專利名稱：胃癌特異性納米疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及胃癌特異性納米疫苗，特別涉及一種胃癌特異性納米疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
雖然近些年來胃癌有逐漸減少的趨勢，但是其仍居國人十大癌癥死因排名的第三位，傳統(tǒng)的治療方式仍是手術(shù)，化療和放療，但均不能有效解決腫瘤轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)等問題。上個(gè)世紀(jì)50年代，Burnett發(fā)現(xiàn)了免疫系統(tǒng)在抗腫瘤中的重要作用，提出了免疫監(jiān)視學(xué)說，才使人們逐漸認(rèn)識(shí)到免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生和消退有著密切的關(guān)系。目前腫瘤免疫治療主要策略可分為①單克隆抗體治療；②免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子治療；③過繼免疫治療；④腫瘤特異性疫苗的主動(dòng)免疫治療。其中基于特定抗原的腫瘤疫苗是一種具有良好前景的腫瘤免疫治療方式。
早期的腫瘤特異性疫苗主要為腫瘤全細(xì)胞疫苗和腫瘤裂解產(chǎn)物疫苗。隨著對腫瘤抗原認(rèn)識(shí)上的不斷深入，目前研究較多的腫瘤疫苗有腫瘤細(xì)胞疫苗、腫瘤核酸疫苗、腫瘤多肽疫苗、腫瘤基因工程疫苗和抗獨(dú)特型腫瘤疫苗等五種。其中，核酸疫苗、多肽疫苗和基因工程疫苗是1990年后才發(fā)展起來的新型疫苗。腫瘤多肽疫苗是由來自腫瘤特異性抗原、病毒相關(guān)抗原、癌基因或抑癌基因突變蛋白的多肽組成的疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比優(yōu)點(diǎn)是①幾乎可以肯定是最安全的疫苗。②可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。③能迅速被合成和純化，可以大量生產(chǎn)，純度高?，F(xiàn)正成為腫瘤疫苗的研制熱點(diǎn)。
作為一種亞單位疫苗，多肽疫苗同樣存在不足之處，主要問題是①抗原特異性差，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原，除黑色素瘤的少數(shù)腫瘤外，多數(shù)腫瘤未發(fā)現(xiàn)有特異性的抗原存在。②體內(nèi)講解過快，因此只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生短暫的無記憶性的IgM，免疫原型弱。③多肽疫苗受到MHC的限制，只能對人群中某種特定的HLA表型產(chǎn)生作用，這給人群中廣泛使用多肽疫苗帶來困難。因此解決問題的關(guān)鍵在于尋找強(qiáng)有效的免疫佐劑增強(qiáng)多肽抗原的免疫效能，發(fā)掘高效無毒的體內(nèi)藥物載體，延遲多肽在體內(nèi)的降解，增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞對其的遞呈作用，并進(jìn)一步突破MHC對抗原的限制。
針對上述問題，大量學(xué)者探索了各種不同的方法，包括尋找高特異性的腫瘤抗原，對已有抗原進(jìn)行修飾，免疫佐劑的應(yīng)用及藥物載體的不斷改進(jìn)更新。本研究所在1980年代制備了一系列與胃癌組織有較高特異性(88％)的胃癌單克隆抗體-MG7抗體，抗原純化分析表明MG7-Ag的抗原成分是中性糖脂和糖蛋白，抗原決定簇位于糖鏈。已初步證實(shí)MG7-Ag可以誘導(dǎo)抗瘤免疫，但是大量提取純化碳水化合物抗原非常困難。申請人研究所的韓全利博士和徐立博士分別用噬菌體肽庫隨機(jī)技術(shù)進(jìn)行親和篩選，獲得了一系列MG7抗原模擬表位，抗體競爭結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)，該模擬表位多肽可以有效的模擬原始抗原，為胃癌疫苗的研究提供了侯選表位。
