專利名稱：用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗cd19的工程抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工程抗體，尤其是用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體及其用途。
背景技術(shù)：
急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是白血病的一種亞型，以B細(xì)胞ALL(B-ALL)為主，占ALL的70-80％，每年新發(fā)病率為0.98/10萬人。目前成人ALL的治療以化療為主，但療效較差，雖然可以取得暫時(shí)的緩解，然而生存期短。我國(guó)成人ALL療效更差，以至無法計(jì)算其長(zhǎng)期生存率。因此，降低白血病的病死率，開展和改善白血病的治療方法是世界醫(yī)學(xué)正在攻克的一個(gè)重點(diǎn)。
隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，基因工程抗體的誕生為腫瘤的診斷和治療帶來了希望，尤其是單鏈抗體的應(yīng)用成為腫瘤免疫基因治療的熱點(diǎn)，它以分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、較好保持抗原親和性及特異性、免疫原性低、體內(nèi)半衰期短，易與效應(yīng)分子相連構(gòu)成多種新功能的抗體分子等為特點(diǎn)，單鏈抗體成為腫瘤免疫治療的重要手段。
20世紀(jì)90年代，人源性單克隆抗體(單抗)的出現(xiàn)，開創(chuàng)了單抗治療血液病的新紀(jì)元。ALL細(xì)胞表面表達(dá)多種抗原，如CD19、CD20、CD22及CD52等，這些表面抗原均可成為單抗的作用靶點(diǎn)。目前已上市的抗CD20單抗可使93％的前B-ALL及成熟B-ALL患者獲完全緩解(CR)，1年生存率達(dá)86％。Thomas等應(yīng)用抗CD20單抗加CVAD治療Burkitt淋巴瘤，89％的病人獲CR，1年無病生存(DFS)率達(dá)86％，無治療相關(guān)死亡。另外，抗CD19單抗和抗CD52單抗也已用于人體。Seibel等對(duì)比了單純化療與化療加抗CD19單抗對(duì)初發(fā)ALL的療效。結(jié)果顯示，單純化療組2周CR率僅為43％，而聯(lián)合化療組達(dá)93％。抗CD22單抗在體外對(duì)MDR-1(多藥耐藥基因)陽性的Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株及BCP-ALL細(xì)胞株EU-1有明顯殺傷作用。
綜上所述，抗體藥物給腫瘤尤其是血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療帶來深遠(yuǎn)影響?？贵w作為單獨(dú)治療藥物業(yè)已證明是有效的，而且與其它化療藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。利用抗體的細(xì)胞特異性，將抗體作為遞送細(xì)胞毒藥物或結(jié)合其它蛋白的載體，可以有效殺滅靶向細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有殺傷作用。因此，如果利用CD19表面抗原作為ALL白血病細(xì)胞的表面標(biāo)記，構(gòu)建CD19單鏈抗體，以此為載體，結(jié)合其它有生物學(xué)作用的蛋白分子，構(gòu)成融合蛋白，通過融合蛋白中的CD19單鏈抗體將融合蛋白結(jié)合到ALL白血病細(xì)胞，刺激CTL細(xì)胞激活，可起到特異性殺傷白血病細(xì)胞的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體(ScFv)，獲得一種新的、能與B-ALL白血病細(xì)胞結(jié)合的活性表達(dá)產(chǎn)物。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體，含有SEQ ID NO.1所述的抗CD19單克隆抗體HI19a重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO.2所述的抗CD19單克隆抗體HI19a輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列。
所述抗CD19單克隆抗體HI19a重鏈可變區(qū)VH基因所表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，包括含有部分或全部該序列CDRs的片段。
所述抗CD19單克隆抗體HI19a輕鏈可變區(qū)VL基因所表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，包括含有部分或全部該序列CDRs的片段。
包括上述cDNA的pMD-18T載體。
包括上述cDNA的所構(gòu)建的pET28a(+)表達(dá)載體。
所述的cDNA所構(gòu)建的pET28a(+)表達(dá)載體，所表達(dá)的cDNA氨基酸序列，包括含有部分或全部該序列CDRs的片段。
所述的cDNA所構(gòu)建的pET28a(+)表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述。
所述用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體，在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明從鼠抗人CD19單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增單克隆抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，并連接成單鏈抗體(ScFv)基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，以獲得一種新的、能與B-ALL白血病細(xì)胞結(jié)合的活性表達(dá)產(chǎn)物。


圖1為PCR擴(kuò)增VH，VL基因片段電泳圖(MMarker，HVH，LVL)。
圖2為PCR擴(kuò)增單鏈抗體(ScFv)基因片段電泳圖(MMarker)。
圖3為抗CD19 ScFv表達(dá)載體pET28a(+)ScFv結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4為ScFv表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(10％)電泳圖(MMarker；O未誘導(dǎo)菌體蛋白；1-4誘導(dǎo)后菌體蛋白)。
