專利名稱：脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使來(lái)自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的方法和組合物，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在美國(guó)每年有大約150萬(wàn)例的骨折歸咎于骨質(zhì)疏松癥，其中大約30萬(wàn)是臀部骨折。臀部骨折50-75％的患者不能獨(dú)立生活，導(dǎo)致看護(hù)費(fèi)用的提高。骨質(zhì)疏松癥的特點(diǎn)是隨著人們變老，骨質(zhì)密度的降低超乎尋常。這種疾病在西方和亞洲發(fā)病率很高(＞30％的60歲以上婦女)，并且壽命越長(zhǎng)患者越多。雖然還不知道導(dǎo)致這種骨骼修復(fù)紊亂的真正原因，但很明顯骨骼重建的動(dòng)態(tài)過(guò)程被一個(gè)以骨質(zhì)形成(骨質(zhì)形成細(xì)胞)活力降低而骨質(zhì)退化(骨質(zhì)退化細(xì)胞)活力增加為特點(diǎn)的過(guò)程所破壞(Parfitt(1992)三角形(Triangle)3199-110；Parfitt(1992)骨骼，卷1，B.K.Hall編。Teleford Press and CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，351-429頁(yè))。
使用骨髓移植物是矯形術(shù)、神經(jīng)外科和牙科，以及塑造/重塑外科中的常規(guī)作法，并且在過(guò)去二十年中這種應(yīng)用越來(lái)越頻繁。除血液之外，骨骼是最經(jīng)常被移植的組織，在美國(guó)，每年估計(jì)使用50萬(wàn)骨骼移植物。在普通矯形術(shù)中使用骨骼移植物包括處理不連合性和急性長(zhǎng)骨骨折，關(guān)節(jié)重建以及在治療多種脊髓異常中促進(jìn)脊椎運(yùn)動(dòng)部分的融合(Lane(1987)Ortho Clin N Amer 18213-225)。
目前臨床上最能接受的移植材料是自體骨骼。所謂的自體移植材料通常是從第二個(gè)手術(shù)部位得到的。自體移植存在重要的問(wèn)題。這些問(wèn)題包括對(duì)于大的傷口和損傷而言缺乏足夠的移植材料。患有骨質(zhì)疏松癥或骨質(zhì)減少的年長(zhǎng)者使用自體移植也成問(wèn)題。與獲取移植材料的手術(shù)相關(guān)的繼發(fā)性發(fā)病率是很高的。這些并發(fā)癥包括感染、骨盆不穩(wěn)(通常在髂骨的頂端獲取骨骼)、血腫和骨盆骨折(Laurie等(1984)Plas Rec Surg73933-938；Summers等(1989)J Bone Joint Surg 71B677-680；Younger等(1989)矯形術(shù)和外傷雜志3192-195；Kurz等(1989)脊柱141324-1331)。另外，供體部位的慢性疼痛是第二種最經(jīng)常報(bào)道的并發(fā)癥(Turner等(1992)JAMA 268907-911)。最后，由于骨骼材料的堅(jiān)硬特性使自體移植物能配合損傷/傷口部位的形狀的能力受到限制。
最近的研究集中在各種基質(zhì)的使用上，所述基質(zhì)或是無(wú)機(jī)材料如羥磷灰石(Flatley等(1983)Clin Orthop Rel Res 179246-252；Shima等(1979)神經(jīng)手術(shù)雜志51533-538；Whitehill等(1985)脊柱1032-41；Herron等(1989)脊柱14496-500；Cook等(1986)脊柱10305-309；各文章內(nèi)容此處引作參考)或是有機(jī)材料如脫礦質(zhì)的骨基質(zhì)(DBM)(綜述見(jiàn)Ashay等(1995)美國(guó)矯形術(shù)雜志24752-761；該文內(nèi)容此處引作參考)。這些基質(zhì)被認(rèn)為是骨質(zhì)傳導(dǎo)性的(促進(jìn)骨質(zhì)形成細(xì)胞在惰性基質(zhì)中的入侵)或骨質(zhì)誘導(dǎo)性的(誘導(dǎo)重新補(bǔ)充的前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞)。食品和藥品管理局批準(zhǔn)的一些用于臨床的產(chǎn)品在臨床上已觀察到許多成功的結(jié)果。盡管獲得成功，使用這些基質(zhì)仍存在很多問(wèn)題。首先是受治療者對(duì)DBM不同程度的反應(yīng)。而且這些基質(zhì)比自體骨骼移植需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)形成重要的結(jié)構(gòu)整體性和有效地承受負(fù)載。
移植物和使用單一基質(zhì)的替代品是使用骨髓或骨髓基質(zhì)細(xì)胞與DBM的混合物。較為理想的是細(xì)胞和DBM來(lái)源于同一受治療者，盡管異源DBM也開(kāi)始在臨床上取得成功(Mulliken(1981)外科年鑒194366-372；Kaban等(1982)J Oral Maxillofac Surg 40623-626)。使用自體骨髓細(xì)胞與異源DBM的移植方法已經(jīng)取得很好的結(jié)果(Connolly(1995)臨床矯形術(shù)3138-18)。但是，阻礙這些技術(shù)廣泛使用的問(wèn)題包括非自身物質(zhì)污染的潛在可能、患者對(duì)捐獻(xiàn)骨髓的可接受性，以及抽出骨髓后引起的潛在并發(fā)癥和骨髓來(lái)源耗竭。
許多研究小組已經(jīng)證明骨髓基質(zhì)細(xì)胞和由此衍生的細(xì)胞系能夠分化為在生化性質(zhì)和形態(tài)上類似于成骨細(xì)胞的細(xì)胞(Dorheim等，(1993)細(xì)胞生理學(xué)雜志154317-328；Grigoriadis等，(1988)細(xì)胞生物學(xué)雜志1062139-2151；Benayahu等(1991)Calcif Tiss Int.49202-207；文獻(xiàn)內(nèi)容引作參考)。在多數(shù)情況下，從人或動(dòng)物的骨髓中分離類成纖維細(xì)胞并將這些細(xì)胞鋪在標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)器上。一般來(lái)說(shuō)，使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方，如添加10-20％胎牛血清和抗生素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)來(lái)富集這些細(xì)胞(Ashton等(1980)臨床矯形術(shù)151294-307；Sonis等(1983)口腔醫(yī)學(xué)雜志3117-120)。