專利名稱：氟尿嘧啶在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氟尿嘧啶在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知艾滋病是近二十年來全世界流行最快、最廣、危害人類生命最嚴(yán)重的傳染病。艾滋病全稱“獲得性免疫缺陷綜合癥”(acquied immuodeficiency syndrome)，簡稱AIDS。1981年，首例艾滋病病例在美國同性戀人群中發(fā)現(xiàn)。我國自1985年發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病人以來，每年艾滋病感染人數(shù)呈幾何級數(shù)增長，現(xiàn)已達(dá)80萬以上。經(jīng)各國科學(xué)家努力，在HIV病毒的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)和致病作用機(jī)制研究方面取得突破性進(jìn)展，HIV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)，主要感染T4細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其繁殖周期包括1，病毒吸附于細(xì)胞表面的受體分子(吸附)；2，病毒的核衣殼侵入宿主細(xì)胞(合胞)；3，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，病毒雙鏈DNA的合成(合成)；4，病毒雙鏈DNA及與其相連的病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核；5，病毒DNA整合于宿主染色體形成前病毒(整合)；6，在宿主RNA聚合酶作用下，合成病毒RNA；7，RNA轉(zhuǎn)錄、加工、運(yùn)輸；8，病毒多聚蛋自前體的合成及毒粒的裝配；9，病毒出芽及包膜形成；10，毒粒的成熟(張興權(quán)，范江主編.艾滋病毒感染與艾滋病。人民衛(wèi)生出版社.199939)。以上各個(gè)環(huán)節(jié)均可作為抗艾滋病藥物研究的作用靶點(diǎn)，至1997年國外共有42種藥物被FDA批準(zhǔn)用于HIV感染和艾滋病相關(guān)疾病的治療，其中11種為抗艾滋病藥物(鄭永唐.賁昆龍.大自然探索.1998.17(4)79-85)，主要為逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶抑制劑；迄今為止，在我國還沒有一種天然或合成化合物被批準(zhǔn)用于治療艾滋病。
由于目前尚無理想的HIV疫苗，所以抗艾滋病藥物治療艾滋病成為目前治療艾滋病的唯一手段，抗艾滋病藥物研究成為藥物研究的熱點(diǎn)課題。
氟尿嘧啶又稱為5-氟尿嘧啶、5-FU、5-Fluorouracil。氟尿嘧啶是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，對胃腸道、頭頸部、肝、乳腺、胰腺、泌尿系統(tǒng)的腫瘤有治療作用，還對宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、絨毛膜上皮癌有治療作用。氟尿嘧啶通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成，對RNA的合成也有一定的抑制作用(高恩民主編.臨床多用藥物手冊.鄭州大學(xué)出版社.2003；534)。
技術(shù)內(nèi)容及其它本發(fā)明的目的在于提供氟尿嘧啶在制備治療艾滋病藥物中的新應(yīng)用。
本發(fā)明研究用氟尿嘧啶和世界首選抗艾滋病藥物AZT作為陽性對照，測定氟尿嘧啶、AZT體外對HIV誘導(dǎo)C8166形成合胞體的抑制活性；以MTT方法測定氟尿嘧啶、AZT對C8166或MT-4細(xì)胞存活和增殖的影響；測定氟尿嘧啶、AZT對HIV-1感染細(xì)胞死亡的保護(hù)作用；以定量ELISA檢測氟尿嘧啶、AZT對HIV-1p24表達(dá)的抑制作用。然后用IC50/EC50得到它們的治療指數(shù)TI值，以確定在上述實(shí)驗(yàn)條件下它們對HIV病毒的抑制活性?，F(xiàn)分述如下本發(fā)明研究使用實(shí)驗(yàn)室中科院昆明動(dòng)物研究所免疫室的P3實(shí)驗(yàn)室。
