專利名稱：口服胰島素保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及一種口服胰島素的保護(hù)劑，用于口服胰島素制劑的抗降解、促吸收輔劑，也潛在地適用于其它口服蛋白藥物制劑，屬醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胰島素(insulin，Ins)作為降血糖生化藥用于治療糖尿病已有83年歷史，迄今仍為胰島素依賴型糖尿病(IDDM)患者的首選藥，亦是越來越多的中晚期非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)患者的必不可少的藥物。但由于胰島素是多肽類藥物，易被腸胃道的蛋白水解酶降解，且不易吸收，所以口服無效。臨床采用胰島素針劑(一般為iv與im兩種)，其中速效型需要每餐飯前30分鐘注射，中長效劑最長也需36小時注射，用藥的不便與痛苦，使很多NIDDM病人拒絕使用胰島素治療，從而造成糖尿病腎病的發(fā)病率越來越高，以致目前慢性腎衰，需血液透析的病人中糖尿病腎病病人占50％左右或更多。此外，患者長期注射用藥還會產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，如胰島素浮腫、低血糖、肥大性脂肪營養(yǎng)不良及皮下脂肪萎縮等。鑒于以上情況，研制使用方便，療效確切，安全可靠的胰島素新劑型是目前國際、國內(nèi)醫(yī)藥界共同關(guān)注的課題?？诜葝u素的研制已有40余年的歷史，目前國內(nèi)外有關(guān)胰島素口服制劑的研究大多圍繞在尋找胰島素的穩(wěn)定劑，吸收促進(jìn)劑及以高分子作為載體，并加入蛋白酶抑制劑的微囊、微球、脂質(zhì)體或復(fù)乳等，但上述制劑普遍存在的問題是吸收差，生物利用度低。在較長的一段時間里，人們用次級膽酸做胰島素的促吸劑，其效果優(yōu)于常用的促吸劑如吐溫、氮酮等物質(zhì)。但因純化的次級膽酸對腸粘膜細(xì)胞的損傷，而影響其作用。
目前，口服胰島素的研制現(xiàn)狀報道雖多，應(yīng)用卻難，至今尚未見到實(shí)際應(yīng)用在糖尿病的臨床報告。主要原因是對蛋白降解酶抑制劑和促進(jìn)吸收劑的研究尚未見突破性進(jìn)展，因此口服胰島素的生物利用度低，不及注射劑量的20％，穩(wěn)定性的問題尚不能解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種口服胰島素的保護(hù)劑，它作為口服胰島素的輔劑，能抵御蛋白降解酶的降解，又有很好的促吸作用，克服口服胰島素制劑在消化道中穩(wěn)定性差和生物利用度低的問題。
本發(fā)明口服胰島素的保護(hù)劑是以哺乳類動物消化液為原料，用以下方法制得以哺乳動物消化液為原料，攪拌下加入無水乙醇，配成50％-70％(w/w)乙醇溶液，加入酸，將溶液酸化至PH值在0-4.5，充分?jǐn)嚢?，在?0℃下蒸發(fā)脫乙醇，脫醇液室溫靜置分層后，分離除去上層清液，沉淀用堿液調(diào)成均勻水相，PH值6-8，在30-40℃孵化30分鐘-4小時，制成保護(hù)劑。
上述酸化程序達(dá)到的酸性越強(qiáng)，沉淀速度越快，反之則沉淀速度較慢，優(yōu)選PH值在1.5-3.5。
上述的水相中加入適量抗氧化劑，混勻。
所說的酸化過程所用的酸選自草酸、乙酸、檸檬酸或稀鹽酸，優(yōu)選為草酸或稀鹽酸。
所說的堿液為碳酸鈉、氨水、或碳酸氫鈉溶液。
所說的抗氧化劑選自苯酚、亞硝酸鈉或維生素E。
作為本保護(hù)劑原料的消化液可采用哺乳類動物從口腔至大腸的所有消化液中的一種或一種以上。
綜上所述，本發(fā)明用乙醇先將消化液破乳，打開天然質(zhì)脂體，破乳后的消化液經(jīng)酸化，大部分蛋白質(zhì)及酶類被溶解。傾去上層清液后，蛋白及破壞胰島素的酶類被去除，而膽酸等不溶于酸的物質(zhì)形成沉淀。用弱堿將形成的沉淀溶解，恢復(fù)其水相，在一定的溫度下恒溫孵化，使天然質(zhì)脂體體系復(fù)性得到本保護(hù)劑。經(jīng)復(fù)性的本保護(hù)劑包被胰島素后，可使胰島素放射免疫活性大大提高。
哺乳動物消化液中存在結(jié)合膽酸、膽紅素、膽固醇以及表面活性劑，并組成天然的質(zhì)脂體，既溶于水，又溶于脂，它們是本保護(hù)劑的有效成分。本發(fā)明保護(hù)劑除去了消化液中大部分的蛋白物質(zhì)(包括蛋白降解酶)，而保留了上述的天然質(zhì)脂體，從而使外源胰島素能進(jìn)入這個體系中而不被降解，使胰島素在消化道有較強(qiáng)的抵抗各種蛋白降解酶的作用和很強(qiáng)的促吸收作用，解決了口服胰島素穩(wěn)定性差和生物利用度低的難題，動物實(shí)驗(yàn)降糖效果好。本保護(hù)劑研制成功，使口服胰島素治療糖尿病成為最佳、最合理的途徑，為糖尿病人免除了針劑治療的痛苦。除口服胰島素外，本保護(hù)劑也潛在地適用于其它口服蛋白藥物制劑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本保護(hù)劑的制備收集新宰殺的豬的堿性消化液1000ml，邊攪拌邊加入無水乙醇，配成65％(w/w)乙醇消化液；繼續(xù)攪拌下加入草酸(或乙酸、檸檬酸、稀鹽酸)，酸化至PH值達(dá)1.5-3.5，然后在20℃室溫下負(fù)壓蒸發(fā)除去乙醇，脫醇液室溫靜置過夜，分離除去上清液，沉淀用氨水(也可選用碳酸鈉或碳酸氫鈉)調(diào)成PH值為8的均勻水相，加入0.2％(v/w)抗氧化劑苯酚(也可選用亞硝酸鈉或維生素E，)混勻。在40℃下孵化4小時，制得保護(hù)劑350ml。
對以上制得的保護(hù)劑進(jìn)行成分分析如下(1)用液相色譜儀(PHLC)分析條件C18，Kromasil.KR--100 15×4.6mm 流動相按文獻(xiàn)；梯度0--25分；B∶A→56.5％；流速1ml/min；uv338。
分析結(jié)果保護(hù)劑中含甘氨膽酸量14.55mg，?；悄懰?.24mg。
(2)用常規(guī)定磷法測保護(hù)劑中的總磷含量，折算成卵磷脂的含量為240mg/100ml。
實(shí)施例2胰島素加保護(hù)劑對豚鼠小腸粘膜體外滲透實(shí)驗(yàn)儀器TP-3型智能透皮擴(kuò)散儀，中國藥科大學(xué)監(jiān)制動物SD大鼠，體重240-300g，麻醉，剝?nèi)⌒∧c粘膜備用。
緩沖液配制磷酸緩沖液(Krebs-Ringer)PH 7.4方法用磷酸緩沖液稀釋所有樣品，均為每毫升溶液含8微克胰島素。設(shè)一孔為空白對照，一孔為胰島素對照，其余四孔分別為胰島素加不同的促吸收劑。每30分鐘取樣一次，共取6次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。
表1小腸粘膜滲透實(shí)驗(yàn)