圖5為純化后抗CD19-ScFv蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
圖6為抗CD19 ScFv的Western blot分析。
圖7a為競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光抑制實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照組(AB血清+鼠源IgG)。
圖7b為競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光抑制實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照組(HI19a+PBS)。
圖7c為競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光抑制實(shí)驗(yàn)組(抗CD19-ScFv+HI19a)圖7d為陽性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組FACS重疊圖。
圖8為抗CD19ScFv結(jié)合曲線及Scatchard分析具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體作進(jìn)一步的詳細(xì)說明HI19a為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所自行研制、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的鼠抗人CD19單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，此細(xì)胞株分泌的抗CD19單克隆抗體，識(shí)別一個(gè)95KDI型穿膜糖蛋白。B-ALL白血病細(xì)胞幾乎均表達(dá)CD19表面抗原。
應(yīng)用RT-PCR方法從分泌抗CD19單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞HI19a中克隆了抗體的重鏈、輕鏈可變區(qū)(VH、VL)基因，所克隆基因分別長(zhǎng)366bp(SEQID NO.1)和324bp(SEQ ID NO.2)，基因內(nèi)無終止密碼子，為開放讀碼框，分別編碼122個(gè)(SEQ ID NO.3)和108個(gè)(SEQ ID NO.4)氨基酸。與GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)我們所克隆的基因片段與鼠源性抗體有較高的同源性。
用(Gly4Ser)3連接肽基因?qū)H，VL拼接成單鏈抗體(ScFv)基因，克隆入pET28a表達(dá)質(zhì)粒，用構(gòu)建的PET28a(+)-CD19ScFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)的蛋白位于包涵體。包涵體蛋白經(jīng)變性、純化、復(fù)性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色，證實(shí)純化后得到分子量為約30Kd的單一蛋白條帶。進(jìn)一步用anti-His-tag抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，證實(shí)純化蛋白條帶為CD19ScFv蛋白。
用免疫競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD19ScFv的結(jié)合活性，經(jīng)單鏈抗體封閉靶細(xì)胞——CD19表達(dá)陽性的人前B細(xì)胞白血病細(xì)胞系Nalm6細(xì)胞后，再加親本抗體(HI19a雜交瘤分泌的抗CD19單克隆抗體)，流式細(xì)胞儀測(cè)定顯示熒光標(biāo)記陽性率從92.64％降為55.17％，表明抗CD19ScFv可競(jìng)爭(zhēng)性抑制HI19a與Nalm6細(xì)胞結(jié)合，即抗CD19ScFv能夠與Nalm6細(xì)胞表面CD19抗原特異性結(jié)合。另外，還用解離常數(shù)(Kd)計(jì)算方法測(cè)定了CD19ScFv的結(jié)合活性，Kd值為1.7×10-8mol/L(R2＝0.99)。
本發(fā)明采用RT-PCR方法從分泌抗人CD19單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株HI19a中克隆了單鏈抗體基因，并在蛋白表達(dá)載體pET28a中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了與B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞結(jié)合活性的ScFv蛋白，為其將來在治療上的應(yīng)用作了前期的基礎(chǔ)性工作。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施過程1.抗CD19抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆應(yīng)用RT-PCR方法從分泌抗CD19單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞HI19a擴(kuò)增抗CD19抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因(1)RNA提取采用Trizol一步法，1)取雜交瘤細(xì)胞約106，加入1mlTrizol，吹打混勻，室溫靜置5分鐘。2)加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。3)12000rpm，4℃，離心15分鐘。4)取上清，加入0.5ml異丙醇室溫靜置15分鐘。5)12000rpm，4℃，離心15分鐘。6)棄上清，加入1ml 75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，離心5分鐘。7)棄上清，沉淀晾干，加入30μl DEPC處理的水溶解RNA。
