專利名稱：一種積雪草多糖的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中草藥提取多糖，更具體地說是從積雪草中提取多糖，及該多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征和它的應(yīng)用，具體包括積雪草多糖HBN的提取方法、化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對機(jī)體的免疫促進(jìn)作用。
背景技術(shù)：
目前癌癥已成為人類死亡的主要因素之一。但至今仍缺乏專一性強、療效好、副作用小的抗癌藥物。現(xiàn)在使用的抗腫瘤藥物雖然種類很多，但大多是采用化學(xué)合成方法制備的化學(xué)藥物，毒副作用較大。近年來，生物治療已成為抗腫瘤治療的重要途徑，免疫促進(jìn)劑是用于腫瘤生物治療的一類藥物。本發(fā)明從積雪草中獲得的多糖即為一種免疫調(diào)節(jié)劑。
積雪草為中國藥典收載的常用中藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有清熱利濕、解毒消腫的功效，適用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、砂淋血淋、癰腫瘡毒等，臨床上多用于跌打損傷、皮膚病等的治療。本發(fā)明從積雪草中提取獲得仍一的一種均一多糖，并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征。藥理試驗表明該化學(xué)結(jié)構(gòu)的多糖具有顯著的免疫促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種從積雪草中分離提取出確定化學(xué)結(jié)構(gòu)特征的多糖。
本發(fā)明的另一目的是提供該多糖的提取分離方法。
本發(fā)明的再一目的是提供該多糖的醫(yī)學(xué)用途。
本發(fā)明是這樣實施的取干積雪草全草粉碎品，加95％的藥用乙醇，浸泡2周，浸泡完畢，過濾，殘渣繼續(xù)用索氏提取器用乙醇回流6小時，濾去母液，殘渣陰干。脫脂后的干品用沸水提取3-5次，每次提取時間為5-6小時，將每次提取的提取液過濾，所得的水提液合并，濃縮至小體積，對流水透析3-4天，繼續(xù)將溶液濃縮至小體積，用10％～20％三氯醋酸在4℃攪拌下脫蛋白，使溶液最終pH為2-3，靜置放置6-8小時。溶液經(jīng)離心去蛋白沉淀，清液以1mol/l氫氧化鈉溶液中和至中性，再對流水透析3天。袋內(nèi)溶液濃縮至1/3～1/5體積，加入3-5倍于糖溶液體積的95％乙醇于溶液中，并且于4℃沉淀過夜。離心收集沉淀，在40℃的低溫真空干燥箱中脫水得到粗多糖JXC1。
取水提粗多糖JXC1，加入適量蒸餾水溶解，離心除去不溶物，上清液通過DEAE-纖維素柱層析進(jìn)行分離。以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.1，0.3，0.5和1.0mol/l的氯化鈉溶液洗脫，分別收取合并各流分，其中水洗部分的組分經(jīng)濃縮、透析和冷凍干燥得到次級多糖組分JXCH。JXCH再通過DEAE-纖維素柱層析，蒸餾水洗脫后，0.2mol/l氯化鈉溶液洗脫，自動收集儀收集流分，硫酸-苯酚法檢測多糖組分，收集糖反應(yīng)陽性部分。減壓濃縮、透析和冷凍干燥得多糖組分，再進(jìn)一步使用DEAE-纖維素柱層析，先以0-0.05mol/l的氯化鈉溶液梯度洗脫，再用0.2mol/l氯化鈉溶液洗脫，收集該組分的多糖溶液，對純水透析1天除去無機(jī)鹽等小分子后，未透過液減壓濃縮、冷凍干燥，獲得的組分經(jīng)Sephadex G-200柱層析，0.2mol/L氯化鈉溶液洗脫，示差檢測儀檢測，收取峰位部分得到主要糖組分，該組分經(jīng)減壓濃縮冷凍干燥得到多糖，命名為HBN。
