專利名稱：Hbv的rna干擾靶點(diǎn)序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及HBV序列上用于RNA干擾的9個(gè)靶點(diǎn)，以及將針對(duì)這些靶點(diǎn)的以各種方式獲得的siRNA用于制備治療乙型肝炎的新藥物。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎(hepatitis B，HB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的。HBV的感染不僅可以導(dǎo)致急、慢性病毒性肝炎和重型肝炎，而且還與肝硬化(livercirrhosis，LC)和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。20％的慢性乙型肝炎患者將發(fā)展成為肝硬化，HBV慢性感染的人罹患HCC的危險(xiǎn)性是正常人的100倍。全世界共有約3.5億人為HBsAg慢性攜帶者，其中3/4在亞洲。HBV感染導(dǎo)致全球每年50～120萬人死亡，其中死于HCC的約占32萬。我國(guó)是HBV感染的高發(fā)區(qū)，約60％的人群感染過HBV，10％的人群為HBsAg攜帶者，多達(dá)1.2億。現(xiàn)有乙型肝炎患者約為1200萬，年發(fā)病率為158/10萬。隨著HBV疫苗在1982年的問世，HBV感染率大大降低，抗病毒藥物的出現(xiàn)也使乙型肝炎的治療取得了一定的進(jìn)展。但是，乙型肝炎的現(xiàn)狀仍然不容樂觀，現(xiàn)有乙型肝炎患者及帶毒者數(shù)量龐大，面臨發(fā)展為肝硬化和肝癌的危險(xiǎn)，不幸的是，到目前為止，還沒有針對(duì)HBV的特效藥物。因此，乙型肝炎的治療至少在今后50年內(nèi)仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問題，尋找更有效的治療途徑是醫(yī)學(xué)研究的重大課題。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性的基因沉默(gene silencing)，1998年2月由華盛頓卡耐基研究院的Fire和馬薩諸賽大學(xué)癌癥中心的Mello首次在線蟲的研究中提出這一概念。繼而發(fā)現(xiàn)它與以前在植物中發(fā)現(xiàn)的co-suppress和在粗糙脈孢霉菌中發(fā)現(xiàn)的quelling現(xiàn)象有共同的分子基礎(chǔ)，都是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)機(jī)制的不同表現(xiàn)形式，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制。RNAi現(xiàn)象也存在于真菌、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等幾乎所有真核生物中，甚至在大腸桿菌中也存在類似RNAi的機(jī)制。
RNAi一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中最為活躍的熱點(diǎn)之一，對(duì)RNAi機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要來源于果蠅和線蟲的研究成果。目前認(rèn)為RNAi的主要過程為RNAi的誘導(dǎo)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被RNaseIII Dicer切割成為21-23nt的小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA的結(jié)構(gòu)特征是5′端單磷酸，3′端羥基，而且3′端有2～3-nt的堿基突出；siRNA與叫做RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的蛋白復(fù)合體結(jié)合，在復(fù)合體內(nèi)，siRNA被解鏈成為單鏈RNA；siRNA中的反義鏈(antisense strand)引導(dǎo)RISC找到目的mRNA，并且按堿基配對(duì)原則與之結(jié)合；RISC內(nèi)的RNA內(nèi)切核酸酶將靶mRNA切斷(切割位置在siRNA的中央，距離5′端10-nt)，從而抑制目的基因的表達(dá)。
RNAi能夠被迅速應(yīng)用于多種生物和功能的研究，得益于它的實(shí)驗(yàn)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，周期短，表型易于觀察。RNAi實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵的因素是干擾靶點(diǎn)的選擇和基因?qū)敕椒?。RNAi是在mRNA水平上發(fā)揮作用的，針對(duì)某一特定基因，并不是任意選擇一段序列都可以達(dá)到抑制效果，不同的靶點(diǎn)抑制效果差別很大，但至今沒有統(tǒng)一的確定最有效靶點(diǎn)的規(guī)則。根據(jù)siRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物學(xué)特性，也結(jié)合經(jīng)驗(yàn)，人們提出以下設(shè)計(jì)和合成siRNA應(yīng)遵循的原則①應(yīng)避免選擇5′和3′端UTR和起始密碼區(qū)；②應(yīng)根據(jù)目的基因的mRNA，選擇其AUG起始密碼子下游50～100nt區(qū)域處的編碼序列；③GC含量應(yīng)在30％～50％之間；④盡量避免3個(gè)同樣的核苷酸連續(xù)出現(xiàn)；⑤每條鏈的3′端要有2個(gè)堿基(最好是TT)突出；⑥最后，選擇的DNA片段經(jīng)BLAST查詢，應(yīng)與其它人類基因無同源性，以避免非特異性抑制。通常認(rèn)為按照以上原則在一個(gè)轉(zhuǎn)錄子上選擇3～5個(gè)干擾靶點(diǎn)，至少會(huì)有1個(gè)有效。但這些規(guī)則不是絕對(duì)的，靶點(diǎn)是否有效還要靠實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。目前有4種方法可以獲得siRNA化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、siRNA表達(dá)盒以及質(zhì)?；虿《据d體體內(nèi)表達(dá)。
