專利名稱：短肽修飾的聚賴氨酸－聚乳酸共聚物納米粒及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒及其制備方法和在醫(yī)藥中的用途。
背景技術(shù)：
1990年Weidner采用內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物顯示乳腺癌新生血管，發(fā)現(xiàn)腫瘤血管密度(MVD)與腫瘤侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病人預(yù)后是相關(guān)的.此后MVD與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系在許多腫瘤被證實(shí)?？寡苄纬傻母深A(yù)治療還處于臨床試驗(yàn)階段。1989年第一個進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗新生血管藥物干擾素(αIFNα)，迄今已有13種該藥物正在進(jìn)行II-III期的臨床試驗(yàn)。Agniostatin和Endostatin是最強(qiáng)的血管形成抑制劑，分別在1994年和1997年由Falkman實(shí)驗(yàn)室報(bào)道。1999年美國FDA已批準(zhǔn)Endostatin進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。但藥物的使用需長期甚至終身服用，這會給患者帶來不便和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，探索一勞永逸的方法也是血管形成研究的方向。
近年來國內(nèi)外對細(xì)胞識別和粘附的分子機(jī)制研究取得了很大的進(jìn)展，其中對含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)序列在細(xì)胞識別和粘附方面的報(bào)道引人注目.RGD是細(xì)胞膜整合蛋白十幾種受體和細(xì)胞外基質(zhì)如膠原、血管細(xì)胞粘附分子等配體識別與結(jié)合的氨基酸最小序列.在一定條件下，人工合成的RGD序列的可溶性小分子多肽能夠競爭性地與細(xì)胞表面的整合蛋白結(jié)合，將細(xì)胞外信息傳入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞一系列的生理變化.國際上已有很多學(xué)者做過大量的實(shí)驗(yàn)，研究RGD序列肽抑制惡性腫瘤的血管新生而抑制其生長與轉(zhuǎn)移，證實(shí)RGD序列肽具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。
有研究者將RDG類多肽直接用于腫瘤的治療。雖然含有RGD序列多肽可為各種整合蛋白所識別，但是RGD序列肽在體內(nèi)不穩(wěn)定，這些多肽在體內(nèi)迅速被分解與清除，需要多次注射大劑量才能抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這成為該類多肽作為實(shí)用性抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物的一個不利因素。加大劑量雖可提高血藥濃度，但在血中未被磷酸化的藥物可迅速尿排，不但不能提高療效，反而產(chǎn)生腎毒性，而被RGD序列封閉的腫瘤細(xì)胞并沒有被殺滅，仍能夠在體內(nèi)存活相當(dāng)長時間，仍可以導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。
也有研究者制備了其聚乙二醇、甲殼素的結(jié)合物，希望通過延長其體內(nèi)作用時間來增強(qiáng)其抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移效果。但是這些結(jié)合物為線性分子結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)極易降解，一旦RGD序列肽脫落，仍可以導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。
脂質(zhì)體作為一種藥物載體得到了比較廣泛的研究，包含有PEG類脂衍生物的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體可以在循環(huán)系統(tǒng)中存在足夠長的時間并發(fā)揮療效.表面結(jié)合了RGD序列肽序列的脂質(zhì)體可以將藥物靶向釋放到病變組織中，顯著降低對其它組織的毒性并提高了療效.脂質(zhì)體最容易制備，卻也最難達(dá)到質(zhì)控要求。雖然不少文獻(xiàn)上仍用脂質(zhì)體，但因體內(nèi)靶向性差，在體內(nèi)應(yīng)用，除腫瘤瘤內(nèi)注射外，其前景仍存在問題。此外，在質(zhì)控上也有一定困難。
復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝癌研究所進(jìn)行了IFNaIb治療棵植性肝癌等的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果令人滿意。但是全身系統(tǒng)給藥，對腫瘤抑制作用減弱、并有副反應(yīng)。