佐劑又稱免疫增強(qiáng)劑，種類很多，目前常用的有福氏佐劑、明礬和氫氧化鋁等，而這些都由于明顯的毒副作用被禁用于人體。CpG是最近得到廣泛研究的新型免疫佐劑，它是在細(xì)菌DNA中發(fā)現(xiàn)的含有非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤基序(cytidine-phosphate-guanosine CpG DNA)，天然的CpG DNA或人工合成的CpG寡核甘酸序列CpG ODN具有誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞增殖活化，能上調(diào)細(xì)胞表面分子可刺激抗原提成細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。它不僅是一種Th1型免疫佐劑，并且是一種安全性極高的可用于人體的新型免疫佐劑，目前已進(jìn)入一期臨床試驗(yàn)。當(dāng)它與抗原通過一定方式結(jié)合后，其免疫佐劑功能大大加強(qiáng)。與腫瘤抗原共同免疫顯示出有效的免疫佐劑效應(yīng)。并且其本身就可誘導(dǎo)有效的腫瘤特異性免疫反應(yīng)。
納米乳劑是一種液-液分散系統(tǒng)，粒徑一般在1-100nm，低粘度、各向同性的、熱力學(xué)穩(wěn)定的油水混合系統(tǒng)。它作為藥物載體具有極大的應(yīng)用潛力，主要有以下優(yōu)點(diǎn)①熱力學(xué)穩(wěn)定且可以過濾，易于制備和保存。②具有增溶作用，可同時(shí)增溶不同脂溶性的藥物，粘度低，注射時(shí)不會(huì)引起疼痛。③藥物分散性好，利于吸收，可提高藥物的生物利用度。④對易于水解的藥物起到保護(hù)作用，可延長藥物的釋藥時(shí)間。⑤具有靶向性，可根據(jù)納米粒徑的不同大小達(dá)到靶向給藥的目的。⑥可攜帶外源性的多肽通過內(nèi)化作用直接進(jìn)入細(xì)胞漿，通過交叉遞呈作用突破MHC限制。

發(fā)明內(nèi)容
腫瘤的生物治療是目前研究的熱點(diǎn)，而疫苗是腫瘤預(yù)防和治療的希望所在。本發(fā)明的目的在于提供一種可用于臨床的胃癌特異性納米疫苗的制備方法，并采用該方法制備的胃癌特異性納米疫苗用于探索腫瘤生物治療的新方法。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種胃癌特異性納米疫苗的制備方法，其特征在于，將人工合成的胃癌特異性抗原MG7模擬表位多肽和免疫佐劑CpGODN 1645，采用納米乳劑包封，獲得胃癌特異性納米疫苗；具體包括以下步驟在雙蒸水中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4％的司盤-80、土溫-80；混合均勻得到水相A；在另一加入雙蒸水的大試管中，先加入質(zhì)量份數(shù)為20％的大豆油，然后各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的胃癌特異性抗原MG7模擬表位多肽和免疫佐劑CpGODN，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4％的司盤-80，混合均勻，得到油相B；在3000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢柘?，將油相B逐滴加入到水相A中，滴加完畢后將混合物移至真空高速剪切乳化機(jī)上，在0.7Kpa真空下，23000轉(zhuǎn)/分，高速剪切40分鐘，2次；
剪切后室溫冷卻20分鐘，得到乳白色帶乳光液體，冰浴下超聲3分鐘后再用膜過濾、除菌后4℃保存，即得到20nm-30nm的胃癌特異性納米疫苗。
本發(fā)明將人工合成胃癌MG7-Ag的模擬表位多肽，用磁力超聲法將其與CpG共包封于納米乳劑中，通過透析純化，HPLC檢測其包封效率分別達(dá)72％和99％，透射電鏡觀察粒徑所研制的納米疫苗為球形或橢圓型，粒徑20-30nm，離心法檢測具有較好的穩(wěn)定性，6KD濾膜過濾除菌。用共包封納米疫苗免疫健康BALB/c小鼠，以空白納米疫苗和PBS作為對照，ELISA測定免疫小鼠血清中抗MG7抗體的效價(jià)顯著提高；ELISPOT法測定小鼠脾T細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)；腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)顯示疫苗對小鼠有一定保護(hù)作用；同時(shí)，對成瘤小鼠進(jìn)行免疫治療，抑瘤率達(dá)到82.5％。并經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有良好穩(wěn)定性和免疫效能，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。為胃癌的生物學(xué)治療打下了基礎(chǔ)。


圖1是本發(fā)明所用的胃癌特異性抗原MG7模擬表位多肽的氨基酸序列。
圖2是本發(fā)明所用的免疫佐劑CpG ODN 1645的核甘酸序列。
圖3是本發(fā)明研制的納米疫苗的透射電鏡照片(1×100000)。
圖4是本發(fā)明研制的納米疫苗用HPLC檢測包封率的高效液相結(jié)果，其中A為標(biāo)準(zhǔn)品，B為待測透析液。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