表1結(jié)果表明無吸收劑時，胰島素本身的穿透率很低；與三種促劑比較，本保護(hù)劑的促吸收作用優(yōu)于目前普遍使用的膽酸鹽和氮酮。
實(shí)施例3加保護(hù)劑的胰島素在SD大鼠在體實(shí)驗(yàn)中的降糖作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)動物動物純系SD大鼠，30只，雌雄各半，日齡(60±10)天，體重180-220克；標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料；分組喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天后，次日喂藥后每組動物同等定量喂食(每只動物每日喂食25-30g)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)室溫度18-25℃，相對濕度40％-70％。
試劑鏈佐霉素，Merck公司產(chǎn)品；普通胰島素，徐州萬邦生物制藥廠產(chǎn)品。
胰島素放免試劑盒為天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司提供，批號02011031。
實(shí)驗(yàn)方法I型糖尿病模型的制備大鼠喂養(yǎng)7天后，禁食36h，實(shí)驗(yàn)前將0.1M枸櫞酸溶液和0.1M枸櫞酸三鈉溶液配成PH＝4.5的緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日用緩沖溶液配成1％的鏈佐霉素溶液，按10mg/200g單劑量腹腔注射。之后喂葡萄糖液。36h后剪尾取血，用微量血糖儀測定血糖，血糖＞13mmol/L列為糖尿病模型。正常對照組，在相同條件下，經(jīng)腹腔單劑量注射生理鹽水0.5ml。36h后，血糖正常為入選動物。將血糖正常動物隨機(jī)分為1組；糖尿病動物隨機(jī)分為4組；每組10只動物。
各組給藥劑量(1)血糖正常組喂空輔料顆粒33.4mg/200g/d，9粒，；(2)高血糖模型組喂空輔料顆粒33.4mg/200g/d，9粒；(3)口服胰島素組喂外源性胰島素加保護(hù)劑顆粒33.4mg/200g/d，7粒，相當(dāng)于給外源性胰島素43.42miu/200g；(4)胰島素注射劑對照組每只動物腹腔注射胰島素量詳見說明；各組給藥途徑、方法及劑量(1)血糖正常組用灌胃法，給每只動物每天灌33.4mg輔料顆粒，10粒。第一日上午給藥后3小時即第二次給藥，以后每日上午給藥一次。
(2)高血糖模型組用灌胃法，給每只動物每天灌空輔料顆33.4mg/200g，9粒。第一日上午給藥后3小時即第二次給藥，以后每日上午給藥一次。
(3)口服胰島素組用灌胃法，給每只動物每天灌喂外源性胰島素加保護(hù)劑顆粒33.4mg/200g/d，7粒。第一日上午給藥后3小時即第二次給藥，以后每日上午給藥一次。
(4)注射劑對照組實(shí)驗(yàn)第一天上午給每只動物腹腔注射30miu醫(yī)用胰島素。次日注射劑量見說明。
采血方法用剪尾取血法。
檢測指標(biāo)血糖。
實(shí)驗(yàn)共做13天。2004年3月22日20點(diǎn)至2004年4月3日，3月22日20點(diǎn)禁食，24日造模，3月26日灌藥，共灌9天藥。
每組動物標(biāo)記、采血時間、血糖測量值(mmol/l)如下列表2-表10。
表2 血糖正常組