研究表明生物活性短肽RGD能有效抑制腫瘤血管的生長，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。目前人們已注意了其臨床上治療腫瘤轉(zhuǎn)移的應(yīng)用價值。繼續(xù)尋找抑制粘連作用強(qiáng)、持續(xù)時間長、能用于臨床的RGD類多肽是今后的研究方向。
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于選擇合適的載體，使生物活性短肽能有效地抑制腫瘤血管的生長。
本發(fā)明提供了一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，該納米粒包括藥物和短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物質(zhì)作載體材料。
本發(fā)明另一目的是提供了一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，該方法為將一定量的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)修飾的PL-PL高分子材料加到一定體積的二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷(DCM)/丙酮的混合有機(jī)溶劑中構(gòu)成有機(jī)相，取適量藥物加入有機(jī)相中，將其勻化后形成初乳，將初乳加到一定量的乳化劑和一定體積的去離子水所構(gòu)成的水相中，再次乳化，將所得乳液攪拌蒸發(fā)有機(jī)溶劑1～5小時，使有機(jī)溶劑揮發(fā)完全，即得短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物(GD-PL-PL)納米粒的分散體系，在膠體溶液中加入或不加入適量的支架劑，常規(guī)凍干保存。
本發(fā)明納米粒載體材料用一系列不同分子量和不同L-lactic Acid與-L-lysine比例以及不同RGD含量的材料，其分子量為4.0×103～6.0×104；L-lacticAcid與-L-lysine比例為100∶1-50∶50；RGD含量為0～50％。其有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷和丙酮(AC)的混合液，DCM和AC的體積比為60～100/0～40。
本發(fā)明水分散介質(zhì)為右旋糖苷40或右旋糖苷70或普朗尼克F68，其濃度為0.1～5％。其勻化方式包括超聲乳化，高壓乳勻方式。支架劑包括葡萄糖、乳糖或甘露糖等，其含量為0.1～5％。
本發(fā)明又一目的是提供了短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物在制備納米級藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的短肽(RGD)修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物(Poly(L-lacticAcid-co-L-lysine)。該高分子材料是優(yōu)良的藥物載體，利用這種材料包裹藥物，在機(jī)械攪拌或高壓乳勻機(jī)作用下制備緩釋納米粒，粒徑在10～1000nm以下可控，表面光滑，均勻度好，顆粒規(guī)則無粘連，再分散性好，載藥量和包封率高，可用于制備靜脈或肌肉注射或口服給藥的緩釋納米粒，作為癌細(xì)胞靶向給藥。
本發(fā)明所述的藥物為有機(jī)藥物、水溶性藥物或水不溶性藥物抗癌藥，如抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環(huán)胞苷)、直接影響和破壞DNA結(jié)構(gòu)及其功能的藥物(如氮芥、環(huán)磷酰胺、氮甲、順鉑、絲裂霉素、喜樹堿)、抑制蛋白質(zhì)合成的藥(如阿霉素、L-門冬酰胺酶、柔紅霉素、光輝霉素)、影響微管蛋白質(zhì)組裝和紡錘絲形成的藥物(長春堿、依托泊苷)。


圖1RGD-PL-PL緩釋納米粒粒徑分布圖。
圖2RGD-PL-PL緩釋納米粒透射電鏡(JEM-100SX透射電子顯微鏡，日本電子公司)圖。
具體實(shí)施例方式下面再以實(shí)施例對本發(fā)明加以進(jìn)一步的說明，但是不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1精確稱取RGD-PL-PL 500mg，加到丙酮中構(gòu)成有機(jī)相。將氟尿嘧啶或米托蒽醌(DHAQ)25mg溶于雙蒸水中形成水相。將氟尿嘧啶或DHAQ溶液加入有機(jī)相中其勻化后形成初乳。稱取普朗尼克F68加入雙蒸水中使其充分溶解，調(diào)節(jié)使其濃度為3％，構(gòu)成外水相。內(nèi)水相與外水相的體積比為1∶4～1∶8。將初乳加到外水相中，高壓乳勻機(jī)乳化，將所得乳液磁力攪拌蒸發(fā)有機(jī)溶劑4～5小時，使丙酮揮發(fā)完全，即得RGD-PL-PL納米粒的分散體系。加入3％的甘露糖作為支架劑，常規(guī)凍干保存。