作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達(dá)的工具，尤其是發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞也存在這一機(jī)制后，RNAi被廣泛用于基因功能的研究以及腫瘤和病毒性疾病的治療研究。本發(fā)明通過構(gòu)建小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體和化學(xué)合成siRNA，在HBV基因組上篩選到9個(gè)干擾靶序列，能有效抑制HBV的蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制，為RNAi用于乙型肝炎的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供針對(duì)HBV有效的RNAi作用靶點(diǎn)，利用這些靶點(diǎn)進(jìn)行RNAi作用，可明顯抑制HBV的蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制，并可以此制備治療乙型肝炎的藥物。
本發(fā)明獲得的針對(duì)HBV有效的RNAi作用靶點(diǎn)，來源于兩條途徑1.構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，插入靶序列，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，通過對(duì)HBV蛋白表達(dá)和DNA的檢測(cè)篩選有效的靶序列；2.化學(xué)合成siRNA，轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞，通過對(duì)HBV蛋白表達(dá)的檢測(cè)篩選有效的靶序列。
本發(fā)明提出的構(gòu)建shRNA表達(dá)載體的方法如下以129Sv/Ev小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出276bp的U6啟動(dòng)子序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pBluescript載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)插入序列的正確性。
本發(fā)明提出了構(gòu)建針對(duì)HBV的shRNA表達(dá)載體的方法合成包括靶序列的正義鏈、loop序列、反義鏈以及終止密碼在內(nèi)的寡核苷酸，克隆到shRNA表達(dá)載體pU6P內(nèi)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測(cè)序證實(shí)。
本發(fā)明提出了兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞的方法，一種是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，另一種是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用的是Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞后用嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)shRNA并持續(xù)抑制HBV蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制的細(xì)胞株。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株用ELISA方法檢測(cè)HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表達(dá)，并用Real-time PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清HBV DNA的含量。
本發(fā)明將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的方法是“hydrodynamic transfection”，即將質(zhì)粒溶解于PBS溶液，經(jīng)小鼠的尾靜脈快速(5秒鐘內(nèi))大量(小鼠體重的10％)地注入小鼠體內(nèi)。