然后通過(guò)將培養(yǎng)基換為含有5-20％胎牛血清、2-20mMβ-甘油磷酸和20-75μM抗壞血酸或抗壞血酸-2-磷酸的培養(yǎng)基來(lái)刺激細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞(Asahina等(1996)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究22238-47；Yamaguchi等(1991)Calcif Tissue Int 49221-225；文獻(xiàn)內(nèi)容此處引作參考)。培養(yǎng)14-21天后，許多細(xì)胞型和細(xì)胞系將礦化培養(yǎng)器中的基質(zhì)，這由von Kossa染色為陽(yáng)性可得到證實(shí)。成骨細(xì)胞譜系的其他表型指示包括分泌堿性磷酸酶活力的升高；培養(yǎng)基中存在分泌的骨鈣蛋白；一些被認(rèn)為是在成骨細(xì)胞中特異表達(dá)的基因的表達(dá)水平提高，包括骨鈣蛋白，骨橋蛋白和骨涎蛋白(Stein等(1990)FASEB雜志43111-3123；Dorheim等(1993)細(xì)胞生理學(xué)雜志154317-328；Asahina等(1996)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究22238-47；Yamaguchi等(1991)Calcif TissueInt 49221-225)。
一些實(shí)驗(yàn)室所進(jìn)行的許多詳細(xì)研究證實(shí)被移植的骨髓基質(zhì)細(xì)胞能夠形成異位骨骼(Gundle等(1995)骨骼16597-603；Haynesworth等(1992)骨骼1381-89；Boynton等(1996)骨骼18321-329)。例如，人和鼠的骨髓基質(zhì)成纖維細(xì)胞已被移植到免疫缺陷的SCID小鼠中(Krebsbach等(1997)移植631059-1069；Kuzneysov等(1997)J BoneMin Res 121335-1347)。使用抗體和組織化學(xué)標(biāo)記證明存在誘導(dǎo)性基質(zhì)時(shí)，供體的骨髓基質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致在異位骨骼形成的部位上發(fā)展出新的成骨細(xì)胞。有羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒(HA/TCP)、明膠、多聚-L-賴氨酸和膠原蛋白的情況下，小鼠的(骨髓基質(zhì))細(xì)胞形成骨骼。與此不同的是，人的基質(zhì)細(xì)胞只在有HA/TCP時(shí)才能有效地形成骨骼。在這些研究中不需要外源的BMP。
骨的形成并不限于骨架。例如，如果肌肉間、腎下囊或皮下等部位同時(shí)表達(dá)骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白，在這些部位引入陶瓷的或脫礦化的骨基質(zhì)將導(dǎo)致骨骼的形成。(Urist等(1996)科學(xué)150893-899)。這些結(jié)果暗示在合適的環(huán)境條件下，這些組織的細(xì)胞具有某些形成骨骼前體細(xì)胞的能力。
在軟組織如脂肪中的異位骨骼形成是一種罕見(jiàn)的病理狀況，它發(fā)現(xiàn)于患有進(jìn)行性纖維骨化—一種遺傳疾病的患者中。雖然并不完全了解其病原學(xué)，該病部分是由于位于軟組織損傷部位的淋巴細(xì)胞異常表達(dá)BMP所引起的(Kaplan等(1997)J Bone Min Res 12855；Shafritz等(1996)N Eng J Med 335555-561)。在脂瘤中也會(huì)偶爾發(fā)現(xiàn)骨骼形成(Katzer(1989)Path Res Pract 184437-443)。
有證據(jù)表明分離自經(jīng)膠原酶處理后的脂肪組織的基質(zhì)—血管部分含有大量的前脂肪細(xì)胞，或傾向于分化為脂肪細(xì)胞的細(xì)胞(Hauner等(1989)臨床研究雜志341663-1670)。這些細(xì)胞能以較低的頻率自發(fā)地分化為脂肪細(xì)胞或能對(duì)產(chǎn)脂肪促進(jìn)劑如四氫噻唑二酮產(chǎn)生應(yīng)答從而提高分化頻率(Halvorsen(1997)等方法1158-60；Digby(1997)糖尿病4138-141)。有證據(jù)表明在這些細(xì)胞系之間基質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出一種互相分化的模式(Gimble等(1996)骨骼19421-428；Bennett等(1991)細(xì)胞科學(xué)雜志99131-139；Beresford等(1992)細(xì)胞科學(xué)雜志102341-351)。具體來(lái)說(shuō)，脂肪形成伴有骨生成可能性的降低，而骨生成伴隨脂肪形成可能性的降低。
在某些條件下，骨髓基質(zhì)細(xì)胞能分化為脂肪細(xì)胞。事實(shí)上，就這一能力，一些骨骼基質(zhì)細(xì)胞系已經(jīng)廣泛地得到表征(Gimble等(1990)歐洲免疫學(xué)雜志20379-387；Gimble等(1992)細(xì)胞生物化學(xué)雜志5073-82；Gimble等(1996)骨骼19421-428)。但是，在本發(fā)明之前，使從脂肪組織分離的基質(zhì)細(xì)胞能分化為成骨細(xì)胞仍是未知的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了使脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞分化為具有成骨性質(zhì)的細(xì)胞的方法和組合物，以及改善受治療者骨骼結(jié)構(gòu)的方法。所述方法包括將脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞在β-甘油磷酸、抗壞血酸和抗壞血酸-2-磷酸中培養(yǎng)足夠長(zhǎng)時(shí)間以誘導(dǎo)所述細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。這種方法和組合物可用于產(chǎn)生在外科手術(shù)部位或傷口進(jìn)行自體移植到骨骼中的成骨細(xì)胞。組合物中包含脂肪基質(zhì)細(xì)胞，以及能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和一定量足夠誘導(dǎo)分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定影響成骨細(xì)胞分化的化合物的方法，所述化合物可用于研究骨骼發(fā)育和治療骨疾病，其中包括骨折和骨質(zhì)疏松癥。


圖1顯示了經(jīng)成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理后，被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的人脂肪基質(zhì)細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)變化。
圖2顯示了經(jīng)成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基或脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理后的脂肪基質(zhì)細(xì)胞和用油紅O(圖2A和圖2C)或yon Kossa方法(圖2B和圖2C)染色后的脂肪基質(zhì)細(xì)胞。