實(shí)施例2精確稱取RGD-PL-PL50mg，加到二氯甲烷(DCM)和丙酮的混合有機(jī)溶劑中(DCM和AC的體積比為60～100/1～40)構(gòu)成有機(jī)相。將氟尿嘧啶或米托蒽醌(DHAQ)2mg溶于雙蒸水中形成水相。將氟尿嘧啶或DHAQ溶液加入有機(jī)相中其勻化后形成初乳。稱取右旋糖苷70加入雙蒸水中使其充分溶解，調(diào)節(jié)使其濃度為1％，構(gòu)成外水相。將初乳加到外水相中，超聲乳化30s，將所得乳液放入燒杯中，磁力攪拌蒸發(fā)有機(jī)溶劑3小時，使二氯甲烷和丙酮揮發(fā)完全，即得RGD-PL-PL納米粒的分散體系。加入3％的甘露糖作為支架劑，常規(guī)凍干保存。
實(shí)施例3精確稱取RGD-PL-PL100mg，加到丙酮中構(gòu)成有機(jī)相。將米托蒽醌(DHAQ)5mg溶于雙蒸水中形成水相。將DHAQ溶液加入有機(jī)相中其勻化后形成初乳。稱取右旋糖苷40加入雙蒸水中使其充分溶解，調(diào)節(jié)使其濃度為1％，構(gòu)成外水相。將初乳加到外水相中，高壓乳勻機(jī)乳化，將所得乳液磁力攪拌蒸發(fā)有機(jī)溶劑1～5小時，使丙酮揮發(fā)完全，即得RGD-PL-PL納米粒的分散體系。加入3％的乳糖作為支架劑，常規(guī)凍干保存。
權(quán)利要求
1.一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，其特征在于該納米粒包括作為活性成份的藥物和由精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰序列短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物的作載體材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，其特征在于其中所述的藥物為有機(jī)藥物、水溶性藥物和水不溶性抗癌藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒，其特在于其中所述的載體材料用賴氨酸、乳酸和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物，分子量為4.0×103～6.0×104；賴氨酸/乳酸為100～50∶0～50；短肽含量為0.001～50％；納米粒徑在10～1000nm。
4.一種如權(quán)利要求1所述的短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于該方法為一定量的由精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰短肽修飾的聚賴氨酸與聚乳酸高分子材料加到乙酸乙酯、二氯甲烷、或二氯甲烷和丙酮的混合有機(jī)溶劑中構(gòu)成有機(jī)相，取適量藥物加入有機(jī)相中，將其勻化后形成初乳，初乳加到一定量的乳化劑和一定體積的去離子水所構(gòu)成的水相中，再次乳化，所得乳液蒸發(fā)有機(jī)溶劑1～5小時，使其揮發(fā)完全，即得短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的水分散體系，在膠體溶液中加入或不加入支架劑，常規(guī)凍干保存；其中聚賴氨酸與聚乳酸比例為100∶1-100；所述短含量為0.001～50％；有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液，體積比為60～100∶1～40；所述的水分散介質(zhì)濃度為0.1～5％(W/V)；其支架劑含量為0.1～5％(W/V)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于勻化方式包括超聲乳化或高壓乳勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于其中所述的支架劑是包括葡萄糖、乳糖或甘露糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于其中所述的分散介質(zhì)為右旋糖苷40或右旋糖苷70或普朗尼克F68。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米粒的制備方法，其特征在于其中所述的高壓乳勻方式初乳超聲的強(qiáng)度為10～300W，每次超聲5～10秒，共超聲1～5次，復(fù)乳超聲的強(qiáng)度為30～600W，每次超聲5～10秒，共超聲1～6次。
9.一種如權(quán)利要求1所述的短肽修飾的聚賴氨酸-聚乳酸共聚物納米材料的用途，其特征在于是制備藥物緩釋納米粒的材料。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種短肽修飾的聚賴氨酸－聚乳酸共聚物納米粒，該納米粒包括藥物和由精氨酰－甘氨酰－天冬氨酰序列短肽、修飾的聚賴氨酸－聚乳酸共聚物納米粒載體組成。本發(fā)明的納米載體材料可用于有機(jī)藥物、水溶性藥物或水不溶性抗癌藥物。本發(fā)明制備方法簡便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，特別適應(yīng)于制備靶向給藥的抗腫瘤藥。
文檔編號A61P35/00GK1634591SQ20041006806
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
發(fā)明者段友容, 王慶瑞, 陳雪英, 何春菊 申請人:東華大學(xué)