專利名稱：浙貝乙素及其衍生物在制備鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及浙貝乙素及其衍生物在鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的用途。
背景技術(shù)：
湖北貝母為百合科貝母屬植物湖北貝母(Fritillaria Hupehensis Hsiao et K.C.Hsia)的干燥鱗莖，微苦、涼，入肺、心經(jīng)，具有清熱潤肺、化痰止咳及散結(jié)之功效。1991年湖北貝母被部頒中藥材標準收載，現(xiàn)已收載于《中華人民共和國藥典》(2000年版)中，發(fā)展成為僅次于浙貝母的第二大主流品種。
現(xiàn)代藥理學研究表明，總生物堿是湖北貝母的生物活性有效部位，總生物堿有舒張離體氣管平滑肌、鎮(zhèn)咳、平喘作用，湖北貝母生物堿含量及生物活性較川貝、浙貝高[參見熊瑋，郭小玲，何嘉瑯.湖北貝母藥理作用的初步研究(J).中草藥，1986，17(3)115-118.]。
浙貝乙素是湖北貝母中的主要生物堿，其含量達0.3％，另外，貝母屬植物中的另一主要生物堿浙貝甲素與浙貝乙素為酮和醇的關(guān)系，浙貝甲素很容易轉(zhuǎn)變?yōu)檎阖愐宜?，兩者含量之和占總生物堿含量的80％以上。藥效學實驗表明浙貝乙素具有優(yōu)良的鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘之功效的結(jié)論，整體效果明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以浙貝乙素為先導化合物，在一系列浙貝乙素衍生物中篩選出鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘活性優(yōu)良的單體，為將其開發(fā)成為一種天然、高效、低毒的鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘藥物打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的是通過如下措施來達到合成一系列浙貝乙素衍生物并鑒定，對浙貝乙素及其衍生物進行了鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘實驗，篩選出活性優(yōu)良的單體。
本發(fā)明提供的浙貝乙素3位衍生物具有以下通式 其中R為 或 即本發(fā)明對浙貝乙素的3位進行結(jié)構(gòu)改造和結(jié)構(gòu)修飾，合成了3β-乙酰化浙貝乙素、3-氧化浙貝乙素、3β-苯甲?；阖愐宜?、3β-丙?；阖愐宜?、3β-丁?；阖愐宜?、3β-丁氧羰基化浙貝乙素等6個浙貝乙素衍生物，并鑒定了它們的結(jié)構(gòu)。
對浙貝乙素及其如上所述6個3位衍生物進行鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘活性實驗。結(jié)果表明3β-乙酰化浙貝乙素、3β-丙?；阖愐宜睾?β-苯甲?；阖愐宜劓?zhèn)咳活性強于浙貝乙素；3β-乙?；阖愐宜亍?β-苯甲?；阖愐宜睾脱趸阖愐宜仂钐祷钚詮娪谡阖愐宜?；3β-乙?；阖愐宜睾脱趸阖愐宜仄酱钚詮娪谡阖愐宜?。因此，3β-乙?；阖愐宜鼐哂泻軓姷逆?zhèn)咳、祛痰、平喘活性，遠遠強于浙貝乙素，整體效果明顯，是一種很有開發(fā)前途的高效鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘藥物。


圖1顯示由浙貝乙素制備3β-乙?；阖愐宜?。
圖2顯示由浙貝乙素制備3-氧化浙貝乙素。
圖3顯示由浙貝乙素制備3β-苯甲?；阖愐宜?。
圖4顯示由浙貝乙素制備3β-丙?；阖愐宜亍?br> 圖5顯示由浙貝乙素制備3β-丁?；阖愐宜亍?br> 圖6顯示由浙貝乙素制備3β-丁氧羰基化浙貝乙素。
具體實施例方式實施例1浙貝乙素衍生物的制備一、實驗材料1浙貝乙素 上步提取所得2吡啶 分析純，天津(香港)新通精細化工有限公司3無水K2CO3分析純，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠4無水MgSO4CuSO4NaHCO3分析純，上海虹光化工廠5乙酸乙酯 三氯甲烷 丙酮 分析純，上海恒麗精細化工有限公司6苯甲酰氯 分析純，北京市昌平石鷹化工廠7正丁醇 分析純，河南焦作市化工廠8乙酸酐、丙酸酐 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司9丁酸酐 Fluka Chemie GmbH CH-9471 Buchs10氯甲酸丁酯 Geel，Belgium.USA.