圖3顯示了經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(PA)、脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基(AD)或成骨細(xì)胞培養(yǎng)基(DST)處理的脂肪基質(zhì)細(xì)胞，分泌到培養(yǎng)基中的骨鈣蛋白和leptin濃度隨時(shí)間的變化。
圖4顯示了在基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(SC)、脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基(AD)或成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(OST)中培養(yǎng)21天后的脂肪基質(zhì)細(xì)胞分泌的堿性磷酸酶的濃度。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了使脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的方法。由本發(fā)明所述方法產(chǎn)生的成骨細(xì)胞可用來(lái)提供用于研究或移植到受治療者損傷或骨折部位的骨中的成骨細(xì)胞。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的方法，其中包括在一種組合物中培養(yǎng)所述細(xì)胞，該組合物包括能支持成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和一定量足夠誘導(dǎo)分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了使脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的組合物。所述組合物包括脂肪基質(zhì)細(xì)胞，能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和足夠量的β-甘油磷酸和抗壞血酸或抗壞血酸-2-磷酸以誘導(dǎo)所述基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。
“脂肪基質(zhì)細(xì)胞”指來(lái)源于脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞?！爸尽币馕吨魏沃窘M織。脂肪組織可以是棕色或白色的脂肪組織。優(yōu)選脂肪是皮下白色的脂肪組織。這些細(xì)胞可以包括原代細(xì)胞培養(yǎng)物或一個(gè)永生化的細(xì)胞系。脂肪組織可以來(lái)源于任何有脂肪組織的生物。優(yōu)選哺乳動(dòng)物的脂肪組織，最優(yōu)選人的脂肪組織。人脂肪組織的一個(gè)方便來(lái)源是吸脂外科手術(shù)，但脂肪組織的來(lái)源或分離的方法對(duì)本發(fā)明并不重要。如果希望成骨細(xì)胞用于自體移植，應(yīng)從受治療者身上分離脂肪組織。
“一定量足夠誘導(dǎo)分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸”指β-甘油磷酸和(抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸)的濃度，當(dāng)補(bǔ)充于能支持成纖維細(xì)胞(如NIH-3T3細(xì)胞、人類脂肪基質(zhì)細(xì)胞以及類似細(xì)胞)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中時(shí)，經(jīng)5天到8周的培養(yǎng)，將誘導(dǎo)所述基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。處理的最佳濃度和時(shí)間將由操作者利用已知的分化成骨細(xì)胞的檢測(cè)方法來(lái)確定。這樣的檢測(cè)方法包括，但不限于形態(tài)和生化特性的檢測(cè)(如分泌的骨鈣蛋白或其它成骨細(xì)胞特異性蛋白或RNA)。
抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的濃度指這些化合物的混合濃度，即所述濃度的總和。例如，“50μM的抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸”的定義包括，但不限于這樣的排列組合50μM的抗壞血酸；50μM的抗壞血酸-2-磷酸；10μM的抗壞血酸和40μM的抗壞血酸-2-磷酸；或40μM的抗壞血酸和10μM的抗壞血酸-2-磷酸。
優(yōu)選，培養(yǎng)基含有大約2-20mMβ-甘油磷酸和大約20-75μM的抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。更優(yōu)選，培養(yǎng)基包含5-15mMβ-甘油磷酸和大約40-60μM的抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。最優(yōu)選，培養(yǎng)基包含10mMβ甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
可以使用任何能支持成纖維細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方包括Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，α-改進(jìn)的極限必需培養(yǎng)基(αMEM)和必需的基本培養(yǎng)基(BME)以及類似的培養(yǎng)基。通常，要向以上培養(yǎng)基中加入5-20％胎牛血清(FCS)以支持成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。但如果在FCS中對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的成分已得到確定并補(bǔ)充到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，也可以使用確定成分培養(yǎng)基。
可用于本發(fā)明所述方法的培養(yǎng)基可以含有一種或多種感興趣的化合物，包括，但不限于，抗生素，骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性或促進(jìn)生長(zhǎng)或分化的化合物，例如骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白或其它生長(zhǎng)因子。骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白的例子包括，但不限于生骨蛋白-1，BMP-5，成骨素，骨骼誘導(dǎo)因子和骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白-4(Asahina等(1996)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究22238-47；Takuwa(1991)生物化學(xué)和生物物理研究通訊17496-101；Chen(1991)JBone Min Res 61387-1390；Sampath(1992)生物化學(xué)學(xué)報(bào)26720352-20362；Wozney等(1988)科學(xué)2421528-1534，文獻(xiàn)此處引作參考)，以及類似的物質(zhì)。