(2)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(40μl)取2.5mM dNTP 4μl，5×first strandbuffer 8μl，DTT 4μl，oligodT 2μl，水16.6μl，混勻后加入RNA約2g，65℃水浴5分鐘，快速冰浴2-3分鐘。加入50u/μl RNasin 0.4μl，Superscript II(200u/μl)1μl混勻后37℃水?。?小時(shí)。取出后70℃水浴10分鐘。-20℃保存。
(3)PCR擴(kuò)增抗CD19抗體的輕重鏈可變區(qū)基因輕鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50μl)設(shè)計(jì)引用通用簡(jiǎn)并引物，上游引物5’-GAC ATT CAG CTG ACC CAG WCT SMH-3’；下游引物5’-CCGTTA GAT CTC CAR BTT KGT SCS-3’。以cDNA為模板，高保真pyrobest聚合酶擴(kuò)增。PCR循環(huán)程序?yàn)?4℃5min；94℃50s，55℃1min，72℃1min；最后72℃延伸10min，共33個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后加入1u普通Taq酶(購自大連寶生物公司)72℃延伸10min后立即進(jìn)行酚氯仿抽提。
重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50μl)上游引物5’-CAG GTSMAR CTG CAG SAG TCW GG-3’；下游引物5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGTCCC TTG GCC CC-3’。以cDNA為模板，高保真pyrobest聚合酶擴(kuò)增。PCR循環(huán)程序?yàn)?4℃5min；94℃，30s，55℃，1min，72℃，1min；最后72℃延伸10min，共33個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后加入1u普通Taq酶(購自大連寶生物公司)72℃延伸10min后立即進(jìn)行酚氯仿抽提。PCR結(jié)果見圖1。
(4)測(cè)序載體的構(gòu)建pMD-18T載體購自大連寶生物公司。將輕重鏈可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物回收，與pMD-18T載體連接，連接反應(yīng)按試劑盒要求進(jìn)行。取連接產(chǎn)物5μl，轉(zhuǎn)化以氯化鈣方法制備的大腸桿菌(DH5a)感受態(tài)，以藍(lán)/白斑方法挑選陽性克隆，輕重鏈各挑取10個(gè)克隆送測(cè)序，測(cè)序證實(shí)輕、重鏈各個(gè)克隆的基因序列完全一致，分別為324bp及366bp，且該基因序列完全符合蛋白數(shù)據(jù)庫中抗體所具有的若干保守的框架氨基酸的特點(diǎn)，該序列為抗體基因序列。分別命名為pMD-18T19-VH及pMD-18T19-VL。
2.單鏈抗體基因表達(dá)載體pET28a ScFv的構(gòu)建根據(jù)輕、重鏈可變區(qū)的基因序列設(shè)計(jì)并合成了用于VH，VL基因擴(kuò)增和拼接的引物。
引物1CCG GAA TTC GAC ATT GTG CTC ACC CAG TCT CCA引物2GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC CCG TTT TAT TTC CAGCTT GGT CCC引物3GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT CAG CCG GCC ATG CGCCAG GTC CAG CTG CAG CAG引物4CCC AAG CTT GTG AGG AGA CTG TGA GAG TGG TGC C在引物1的5’端加上EcoRI酶切位點(diǎn)，引物4的3’端加上HindIII酶切位點(diǎn)。從所構(gòu)建的pMD-18T19-VH及pMD-18T19-VL載體，應(yīng)用PCR擴(kuò)增VH，VL片段，回收后，經(jīng)重疊延伸拼接法通過PCR擴(kuò)增抗CD19ScFv基因片段，見圖2。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI+HindIII處理后再與經(jīng)EcoRI+HindIII處理后的攜帶有(His)6標(biāo)簽的pET28a(+)載體連接(16℃連接過夜)。組成pET28a的抗CD19-ScFv的表達(dá)載體，見圖3。測(cè)序表明，抗CD19ScFv基因片段為750bp，按氨基酸序列推測(cè)ScFv約為27KD的蛋白。測(cè)序正確的克隆用于蛋白表達(dá)。
3.抗CD19ScFv抗體片段的表達(dá)、純化及復(fù)性(1)用構(gòu)建的PET28a(+)-CD19ScFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板(1％agar)上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取經(jīng)鑒定正確的單克隆活化后，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.7-0.9，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)，取100μl菌液，離心后用100μl 1×SDS上樣buffer重懸，100℃煮沸5min。取20μl上樣，10％SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色。實(shí)驗(yàn)證明重組質(zhì)粒pET28a(+)ScFv在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)有重組蛋白表達(dá)，750bp片段表達(dá)出約29Kd的帶(His)6的重組蛋白，見圖4。
(2)抗CD19單鏈抗體(ScFv)純化將表達(dá)的菌體沉淀重懸于1/30培養(yǎng)體積的預(yù)冷50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCL、1mmol/L EDTA、pH7.0溶解。反復(fù)凍融3次后超聲破碎細(xì)菌，4℃，30000g離心30分鐘。沉淀中加入1/30培養(yǎng)體積的3M尿素和50mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶解后30000g離心30分鐘。4℃收集包涵體。用1/40培養(yǎng)體積的6M鹽酸胍和0.1MTris-HCl，pH7.0，于4℃搖動(dòng)過夜溶解包涵體。4℃，30000g離心30分鐘去處沉淀，上清用于純化。鎳柱購于Novagen公司，用3倍柱床體積的Startbuffer(6M鹽酸胍，0.1M Tris-HCl，pH7.0)平衡鎳柱后上樣，20倍柱床體積、pH為7.0的6M尿素、50mmol/L Tris-HCl和50mmol/L咪唑洗柱，分別用4倍柱床體積的含有250mmol/L咪唑、6M尿素和50mmol/L Tris-HCl洗脫結(jié)合在鎳柱上的ScFv。