本發(fā)明選用胃癌高表達(dá)抗原MG7為靶點(diǎn)，結(jié)合新型免疫佐劑CpG，采用高科技納米技術(shù)將二者共同包封，成功地研制出人胃癌特異性納米疫苗，HPLC檢測顯示達(dá)到理想包封率，離心法證實(shí)具有較高穩(wěn)定性。動(dòng)物免疫后，運(yùn)用ELISA法檢測體液免疫，ELISPOT檢測細(xì)胞免疫，腫瘤攻擊試驗(yàn)檢測疫苗的腫瘤預(yù)防和治療作用。試驗(yàn)證實(shí)該納米疫苗可有效激發(fā)系統(tǒng)的免疫效能，具有良好的預(yù)防和治療效果。
1.技術(shù)方案及其路線1.1人胃癌特異性納米疫苗的研制1.1.1材料準(zhǔn)備胃癌特異性抗原MG7模擬表位多肽(圖1)由美國美聯(lián)(西安)生物科技有限公司合成并純化。免疫佐劑CpG ODN 1645(圖2)由美國賽百盛有限公司合成并作硫代修飾。司盤-80(span-80)、土溫-80(twen-80)、大豆油均購自美國Sigma公司。6KD透析膜購自華美生物工程公司。BALB/c小鼠，雌性，4周齡，體重15g-20g，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.2疫苗乳劑制備納米乳劑包封癌特異性抗原MG7模擬表位多肽和免疫佐劑CpG ODN制備納米疫苗2ml雙蒸水中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4％的twen-80和span-80，混合均勻得到水相A，另取一大試管中加入8.0ml雙蒸水，1.6ml大豆油，以及胃癌特異性抗原MG7模擬表位多肽、免疫佐劑CpG ODN各1.6mg，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4％的span-80，混合均勻，得到油相B。
在3000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢柘?，將油相B逐滴加入到水相A中，滴加完畢后將混合物移至真空高速剪切乳化機(jī)上，在0.7Kpa真空下，23000轉(zhuǎn)/分，高速剪切40分鐘，2次，室溫冷卻20分鐘，得到乳白色帶乳光液體，冰浴下超聲3分鐘后用0.22μm的膜過濾除菌后4℃保存，即得到20nm-30nm的胃癌特異性納米疫苗。
本發(fā)明的方法制備的胃癌特異性納米疫苗，可以同比放大生產(chǎn)。
1.2疫苗物理性能的檢測1.2.1包封效率的檢測取5ml制備好的MG7胃癌特異性納米疫苗，置于6KD透析膜(購自華美生物工程有限公司)中，4℃下去離子水透析48h，取透析液，同時(shí)配制濃度為5ug/ml的MG7標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)，在215nm處檢測吸收峰。以內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法，通過峰面積之比計(jì)算包封率，具體計(jì)算公式如下

包封效率以及藥物免疫用量如下表

1.2.2納米疫苗乳劑粒徑測定取適量MG7胃癌特異性納米疫苗分散于生理鹽水中，滴網(wǎng)染色，3％磷鎢酸負(fù)染，風(fēng)干后，透射電鏡觀察攝照。如下圖，所制備的納米疫苗為圓形或橢圓型微囊，粒徑范圍20nm-30nm，大小均勻(圖3)。
1.2.3納米疫苗穩(wěn)定性研究取制備好的納米疫苗2ml，4000rpm離心10min，或室溫靜置4個(gè)月，未見分層，重新透析，HPLC檢測透析液中無游離藥物漏出。
1.3疫苗體內(nèi)免疫效能檢測1.3.1 BLAB/c小鼠分組與免疫方案分組30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組MG7、CpG ODN共包封疫苗組[Nano(MG7+CpG)]，MG7、CpG ODN單獨(dú)包封組[Nano(MG7)+Nano(CpG)]，單獨(dú)包封MG7納米疫苗與游離CpG組[Nano(MG7)+CpG]，單獨(dú)包封MG7納米疫苗組，空白納米乳劑組[Nano(-)]，PBS組，每組5只，采用小鼠尾靜脈注射免疫，MG7納米乳劑1ml/只，每隔10天用同樣方法加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。
1.6血清抗MG7抗體效價(jià)的測定在每次免疫后10天采小鼠眶上靜脈血，將經(jīng)過證實(shí)表達(dá)有MG7抗原的艾氏腹水瘤細(xì)胞(本研究所保存)鋪于96孔板，以抗MG7-Ag抗體(本研究所保存)為陽性對照通過間接ELISA法測定血清抗MG7抗體效價(jià)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以無關(guān)抗體做陰性對照。共包封疫苗組的抗體效價(jià)明顯高于其余各組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明本發(fā)明可誘導(dǎo)有效的體液免疫反應(yīng)。