優(yōu)選地，脂肪組織經(jīng)過(guò)處理從而使基質(zhì)細(xì)胞彼此解離并同其它類型的細(xì)胞分離，除去沉淀的血液成份。通常，可以用蛋白水解酶，比如膠原酶和/或胰蛋白酶以及能螯合鈣離子的試劑來(lái)處理脂肪組織可以使其解離為單個(gè)可存活的細(xì)胞。然后通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如差速離心，熒光激發(fā)細(xì)胞分選術(shù)，親和層析以及類似的方法可以部分或全部地純化基質(zhì)細(xì)胞。然后在經(jīng)含有β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的培養(yǎng)基處理前，將部分或全部純化的基質(zhì)細(xì)胞在支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)到5個(gè)細(xì)胞傳代時(shí)間。
將基質(zhì)細(xì)胞在含有β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以誘導(dǎo)其分化為成骨細(xì)胞。為使得基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，用β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸處理時(shí)間的長(zhǎng)短取決于多種因素。這些因素包括，但不限于，所用β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的濃度，所用培養(yǎng)基，脂肪組織或基質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源，鋪板的起始密度，生長(zhǎng)因子或骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)存在與否等。操作者可以優(yōu)化β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的濃度以及其它條件和因子。通過(guò)測(cè)量已分化為成骨細(xì)胞的細(xì)胞百分比可以確定最佳的濃度和處理次數(shù)。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的形態(tài)學(xué)和生化檢測(cè)和指數(shù)可以監(jiān)測(cè)上述百分比。這樣的檢測(cè)和指數(shù)包括，但不限于對(duì)形態(tài)和生化特性檢測(cè)，比如鈣沉淀物或成骨細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)或RNA的存在、von Kossa染色、骨鈣蛋白的分泌和堿性磷酸酶的分泌。
來(lái)源于脂肪組織基質(zhì)細(xì)胞的成骨細(xì)胞可以導(dǎo)入人或動(dòng)物受治療者的外科手術(shù)或骨折部位。將成骨細(xì)胞導(dǎo)入骨骼可用于治療骨折和骨疾病，包括骨質(zhì)疏松癥。因此，在另外一個(gè)方面，本發(fā)明著眼于改善受治療者骨結(jié)構(gòu)的方法，包括a)在含有能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和一定量足夠誘導(dǎo)分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養(yǎng)來(lái)自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞。
b)將所述成骨細(xì)胞導(dǎo)入所述受治者的外科手術(shù)或骨折部位。
優(yōu)選基質(zhì)細(xì)胞分離自將接受分化的成骨細(xì)胞的受治療者的脂肪組織，但也可以使用分離自與受治療者同種或異種的生物的基質(zhì)細(xì)胞。受治療者可以是有骨組織的任何生物。優(yōu)選的受治療者是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的受治療者是人。
在移植到受治療者的外科手術(shù)或骨折部位之前，可以用目的核酸來(lái)穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化基質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞。目的核酸序列包括，但不限于能編碼提高成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，分化和/或礦化的產(chǎn)物的基因。例如，為治療沒(méi)有愈合的骨折或骨質(zhì)疏松癥，可以將骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白4的表達(dá)系統(tǒng)以穩(wěn)定或瞬時(shí)的方式轉(zhuǎn)化到前脂肪細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，將成骨細(xì)胞移植到骨骼外科手術(shù)或骨折部位上的方法也同樣為人所周知。
可以將成骨細(xì)胞單獨(dú)或以它與有益于骨骼傷口和損傷的修復(fù)的組合物形成的混合物的形成導(dǎo)入。這些組合物包括，但不限于，骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白，羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒(HA/TCP)，明膠，多聚-L-賴氨酸，和膠原。例如，可以將從脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)的成骨細(xì)胞與DMB或其它基質(zhì)組合以使該復(fù)合材料具有骨質(zhì)生成性(自身產(chǎn)生骨骼)和骨質(zhì)誘導(dǎo)性。用自體骨髓細(xì)胞與同種異體的DMB組合的類似方法也產(chǎn)生了很好的結(jié)果(Connolly(1995)臨床矯形術(shù)3188-18)。
