(該區(qū)域可能是含有組蛋白脫乙酰酶酶促活性位點的結構域)有顯著的同源性，提示P74編碼的蛋白質可能共享了這些蛋白質的功能?？寺74部分cDNA的163-1716bp之間的序列顯示出與組蛋白脫乙酰酶A(登錄號NP_006028)有大約80％的同源性?？寺74部分cDNA的385-1707bp之間的序列顯示出與組蛋白脫乙酰酶5(登錄號NP_005465)的序列同源?？寺74部分cDNA的418-1629bp之間的序列顯示出與組蛋白脫乙酰酶mHDA1(登錄號AAD09834)的序列同源，而克隆P74部分cDNA的424-1551bp之間的序列顯示出與組蛋白脫乙酰酶6(登錄號NP_006035)的序列同源。圖8中顯示了從PAC序列推導的全長蛋白的氨基酸序列與組蛋白脫乙酰酶A(Genebank登錄號NP-006028.1)氨基酸序列的序列對比。
實施例6半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的功能特性分析A)雙雜交篩選中鑒定出的cDNA克隆J2、P16、P43、P70、P74或P79編碼的蛋白質，在35S甲硫氨酸存在下、在TnT T7連接的網狀細胞裂解液系統(tǒng)CoupledRetyculocyte Lysate System(購自Promega，目錄號#L4610)中，表達在網狀細胞裂解液中，并在SDS-PAGE凝膠上分離(見圖9A)。分析相同量的網狀細胞裂解液表達的蛋白質，分析其與上述實施例1B中半胱天冬蛋白酶-8的兩個亞基與GST融合并在細菌中表達的融合蛋白GST-S1-S2(C360S)的結合。在單用GST珠粒4℃培育1小時來預先清除后，通過與GST珠粒4℃培育1小時后，使TnT產生的蛋白質與連接了GST珠粒的半胱天冬蛋白酶-8 GST-S2-S1融合蛋白一起沉淀，洗滌GST沉淀物，通過在含有SDS的樣品緩沖液中沸騰并用SDS-PAGE分離，從珠粒分離出與半胱天冬蛋白酶-8結合的蛋白質。這樣，就可通過放射自顯影使能結合半胱天冬蛋白酶-8構建物的蛋白質顯色。與GST-S1-S2(C360S)和Bid(Fas凋亡信號通道中的一種已知的鄰近的半胱天冬蛋白酶-8底物)的結合相比，克隆P74編碼的蛋白質看來在體外特異性地結合半胱天冬蛋白酶-8(見圖9B)。在圖中，網狀細胞裂解液產生的全長蛋白質用星號作標記。
在上述實施例1A中描述的雙雜交測試中，發(fā)現(xiàn)P74編碼的蛋白質與半胱天冬蛋白酶8的兩個亞基編碼的融合蛋白結合，但是不與單獨表達的半胱天冬蛋白酶-8小亞基結合。相比而言，上述實施例中提到的其它蛋白質，如Tip60，卻與單獨表達的半胱天冬蛋白酶-8的S2小亞基結合(數(shù)據未顯示)。
B)用TnT T7連接的網狀細胞裂解液系統(tǒng)，在35S甲硫氨酸存在下，在體外在網狀細胞裂解液中表達P43 cDNA編碼的蛋白質，使其受在大腸桿菌中表達成組氨酸標記的亞基2-亞基1(S2-S1)融合蛋白的重組野生型或突變型半胱天冬蛋白酶3、半胱天冬蛋白酶9或半胱天冬蛋白酶10切割。半胱天冬蛋白酶-8表達成亞基1-亞基2(S1-S2)-組氨酸標記的融合蛋白。在蛋白酶試驗中采用1體積和4體積的總細菌裂解液，定義為1或4個相對單位(RU)(圖10)。簡言之，在細菌產生的半胱天冬蛋白酶-8存在下，在蛋白酶緩沖液中37C培育體外合成的35S標記蛋白30分鐘。在SDS-PAGE上分離蛋白質及其片段，結果用放射自顯影或磷光顯影來顯示。結果表明，用作底物的P43cDNA編碼的蛋白質被半胱天冬蛋白酶-8有效切割，受半胱天冬蛋白酶-10的切割較弱，而且不被半胱天冬蛋白酶-3或半胱天冬蛋白酶-9切割(圖10)。因此，看來該蛋白質是半胱天冬蛋白酶-8的特異性底物。
C)為了分析新克隆的蛋白質對TNF受體信號傳導途徑誘導的凋亡性細胞死亡的作用，將所選cDNA克隆到pcDNA 3.1/His C表達載體(購自Invitrogen)中，與pcDNA3載體(Invitrogen)中表達的p55 TNFR受體以及pEGFPC1表達載體(Clontech)表達的綠色熒光蛋白(GFP)瞬時共轉染到HEK-293-T細胞中。將Tip60 cDNA和缺少N端開頭32個氨基酸的Δ32-Tip60克隆到pCGN載體(M.Tanaka和W.Herr在Cell 60，375-386，1990中有所描述)中，其中血凝素(HA)標記與cDNA的N端融合并用于相同的實驗設定。
