專利名稱：一種干擾素長效注射微球制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種干擾素(interferon，IFN)長效注射微球制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
干擾素是正常機體細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機體免疫功能的蛋白質(zhì)。在臨床上對于許多惡性腫瘤和病毒性疾病療效確切。為使干擾素在體內(nèi)血藥濃度平穩(wěn)，減少病人的用藥次數(shù)，提高干擾素的治療效果，往往使用生物可降解聚合物作為基質(zhì)制備成長效劑型以控制藥物釋放。例如將蛋白質(zhì)類藥物制成微球制劑。
復(fù)乳法是制備IFN微球制劑的方法之一，文獻報道(Sanchez A， M，Gonzalez L，et al.Biodegradable micro- and nanoparticles as long-term deliveryvehicles for interferon-alpha.Eur J Pharm Sci，2003，18221)用該方法制備了IFN-α微球，制備方法如下一、配方與配比主要成分 含量(w/v)IFN-α 0.01％聚乳酸-羥基乙酸嵌段共聚物(PLGA) 89.99％人血清白蛋白(HSA) 1％伯洛沙姆188(F-68) 9％二、操作步驟
1 制備油相將生物可降解基質(zhì)材料按處方量溶于有機溶劑二氯甲烷，即成油相。
2 制備內(nèi)水相將IFN-α和HSA和F-68溶液按處方量混勻，即成內(nèi)水相。
3 制備初乳將上述內(nèi)水相加入油相混合超聲即成初乳。
4 制備微球初乳在海藻酸鈉溶液中分散制備復(fù)乳，復(fù)乳經(jīng)溶劑揮發(fā)、固化形成微球。該微球制備工藝較簡單，體外釋藥可維持一個月左右。然而由于所使用的保護劑HSA分子量大，在微球中所占比例大，導(dǎo)致微球載藥量低，藥物在微球中所占的質(zhì)量百分比僅為0.01％左右。且若用血制品人血白蛋白有可能造成病毒性疾病的傳染。
US6379701B1中提到了另一種制備IFN微球制劑的方法，稱作低溫噴霧提取法。具體制備方法如下一、配方及配比優(yōu)選處方為主要成分 質(zhì)量鋅離子穩(wěn)定化的干擾素(鋅離子、干擾素摩爾比為2∶1) 40mgPLGA 410mg碳酸氫鈉 10mg碳酸鋅50mg二、操作步驟1制備IFN-α-Zn2+復(fù)合物將IFN-α溶于pH7.2的碳酸氫鈉緩沖液，加適量醋酸鋅(ZnAc)溶液，使IFN-α和Zn2+在溶液中的摩爾比為1∶2，再加入適量醋酸(HAc)溶液將溶液pH調(diào)為7.1，即形成IFN-α-Zn2+復(fù)合物。
2制備IFN-α-Zn2+復(fù)合物微粉將上述含IFN-α-Zn2+復(fù)合物的溶液經(jīng)低溫噴霧干燥法制成微粉。
3制備IFN-α微球?qū)LGA按處方量溶于有機溶劑二氯甲烷，加入處方量上述微粉形成混懸液，再用噴霧冷凍提取法在液氮中分散形成微球，然后在-80℃低溫冰箱中用無水乙醇緩慢萃取有機溶劑使微球固化，萃取過程約需3天。該微球體內(nèi)釋藥可維持一個星期左右。
本方法制備工藝復(fù)雜，制備時間長，需專門設(shè)備，行兩次噴霧。但將鋅離子和IFN-α制備成復(fù)合物后，不僅提高了IFN-α的穩(wěn)定性，而且提高了微球制劑的載藥量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備工藝簡單、載藥量大、釋藥平穩(wěn)且持續(xù)時間長的IFN長效注射微球制劑及其制備方法，其可在體外持續(xù)釋藥達(dá)4周以上。
本發(fā)明的制備方法如下一、配方與配比主要成分含量鋅離子穩(wěn)定化的干擾素(鋅離子、干擾素摩爾比為2∶1)1～50mgPLGA50～500mg釋放調(diào)節(jié)劑(碳酸鋅或伯洛沙姆188) 0～50mg