本發(fā)明另外一個(gè)目的是為鑒定和研究能促使基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的化合物提供方法。能提高成骨細(xì)胞的分化的化合物在各種骨疾病，包括骨折和骨質(zhì)疏松癥的治療中可能有一定作用。另外，發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的化合物可應(yīng)用于體外或體內(nèi)使細(xì)胞分化。相反地，發(fā)現(xiàn)能阻礙成骨細(xì)胞分化的化合物或因子可應(yīng)用于某些疾病狀態(tài)，其中特應(yīng)性骨產(chǎn)生，比如Paget’s病或成軟骨組織變形，可以利用這些化合物進(jìn)行治療。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明著眼于鑒定影響成骨細(xì)胞分化的化合物的方法，包括a)在存在或缺乏被檢測(cè)其對(duì)成骨細(xì)胞分化之影響的化合物的情況下，在含有能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和一定量足夠誘導(dǎo)分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養(yǎng)脂肪基質(zhì)細(xì)胞；以及b)比較存在或缺乏所述化合物時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化情況。
可以對(duì)任何化合物測(cè)試其影響基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力。與待測(cè)化合物相容的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以在《Remington’s制藥科學(xué)》(此處引作參考)的現(xiàn)行版本中找到。
將檢測(cè)結(jié)果與使用已知分化促進(jìn)劑的結(jié)果進(jìn)行比較，比如產(chǎn)骨蛋白1和骨質(zhì)形態(tài)發(fā)生蛋白-4(Asahina等(1996)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究22238-47；Takawa(1991)supra；Chen(1991)supra；Sampath(1992)Supra；Wozney等(1988)科學(xué)2421528-1534)，已知這些物質(zhì)通過(guò)提高成骨細(xì)胞標(biāo)記物(比如骨鈣蛋白一一種成骨細(xì)胞功能的明確標(biāo)記物)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化(Celeste(1986)美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)879843-9872；Stein等(1990)FASEB雜志43111-3123)。并且也可以將這些檢測(cè)的結(jié)果與已知的成骨細(xì)胞分化抑制劑(比如α-TNF)進(jìn)行比較，這些抑制劑能全部或部分阻斷基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。
參考下面的實(shí)施例可以更清楚地理解本發(fā)明的特點(diǎn)和有利之處，但這些實(shí)施例并非用來(lái)限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1從人的脂肪組織中分離基質(zhì)根據(jù)Rodbell(1964，生物化學(xué)雜志239275)和Hauner等(1989，臨床研究雜志)描述的方法從人類脂肪組織中分離基質(zhì)細(xì)胞。簡(jiǎn)要地說(shuō)，通過(guò)吸脂術(shù)分離來(lái)自人皮下儲(chǔ)存的脂肪組織。然后將脂肪組織從吸脂杯中轉(zhuǎn)移到500ml無(wú)菌的燒杯中，并沉降大約10分鐘。吸去沉淀的血。將125ml體積(或更少)的脂肪組織轉(zhuǎn)移到250ml離心管中，然后在離心管中加入Krebs-Ringer緩沖液。組織和緩沖液放置沉降3分鐘或直到產(chǎn)生清晰的分層，然后吸出緩沖液。再用Krebs-Ringer緩沖液將組織洗4-5次或直到組織為橙黃色，而緩沖液為淺褐色。
通過(guò)膠原酶處理來(lái)解離脂肪組織的細(xì)胞。簡(jiǎn)要地說(shuō)，從脂肪組織中除去緩沖液，換上比例為1ml膠原酶溶液/ml組織的2mg膠原酶/ml KrebsBiffer溶液(Worthington，MA，USA，type 1)。離心管在37℃水浴中保溫30-35分鐘，并不時(shí)振蕩。
經(jīng)室溫下500xg離心5分鐘使得基質(zhì)細(xì)胞與脂肪組織中其它組份分離。吸去油和脂肪細(xì)胞。剩余的基質(zhì)-泡囊部分通過(guò)強(qiáng)烈旋轉(zhuǎn)重新懸浮于大約100ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，分到50ml的離心管并于500xg離心5分鐘。小心吸去緩沖液，留下基質(zhì)細(xì)胞。然后將基質(zhì)細(xì)胞重新懸浮于基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM(Morton(1970)體外689-108；Dulbecco(1959)病毒學(xué)8396)/Ham’s F-10培養(yǎng)基(Ham(1963)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究29515)(1∶1，v/v)；10％(v/v)胎牛血清；15mM HEPES，pH7.4；60U/ml青霉素；60U/ml鏈霉素；15μg/ml兩性霉素B)，以合適的細(xì)胞密度下鋪板并在5％CO2下37℃培養(yǎng)過(guò)夜。一旦附著在組織培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上，培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞可以馬上投入使用或者在被誘導(dǎo)而分化為成骨細(xì)胞(如以下實(shí)施例2所述)之前，在培養(yǎng)基中維持5個(gè)傳代時(shí)間。
實(shí)施例2髓外脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞如實(shí)施例1所述分離脂肪基質(zhì)細(xì)胞，然后如下處理以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞以大約22000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度鋪在24孔和/或6孔組織培養(yǎng)板中的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(見(jiàn)上)上。24小時(shí)后，用成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％的胎牛血清(v/v)的DMEM；10mMβ-甘油磷酸；50μg/ml抗壞血酸-2-磷酸；60U/ml青霉素；60U/ml鏈霉素，15μg/ml兩性霉素)取代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。三周內(nèi)，每三天用新鮮的培養(yǎng)基置換成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基。換培養(yǎng)基時(shí)，收集1ml條件培養(yǎng)基并保存于-80℃，用于以后分析分泌的因子。另一種替代的方法是根據(jù)Hauner等人(1989臨床研究雜志341663-1670)的方法，經(jīng)脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理，誘導(dǎo)分離自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