24小時后，在熒光顯微鏡下檢查轉染的細胞，通過測定熒光細胞總數(shù)中顯示出凋亡形態(tài)的細胞數(shù)，來對細胞死亡評分。發(fā)現(xiàn)克隆到pcDNA-His載體中的部分cDNA所過度表達的P74蛋白保護了HEK-293-T細胞和HeLa細胞不會因p55TNF受體(圖11)過度表達或半胱天冬蛋白酶-8的兩個融合的亞基(未顯示)過度表達誘導而死亡。發(fā)現(xiàn)野生型Tip60和不能被切割的Tip60突變型(其中位置200和203的天冬氨酸殘基被丙氨酸殘基置換)保護HEK-293-T細胞不會因p55 TNF受體(圖12)過度表達誘導而死亡，而缺少N-端開頭32個氨基酸的Δ32-Tip60沒有顯示出此保護作用。
在完全描述了本發(fā)明后，本領域技術人員將會理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下無需過多實驗就能在范圍很廣的等價參數(shù)、濃度和條件內進行同樣的發(fā)明。
盡管本發(fā)明已經聯(lián)系其具體實例作了描述，但是應當知道它還能作進一步的改進。本申請應當覆蓋大致上根據本發(fā)明原理、本文公開的內容、利用本發(fā)明所屬領域已知或常規(guī)技術以及如下文所附權利要求范圍內提出的必要特征所作的任何變化、用途或改進。
本文中引用的所有文獻，包括期刊雜志或摘要、出版的或對應的美國或外國專利申請、授權的美國或外國專利、或任何其它文獻，包括引用文獻中列舉的所有數(shù)據、圖表和文本，均全部納入本文作參考。另外，本文引用的文獻中所引用的文獻的全部內容也全部納入本文作參考。
參考已知的步驟、常規(guī)的步驟、已知的方法或常規(guī)方法并不以任何方式表示承認本發(fā)明的各個方面、描述或實例已在相關技術領域予以公開、指導或提示。
前述具體實例的描述將完全揭示本發(fā)明的總體特征，在不脫離本發(fā)明的總思路下，其它人可運用本領域技術人員所知的知識(包括本文引用的內容和參考文獻)無需過多實驗就很容易對這些具體的實例作變化和/或改進用于各種應用。因此，基于本文的理論和指導，這些變化和改進均應在本文所公開的實例的等價意義和范圍內。
應當理解，本文的措詞或術語均只是為了便于描述，而非限制性，因此本說明書的措詞或術語可由本領域技術人員根據本文的理論和指導結合本領域普通技術人員的知識來作解釋。
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序列表<110>依達研究發(fā)展有限公司(YEDA RESEARCH AND DEVEL OPMENT CO.，LTD.)<120>與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白質<130>
<140>
<141>
<150>132105<151>1999-09-28<150>127721<151>1998-12-24<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>447<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1cggcacgagg gcctgggcaa cggccggcac acgctgggac agcaggaagt ggaagtggac 60ggtctgacgg cctacgtggc aggtgagcgc cctgacccac tgggtcccag gtcccagccc 120gcatgccagg tggcccacga cccccccaga gcctgccctc tctgctctca aggcaccaag 180acgctgagtg gcagcatagc cccaatgaac gtctgtgtcc gggcacttcc tgcaggccac 240aggttcagca tgaagtcggc cttgaaggct gcatccttgc accccgccca gttgctgggg 300ctggagaaga gtaaggggac cttgactttg gtgctgacgc agacttcgtg gtgctcgacg 360actcccttca cgtccaggcc acctacatct cgggtgagct ggtgtggcag gcggacgcag 420ctaggcagtg acaaggacct cggctga 447<210>2<211>148<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Arg His Glu Gly Leu Gly Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Gln Gln Glu1 5 10 15Val Glu Val Asp Gly Leu Thr Ala Tyr Val Ala Gly Glu Arg Pro Asp20 25 30Pro Leu Gly Pro Arg Ser Gln Pro Ala Cys Gln Val Ala His Asp Pro35 40 45Pro Arg Ala Cys Pro Leu Cys Ser Gln Gly Thr Lys Thr Leu Ser Gly