二、操作步驟1.制備油相將生物可降解基質(zhì)材料溶于有機溶劑，即成油相。
所說的生物可降解基質(zhì)材料選自聚乳酸(PLA)，聚乳酸-羥基乙酸嵌段共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚腈基丙烯酸酯、聚醚酯等。優(yōu)選PLGA，其中乳酸(LA)和羥基乙酸(GA)的比例為1∶1，平均分子量為5000～70000道爾頓，特異性粘度為0.1～0.6dl/g。
所說的有機溶劑選自二氯甲烷或乙腈。
2.制備IFN和鋅離子復(fù)合物微粉IFN原液經(jīng)超濾脫鹽后換用10mM pH7.2的NaHCO3緩沖液，在其中加2mMZnAc，調(diào)節(jié)Zn2+和IFN的摩爾比為2∶1，并使IFN終濃度為1mg/ml左右，用1％HAc調(diào)pH至7.1，即可產(chǎn)生Zn2+和IFN復(fù)合物沉淀。再加入10倍量PEG6000，溶解混勻后冷凍干燥，得凍干粉。凍干粉用有機溶劑二氯甲烷或乙腈溶解，離心去上清，重復(fù)三次以去除PEG6000，即得IFN和鋅離子復(fù)合物微粉。
3.制備IFN微球?qū)FN和鋅離子復(fù)合物微粉加入油相，渦旋或超聲分散后，逐滴加入連續(xù)相棉子油或水中，攪拌乳化。
當(dāng)選用棉子油為連續(xù)相時，使用的乳化劑為0.1％～2％的卵磷脂，室溫攪拌2～6小時，然后加入適量石油醚200～1000rpm繼續(xù)攪拌10～40分鐘，使微球固化，再離心，石油醚洗滌，冷凍干燥即得本發(fā)明微球。
當(dāng)選用水溶液為連續(xù)相時，使用的乳化劑為0.5％～5％聚乙烯醇(PVA)，以600～1800rpm高速攪拌乳化1～5分鐘，得新生微球，再加5～10倍體積量蒸餾水稀釋，以300～600rpm繼續(xù)攪拌使有機溶劑揮發(fā)并固化微球，離心，蒸餾水洗滌，冷凍干燥即得本發(fā)明微球。
還可在微球處方中加入適量釋放調(diào)節(jié)劑碳酸鋅和伯洛沙姆188(0～10％)，調(diào)節(jié)微球中IFN的釋放速度。
本發(fā)明的IFN長效注射微球外觀圓整，粒徑均勻，混懸性好，包封率達(dá)85％以上，經(jīng)體外釋放實驗，緩釋達(dá)4周以上，釋放符合近似零級模式。


圖1為實施例1制備的IFN微球體外累積釋放～時間曲線圖。
圖2為實施例2制備的IFN微球體外累積釋放～時間曲線圖。
圖3為實施例3制備的IFN微球體外累積釋放～時間曲線圖。
圖4為實施例4制備的IFN微球體外累積釋放～時間曲線圖。
具體實施例方式
實施例1以乙腈為連續(xù)相制備IFN微球制劑(1)Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物的制備IFN-α-2b(0.5mg/ml，上海萬興生物制藥有限公司，批號20030401，下同)原液2ml經(jīng)超濾脫鹽后換用10Mm pH7.2的NaHCO3緩沖液800μl配成溶液，加2mM ZnAc 52μl，使IFN-α-2b和Zn2+摩爾比為2∶1，IFN-α-2b終濃度為1mg/ml左右，用1％HAc調(diào)pH為7.1，立即產(chǎn)生Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物沉淀。
(2)制備Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物微粉在上述Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物的溶液中加入10mg PEG6000，溶解混勻后冷凍干燥，得凍干粉。凍干粉用有機溶劑乙腈溶解，離心去上清，重復(fù)三次以去除PEG6000，即得Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物微粉。