經(jīng)高效凝膠柱層析(HPGPC)分析表明HBN的分子量為5.4×105Da。比旋度[α]D＝-10.4°(c＝0.70，水)。HBN的各個殘基摩爾比為阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶木糖＝1.00∶1.90∶0.26∶0.30∶0.15。13C NMR譜中，位于δ110.4和108.5ppm的信號為α-Araf和β-Xylp的異頭碳信號。位于δ104.6～104.4ppm異頭區(qū)域的信號是β-Galp信號。δ102.0和100.6ppm的弱信號為α-Rhap和α-GalpA的C1信號。約76％Araf殘基處于末端，因此主要的Araf信號是由t-Araf產(chǎn)生。1H NMR譜圖中，信號δ5.2和4.4-4.5ppm相應(yīng)于Araf和β-Galp的異頭氫信號。α-Rhap、α-GalpA和β-Xylp的異頭氫信號位于δ5.1、4.9和4.7ppm處。上述結(jié)果結(jié)合甲基化反應(yīng)以及高碘酸鈉氧化、部分酸水解和酶降解等確證多糖結(jié)構(gòu)常用的化學(xué)方法的結(jié)果，證明HBN是一個由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和木糖組成的阿拉伯半乳聚糖。其中鼠李糖和半乳糖醛酸殘基構(gòu)成了HBN多糖的核心部分，屬于果膠RG-I構(gòu)型。在這條核心鏈的鼠李糖O-4位連接HBN的主要結(jié)構(gòu)，即阿拉伯半乳聚糖區(qū)域以及短鏈的木糖鏈。在阿拉伯半乳聚糖鏈區(qū)域，1，6-連接的半乳糖占主導(dǎo)地位，即以1，6-連接的半乳糖形成長鏈，在其O-3位連接其它半乳糖支鏈和阿拉伯糖支鏈。同時在阿拉伯半乳聚糖鏈區(qū)域也存在部分1，3-連接的半乳糖構(gòu)成的長鏈，并在O-6連接阿拉伯糖鏈和半乳糖鏈。
藥理試驗1.體外的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性分別取各多糖樣品HBN 1-2mg/ml溶于生理鹽水，臨用時稀釋成濃度為1,10,100μl/g的溶液。小鼠以頸椎脫位致死，無菌取脾臟，分離脾細(xì)胞，尼龍網(wǎng)過濾，蒸餾水破壞紅細(xì)胞，調(diào)節(jié)至等滲，以RPMI-1640培養(yǎng)液洗三次，記數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106Cell/ml。于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μ細(xì)胞，設(shè)一個對照組，再加入不同濃度的樣品聯(lián)合ConA或LPA，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱48小時。培養(yǎng)終止前小時加MTT溶液20ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，加入三聯(lián)液(二甲基甲酰胺和12烷基苯磺酸鈉溶液)100ul/孔，于37℃放置過夜后，以DG-3022型酶柱儀測每孔的A570值。結(jié)果表明在濃度為1、10和100μg/ml時對T細(xì)胞的增殖率分別為36％、55％和76％，對B細(xì)胞的增值率分別達(dá)42％、120％和383％。為顯著效果。各組濃度下的HBN均未表現(xiàn)出毒性。
2.小鼠體內(nèi)免疫試驗ICR(♀)小鼠體重20±2g，對照組生理鹽水0.2ml/鼠，qd.×4d給藥組分別腹腔注射劑量為0.1、1.0和10mg/kg的HBN，給藥4天。小鼠給藥后第三天致敏將鮮羊紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌三次，按5％比例稀釋SRBC壓積，每只小鼠腹腔注射0.2ml。第五天解剖測定各項免疫參數(shù)。結(jié)果表明多糖HBN在0.1-10mg/kg的劑量下對小鼠的脾臟抗體形成細(xì)胞分泌抗體沒有影響；在0.1-1mg/kg的劑量下，HBN對小鼠血清IgG無明顯影響；在大劑量(10mg/kg)時出現(xiàn)對小鼠血清IgG抑制的作用；在1.0mg/kg劑量下，其對T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有明顯促進(jìn)作用(P＜0.01)。