11PCC 北京百靈威化學技術(shù)有限公司12高效硅膠H板 青島海洋化工廠分廠二、實驗方法(一)乙?；?1)2g浙貝乙素溶于5ml無水吡啶中，再加入乙酸酐5ml，放置24h。
(2)反應液移入分液漏斗中，加飽和CuSO4溶液3.3ml，片刻再加飽和NaHCO3溶液至無氣泡產(chǎn)生，再加乙酸乙酯反復萃取，至水層無生物堿。
(3)合并乙酸乙酯層，用無水MgSO4干燥，放置24h。
(4)過濾除去MgSO4，并將乙酸乙酯層回收，上硅膠柱，反復分離至純化合物。
(二)氧化(1)2g浙貝乙素溶于40mlCH2Cl2中，加2gPCC，攪拌，薄層跟蹤至反應完全。
(2)傾出CH2Cl2溶液，瓶中殘渣用CH2Cl2洗至無生物堿。
(3)溶液回收至小體積。
(4)柱層析法分離產(chǎn)物至純化合物。
(三)苯甲?；?1)0.1g浙貝乙素溶于20ml無水吡啶中，冰浴中加入11ml苯甲酰氯，室溫放置，薄層跟蹤。
(2)反應完全后，將溶液倒入碎冰中，加10ml飽和CuSO4溶液，片刻，加飽和NaHCO3溶液至無氣泡，用氯仿萃取至水層無生物堿。
(3)合并氯仿層，無水MgSO4干燥，放置24h，過濾去MgSO4，回收至小體積，上硅膠柱，反復分離至純化合物。
(四)丙?；?1)浙貝乙素2g溶于5ml無水吡啶中，加5ml丙酸酐，放置，薄層跟蹤。
(2)反應完全后，加2.5ml飽和CuSO4溶液，片刻，再加飽和NaHCO3溶液至無氣泡產(chǎn)生。
(3)EtOAC反復萃取，至水層無生物堿，合并EtOAC層，用無水MgSO4干燥，放置24h，濾去MgSO4，回收至小體積，上硅膠柱，反復分離至純化合物。
(五)丁酰化(1)浙貝乙素2g溶于5ml無水吡啶中，加5ml丁酸酐，放置，薄層跟蹤。
(2)反應完全后，加2.5ml飽和CuSO4溶液，片刻，再加飽和NaHCO3溶液至無氣泡產(chǎn)生。
(3)EtOAC反復萃取，至無生物堿，合并EtOAC層，用無水MgSO4干燥，放置24h，濾去MgSO4，回收至小體積，上硅膠柱，反復分離至純化合物。
(六)丁氧羰基化浙貝乙素(1)浙貝乙素2g溶于20ml無水吡啶中，冰浴中逐漸加入氯甲酸丁酯43ml，30-40℃放置，薄層跟蹤。
(2)反應完全后，加2.5ml飽和CuSO4溶液，片刻，再加飽和NaHCO3溶液至無氣泡產(chǎn)生。
(3)EtOAC反復萃取，至無生物堿，合并EtOAC層，用無水MgSO4干燥，放置24h，濾去MgSO4，回收至小體積，上硅膠柱，反復分離至純化合物。
實施例2浙貝乙素衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定一、乙酰化浙貝乙素(PE-D1)乙?；阖愐宜兀瑹o色針晶(丙酮)，mp179.5-181.5℃；FAB(+)-MS m/z472(M+H)+；1H-NMR譜圖顯示有四個甲基信號和一個羥基同碳質(zhì)子信號，δ0.74的單峰顯示H-19位于較高場，說明C6位有酮基存在，對H-19產(chǎn)生屛蔽作用；δ0.98(3H，s，H-21)C20-CH3為單峰且位于低場說明C20有羥基，δ1.04(3H，d，J＝7Hz，H-27)說明C25-CH3為直立-構(gòu)型，δ1.98(3H，S)為乙?；募谆?，δ4.64(1H，m，W1/2＝24Hz)為C3的羥基同碳質(zhì)子，而浙貝乙素C3-Hδ3.582，此苷化位移說明乙?；恢迷贑3-OH。13C-NMR譜圖顯示有29個碳原子信號，其DEPT實驗表明其有4個伯碳，11個仲碳，10個叔碳，2個季碳，1個酮基碳原子，1個酯羰基碳原子。通過與浙貝乙素的碳譜數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)C3δ72.9比浙貝乙素C3δ70.9低場2ppm，而C2δ26.5比浙貝乙素C2δ30.5高場4ppm，C4δ26.1比浙貝乙素C2δ30.1高場4ppm，此苷化位移說明乙?；恢迷贑3-OH無疑。