1.3.2 ELISPOT法檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞活性ELISPOT檢測試劑盒(購自法國Diaclone公司)。用100ul 70％酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋，4℃過夜。倒去液體，100ul PBS洗滌一次。每孔加入100ul 2％脫脂乳PBS，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時(shí)。在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。用100ul PBS洗滌一次。每孔加入50ul細(xì)胞懸浮液(1×106cells)(含10μg/ml MG7多肽)，37℃CO2孵育箱中孵育16小時(shí))。在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。于10ml PBS-1％BSA中稀釋100ul檢測抗體，每孔加100ul，37℃孵育2小時(shí)。倒去液體，100ul洗滌緩沖液洗3次。以10ml PBS-1％BSA稀釋10ul親和素堿性磷酸酶，每孔加入100ul，37℃孵育1小時(shí)。倒去液體，洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。每孔加入100ul BCIP/NBT。室溫下反應(yīng)25分鐘。完全顯色后，倒掉孔內(nèi)液體。用蒸餾水充分洗滌，吸水紙上輕拍，使膜干燥。將板倒置4℃下放置一夜，讀取點(diǎn)數(shù)。共包封納米疫苗組活性淋巴細(xì)胞數(shù)最多，為PBS對照組的8.4倍，空白納米乳劑組的6.2倍。說明本發(fā)明可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
1.3.3腫瘤攻擊試驗(yàn)檢測疫苗體內(nèi)腫瘤預(yù)防效能免疫5周后，取艾氏腹水瘤細(xì)胞接種健康小鼠，待腹水形成，取小鼠腹腔腹水100μL/只(約含艾氏腹水瘤細(xì)胞1×108)皮下接種進(jìn)行腫瘤攻擊試驗(yàn)。兩周后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出瘤體，稱重，比較各組小鼠成瘤情況。試驗(yàn)顯示共包封疫苗組有2只小鼠未見腫瘤形成，平均瘤體重量約為PBS對照組的1/8，空白乳劑組的1/5，效果明顯優(yōu)于其余各組。說明本發(fā)明對腫瘤具有很好的預(yù)防作用。
1.3.4疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療效能檢測將健康小鼠分為6組每組5只，小鼠腹腔腹水100μL/只(約含艾氏腹水瘤細(xì)胞1×108)皮下接種，2周后，腫瘤形成。按Nano(MG7+CpG)，Nano(MG7)+Nano(CpG)，Nano(MG7)+CpG，Nano(MG7)，Nano(-)以及PBS對荷瘤小鼠進(jìn)行疫苗治療，采用小鼠尾靜脈注射治療，藥物用量見表，每隔10天用同樣方法加強(qiáng)免疫一次，共治療3次。最后一次治療后兩周，頸椎脫臼法處死小鼠，取出瘤體，稱重，比較各組小鼠抑瘤率。結(jié)果顯示共包封組的腫瘤抑制率達(dá)82.5％，高于其他各組，而空白組僅為1.8％。說明本發(fā)明對腫瘤具有良好治療作用。
2.技術(shù)效果本發(fā)明采用胃癌特異性表面標(biāo)志物MG7模擬表位設(shè)計(jì)合成抗原多肽，實(shí)驗(yàn)證明可以較好的模擬MG7抗原性，由較高的胃癌特異性。將其用理化方法包封于納米顆粒之中，成功制備了胃癌特異性納米疫苗，取得較高的包封率，粒徑大小均勻，穩(wěn)定性好。免疫小鼠，經(jīng)ELISA法檢測體液免疫，ELISPOT法檢測細(xì)胞免疫。證實(shí)可誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，腫瘤攻擊試驗(yàn)顯示本發(fā)明對小鼠具有顯著腫瘤預(yù)防和治療作用。本疫苗的研制對胃癌的生物學(xué)治療具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。并且為多系統(tǒng)腫瘤治療提供了一種嶄新途徑。