表3

表4 高糖模型組

表5

表6 口服胰島素組

表7

表8

表9 胰島素注射劑對照組

表10

注射胰島素稀釋方法抽取胰島素4u(相當(dāng)于注射用胰島素注射器4小格)，用注射用生理鹽水稀釋至40u處，每小格相當(dāng)于100miu，推去36小格，留4格，再稀釋至40u處，每小格相當(dāng)于10miu。
26日，每只大鼠注射30miu，血糖下降不明顯。
27日，每只大鼠注射40miu，血糖下降不明顯。
28日，每只大鼠注射50miu，血糖下降仍不明顯。
29日，抽取注射胰島素1u，稀釋到40u處，每只動物腹腔注射120miu(相當(dāng)于3小格)，但血糖下降仍不理想。
30日，抽取胰島素2u，稀釋至40u處，每小格相當(dāng)于50miu，每只動物腹腔注射200miu，(相當(dāng)于4小格)血糖只有輕微下降。
31日胰島素配制方法不變，每只動物腹腔注射300miu(相當(dāng)于6小格)血糖下降較明顯。但有個別動物血糖下降不理想。
1日胰島素配制方法不變，每只動物腹腔注射400miu(相當(dāng)于8小格)血糖下降很明顯。但有個別動物血糖下降不理想。
注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即宰殺保護(hù)劑加胰島素組的動物。肉眼觀察動物小腸粘膜結(jié)構(gòu)完整，顏色正常；鏡下小腸粘膜細(xì)胞正常。
上述在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，經(jīng)本發(fā)明保護(hù)劑保護(hù)的胰島素，其口服的降糖作用可靠，降糖效果等于或優(yōu)于注射用胰島素。
權(quán)利要求
1.口服胰島素保護(hù)劑，其特征是用以下方法制得以哺乳動物消化液為原料，攪拌下加入無水乙醇，配成50％-70％(w/w)乙醇溶液，加入酸，使溶液酸化至PH值為0-4.5，充分?jǐn)嚢韬?，在?0℃下蒸發(fā)脫乙醇，脫醇液室溫靜置分層后，分離除去上層清液，沉淀用堿液調(diào)成均勻水相，PH值6-8，在30-40℃孵化30分鐘-4小時，制成保護(hù)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服胰島素保護(hù)劑，其特征是酸化溶液PH值為1.5-3.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服胰島素保護(hù)劑，其特征是所說的水相中加入適量抗氧化劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口服胰島素保護(hù)劑，其特征是酸化所用的酸是草酸、硫酸、乙酸、檸檬酸或稀鹽酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消化液的口服胰島素保護(hù)劑，其特征是酸化所用的酸是草酸或稀鹽酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消化液的口服胰島素保護(hù)劑，其特征是所說的堿液為碳酸鈉、氨水、或碳酸氫鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的消化液的口服胰島素保護(hù)劑，其特征是所說的抗氧化劑選用苯酚、亞硝酸鈉或維生素E。
8.權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7的口服胰島素保護(hù)劑，其特征是所說的哺乳動物消化液包括從口腔至大腸的所有消化液中的一種或一種以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種口服胰島素保護(hù)劑，是口服胰島素抗降解、促吸收的輔劑。它由以下方法制得哺乳動物消化液加入無水乙醇，攪拌下配成50％－70％乙醇溶液，加酸使溶液酸化至pH值1.5－3.5，在≤30℃下蒸發(fā)脫醇，脫醇液室溫靜置分層，分離除去上清液后，沉淀用堿液調(diào)成pH值6－8的均勻水相，加入適量的抗氧化劑混勻，在30－40℃孵化30分鐘－4小時，得本保護(hù)劑。本保護(hù)劑包被藥用胰島素后，可使胰島素放射免疫活性大大提高，經(jīng)體外小腸粘膜促吸實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本保護(hù)劑包被的口服胰島素與胰島素注射劑相比，具有相似的降糖作用，從而可為糖尿病人免除針劑治療的痛苦。
文檔編號A61K38/28GK1754575SQ20041006479
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者薛南榮, 何執(zhí)靜 申請人:薛南榮