對(duì)如上所述經(jīng)成骨細(xì)胞培養(yǎng)基處理的細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察顯示與成骨細(xì)胞的外形相一致的形態(tài)學(xué)變化(圖1)。延長(zhǎng)培養(yǎng)(21-28天)后，在每個(gè)培養(yǎng)小孔內(nèi)形成了一些多細(xì)胞結(jié)。成骨細(xì)胞培養(yǎng)物的顆粒狀外型表明磷酸鈣沉淀物和前骨結(jié)構(gòu)的存在。因?yàn)榉蛛x自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞用脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理時(shí)，也有可能分化為脂肪細(xì)胞，也應(yīng)檢查經(jīng)成骨細(xì)胞培養(yǎng)基處理的細(xì)胞中是否存在脂肪細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有油滴以及缺乏具有特征性的圓形的脂肪細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞表明經(jīng)成骨細(xì)胞培養(yǎng)基處理的培養(yǎng)物中沒(méi)有明顯的脂肪細(xì)胞。
經(jīng)成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基處理的細(xì)胞用von Kossa的方法進(jìn)行染色以鑒定基質(zhì)細(xì)胞是否分化為成骨細(xì)胞。簡(jiǎn)要地說(shuō)，通過(guò)用無(wú)血清的培養(yǎng)基置換80％的培養(yǎng)基數(shù)次，連續(xù)稀釋出培養(yǎng)基中的胎牛血清。細(xì)胞在5％的甲醛中固定，然后用PBS洗滌數(shù)次以除去殘余血清。固定化的細(xì)胞在100％的乙醇中4℃下保溫大約10分鐘。除去乙醇后，在波長(zhǎng)為254nm的紫外下，固定化的細(xì)胞在0.5ml的5％硝酸銀中保溫10分鐘。在蒸餾水中沖洗細(xì)胞2-3次，在5％硫代硫酸鈉中溫育5分鐘，然后用水沖洗。染色的細(xì)胞可以在50％甘油中無(wú)限期地保存。圖2B和圖2C顯示了von kossa染色的結(jié)果。只有得到成骨細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞染色為陽(yáng)性并變黑。
如下進(jìn)行油紅O染色培養(yǎng)平板用PBS洗滌幾次以除去培養(yǎng)基中的血清或牛血清白蛋白。細(xì)胞在甲醇中或溶于PBS的10％甲醛中固定15分鐘到24小時(shí)。通過(guò)將6ml儲(chǔ)存液(0.5油紅O溶于100ml異丙醇)加入4ml蒸餾水中來(lái)制備油紅O染色溶液。在經(jīng)Whatman#1濾紙過(guò)濾之前，染色液在室溫下放置一個(gè)小時(shí)。細(xì)胞以大約3ml/100mm平板或在6孔平板中以1ml/孔的比例在室溫下染色1小時(shí)，然后用水洗滌幾次。將殘留的洗滌用水全部除去。加入150μl/孔的異丙醇，平板在室溫下放置10分鐘。將異丙醇吹吸幾次以保證所用油紅O溶解。在500nm處測(cè)量光密度。
接受脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基的細(xì)胞用下述方法經(jīng)油紅O染色將呈現(xiàn)特征性的紅色，表明脂質(zhì)的積累(圖2A)。在培養(yǎng)基中4周后，前脂肪細(xì)胞顯示出積累的很小的油滴。細(xì)胞接受成骨細(xì)胞培養(yǎng)基顯示了一些非特異性的油紅O背景，但該染色與細(xì)胞無(wú)關(guān)(圖2C)。這些結(jié)果表明分化為成骨細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有可檢測(cè)到的脂肪細(xì)胞形態(tài)。缺乏這種中性脂質(zhì)積累是失去脂肪細(xì)胞功能和譜系的標(biāo)志。
還檢測(cè)了指示成骨細(xì)胞分化的生化變化。骨鈣蛋白是成骨細(xì)胞特異性分泌的蛋白，可由ELISA(完整人類骨鈣蛋白K EIA試劑盒，貨號(hào)BT-460，Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，MA)來(lái)檢測(cè)。檢查成骨細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)基是否存在分泌的骨鈣蛋白。簡(jiǎn)要地說(shuō)，收集條件培養(yǎng)基(40000細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后的培養(yǎng)基2ml)，每種培養(yǎng)基取20μl進(jìn)行檢測(cè)。如圖3所示，在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣蛋白增加，而脂肪基質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分泌的骨鈣蛋白很少或沒(méi)有。
用商業(yè)來(lái)源的ELISA試劑盒檢測(cè)分泌的leptin肽。收集條件培養(yǎng)基(40000細(xì)胞條件培養(yǎng)72小時(shí)后的培養(yǎng)基2ml)，取100μl依照生產(chǎn)商建議的方案進(jìn)行檢測(cè)。正如預(yù)期的那樣，在脂肪細(xì)胞分化期間，分泌到培養(yǎng)基中的leptin的量增加，而在成骨細(xì)胞分化中則否。在條件培養(yǎng)基中l(wèi)eptin--一種脂肪細(xì)胞特異性分泌蛋白的存在，是脂肪細(xì)胞活力明確的指示物。成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞不能分泌可檢測(cè)量的leptin到培養(yǎng)基中，這表示缺乏脂肪細(xì)胞譜系，而只有脂肪細(xì)胞分化兩周后的細(xì)胞才分泌leptin。
成骨細(xì)胞譜系的另一個(gè)標(biāo)記是分泌堿性磷酸酯酶的能力。按上述方法制備和培養(yǎng)細(xì)胞。使用商業(yè)來(lái)源的檢測(cè)試劑盒(Sigma診斷公司，貨號(hào)104-LS，St Louis，MO)檢查條件培養(yǎng)基的堿性磷酸酯酶活性。如圖4所示，前脂肪細(xì)胞有本底水平的分泌的堿性磷酸酯酶活力。經(jīng)分化，脂肪細(xì)胞失去了本底分泌活力，而成骨細(xì)胞的堿性磷酸酯酶的水平則有提高。