另外，本發(fā)明經(jīng)申請人進(jìn)行的專利檢索后，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同的技術(shù)方法和產(chǎn)品，因此本發(fā)明具有惟一性和自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。
3.最佳實(shí)施方式3.1復(fù)合抗腫瘤疫苗的構(gòu)建3.1.1多聯(lián)的胃癌特異性疫苗的構(gòu)建應(yīng)用本發(fā)明中的納米疫苗的構(gòu)建方法，將多個(gè)不同的胃癌特異性抗原肽相連接，制備強(qiáng)效的胃癌特異性納米疫苗，增強(qiáng)疫苗的免疫治療效果。
3.1.2廣譜的消化道腫瘤疫苗的構(gòu)建用本發(fā)明中的納米疫苗的構(gòu)建方法，將多種消化系統(tǒng)腫瘤特異性抗原肽相連接，制備廣泛應(yīng)用于消化道腫瘤的疫苗。達(dá)到同時(shí)預(yù)防抑制胃癌和消化道其他腫瘤的目的。
3.1.3多肽、基因復(fù)合型納米疫苗的構(gòu)建將本發(fā)明中的多肽與可表達(dá)MG7抗原肽的基因載體，如質(zhì)?；蛳俨《据d體共包封于納米乳劑中，納米顆粒可將多肽類抗原和可表達(dá)抗原的基因類藥物共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞漿中，不僅可發(fā)揮多肽藥物快速高效的特點(diǎn)，還具有基因藥物的持久性，從而達(dá)到更好的免疫效果。
3.2靶向性腫瘤疫苗的構(gòu)建結(jié)合本發(fā)明中構(gòu)建的納米疫苗，在納米粒表面交聯(lián)特異性靶向分子，可起到靶向給藥的目的。
氨基酸序列MG7Lys Pro His Val His Thr Lys基因序列CpG 1645GCATGACGTTGAGCT
權(quán)利要求
1.一種胃癌特異性納米疫苗的制備方法，其特征在于，將人工合成的胃癌特異性抗原MG7模擬表位多肽和免疫佐劑CpG ODN 1645采用納米乳劑包封，獲得胃癌特異性納米疫苗；具體包括以下步驟1)在雙蒸水中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4％的司盤-80、土溫-80；混合均勻得到水相A；2)在另一加入雙蒸水的大試管中，先加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的大豆油，然后各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2％的胃癌特異性抗原MG7模擬表位多肽和免疫佐劑CpGODN，最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4％的司盤-80，混合均勻，得到油相B；3)在3000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢柘?，將油相B逐滴加入到水相A中，滴加完畢后將混合物移至真空高速剪切乳化機(jī)上，在0.7Kpa真空下，以23000轉(zhuǎn)/分剪切40分鐘，2次；4)剪切后室溫冷卻20分鐘，得到乳白色帶乳光液體，冰浴下超聲3分鐘后再用膜過濾、除菌后4℃保存，即得到20nm-30nm的胃癌特異性納米疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了胃癌特異性納米疫苗的制備方法。本發(fā)明利用生物性納米乳劑作為體內(nèi)藥物運(yùn)輸載體，以胃癌特異性多肽抗原MG7為免疫抗原，以含有CpG基序的寡核甘酸(CpG ODN)為免疫佐劑，采用磁力超聲法構(gòu)建共包封有MG7－Ag模擬表位多肽與CpG ODN的納米疫苗。經(jīng)高效液相色譜分析，電鏡觀察以及離心等方法鑒定表明所構(gòu)建的納米疫苗粒徑控制在20－30nm并具有較高的包封率和穩(wěn)定性。疫苗免疫接種后，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗MG7－Ag特異性抗體以及一定數(shù)量的特異性CTL分泌IFNγ，抗原－佐劑共包封組優(yōu)于單表位抗原單獨(dú)包封組和其他對照組。腫瘤攻擊后，共包封疫苗免疫組小鼠成瘤體積明顯小于對照組。這一基因疫苗在胃癌的免疫治療研究，胃癌特異性疫苗的研制方面將具有巨大的潛在價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1647821SQ20041007312
公開日2005年8月3日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者吳開春, 師瑞, 吳道澄, 寧小萱, 丁杰, 樊代明 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)