(3)微球的制備PLGA(LA∶GA＝50∶50，特異性粘度為0.19dl/g，美國BirminghamPolymers公司)100mg溶于500μl乙腈溶液中成油相，將IFN-α-2b與Zn2+復(fù)合物的微粉加入油相中按常規(guī)水浴超聲混懸，加入30ml棉子油(含0.05％卵磷脂作為乳化劑，w/v)中，600rpm攪拌乳化2小時，然后加入輕質(zhì)石油醚(沸點60-90℃)，繼續(xù)攪拌15分鐘使微球固化完全，離心、石油醚洗滌、冷凍干燥即得本發(fā)明微球。
實施例2以乙腈為連續(xù)相碳酸鋅為釋放調(diào)節(jié)劑制備IFN微球制劑Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物微粉的制備方法同實施例1(1)、(2)兩步，并將碳酸鋅經(jīng)氣流粉碎控制粒徑小于5μm，得碳酸鋅微粉。
PLGA(RG503H，PLA∶PGA＝50∶50，德國Boehringer Ingelheim公司)50mg溶于500μl的乙腈溶液中成油相，將上述Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物微粉和碳酸鋅微粉各1mg加入油相中按常規(guī)水浴超聲混懸，混懸液加入30ml棉子油(含0.05％卵磷脂作為乳化劑，w/v)中，600rpm攪拌乳化2小時，然后加入輕質(zhì)石油醚(沸點60-90℃)，繼續(xù)攪拌15分鐘使微球固化完全，離心、石油醚洗滌、冷凍干燥即得本發(fā)明微球。
實施例3以乙腈為連續(xù)相伯洛沙姆188(F-68)為釋放調(diào)節(jié)劑制備IFN微球制劑Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物的制備方法同實施例1(1)，在含復(fù)合物的溶液中加入7.5mg(或15mg)F-68溶解混勻后冷凍干燥得凍干粉。
PLGA(RG503H，PLA∶PGA＝50∶50，德國Boehringer Ingelheim公司)41.5mg(或34mg)溶于500μl的乙腈溶液中成油相，將上述凍干粉加到油相中水浴超聲混懸，使處方中F-68的含量分別為15％(或30％)?；鞈乙杭拥?0ml棉子油(含0.05％卵磷脂作為乳化劑，w/v)中，600rpm攪拌乳化2小時，然后加入輕質(zhì)石油醚(沸點60-90℃)，繼續(xù)攪拌15分鐘使微球固化完全，離心、石油醚洗滌、冷凍干燥即得本發(fā)明微球。
實施例4以水為連續(xù)相制備IFN微球制劑Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物的制備方法同實施例1(1)，在含復(fù)合物的溶液中加入10mgPEG6000，溶解混勻后冷凍干燥，得凍干粉。凍干粉用有機溶劑二氯甲烷1ml溶解，離心去上清，重復(fù)三次以去除PEG6000，即得Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物微粉。
PLGA(LA∶GA＝50∶50，特異性粘度為0.19dl/g，美國Birmingham Polymers公司)100mg溶于300μl二氯甲烷溶液中成油相，將Zn2+和IFN-α-2b復(fù)合物微粉加入油相中水浴超聲混懸，加到20ml 3％PVA水溶液中，1000rpm攪拌2分鐘，并將其立即用約200ml蒸餾水稀釋，400rpm攪拌4小時，離心收集微球，蒸餾水洗滌，冷凍干燥即得本發(fā)明微球。
微球的體外釋放試驗稱取含藥微球10～30mg置10ml離心管中，加入1.5ml 10mM pH7.4緩沖液(含0.02％疊氮鈉作為抑菌劑，0.02％F-68潤濕劑)作為釋放介質(zhì)，置于恒溫水浴搖床中，在100rpm振蕩速度、37℃±0.5℃溫度條件下進行微球的體外釋放度測定。分別在2小時、1天、2天取出離心管，于2000rpm離心10分鐘，取上清用BCA法(Pierce公司BCA蛋白測定試劑盒，按說明書操作)測定上清中IFN的含量，沉淀中再加等量新的釋放介質(zhì)，按同法每隔3～4天取樣檢測一次。