實(shí)施例3鑒定影響成骨細(xì)胞分化的化合物按照實(shí)施例1描述的方法，用分離自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)物來(lái)研究目的化合物對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。如實(shí)施例2所述，在存在或缺乏目的化合物時(shí)，成骨細(xì)胞由脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)。通過(guò)分泌骨鈣蛋白的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)分化。使用本實(shí)施例的方法，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的化合物包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和骨橋蛋白-1(未顯示數(shù)據(jù))。這些結(jié)果與Wozney等，1988科學(xué)2421528-1534；Asahina等，1996實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究22238-47；Cook等，1996臨床矯形術(shù)32429-38以前的發(fā)現(xiàn)相符。如下討論促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的化合物可用于增強(qiáng)受治療者的骨結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例4骨修復(fù)中成骨細(xì)胞的應(yīng)用按照實(shí)施例1的方法，使用吸脂術(shù)從患有不能痊愈性骨折和骨質(zhì)疏松癥骨折的患者的脂肪組織中分離基質(zhì)細(xì)胞。用實(shí)施例2的方法在體外誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。7-21天后，通過(guò)例如胰酶處理或從組織培養(yǎng)板中機(jī)械地剝離來(lái)收集已分化的成骨細(xì)胞，然后在無(wú)菌條件下4-20℃ 3000xg離心10分鐘濃縮細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞懸浮于膠原或MatrigelTM溶液中，然后使用20口徑或更大孔徑的針頭直接注射到骨折或外科手術(shù)部位。另一個(gè)替代的方法是，在注射前，將細(xì)胞與DBM或比如ProOsteon 2000TM(Interpore Cross，Irvine，CA)或CollagraftTM(Zimmer，Warsaw，IN)的陶瓷基質(zhì)相混合。所用細(xì)胞的數(shù)量取決于骨折的面積和性質(zhì)。根據(jù)所需的骨折恢復(fù)速度可以進(jìn)行多種治療。結(jié)果是痊愈時(shí)間的縮短和骨折部位周圍骨密度的增加。
實(shí)施例5使用基因改變的成骨細(xì)胞治療骨折或骨質(zhì)疏松癥如實(shí)施例1所述分離基質(zhì)細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法如氯化法(Maniatis等(1982)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)將基因材料(例如編碼有用基因產(chǎn)物，如骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白的DNA，它可操縱地與啟動(dòng)子相連)轉(zhuǎn)入基質(zhì)細(xì)胞。使用Effectene試劑可改善該方法，并在這里描述。在1個(gè)微量離心管中，將0.1-2.0μg pCMV-βgal(Stratagene Inc.，La Jolla，CA)加入150μlBuffer EC(Qiagen EffecteneTM試劑盒，貨號(hào)301425，Qiagen公司)。這樣可以凝聚DNA。將8μl的促進(jìn)劑(試劑盒)加入凝聚后的DNA。然后將含有凝聚DNA的離心管旋轉(zhuǎn)1秒鐘并在室溫下放置2-5分鐘。短暫離心以除去管頂端的液滴。加入10μl EffeeteneTM，離心管旋轉(zhuǎn)10秒，室溫下放置5-10分鐘。在5-10分鐘的保溫時(shí)間后，向DNA混合物中加入1ml培養(yǎng)基。
從細(xì)胞移去120μl舊培養(yǎng)基并加入70μl新鮮培養(yǎng)基，然后將25μ1 DNA混合物移入每個(gè)孔。細(xì)胞于37培養(yǎng)約5小時(shí)。但是，Effectene沒(méi)有毒性也可以一直保留在細(xì)胞上。
然后將細(xì)胞在感染72小時(shí)后用80μl新鮮培養(yǎng)基沖洗1次，并用Mantiatis等描述的方法(1982)檢測(cè)細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活力。由實(shí)施例1描述的方法可使這些細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞?？商娲兀蛘逥NA可以直接導(dǎo)入分化為成骨細(xì)胞的細(xì)胞中。
也可以使用其它將核酸序列導(dǎo)入細(xì)胞的方法。例如，通過(guò)與Becker等(1994，Meth Cell Biol 43161-189)和Meunier-Durmont等(1996，歐洲生物化學(xué)237660-667)描述的相類似的方法，可以使用腺病毒將DNA轉(zhuǎn)入基質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)如以上實(shí)施例1描述的處理后分化為成骨細(xì)胞?；蛘?，分化的成骨細(xì)胞能夠用病毒顆粒感染。加入抗生素選擇性標(biāo)記使其能富集含有導(dǎo)入遺傳材料的細(xì)胞。然后如以上實(shí)施例3所述，將得到的帶有導(dǎo)入遺傳材料的成骨細(xì)胞移植到骨折或骨質(zhì)疏松癥的骨髓中。
說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物表明了本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有出版物引入本文作為參考文獻(xiàn)，正如每篇均是逐一并個(gè)別地全文引入作為參考文獻(xiàn)一樣。