根據(jù)上述藥理試驗的體內(nèi)外結(jié)果，表明HBN可以作為免疫調(diào)節(jié)藥物使用。


圖1是積雪草多糖分離純化示意圖。
具體實施例方式
實施例干積雪草全草粉碎品經(jīng)95％的藥用乙醇浸泡2周后，過濾，殘渣繼續(xù)用索氏提取器乙醇回流提取，濾去母液，殘渣陰干。脫脂后的干品(6公斤)用沸水提取，每次加水30升，提取時間為5-6小時，以苯酚硫酸法檢測提取液的糖含量，直至糖反應(yīng)不明顯，共計提取4次。將每次提取過濾所得的水提母液合并，濃縮至小體積，使用玻璃透析紙流水透析3天，繼續(xù)將溶液濃縮至小體積，用15％三氯醋酸在4℃下攪拌脫蛋白。溶液經(jīng)離心去沉淀，清液以1mol/l氫氧化鈉溶液中和至中性，再對流水透析3天。袋內(nèi)溶液濃縮至適當(dāng)體積(約1/3-1/5)，加入95％的乙醇4倍于糖溶液的體積于4℃沉淀過夜。離心收集沉淀，經(jīng)乙醇和無水丙酮依次洗滌三次后在40℃的低溫真空干燥箱中脫水得到360g棕灰色的固體(JXC1，產(chǎn)率2.1％)。
取6g水提粗多糖JXC1，加入適量蒸餾水溶解，離心，上清液用DEAE-纖維素(氯型)柱層析進(jìn)行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.1，0.3，0.5和1.0mol/l的NaCl溶液洗脫，分別收取各流份，其中從水洗洗脫組分中獲得多糖組分JXCH。
JXCH再用DEAE-纖維素(乙酸型)柱層析，蒸餾水洗脫后，0.2mol/l NaCl洗脫，自動收集儀收集流分，硫酸-苯酚法顯色，收集糖組分。減壓濃縮、透析和冷凍干燥該多糖組分，再進(jìn)一步使用DEAE-纖維素(乙酸型)柱層析，先以0-0.05mol/l的乙酸鈉溶液梯度洗脫，再用0.2mol/l氯化鈉溶液洗脫，收集該組分的多糖溶液，透析除去無機(jī)鹽等小分子后，減壓濃縮、冷凍干燥，獲得的組分經(jīng)Sephadex G-200柱層析得到洗脫主要糖組分，該組分經(jīng)減壓濃縮冷凍干燥得到多糖HBN(400mg)。
物化性質(zhì)測定按照多糖的常規(guī)方法，HPGPC法測定分子量為5.4×105Da，比旋度[α]D＝-10.4°(c 0.70，水)。
化學(xué)結(jié)構(gòu)測定按照多糖的常規(guī)方法，包括光譜方法(13C NMR，IR)及化學(xué)方法(全水解、甲基化反應(yīng)、高碘酸鈉氧化-Smith降解、部分酸水解和酶解)證明HBN為一個由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和木糖組成的阿拉伯半乳聚糖。HBN中鼠李糖和半乳糖醛酸構(gòu)成了HBN多糖的核心部分，屬于RG-I構(gòu)型。在這條核心鏈的鼠李糖O-4位連接HBN的主要結(jié)構(gòu)，即阿拉伯半乳聚糖區(qū)域以及短鏈的木糖鏈。在阿拉伯半乳聚糖鏈區(qū)域，1，6-連接的半乳糖占主導(dǎo)地位，即以1，6-連接的半乳糖形成長鏈，在其O-3位連接其它半乳糖支鏈和阿拉伯糖支鏈。同時在阿拉伯半乳聚糖鏈區(qū)域也存在部分1，3-連接的半乳糖構(gòu)成的長鏈，并在O-6連接阿拉伯糖鏈和半乳糖鏈。
藥理試驗取上述HBN分別按照試驗中提及的藥理試驗方法進(jìn)行體內(nèi)體外免疫試驗。結(jié)果表明對T、B淋巴細(xì)胞的增殖試驗中，濃度為1、10、100μg/ml的體外試驗可達(dá)顯著和非常顯著。體內(nèi)劑量達(dá)到1mg/kg的時候，HBN對絲裂原(ConA，LPS)誘導(dǎo)小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有明顯的促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.