本發(fā)明提出了合成siRNA選擇有效靶序列的依據(jù)①用RNA structure軟件預(yù)測(cè)HBV 4條mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇其中不形成發(fā)夾的片段，或者保證有十幾個(gè)堿基不形成發(fā)夾。②在其中挑選AA開頭的21個(gè)堿基，同時(shí)GC含量在30～50％(不少于7個(gè))，盡量避免GGG或CCC。③檢查序列的保守性，選擇保守性高的。④與人類基因組比對(duì)，確保無同源性(配對(duì)少于15個(gè)堿基)。用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞的方法篩選到4條有效抑制HBV蛋白表達(dá)的靶序列。


圖1針對(duì)HBV的干擾靶點(diǎn)位置和pU6-siHBV載體的構(gòu)建(圖1A)各靶點(diǎn)在HBV基因組及4條轉(zhuǎn)錄子上的位置。其中Core、S1、S2、S、X和Pol分別代表HBV的C、preS1、preS2、X和P基因。(圖1B)針對(duì)HBV的shRNA表達(dá)載體pU6-siHBV的構(gòu)建(以pU6-siHBV4為例)。(圖1C)表達(dá)載體pU6-siHBV4在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
圖2shRNA表達(dá)質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的影響圖3shRNA表達(dá)質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)2.2.15細(xì)胞HBeAg表達(dá)的影響圖4shRNA表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制的影響圖5pGK-siHBV載體構(gòu)建流程6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的HBsAg檢測(cè)圖7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的HBeAg檢測(cè)圖8Northern Blot檢測(cè)細(xì)胞mRNA水平的變化圖9穩(wěn)定株細(xì)胞上清HBV DNA的測(cè)定圖10質(zhì)粒注射前后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT的變化圖11質(zhì)粒注射前后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清AST的變化圖12質(zhì)粒注射前后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBsAg的檢測(cè)圖13化學(xué)合成的siRNA對(duì)2.2.15細(xì)胞HBsAg表達(dá)的影響圖14化學(xué)合成的siRNA對(duì)2.2.15細(xì)胞HBeAg表達(dá)的影響具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例一shRNA表達(dá)載體pU6P的構(gòu)建以129Sv/Ev小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出276bp的U6啟動(dòng)子序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pBluescript載體(Stratagene)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)插入序列的正確性。擴(kuò)增引物如下MU6p55′-GCgaattc(EcoRI)gcggccgc(NotI)(-276)ACAGACTTGTGGGAGAAGCT-3′MU6p35′-GGCtctaga(XbaI)g(+1)atatc(EcoRV)AAACAAGGCTTTTCTCCAAGG-3′實(shí)施例二pU6-siHBV載體的構(gòu)建從GenBank中搜索不同基因型HBV基因組序列(共23條)，用CLUSTERX軟件進(jìn)行比對(duì)，找出保守區(qū)段。根據(jù)siRNA靶點(diǎn)選擇的原則，以2.2.15細(xì)胞中HBV的序列為基準(zhǔn)(GenBank accession number U95551)，在保守區(qū)域選出21～24nt的序列作為候選靶點(diǎn)，再將這些序列與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確證與人類基因組沒有同源性，一共選擇了12條靶序列(表1，圖1A)。靶序列確定以后，根據(jù)載體構(gòu)建的要求，合成2條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈。每一條鏈包括目的序列的正義序列、loop序列(TTCAAGAGA)、目的序列的反義序列、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(TTTTT)以及XbaI酶切后的粘端序列。載體pU6P用EcoRV-XbaI雙酶切，膠回收，滅菌的去離子水溶解備用。合成的寡核苷酸鏈用滅菌的去離子水溶解，退火后與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，37℃培養(yǎng)過夜，挑克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，陽性克隆利用載體的T7和T3引物進(jìn)行測(cè)序，確證插入序列的正確性(圖1B，圖1C)。