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<400>7Met Phe Ala Arg Ser Ala Gly Leu Cys Phe Pro Trp Val Pro Gly Val1 5 10 15Ser His Gly Gly Asp Ala Glu Glu Val Leu Ala Gln His Pro Thr Pro20 25 30Thr Gly Arg Gly Ala Glu Arg Arg Pro Arg Pro Pro Asp Ser Ser Ala35 40 45Glu Gly Asp Pro Gly Met Leu Lys Pro Cys Gly Cys Val Pro Ser Pro50 55 60Gln Lys Val Ala Leu Lys Val Gly Ala Pro Phe Cys Thr Cys Gly Cys65 70 75 80Phe Gln Arg Phe His Leu Pro Lys Ala Cys Pro Gly Gln Gln Gly Ser85 90 95Pro Glu Ser Ala Arg Pro Arg Asn Arg Gln Pro Tyr Ala Thr Gln Asn100 105 110Gly Pro Ala Pro Arg Pro Gln Val Leu Pro Gly Ser Ser Ser Arg Cys115 120 125Cys His Gly Tyr Ile Cys Phe Leu Phe Asp Ser Ser Gln Thr Ala Glu130 135 140Val Glu Val Gly Trp Gly Gly Asp Thr Gly Ser Gln Leu Arg Pro Leu145 150 155 160Leu Arg Gly Ala Val Tyr Asn Ser Arg Met Trp Asp Ser Gln Lys Glu165 170 175Asp Ser Lys Pro Asp Ile Leu Arg Leu Gln Asn Thr Gln Leu Phe His180 185 190Ser Val Ser Leu Ser Thr Asp Gly Thr Gln Val Ser Pro Gly Ala His195 200 205Tyr Cys Ser Pro Thr Gly Ala Gly Cys Pro Arg Pro Cys Ala Asp Thr210 215 220Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro Met Asp Leu Arg Val Gly Gln Arg Pro225 230 235 240Pro Val Glu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Gln Arg Pro245 250 255Gln Arg Leu His His His Leu Phe Leu Ala Gly Leu Gln Gln Gln Arg260 265 270
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權利要求
1.一種能與半胱天冬蛋白酶-8的亞基1和/或亞基2相互作用的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，它是克隆p74或其剪接變體編碼的蛋白質。
3.根據權利要求2所述的蛋白質，所述剪接變體選自克隆p16和p43。
4.根據權利要求1所述的蛋白質，它是克隆L7、L12、M26、B4、B17、J40、B13、B37或B33編碼的蛋白質。
5.根據權利要求1所述的蛋白，它在體外被半胱天冬蛋白酶-8切割。
6.根據權利要求1所述的蛋白，它在體內被半胱天冬蛋白酶-8切割。
7.一種分離的DNA序列，它編碼權利要求1所述的蛋白。
8.一種分離的DNA序列，它能在中等嚴謹條件下與權利要求7所述的DNA序列雜交。
9.一種載體，它含有權利要求7或8所述的DNA序列。
10.一種真核或原核宿主細胞，它含有權利要求9所述的載體。
11.一種產生權利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物的方法，該方法包括使權利要求10所述的宿主細胞在允許所述蛋白產生的條件下生長，按照需要影響翻譯后的修飾，獲得所述蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，然后分離所述蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物。