以取樣天數(shù)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的IFN累積釋放百分比為縱坐標(biāo)制作藥物釋放曲線，上述四個實施例制備的微球制劑釋放曲線分別見圖1～4。由圖可見所制備的IFN緩釋微球制劑可在體外釋藥4周以上。
本發(fā)明干擾素長效注射微球制劑制備工藝簡單，重現(xiàn)性好，微球載藥量大，釋藥平穩(wěn)且持續(xù)時間長。
權(quán)利要求
1.一種干擾素長效注射微球制劑的制備方法，配方與配比如下鋅離子穩(wěn)定化的干擾素(鋅離子、干擾素摩爾比為2∶1) 1～50mgPLGA 50～500mg釋放調(diào)節(jié)劑(碳酸鋅或伯洛沙姆188) 0～50mg具體操作步驟為(1)制備油相將生物可降解基質(zhì)材料溶于有機溶劑，即成油相，所說的生物可降解基質(zhì)材料選自聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羥基乙酸嵌段共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚腈基丙烯酸酯、聚醚酯等。其中PLGA的乳酸(LA)和羥基乙酸(GA)的比例為1∶1，平均分子量為5000～70000道爾頓，特異性粘度為0.1～0.6dl/g；所說的有機溶劑選自二氯甲烷或乙腈；(2)制備IFN和鋅離子復(fù)合物微粉IFN原液經(jīng)超濾脫鹽后換用10mM pH7.2的NaHCO3緩沖液，在其中加2mMZnAc，調(diào)節(jié)Zn2+和IFN的摩爾比為2∶1，并使IFN終濃度為1mg/ml左右，用1％HAc調(diào)pH至7.1，即可產(chǎn)生Zn2+和IFN復(fù)合物沉淀，再加入10倍量PEG6000，溶解混勻后冷凍干燥，得凍干粉，凍干粉用有機溶劑二氯甲烷或乙腈溶解，離心去上清，以去除PEG6000，即得IFN和鋅離子復(fù)合物微粉；(3)制備IFN微球?qū)FN和鋅離子復(fù)合物微粉加入油相，渦旋或超聲分散后，逐滴加入連續(xù)相棉子油或水中，攪拌乳化，當(dāng)選用棉子油為連續(xù)相時，使用的乳化劑為0.1％～2％的卵磷脂，室溫攪拌2～6小時，然后加入適量石油醚200～1000rpm繼續(xù)攪拌10～40分鐘，使微球固化，再離心，石油醚洗滌，冷凍干燥即得本發(fā)明微球；當(dāng)選用水溶液為連續(xù)相時，使用的乳化劑為0.5％～5％聚乙烯醇(PVA)，以600～1800rpm高速攪拌乳化1～5分鐘，得新生微球，再加5～10倍體積量蒸餾水稀釋，以300～600rpm繼續(xù)攪拌使有機溶劑揮發(fā)并固化微球，離心，蒸餾水洗滌，冷凍干燥即得本發(fā)明微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種干擾素(IFN)的長效注射微球制劑的制備方法。本發(fā)明中的IFN微球由干擾素、生物可降解基質(zhì)和添加劑組成。本發(fā)明的制備方法其優(yōu)點在于，提高了干擾素在制備工藝和釋放過程中的穩(wěn)定性，方法簡便，易于操作，重現(xiàn)性好。所制備的緩釋微球可在體外緩釋達(dá)4周以上，釋放符合近似零級模式。
文檔編號A61K38/21GK1634570SQ20041006677
公開日2005年7月6日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者鐘延強, 吳誠, 魯瑩, 尹東鋒 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)