雖然已參照特定的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，可以想到很多變化、改善和實(shí)施方案都是可能的，并且可以相應(yīng)地認(rèn)為所有這些變化、改善和實(shí)施方案都在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種使脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的方法，包括在包含能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)分化量的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述量是大約5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述量是大約10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基選自DMEM，αMEM和BME。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含大約5-20％的胎牛血清。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含一種或多種骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
10.一種鑒定影響成骨細(xì)胞分化的化合物的方法，包括a)在分別存在和缺乏受試以測(cè)試其對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響的化合物時(shí)，在包含能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和一定量足夠誘導(dǎo)分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養(yǎng)脂肪基質(zhì)細(xì)胞；和b)比較分別培養(yǎng)于存在或缺乏所說(shuō)的化合物中的所述細(xì)胞中成骨細(xì)胞的分化情況。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述量是5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述量是10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
14.一種改善受治療者骨結(jié)構(gòu)的方法，包括a)在包含能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和一定量足夠誘導(dǎo)分化的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸的組合物中培養(yǎng)脂肪基質(zhì)細(xì)胞；以及b)將所說(shuō)的成骨細(xì)胞導(dǎo)入受治療者的外科手術(shù)或骨折部位。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述量是大約5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
17.權(quán)利要求書(shū)16方法，其中所述的數(shù)量是大約10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述脂肪基質(zhì)細(xì)胞分離自所說(shuō)的受治療者。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述培養(yǎng)基選自DMEM，αMEM和BME。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含5-20％的胎牛血清。
21.權(quán)利要求14的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含一種或多種骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白。
22.權(quán)利要求14的方法，其中所述受治療者是哺乳動(dòng)物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述受治療者是人。
24.權(quán)利要求14的方法，其中所述成骨細(xì)胞是與在骨傷口，骨缺損和/或骨疾病的修復(fù)中有用的組合物相混合導(dǎo)入的。
25.權(quán)利要求14的方法，其中將目的核苷酸序列導(dǎo)入所述脂肪基質(zhì)細(xì)胞或所述成骨細(xì)胞。
26.一種組合物，包含脂肪基質(zhì)細(xì)胞、能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和一定量的足以誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的β-甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述量是大約2-20mM的β-甘油磷酸和大約20-75μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述量是大約5-15mM的β-甘油磷酸和大約40-60μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中所述量是大約10mM的β-甘油磷酸和大約50μM抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸。
30.權(quán)利要求26的組合物，其中所述基質(zhì)細(xì)胞是人的。
全文摘要
本發(fā)明提供了使來(lái)源于脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞分化為具有成骨細(xì)胞性質(zhì)之細(xì)胞的方法和組合物，以及改善受治療者骨骼結(jié)構(gòu)的方法。這些方法包括在β－甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸－2－磷酸中將來(lái)源于脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)足夠長(zhǎng)時(shí)間以使所述細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。所述方法和組合物可應(yīng)用于在外科手術(shù)和損傷部位產(chǎn)生自體移植入骨所需的成骨細(xì)胞。所述組合物包括脂肪基質(zhì)細(xì)胞、能支持成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基以及一定量的足夠所說(shuō)的誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的β－甘油磷酸和抗壞血酸和/或抗壞血酸－2－磷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定影響成骨細(xì)胞分化的化合物的方法。所述化合物可用于研究骨骼發(fā)育和治療包括骨折和骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的骨疾病的治療。
文檔編號(hào)A61F2/00GK1584020SQ20041005902
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期1998年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月2日
發(fā)明者Y-D·C·哈爾沃森 申請(qǐng)人:澤恩比奧公司