12.根據權利要求11所述的方法，其中細胞是原核細胞。
13.根據權利要求11所述的方法，其中細胞是真核細胞。
14.根據權利要求13所述的方法，其中細胞是哺乳動物、昆蟲或酵母細胞。
15.根據權利要求14所述的方法，其中細胞是HeLa細胞或293 T HEK細胞。
16.根據權利要求11所述的方法，其中用人CMV啟動子作為啟動子。
17.一種與半胱天冬蛋白酶-8相互作用的肽，它含有權利要求1所述的蛋白質的至少4個連續(xù)的氨基酸。
18.權利要求17所述的肽的衍生物。
19.根據權利要求18所述的肽衍生物，它能在接觸所述半胱天冬蛋白酶-8時與半胱天冬蛋白酶-8形成共價鍵。
20.一種核酶，它對對應于權利要求7或8所述DNA序列的核苷酸序列有特異性。
21.一種反義寡核苷酸，它含有對應于權利要求7或8所述DNA序列的序列的至少9個核苷酸。
22.一種抗體，它針對權利要求1所述的蛋白的表位。
23.一種用于檢測半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的免疫試驗，該試驗含有權利要求22所述的抗體作為試劑。
24.一種用于檢測半胱天冬蛋白酶-8的免疫試驗，該試驗含有權利要求17至19任一項所述的肽。
25.一種用于檢測半胱天冬蛋白酶-8的免疫試驗，該試驗含有權利要求1至4任一項所述的蛋白。
26.一種鑒定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的方法，該方法包括下列步驟a)提供酵母細胞，該酵母細胞含有與啟動子相連的含DNA序列基序的報道基因；b)在所述酵母細胞中表達所述半胱天冬蛋白酶-8的p20亞基；c)在所述酵母細胞內表達DNA結合域與所述半胱天冬蛋白酶-8的p10和/或p20亞基的融合蛋白，其中所述DNA結合域能結合所述DNA序列基序；d)任選地，在所述酵母細胞內表達所述半胱天冬蛋白酶-8的未融合的p10或p20亞基；e)用由驅動融合蛋白表達的表達載體所組成的文庫轉化所述酵母細胞培養(yǎng)物，該融合蛋白由cDNA文庫和轉錄激活子組成；f)從轉化的酵母細胞中篩選出報道基因被激活的酵母細胞，和g)分離步驟f)的酵母細胞，并進一步分離出在其誘餌載體中表達的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。
27.權利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，權利要求20所述的核酶，權利要求21所述的反義寡核苷酸或權利要求22所述的抗體，在調節(jié)半胱天冬蛋白酶-8活性中的應用。
28.權利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，權利要求20所述的核酶，權利要求21所述的反義寡核苷酸或權利要求22所述的抗體，在調節(jié)TNF-受體或Fas介導的效應中的應用。
29.權利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，權利要求20所述的核酶，權利要求21所述的反義寡核苷酸或權利要求22所述的抗體，在調節(jié)凋亡中的應用。
30.權利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，權利要求20所述的核酶，權利要求21所述的反義寡核苷酸或權利要求22所述的抗體，在制備藥劑中的應用。
31.權利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，權利要求20所述的核酶，權利要求21所述的反義寡核苷酸或權利要求22所述的抗體，在制備用于治療有原發(fā)性少突神經膠質病的多發(fā)性硬化、自身免疫眼色素層視網膜炎、糖尿病、狼瘡、自身免疫心肌炎I、HCV介導的慢性肝炎、慢性胃炎甲型胃炎、混合結締組織疾病MCTD、Crohn疾病或潰瘍性結腸炎的藥劑中的應用。
32.權利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同種型、等位基因變體、片段、功能類似物、突變體或衍生物，用來分離、鑒定和克隆其它同類蛋白質的應用。
全文摘要
提供了與半胱天冬蛋白酶－8相互作用的蛋白質。還提供了這些蛋白質的生產和用途。
文檔編號A61K38/46GK1603342SQ20041005638
公開日2005年4月6日 申請日期1999年12月23日 優(yōu)先權日1998年12月24日
發(fā)明者D·沃勒克, M·舒赫曼, T·岡察洛夫 申請人:依達研究發(fā)展有限公司