取PE-D1 100mg，5％NaOH-MeOH 70℃水浴上回流4h，冷后堿化，用C6H6萃取生物堿白色珊瑚狀結(jié)晶，mp213℃～214℃，[α]D-62.5(c0.5，MeOH)，HR-MS測得分子式C27H43NO3分子量429.3234(計算值429.6433)。IR(KBr)cm-13410，1055(OH)，2950，1463～1445(-CH3，-CH2-)，2750(反式喹喏里西啶)，1705(C＝O)。FAB-MS m/z579(M+H+Triethanolamine)+，430[M+H]+，428[M-H]+。1H-NMR譜圖顯示有三個甲基信號δ0.76、δ1.03(3H，s，H-21)C20-CH3，δ1.07(3H，d，J＝7Hz，H-27)，δ3.582(1H，m，W1/2＝24Hz)為C3的羥基同碳質(zhì)子。13C-NMR譜圖顯示有27個碳原子信號，其DEPT實驗表明含有3個伯碳，11個仲碳，10個叔碳，2個季碳和1個酮基碳原子。以上理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)與文獻報道[3]的浙貝乙素一致，與浙貝乙素標準品作混合熔點測定，熔點不下降，薄層層析對比分析，Rf值相同，斑點重疊。
綜上所述，所合成的浙貝乙素衍生物為3β-乙?；阖愐宜?3β-acetyl-peminine)。
二、氧化浙貝乙素(PE-D2)氧化浙貝乙素，無色針晶(丙酮)，mp177.5-179.5℃；FAB(+)-MS m/z428(M+H)+；1H-NMR譜圖顯示有三個甲基信號和一個羥基同碳質(zhì)子信號，δ0.91的單峰顯示H-19相對于浙貝乙素位于較低場，說明C3位有酮基存在，對H-19產(chǎn)生去屛蔽作用；δ0.99(3H，s，H-21)C20-CH3為單峰且位于低場說明C20有羥基，δ1.02(3H，d，J＝7Hz，H-27)說明C25-CH3為直立-構(gòu)型。13C-NMR譜圖顯示有27個碳原子信號，其DEPT實驗表明其有3個伯碳，11個仲碳，9個叔碳，2個季碳，2個酮基碳原子。通過與浙貝乙素的碳譜數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)C2δ38.1比浙貝乙素C2δ30.5低場，C4δ37.2比浙貝乙素C2δ30.1高場4ppm。
綜上所述，所合成的浙貝乙素衍生物為3-氧化浙貝乙素。
三、苯甲酰化浙貝乙素(PE-D3)苯甲?；阖愐宜?，無色簇晶(丙酮)，mp133.5-135.5℃；FAB(+)-MS m/z534(M+H)+；1H-NMR譜圖顯示有三個甲基信號和一個羥基同碳質(zhì)子信號，δ0.83的單峰顯示H-19位于較高場，說明C6位有酮基存在，對H-19產(chǎn)生屛蔽作用；δ1.02(3H，s，H-21)C20-CH3為單峰且位于低場說明C20有羥基，δ1.08(3H，d，J＝7Hz，H-27)說明C25-CH3為直立-構(gòu)型，δ4.92(1H，m)為C3的羥基同碳質(zhì)子，而浙貝乙素C3-Hδ3.582，此苷化位移說明苯甲?；恢迷贑3-OH，δ8.02(2H，d J＝7.2Hz)，δ7.55(1H，m)，7.42(2H，m)為單取代苯環(huán)上氫質(zhì)子峰。13C-NMR譜圖顯示有34個碳原子信號，其DEPT實驗表明其有3個伯碳，16個仲碳，10個叔碳，3個季碳，1個酮基碳原子，1個酯羰基碳原子。通過與浙貝乙素的碳譜數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)C3δ73.6比浙貝乙素C3δ70.9低場2.7ppm，而C2δ26.7比浙貝乙素C2δ30.5高場4.2ppm，C4δ26.4比浙貝乙素C2δ30.1高場4.3ppm，此苷化位移說明苯甲酰化位置在C3-OH。