測(cè)序引物T7 5′-CCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′T3 5′-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′實(shí)施例三shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV的瞬時(shí)抑制2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)在含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，RPMI 1640培養(yǎng)液含有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和氨芐青霉素100u/ml、鏈霉素100μg/ml以及200μg/ml的G418。根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇轉(zhuǎn)染參數(shù)，主要轉(zhuǎn)染步驟如下在轉(zhuǎn)染的前一天，消化和計(jì)數(shù)細(xì)胞，用含血清不含抗生素的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，鋪96孔板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，使細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率(confluency)達(dá)到40～50％；對(duì)于每一孔細(xì)胞，用25μl不含血清的opti-MEM稀釋240ng質(zhì)粒DNA；并稀釋1μl LF2000，室溫放置5min；將稀釋好的LF2000和質(zhì)粒DNA混在一起，輕輕混勻，室溫放置20min，使DNA和轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物；將DNA-LF2000復(fù)合物(50μl)加到每孔細(xì)胞里，輕輕混勻。37℃繼續(xù)孵育。
轉(zhuǎn)染后2、4、6、8天分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的蛋白。其中4、5、6、11、12號(hào)質(zhì)粒對(duì)HBsAg的抑制比較明顯，與空白對(duì)照pU6P相比，轉(zhuǎn)染后4天，抑制率最高的是pU6-siHBV5和pU6-siHBV11，分別達(dá)到72.8±5.4％(P＝0.00003)和68.0±11.1％(P＝0.0001)(圖2)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HBeAg的變化趨勢(shì)與HBsAg一致，只是抑制效率略有降低，而且pU6-siHBV6對(duì)HBeAg沒有明顯抑制。轉(zhuǎn)染后4天，pU6-siHBV5的抑制率最高為55.8±6.2％(P＝0.000026)，pU6-siHBV11、pU6-siHBV12和pU6-siHBV4也有不同程度的抑制。pU6-siGFP對(duì)HBeAg的表達(dá)沒有影響(P＝0.13)(圖3)。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間用Real-time PCR法測(cè)定培養(yǎng)上清HBV DNA的含量，結(jié)果表明HBV DNA自轉(zhuǎn)染后2天即有下降，6天時(shí)下降最明顯。與pU6P相比，pU6-siHBV11對(duì)HBV DNA的抑制約為1.9倍(P＝0.013)，pU6-siHBV4對(duì)HBV DNA的抑制約為1.8倍(P＝0.015)。pU6-siGFP對(duì)HBV DNA的含量沒有影響(P＝0.76)。說明pU6-siHBV的轉(zhuǎn)染能夠抑制2.2.15細(xì)胞HBV DNA的復(fù)制，且這種抑制有特異性(圖4)。
實(shí)施例四含有嘌呤霉素抗性基因的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建為構(gòu)建含有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，pU6-siHBV用NotI單切，將shRNA表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到帶有嘌呤霉素抗性基因的載體pGK-puro上。
將質(zhì)粒pU6-siHBV用NotI單切，膠回收約350bp的片斷。含有puromycin抗性基因的質(zhì)粒pGK-puro也用NotI單酶切，并進(jìn)行電泳膠回收。為防止載體自連，將膠回收產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化。DNA片斷和去磷酸化的載體進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，用NotI單切鑒定，命名為pGK-siHBV(圖5)。
實(shí)施例五shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV的穩(wěn)定抑制2.2.15細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1.8×105/ml，鋪24孔板，每孔500μl，細(xì)胞匯合度約80％；24小時(shí)后，轉(zhuǎn)染pGK-siHBV質(zhì)粒，每孔加質(zhì)粒DNA 1μg、LF2000 2μl；空白孔不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；24小時(shí)后，將細(xì)胞消化，用培養(yǎng)液稀釋10倍，重新鋪板(1孔變?yōu)?0孔)；再過30小時(shí)，將培養(yǎng)液換為含puromycin 3.0μg/ml的培養(yǎng)液；篩選后3天，空白對(duì)照孔大多數(shù)細(xì)胞死亡；實(shí)驗(yàn)孔存活細(xì)胞較多，換液；每3天換液，篩選后8天，對(duì)照孔細(xì)胞基本死光；篩選后16天，存活的細(xì)胞克隆已繁殖成為肉眼可見的一大團(tuán)，將每團(tuán)細(xì)胞小心地用10μl槍頭撿到96孔板的一孔(無需胰酶消化)。