試劑和溶液(1)試劑MTT[3，(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5 diphenyl tetrazolium bromide]購自Amresco公司；SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)為Serva產(chǎn)品；DMF(N，N′-Dimethyl formamine)，分析純，購自上?；瘜W(xué)試劑公司；陽性對照藥物AZT購自Sigma公司。
(2)溶液RPMI-1640完全培養(yǎng)基，含有10％新生小牛血清(NCS)購自Gibco.2m ML-谷氨酰胺(Mr.＝146.015)，10Mm HEPES(Mr.＝238.3)，50μM；2-巰基乙醇，100，000IU青霉素，100μqg/ml硫酸鏈霉素(Mr.＝1457.38)。
藥物氟尿嘧啶為上海華聯(lián)制藥公司生產(chǎn)。藥物溶于去離子水中，過濾除菌，4℃保存，濃度為5mg/ml、2mg/ml。
細(xì)胞和病毒C8166、MT-4和HIV-1 IIIB/H9均由英國MRC，AIDS Reagent Project惠贈(zèng)。按常規(guī)方法制備HIV-1 IIIB，滴定并計(jì)算出病毒的TCID50。病毒貯存液分裝后，置-70℃保存。細(xì)胞和病毒均按常規(guī)方法凍存和復(fù)蘇。
病毒感染性的滴定HIV-1按Johnson & Byington(1990)所述方法改良進(jìn)行滴定，簡述如下將HIV-1貯存液在96孔板上作4倍稀釋，10個(gè)梯度，每梯度6個(gè)重復(fù)孔，每孔加入C8166細(xì)胞50μl(3×105/ml)，每孔終體積200μl 37℃，5％CO2培養(yǎng)。第二天補(bǔ)加新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基100μl。第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中HIV-1誘導(dǎo)細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞體(syncytium)的形成進(jìn)行判斷；按Reed &Muench方法計(jì)算病毒的TCID50，(50％Tissue Culture Infection Dose)，及引起細(xì)胞出現(xiàn)CPE的病毒上清稀釋度。
氟尿嘧啶對C8166的細(xì)胞毒性檢測4×105/ml C8166細(xì)胞懸液100μl與不同濃度的藥物溶液混合，同時(shí)設(shè)置陽性藥物AZT對照孔、不含藥物的對照孔和空白對照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)3天，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。ELx800 ELISA Reader測定OD595/630nm值。計(jì)算CC50值(50％CytotoxicConcentration)即50％細(xì)胞存活時(shí)的藥物濃度。
氟尿嘧啶對HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制試驗(yàn)4×105/ml C8166細(xì)胞懸液50μl與不同濃度的藥物溶液混合，加入50μl HIV-1稀釋上清50μl，M.O.I.為0.06，同時(shí)設(shè)置不含藥物的對照孔及陰性對照孔，設(shè)置陽性藥物AZT對照。37℃，5％CO2培養(yǎng)二天，倒置顯微鏡下(100×)計(jì)數(shù)合胞體個(gè)數(shù)。計(jì)算EC50值(50％Effective Concentration)即抑制合胞體形成50％時(shí)的藥物濃度。
氟尿嘧啶對HIV-1感染MT-4細(xì)胞死亡的保護(hù)作用8×105/ml MT-4細(xì)胞懸液50μl與100μl不同濃度的藥物溶液混合，培養(yǎng)板的一半孔加入50μl培養(yǎng)基，另一半孔加入50μl HIV-1稀釋上清，M.O.I.為0.06，同時(shí)設(shè)置不含藥物的未感染或感染HIV-1的細(xì)胞對照孔及空白對照孔，設(shè)置陽性藥物AZT對照，37℃，5％CO2培養(yǎng)5天，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。ELx800ELISA Reader測定OD595/630nm值。計(jì)算藥物對正常細(xì)胞的存活率和HIV-1感染細(xì)胞的保護(hù)率。