取PE-D3 100mg，5％NaOH-MeOH 70℃水浴上回流4h，冷后堿化，用CHCl3萃取生物堿，與標準品浙貝乙素作混合熔點測定，熔點不下降，薄層層析對比分析，Rf值相同，斑點重疊。
綜上所述，所合成的浙貝乙素衍生物為3β-苯甲?；阖愐宜?。
四、丙?；阖愐宜?PE-D4)丙酰化浙貝乙素，無色方晶(丙酮)，mp172-174℃；FAB(+)-MS m/z486(M+H)+；1H-NMR譜圖顯示有四個甲基信號和一個羥基同碳質(zhì)子信號，δ0.74的單峰顯示H-19位于較高場，說明C6位有酮基存在，對H-19產(chǎn)生屛蔽作用；δ0.98(3H，s，H-21)C20-CH3為單峰且位于低場說明C20有羥基，δ1.03(3H，d，J＝7Hz，H-27)說明C25-CH3為直立-構(gòu)型，δ1.08(3H，t，J＝6Hz，H-3’)，δ2.25(2H，qart)為丙?；募谆?，δ4.65(1H，m)為C3的羥基同碳質(zhì)子，而浙貝乙素C3-Hδ3.58，此苷化位移說明丙酰化位置在C3-OH。13C-NMR譜圖顯示有30個碳原子信號，其DEPT實驗表明其有4個伯碳，12個仲碳，10個叔碳，2個季碳，1個酮基碳原子，1個酯羰基碳原子。通過與浙貝乙素的碳譜數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)C3δ72.7比浙貝乙素C3δ70.9低場1.8ppm，而C2δ26.6比浙貝乙素C2δ30.5高場4.1ppm，C4δ26.1比浙貝乙素C2δ30.1高場4ppm，此苷化位移說明丙酰化位置在C3-OH。
取PE-D4 100mg，5％NaOH-MeOH 70℃水浴上回流4h，冷后堿化，用CHCl3萃取生物堿，與浙貝乙素標準品作混合熔點測定，熔點不下降，薄層層析對比分析，Rf值相同，斑點重疊。
綜上所述，所合成的浙貝乙素衍生物為3β-丙?；阖愐宜亍?br> 五、丁?；阖愐宜?PE-D5)丁?；阖愐宜責o色棱晶(丙酮)，mp128-130℃；FAB(+)-MS m/z500(M+H)+；1H-NMR譜圖顯示有四個甲基信號和一個羥基同碳質(zhì)子信號，δ0.75的單峰顯示H-19位于較高場，說明C6位有酮基存在，對H-19產(chǎn)生屛蔽作用；δ0.99(3H，s，H-21)C20-CH3為單峰且位于低場說明C20有羥基，δ1.04(3H，d，J＝7Hz，H-27)說明C25-CH3為直立-構(gòu)型，δ0.91(3H，t，J＝5.8Hz，H-4’)為丁?；募谆?，δ2.22(3H，t，H-2’)為丁?；膩喖谆澹?.66(1H，m)為C3的羥基同碳質(zhì)子，而浙貝乙素C3-Hδ3.582，此苷化位移說明乙?；恢迷贑3-OH。13C-NMR譜圖顯示有31個碳原子信號，其DEPT實驗表明其有4個伯碳，13個仲碳，10個叔碳，2個季碳，1個酮基碳原子，1個酯羰基碳原子。通過與浙貝乙素的碳譜數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)C3δ72.6比浙貝乙素C3δ70.9低場1.7ppm，而C2δ26.6比浙貝乙素C2δ30.5高場4.1ppm，C4δ26.1比浙貝乙素C2δ30.1高場4ppm，此苷化位移說明乙酰化位置在C3-OH。
取PE-D5 100mg，5％NaOH-MeOH 70℃水浴上回流4h，冷后堿化，用CHCl3萃取生物堿，與浙貝乙素標準品作混合熔點測定，熔點不下降，薄層層析對比分析，Rf值相同，斑點重疊。
綜上所述，所合成的浙貝乙素衍生物為3β-丁?；阖愐宜?。