盡量吹散細(xì)胞，降低篩選液puromycin濃度為1.5μg/ml。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，酌情換液；2周后，取其上清做HBsAg檢測(cè)，篩選出細(xì)胞密度高、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而HBsAg吸光度極低(低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的20％)的孔；吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，加少量胰酶(約10μl)，培養(yǎng)箱內(nèi)放置5min，吸出胰酶，加入培養(yǎng)液，盡量將細(xì)胞吹散，分別移至24孔板；第二天，各孔細(xì)胞換液(怕有胰酶殘存)，以后視情況幾天換液一次；10天后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不一。再次取上清檢測(cè)HBsAg，篩選出細(xì)胞密度高、生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而HBsAg吸光度極低的孔；將孔內(nèi)的細(xì)胞消化，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2)擴(kuò)大培養(yǎng)；10天后，第3次進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選細(xì)胞生長(zhǎng)良好，吸光度低的細(xì)胞進(jìn)行換液、換瓶或傳代處理；細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，并凍存，命名為S11。2周和2月后分別進(jìn)行第4次和第5次ELISA檢測(cè)，穩(wěn)定抑制的細(xì)胞株予以保留，否則棄之。
pGK-siHBV11和pGK-U6P空載體轉(zhuǎn)染成功，前者得到8株細(xì)胞，命名為S11-1、S11-2、S11-3、S11-4、S11-5、S11-6、S11-8、S11-9；后者得到2株細(xì)胞，命名為Su6p-1和Su6p-2。
HBsAg的檢測(cè)結(jié)果表明，與2.2.15細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了空載體得到的穩(wěn)定株Su6p-1和Su6p-2 HBsAg的分泌沒有明顯變化，P值分別為0.23和0.37；而轉(zhuǎn)染pGK-siHBV11得到的穩(wěn)定株S11-1等8個(gè)細(xì)胞株HBsAg的抑制非常明顯，抑制率為93.8～96.1％(圖6)。按照ELISA檢測(cè)試劑盒的說明，8個(gè)細(xì)胞株的HBsAg均為陰性。
與此相似，Su6p-1和Su6p-2細(xì)胞株的HBeAg水平與2.2.15細(xì)胞沒有明顯區(qū)別，P值分別為0.43和0.36；其它8個(gè)細(xì)胞株的HBeAg均有明顯降低，為80.2～88.3％。S11-4的抑制率最高88.3％(P＝4.92E-12)，S11-5的抑制率最低80.2％(P＝2.5E-12)(圖7)。
提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行Northern Blot檢測(cè)，與2.2.15細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒的Su6p-2細(xì)胞3.5kb和2.4/2.1kb的mRNA均沒有明顯變化，而轉(zhuǎn)染了pGK-siHBV11的穩(wěn)定株細(xì)胞S11-4和S11-8mRNA明顯減少，尤其是2.4/2.1kb的mRNA幾乎檢測(cè)不到，說明shRNA在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達(dá)有效地切斷了相應(yīng)的mRNA(圖8)。
細(xì)胞培養(yǎng)上清HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果表明，與2.2.15細(xì)胞相比，穩(wěn)定株S11-4的HBVDNA降低了9.6倍(1.85E-07)；S11-5降低了12.5倍(7.81E-07)；S11-8降低了12.8倍(6.81E-07)。Su6p-2沒有明顯降低(P＝0.20)(圖9)。說明pGK-siHBV11轉(zhuǎn)染后得到的穩(wěn)定株細(xì)胞HBV的復(fù)制得到了持續(xù)的抑制。
實(shí)施例六HBV轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇7～8周齡雄性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，體重約20～25g。事先采血檢測(cè)HBsAg，選擇HBsAg吸光度相近的小鼠隨機(jī)分組，每組6只，重復(fù)3次。