一種由積雪草提取的多糖HBN，其結(jié)構(gòu)為分子量為5.4×105Da、比旋度[α]D＝-10.4°(c＝0.70，水)；HBN的各個殘基摩爾比為阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶木糖＝1.00∶1.90∶0.26∶0.30∶0.15；13C NMR譜中，位于δ110.4和108.5ppm的信號為α-Araf和β-Xylp的異頭碳信號；位于δ104.6～104.4ppm異頭區(qū)域的信號是β-Galp信號；δ102.0和100.6ppm的弱信號為α-Rhap和α-GalpA的C1信號；約76％Araf殘基處于末端，因此主要的Araf信號是由t-Araf產(chǎn)生；1H NMR譜圖中，信號δ5.2和4.4-4.5ppm相應(yīng)于Araf和β-Galp的異頭氫信號；α-Rhap、α-GalpA和β-Xylp的異頭氫信號位于δ5.1、4.9和4.7ppm處；上述結(jié)果結(jié)合甲基化反應(yīng)以及高碘酸鈉氧化、部分酸水解和酶降解等測定多糖結(jié)構(gòu)常用的化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，證明HBN是一個由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和木糖組成的阿拉伯半乳聚糖；其中鼠李糖和半乳糖醛酸殘基構(gòu)成了HBN多糖的核心部分，屬于果膠RG-I構(gòu)型；在這條核心鏈的鼠李糖O-4位連接HBN的主要結(jié)構(gòu)，即阿拉伯半乳聚糖區(qū)域以及短鏈的木糖鏈；在阿拉伯半乳聚糖鏈區(qū)域，1，6-連接的半乳糖占主導(dǎo)地位，即以1，6-連接的半乳糖形成長鏈，在其O-3位連接其它半乳糖支鏈和阿拉伯糖支鏈；同時在阿拉伯半乳聚糖鏈區(qū)域也存在部分1，3-連接的半乳糖構(gòu)成的長鏈，并在O-6連接阿拉伯糖鏈和半乳糖鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的由積雪草提取的多糖HBN的制備方法由如下步驟組成a、干積雪草全草粉碎物95％的藥用乙醇浸泡2周后，過濾、殘渣用索氏提取器乙醇提取，濾去母液，殘渣陰干；b、上述脫脂后的干品沸水提取3-5次，提取液過濾，合并提取液減壓濃縮至小體積，用對流水透析3-4天，繼續(xù)將溶液濃縮到小體積，用10％～20％三氯醋酸在4℃攪拌脫蛋白，溶液離心去沉淀，上清液用1mol/l NaOH溶液中和至中性，再用對流水透析3天，袋內(nèi)溶液濃縮至1/3-1/5體積，加入3～5倍于糖溶液體積的95％乙醇，在冰箱中(4℃)放置過夜，離心收集沉淀，在40℃的低溫真空干燥箱中脫水得粗多糖JXCl；c、加入蒸餾水溶解粗多糖，離心除去不溶物，上清液通過DEAE-纖維素柱層析分離，以蒸餾水作為冼脫液，然后用依次用每立升含0.1，0.3，0.5和1克分子的氯化鈉溶液冼脫，分別收取合并各流分，其中水冼部分組分經(jīng)濃縮、透析和冷凍干燥得次級多糖組份JXCH；d、上述JXCH通過DEAE-纖維素柱層析，蒸餾水冼脫后，用0.2克分子/立升氯化鈉溶液冼脫，自動收集儀收集流分(硫酸-苯酚法檢測多糖組份)，收集糖反應(yīng)陽性部分減壓濃縮、透析和冷凍干燥該多糖組份，再用DEAE-纖維柱層析先以0-0.05克分子/立升氯化鈉溶液梯度冼脫，再用0.2克分子/立升NaCl溶液洗脫，收集該組份多糖溶液，透析除去無機(jī)鹽小分子后，減壓濃縮，冷凍干燥，得多糖組份；e、上述多糖組份經(jīng)Sephadex G 200柱層析0.2克分子/立升氯化鈉溶液冼脫，收集該組份的多糖溶液濃縮，冷凍干燥得多糖HBN。
3.如權(quán)利要求1所述的由積雪草提取的多糖HBN的用途在制備作為免疫調(diào)節(jié)藥物使用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種采用從積雪草中提取的多糖，提取多糖的方法以及該多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)。經(jīng)動物體內(nèi)外藥理試驗證明該多糖具有明顯的免疫促進(jìn)作用，可作為免疫功能低下疾病的輔助治療藥物。
文檔編號A61P37/00GK1754892SQ200410066859
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者方積年, 王雪松, 左建平 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所