(3)SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定純化產(chǎn)物經(jīng)10％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色，證實(shí)純化后得到分子量為約30Kd的單一條帶。進(jìn)一步用Western blot驗(yàn)證，具體方法參考分子克隆，其中以抗His-tag抗體(IgG)為一抗與抗CD19-ScFv融合蛋白上的(His)6標(biāo)簽結(jié)合，進(jìn)行Western blot反應(yīng)。結(jié)果證實(shí)純化條帶為目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，見圖5、圖6。
(4)CD19ScFv的復(fù)性將洗脫的樣品在TEA緩沖液(0.4M精氨酸-HCL，0.1MTris-HCl，2mmol/L EDTA，pH7.0)緩慢透析復(fù)性，4℃過夜。
4.BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度(1)配制蛋白測(cè)定反應(yīng)液，取A液(BCA二鈉，1％；Na2CO3·H2O，2％；酒石酸鈉，0.16％；NaOH，0.4％；NaHCO3，0.95％；pH11.25)1ml加入B液(CuSO4·5H2O，4％)20μl混勻。
(2)應(yīng)液中加入50μl樣品蛋白溶液，及蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(不同濃度的牛血清白蛋白)混勻，于37℃水浴中反應(yīng)30分鐘。
(3)取各管的反應(yīng)液于562nm波長(zhǎng)進(jìn)行光吸收分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度于光吸收值(OD)的線性圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的OD-蛋白濃度關(guān)系，計(jì)算蛋白樣品的濃度。復(fù)性后抗CD19ScFv蛋白濃度為85.71μg/ml.
5.抗CD19 ScFv抗體活性測(cè)定——競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)取CD19表達(dá)陽性的Nalm6細(xì)胞系，制成1×106細(xì)胞懸液，加樣于40孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5×105細(xì)胞/孔。陰性對(duì)照組加100μl人AB血清，4℃孵育1h，3000rpm，4℃離心8min，棄上清液，PBS洗細(xì)胞2次，加鼠源性IgG 20μl(1mg/ml)；陽性對(duì)照組于人AB血清封閉1小時(shí)后加入抗CD19單克隆抗體HI19a工作液20μl；試驗(yàn)組加人AB血清封閉后先加100μl抗CD19ScFv，4℃孵育1h，3000rpm，4℃離心8min，棄上清液，PBS洗細(xì)胞2次，再加抗CD19單克隆抗體HI19a 20μl(1mg/ml)，4℃孵育1h，3000rpm，4℃離心8min，棄上清液，PBS洗細(xì)胞2次。三組細(xì)胞分別重懸于PBS中，加入20μl羊抗鼠IgG-FITC二抗，4℃孵育45min，PBS洗去未結(jié)合的熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)單克隆抗體HI19a與Nalm6細(xì)胞系結(jié)合的陽性率。
陽性對(duì)照組中Nalm6細(xì)胞與單抗HI19a結(jié)合陽性率為92.64％，實(shí)驗(yàn)組中的Nalm6細(xì)胞經(jīng)抗CD19 ScFv競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后，與HI19a結(jié)合的陽性率為55.17％，表明抗CD19 ScFv可競(jìng)爭(zhēng)性抑制HI19a與Nalm6細(xì)胞系結(jié)合，即抗CD19 ScFv能夠與Nalm6細(xì)胞系表面CD19抗原特異性結(jié)合，見圖7a、7b、7c、7d。
6.抗CD19ScFv抗體活性測(cè)定——解離常數(shù)測(cè)定(1)在96孔酶標(biāo)板中加入100μl Nalm6細(xì)胞裂解液，37℃包被2小時(shí)；(2)甩去包被液，以PBS(含0.05％Tween-20)洗3次，加入封閉液(PBS含3％牛血清白蛋白，10％羊血清)封閉2h后甩去封閉液，PBS洗滌3次。
(3)一式二孔加入100μl 1∶4倍比稀釋的CD19ScFv，以3％的牛血清白蛋白溶液作對(duì)照，37℃孵育2h。
(4)除去反應(yīng)液后以PBS洗滌三次，加入抗His-tag單抗(1∶2000稀釋，0.1μg/ml)，37℃孵育2h。
(5)甩去第一抗體溶液，PBS洗三次后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗鼠IgG(1∶1000稀釋)，37℃孵育2h。
(6)甩去反應(yīng)液，PBS洗三次后，加顯色液(OPD，H2O2)反應(yīng)約10分鐘以2N H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(Vamed Engineering，Austria)測(cè)定各孔OD492nm吸光值。每個(gè)ScFv濃度的光吸收值取均值。
(7)解離常數(shù)計(jì)算將數(shù)據(jù)代入ΔA＝ΔAMAX×L/(Kd+L)即ΔA＝-Kd×ΔA/L-ΔAMAX(ΔA為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的OD值的差，L為加入的重組的CD19ScFv的濃度。回歸分析，計(jì)算解離常數(shù)Kd值，Kd＝1.7×10-8mol/L(R2＝0.99)，見圖8。