氟尿嘧啶對HIV-1 IIIB在急性感染C8I66細(xì)胞中復(fù)制的抑制試驗(yàn)8×105/ml C8166細(xì)胞50μl/孔接種到含有100μl/孔倍比稀釋化合物的96孔板上，然后加入50μl的HIV-1稀釋上清，1300TClD50/孔。同時(shí)設(shè)置不含化合物的對照孔。37℃，5％CO2培養(yǎng)二天。培養(yǎng)上清離心后收集，Triton-X 100滅活。檢測化合物對HIV-1復(fù)制的抑制作用采用捕捉p24抗原ELISA方法。Elx800 ELISA Reader測定490nmOD值，參考波長630nm。
計(jì)算1，細(xì)胞生長抑制率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)×100(樣品的毒性)2，合胞體形成的生長抑制率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù))×100 (合胞體方法)3，IC50/CC50為對50％的宿主細(xì)胞產(chǎn)毒性的樣品的濃度；EC50為保護(hù)50％的HIV-1感染細(xì)胞存活時(shí)的化合物濃度或具有50％合胞體形成抑制率的化合物濃度。治療指數(shù)TI為IC50/EC50的比值，選擇指數(shù)TI為CC50/EC50的比值。
本發(fā)明研究中發(fā)現(xiàn)，氟尿嘧啶有較好的抗艾滋病毒活性。分述如下首先，陽性對照藥物AZT在對C8166的細(xì)胞毒性檢測和對HIV-1誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中測得的CC50值為3.36μmol/L，EC50值為0.227nmol/L(即0.000679μmol/L)，治療指數(shù)TI值為14798.96。結(jié)論AZT具有很高的HIV病毒抑制活性。氟尿嘧啶在上述實(shí)驗(yàn)中測得的CC50值為4.00μg/ml，EC50值為0.005μg/ml，治療指數(shù)TI值為840.05。結(jié)論氟尿嘧啶有較好的抗艾滋病毒活性。
在AZT對HIV-1感染MT-4細(xì)胞死亡的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，測得的CC50值為1.00μg/ml，EC50值為0.099μg/ml，治療指數(shù)TI值為10.1。在氟尿嘧啶對HIV-1感染MT-4細(xì)胞死亡的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，測得的CC50值為0.08μg/ml，EC50值為107.15μg/ml，治療指數(shù)TI值為0.00054。結(jié)論氟尿嘧啶對HIV-1感染MT-4細(xì)胞死亡的保護(hù)作用極差。
在對HIV-1 IIIB在急性感染C8I66細(xì)胞中復(fù)制的抑制試驗(yàn)中，測得AZT的EC50值分別為0.008和0.011μg/ml，結(jié)論AZT具有很高的HIV病毒抑制活性。測得氟尿嘧啶的EC50值分別為2.17和2.23μg/ml，結(jié)論氟尿嘧啶具有較好的HIV病毒抑制活性。
本發(fā)明的另一個(gè)有益效果在于，氟尿嘧啶與AZT相比，價(jià)格低廉。每粒含0.1克原料藥的AZT價(jià)格為1.75美元，而氟尿嘧啶原料藥在我國售價(jià)僅為0.80元/克。
本發(fā)明的最后一個(gè)有益效果在于，氟尿嘧啶是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，所以，在制備治療艾滋病藥物中的新應(yīng)用研究中，可以節(jié)省許多研究時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。
權(quán)利要求
1.氟尿嘧啶在制備治療艾滋病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及氟尿嘧啶經(jīng)體外對HIV誘導(dǎo)C8166形成合胞體的抑制活性；以MTT方法測定其對C8166或MT－4細(xì)胞存活和增殖的影響；對HIV－1感染細(xì)胞死亡的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)；以定量ELISA檢測其對HIV－1p24表達(dá)的抑制作用實(shí)驗(yàn)等一系列實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)氟尿嘧啶具有制備治療艾滋病藥物的新用途。
文檔編號A61P31/18GK1586482SQ20041006957
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者鐘文遠(yuǎn) 申請人:鐘文遠(yuǎn)