六、丁氧羰基化浙貝乙素(PE-D6)丁氧羰基化浙貝乙素，無色針晶(丙酮)，mp66-68℃；FAB(+)-MS m/z530(M+H)+；1H-NMR譜圖顯示有四個甲基信號和一個羥基同碳質(zhì)子信號，δ0.70的單峰顯示H-19位于較高場，說明C6位有酮基存在，對H-19產(chǎn)生屛蔽作用；δ0.95(3H，s，H-21)C20-CH3為單峰且位于低場說明C20有羥基，δ1.00(3H，d，J＝7.0Hz，H-27)說明C25-CH3為直立-構(gòu)型，δ0.87(3H，t，J＝7.4Hz)為丁氧羰基的甲基峰，δ4.04(2H，t，J＝5.0Hz)為丁氧羰基的亞甲基峰，δ4.46(1H，m)為C3的羥基同碳質(zhì)子，而浙貝乙素C3-Hδ3.582，此苷化位移說明乙?；恢迷贑3-OH。13C-NMR譜圖顯示有29個碳原子信號，其DEPT實驗表明其有4個伯碳，14個仲碳，10個叔碳，2個季碳，1個酮基碳原子，1個碳酸酯羰基碳原子。通過與浙貝乙素的碳譜數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)C3δ76.8比浙貝乙素C3δ70.9低場5.9ppm，而C2δ26.5比浙貝乙素C2δ30.5高場4ppm，C4δ26.1比浙貝乙素C2δ30.1高場4ppm，此苷化位移說明乙?；恢迷贑3-OH。
取PE-D6 100mg，5％NaOH-MeOH 70℃水浴上回流4h，冷后堿化，用CHCl3萃取生物堿，與浙貝乙素標準品作混合熔點測定，熔點不下降，薄層層析對比分析，Rf值相同，斑點重疊。
綜上所述，所合成的浙貝乙素衍生物為3β-丁氧羰基化浙貝乙素。
實施例3浙貝乙素衍生物鎮(zhèn)咳活性實驗實驗材料昆明種小鼠 華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供樣品溶液分別精密稱取浙貝乙素及6個衍生物3β-乙酰化浙貝乙素(乙?；?、氧化浙貝乙素(氧化)、3β-苯甲?；阖愐宜?苯甲酰化)、3β-丙?；阖愐宜?丙?；?、3β-丁?；阖愐宜?丁酰化)、3β-丁氧羰基化浙貝乙素(丁氧羰基化)各適量，滴加適量稀HCl溶解，用蒸餾水定容，樣品溶液pH值大約在4-5之間。
陽性對照磷酸可待因(北京中順制藥廠)實驗原理采用濃氨水引咳法，濃氨水為一種較強的刺激物，小鼠吸入后，呼吸道受刺激。反射性的引起咳嗽，能抑制咳嗽中樞或降低呼吸道感受器敏感性藥物均有鎮(zhèn)咳作用。
實驗方法和結(jié)果取體重18-22g小白鼠120只，雌雄各半，隨機分成12組，按表1(i.g)給藥1小時后，置于倒置的500ml燒杯內(nèi)，用1mL注射器吸取0.2ml濃氨水注入燒杯內(nèi)放的一個棉球中，觀察咳嗽潛伏期和3分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)。
表1浙貝乙素及其衍生物的鎮(zhèn)咳活性咳嗽次數(shù)分組 動物數(shù) 劑量(mg/kg) 途徑 咳嗽潛伏期(秒)(3分鐘內(nèi))陰性 100i.g 46±26.8 18.0±9.8陽性 1030 i.g 82.7±43.0*7.7±4.9*浙貝乙素 103i.g 30.6±14.7 14.8±8.03β-乙?；阖愐宜?103i.g 92.8±43.0*8.5±7.0*3β-丙?；阖愐宜?103i.g 62.4±46.8*8.4±4.73β-丁酰化浙貝乙素 103i.g 57.1±41.0、 10.6±6.03β-苯甲酰化浙貝乙素 103i.g 25.1±12.1 7.6±3.8*3-氧化浙貝乙素 103i.g 44.7±19.8 10.9±5.33β-丁氧羰基化浙貝乙素 103i.g 71±41.2 12.0±10.2陽性組磷酸可待因 陰性組不含樣品的蒸餾水與陰性對照*P ＜0.05結(jié)果分析3β-乙?；阖愐宜嘏c陰性比較有差異，鎮(zhèn)咳活性明顯強于浙貝乙素。3β-丙?；阖愐宜睾?β-苯甲?；阖愐宜匾嘤幸欢ǖ逆?zhèn)咳活性，強于浙貝乙素。
實施例4浙貝乙素衍生物祛痰活性實驗實驗材料昆明種小鼠 華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供樣品溶液分別精密稱取浙貝乙素及6個衍生物3β-乙酰化浙貝乙素(乙?；?、氧化浙貝乙素(氧化)、3β-苯甲?；阖愐宜?苯甲?；?、3β-丙酰化浙貝乙素(丙?；?、3β-丁?；阖愐宜?丁?；?、3β-丁氧羰基化浙貝乙素(丁氧羰基化)各適量，滴加適量稀HCl溶解，用蒸餾水定容，樣品溶液pH值大約在4-5之間。