SEQUENCE LISTING(序列表)<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所<120>用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體及其用途<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>366<212>DNA<213>Mus musculus(小鼠)
<220>
<221>V_region<222>(1)..(366)<400>1caggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg120cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac180aatggaaagt tcaagggtca agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac240atgcagctca gcggcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagaaagacc300attagttcgg tagtagattt ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc360tcctca 366<210>2<211>324<212>DNA<213>Mus musculus(小鼠)<220>
<221>V_region<222>(1)..(324)<400>1gacattgtgc tcacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60tcacctgcaa ggccagtcag aatgtgggta ctaatgtagc ctggtatcaa cagaaaccag120gacaatctcc taaaccactg atttactcgg caacctaccg gaacagtgga gtccctgatc180gcttcacagg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcactaac gtgcagtcta240aagacttggc agactatttc tgtcaacaat ataacaggta tccgtacacg tccggagggg300ggaccaagct ggaaataaaa cggg 324
<210>3<211>122<212>PRT<213>Mus musculus(小鼠)<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(122<400>3Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr20 25 30Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>108<212>PRT<213>Mus musculus(小鼠)<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(108)<400>4Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser65 70 75 80Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg100 10權(quán)利要求
1.一種用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體，其特征是含有SEQ ID NO.1所述的抗CD19單克隆抗體HI19a重鏈可變區(qū)VH基因核苷酸序列和SEQ ID NO.2所述的抗CD19單克隆抗體HI19a輕鏈可變區(qū)VL基因核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體，其特征是所述抗CD19單克隆抗體HI19a重鏈可變區(qū)VH基因所表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，包括含有部分或全部該序列CDRs的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞的抗CD19的工程抗體，其特征是所述抗CD19單克隆抗體HI19a輕鏈可變區(qū)VL基因所表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，包括含有部分或全部該序列CDRs的片段。
4.包括權(quán)利要求1的cDNA的pMD-18T載體。
5.包括權(quán)利要求1的cDNA的所構(gòu)建的pET28a(+)表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述cDNA的所構(gòu)建的pET28a(+)表達(dá)載體，其特征在于所表達(dá)的cDNA氨基酸序列，包括含有部分或全部該序列CDRs的片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述cDNA的所構(gòu)建的pET28a(+)表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所述。
8.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體，在制備治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于靶向結(jié)合淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抗CD19的工程抗體及其應(yīng)用，為下一步研制靶向治療白血病的基因工程藥物奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及抗CD19單克隆抗體HI19a重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備用于白血病治療藥物中的應(yīng)用。重鏈和輕鏈可變區(qū)基因來自抗CD19單克隆抗體HI19a。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)成功制備抗CD19基因工程抗體，為白血病的靶向治療奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1775808SQ20041007271
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者王敏, 王建祥, 陳森, 廖小龍, 饒青, 邢海燕, 田征, 唐克晶, 林冬 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所