質(zhì)粒注射采用hydrodynamic transfection方法小鼠用戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium，50mg/kg body weight)麻醉后，用27gauge(外部直徑0.41mm)注射針經(jīng)小鼠尾靜脈注射質(zhì)粒溶液(PBS溶解)。注射時(shí)間5秒；注射體積動(dòng)物體重的10％(2～2.5ml)；質(zhì)粒的量10μg/只。注射質(zhì)粒pU6-siHBV5、pU6-siHBV11和pU6-siGFP(陰性對(duì)照)。
質(zhì)粒注射后不同時(shí)間測(cè)定血清內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量，小鼠質(zhì)粒注射后血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST有一過性升高，注射后1天上升明顯，分別是注射前的15～30倍和4～6倍，3天后已基本恢復(fù)正常(圖10，11)。轉(zhuǎn)氨酶的暫時(shí)升高可能是由于大量液體的快速注射造成肝細(xì)胞通透性增高所致。
小鼠血清HBsAg檢測(cè)的結(jié)果表明(圖12)，血清HBsAg自注射后3天開始下降，一直持續(xù)到注射后2周。注射后5天下降最明顯，與pU6-siGFP組相比，pU6-siHBV5組降低了48.7±6.8％(P＝0.00056)，pU6-siHBV11組降低了56.7±5.7％(P＝0.00024)。
實(shí)施例七化學(xué)合成的siRNA對(duì)2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制根據(jù)siRNA靶點(diǎn)選擇的原則，在HBV基因組上選擇了4條序列(HV-1，HV-2，HV-3，HV-4)，分別針對(duì)S、C和P區(qū)。并同時(shí)合成了2條文獻(xiàn)報(bào)道的序列HC-1和HC-2作為陽性對(duì)照。
將合成的6條siRNA(包括2條陽性對(duì)照)經(jīng)處理后轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞，不加siRNA，只加轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine的孔(mock transfection)做空白對(duì)照。3天后檢測(cè)上清HBsAg和HBeAg，結(jié)果表明(圖13)，與空白對(duì)照相比，HV-1、HV-2和HC-2對(duì)HBsAg的抑制率分別為60.4±4.6％(P＝6E-11)、75.7±2.7％(P＝3.48E-13)和55.5±7.3％(P＝4.66E-09)，HV-2的抑制率高于陽性對(duì)照HC-2(P＝3.92E-05)；而HV-3、HV-4和HC-1對(duì)HBsAg的表達(dá)沒有抑制作用。
所有的6個(gè)siRNA對(duì)HBeAg的表達(dá)都有明顯的抑制，抑制率最高為68.2±1.8％(HC-2，P＝3.39E-10)，最低為52.2±8.8％(HV-1，P＝2.72E-07)，各序列之間抑制率的差別不大(圖14)。
所選擇的4條序列均能有效抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)，有效率為100％。
表1 HBV RNAi靶點(diǎn)序列

表2合成siRNA序列

權(quán)利要求
1.HBV的RNA干擾靶點(diǎn)序列5′-GATCCATACTGCGGAACTCCT-3′或5′-GATCCTGCGCGGGACGTCCTT-3′或5′-GATTCCTAGGACCCCTTCTCG-3′或5′-GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT-3′或5′-GCACTTCGCTTCACCTCTGCACGT-3′或5′-AATCACTCACCAACCTCCTGT-3′或5′-AACAATACCTGAACCTTTACC-3′或5′-AAACTACTGTTGTTAGACGAC-3′或5′-AAGAATTTGGAGCTACTGTGG-3′。
2.針對(duì)權(quán)利要求1所述的HBV的RNA干擾靶點(diǎn)序列獲得的siRNA。
3.權(quán)利要求1所述的靶點(diǎn)序列在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的siRNA在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及9個(gè)針對(duì)HBV進(jìn)行RNA干擾的靶點(diǎn)，以及依據(jù)這些靶序列制備乙型肝炎藥物的應(yīng)用。本發(fā)明通過shRNA表達(dá)質(zhì)粒以及化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞及動(dòng)物的方法篩選了HBV基因組上16個(gè)RNA干擾的靶點(diǎn)，其中的9個(gè)靶點(diǎn)能夠在細(xì)胞水平明顯抑制HBV蛋白質(zhì)的表達(dá)(序列見表1和表2)。11號(hào)靶點(diǎn)還能穩(wěn)定抑制細(xì)胞內(nèi)HBV蛋白質(zhì)的表達(dá)和病毒復(fù)制，并能抑制HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)。依據(jù)這些靶序列可以制備治療乙型肝炎的藥物。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1667120SQ200410077788
公開日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者徐安龍, 任向榮, 周玲君, 羅廣彬, 謝珍慧, 林斌, 董美玲 申請(qǐng)人:中山大學(xué)