陽性對照愈創(chuàng)木酚甘油醚(吉林省恒和維康藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號20030901)
酚紅 (天津市化學試劑研究所，20020408)實驗原理利用酚紅能部分地從氣管排泌的特點，在祛痰藥物的影響下，隨著支氣管分泌量的增加，由呼吸道粘膜排出的酚紅也增多，用分光光度計測出酚紅的排泌量，從而得知藥物祛痰作用的強弱。
酚紅標準曲線的制定精密稱取酚紅粉末0.0025g，置于50ml容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，配制成50ug/ml的溶液，再分別精密吸取0.30ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml該溶液于10ml容量瓶中并定容，用WFZ800-D3B紫外分光光度計測定各自的吸光度。
表2酚紅標準曲線的制定酚紅(μl/ml)1.5 2.5 510 15A值 0.0490.0840.1560.3060.456以吸收度值(A)對酚紅的含量(X)回歸，得回歸方程為A＝0.0306x+0.0042，γ＝0.9997由于吸收度值(A)對酚紅含量(X)有直線關(guān)系，因此在本次實驗中直接用吸收度值(A)來替代酚紅含量作為祛痰作用的強弱的指標。
實驗方法取體重22～26g的小鼠120只，雌雄各半，隨機分成12組，實驗前禁食不禁誰12小時，按表3(i.g)給藥。給藥后30分鐘，腹腔注射0.5％酚紅溶液0.5ml，30分鐘后鐘后處死小鼠，盡量不損傷氣管，仰臥固定于手術(shù)板，剪開頸正中皮膚，分離氣管，小心地剔除氣管周圍的組織，然后剪取甲狀軟骨至氣管分叉處的氣管段，取出氣管后，放入已盛有2.00ml 0.5％的NaHCO3試管中，穩(wěn)定洗出液的pH，于4000rpm離心20分鐘WFZ800-D3B紫外分光光度計上以433nm波長，測定洗出液的吸收度值(A)。
表3浙貝乙素及其衍生物的祛痰活性分組 動物數(shù) 劑量(mg/kg) 途徑 A值陰性 100 i.g0.0852±0.0338陽性 1030 i.g0.1874±0.0922***浙貝乙素 103 i.g0.0964±0.02933β-乙?；阖愐宜?103 i.g0.1502±0.0509***3β-丙?；阖愐宜?103 i.g0.1268±0.06933β-丁酰化浙貝乙素 103 i.g0.1077±0.05013β-苯甲?；阖愐宜? 103 i.g0.2145±0.0613***3-氧化浙貝乙素 103 i.g0.1361±0.0296***3β-丁氧羰基化浙貝乙素 103 i.g0.1187±0.0587陽性組愈創(chuàng)木酚甘油醚 陰性組；不含樣品的蒸餾水與陰性對照***P＜0.005結(jié)果分析3β-乙?；阖愐宜嘏c陰性比較有差異，祛痰活性明顯強于浙貝乙素。3β-苯甲酰化浙貝乙素和氧化浙貝乙素亦有很強的祛痰活性，強于浙貝乙素。
實施例5浙貝乙素衍生物平喘活性實驗實驗材料豚鼠SD種 華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供樣品溶液 分別精密稱取浙貝乙素及6個衍生物3β-乙?；阖愐宜?乙?；?、氧化浙貝乙素(氧化)、3β-苯甲酰化浙貝乙素(苯甲?；?、3β-丙?；阖愐宜?丙?；?、3β-丁酰化浙貝乙素(丁?；?、3β-丁氧羰基化浙貝乙素(丁氧羰基化)各適量，滴加適量稀HCl溶解，用蒸餾水定容，樣品溶液pH值大約在4-5之間。
陽性對照 氨茶堿注射液(天津市金耀氨基酸有限公司 產(chǎn)品批號0305072)引喘液2％的氯化乙酰膽堿和0.1％組胺的等量混合液實驗原理具有支氣管收縮作用的藥物如組胺、乙酰膽堿等，以氣霧法給予豚鼠吸入，可引起豚鼠呼吸急促、喘息，甚至窒息，從而導致動物抽搐而跌倒，這種藥物性豚鼠哮喘模型可用于觀察藥物的平喘作用(主要是支氣管擴張作用)。如引喘潛伏期延長，發(fā)生抽搐的動物數(shù)減少，經(jīng)統(tǒng)計處理有顯著性意義，即可認為該藥具有平喘作用。
實驗方法與結(jié)果
取200-250g的豚鼠(幼年豚鼠)，雌雄均可，逐一測定引喘潛伏期，挑選合格者。將豚鼠放入一個與420型超聲霧化儀相連的有機玻璃盒內(nèi)，420型超聲霧化儀以53Kpa(400mmHg)的恒壓噴入2％的氯化乙酰膽堿和0.1％組胺的等量混合液15秒，密切注意豚鼠的反應，觀察6分鐘之內(nèi)豚鼠出現(xiàn)喘息性抽搐的潛伏期即引喘潛伏期(從噴霧開始到出現(xiàn)喘息性抽搐性的時間)與發(fā)生抽搐的動物數(shù)。如見到豚鼠跌倒應立即將其取出，以免死亡，并記錄引喘潛伏期，若引喘潛伏期大于150秒則認為不敏感而不予選用，次日將合格的豚鼠按體重隨機分組，每組6只，將12組豚鼠分別按下表給予待測樣品和對照品，用藥30分鐘后，以同樣條件引喘并測定引喘潛伏期與發(fā)生抽搐動物數(shù)的變化。
表4浙貝乙素及其衍生物的平喘活性用藥前后分組 動物數(shù) 劑量(mg/kg)途徑潛伏期差值(秒)陰性6 0 i.p -5.6±7.5陽性6 125i.p 74.8±23.0***浙貝乙素6 3 i.p 18.5±9.7***3β-乙酰化浙貝乙素 6 3 i.p 45.6±21.2***3β-丙?；阖愐宜? 6 3 i.p -3.2±2.93β-丁酰化浙貝乙素 6 3 i.p 7.0±8.43β-苯甲?；阖愐宜? 3 i.p 3.6±10.43-氧化浙貝乙素 6 3 i.p 12.0±8.6***3β-丁氧羰基化浙貝乙素 6 3 i.p 8.8±13.5陽性組氨茶堿注射液 陰性組不含樣品的蒸餾水與陰性對照***P＜0.005結(jié)果分析3β-乙?；阖愐宜嘏c陰性比較有差異，平喘活性明顯強于浙貝乙素。氧化浙貝乙素亦有很強的平喘活性，強于浙貝乙素。
權(quán)利要求
1.具有下述通式的浙貝乙素3位衍生物， 其中R為 或
2.權(quán)利要求1所述化合物在制備鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應用。
3.3β-乙?；阖愐宜卦谥苽滏?zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應用。
4.3β-乙?；阖愐宜卦谥苽滏?zhèn)咳藥物中的應用。
5.3β-丙酰化浙貝乙素在制備鎮(zhèn)咳藥物中的應用。
6.3β-苯甲?；阖愐宜卦谥苽滏?zhèn)咳藥物中的應用。
7.3β-乙?；阖愐宜卦谥苽潇钐邓幬镏械膽?。
8.3β-乙?；阖愐宜鼗?-氧化浙貝乙素在制備平喘藥物中的應用。
9.3β-乙?；阖愐宜?、3β-苯甲?；阖愐宜鼗?-氧化浙貝乙素在制備祛痰藥物中的應用。
10.浙貝乙素在制備鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了浙貝乙素及其衍生物在鎮(zhèn)咳祛痰平喘藥物中的用途。在浙貝乙素的一系列3位衍生物中，3β－乙?；阖愐宜鼐哂泻軓姷逆?zhèn)咳、祛痰、平喘活性，遠遠強于浙貝乙素，整體效果明顯，是一種很有開發(fā)前途的高效鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘藥物。
文檔編號A61P11/00GK1739529SQ20041006075
公開日2006年3月1日 申請日期2004年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月23日
發(fā)明者吳繼洲, 張勇慧, 阮漢利, 皮慧芳 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院