專利名稱：羅漢松屬萃取物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羅漢松屬(Podocarpus spp.)萃取物及其制造方法，特別涉及含有雙黃酮類(Biflavonoid)化合物的羅漢松屬萃取物及其制造方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，同時(shí)更是人體和外界接觸的第一道防線。皮膚具有多種功能，其中最主要就是保護(hù)人體，可以防止病菌的侵入，并防止體內(nèi)水分的過(guò)度散失。而且皮膚中含有黑色素，黑色素呈褐色至黑色。當(dāng)皮膚曝于日光中，會(huì)使黑色素的顏色加深且量亦增加，可以防止紫外線透入體內(nèi)。此外，皮膚也有排泄、調(diào)節(jié)體溫、感覺(jué)等的功能。
皮膚老化是必經(jīng)的過(guò)程，老化的皮膚會(huì)產(chǎn)生各種組織形態(tài)與生理功能的變化，例如皮膚萎縮、松弛、失去彈性和光澤、產(chǎn)生皺紋、色素變化、皮膚傷口愈合能力及免疫力降低等。除了因增齡而造成的內(nèi)因性老化之外，皮膚尚受到環(huán)境諸多不利的影響，而加速或提前老化。這些外因性老化的原因例如，長(zhǎng)期暴露于陽(yáng)光或高能量放射線下、飲食不干凈、組織受損、微生物感染、生活壓力過(guò)大、疲勞過(guò)度、或過(guò)多的油脂攝取等，也會(huì)增加自由基及黑色素的產(chǎn)生或是代謝因子喪失。過(guò)量的自由基累積于皮膚中，會(huì)造成表皮、真皮結(jié)締組織中的DNA受到破壞、脂質(zhì)過(guò)氧化(Lipid Peroxidation)以及各種膠原蛋白質(zhì)變性，使得結(jié)締組織失去原有功能，而產(chǎn)生皮膚老化的現(xiàn)象，例如皺紋(Wrinkle)、失去彈性(Loss of Tone)以及干燥等。近年來(lái)，很多研究報(bào)告指出反應(yīng)性氧族(ROS)不但能直接破壞組織間隙的膠原蛋白，還能讓基質(zhì)蛋白酶組織抑制物(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases；TIMPs)去活性化，誘使另一類與皮膚老化相關(guān)的酵素，即基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases；MMPs)活化與表現(xiàn)。
基質(zhì)金屬蛋白酶涵蓋了一整個(gè)大家族，大部分功用都是切除細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix)的蛋白質(zhì)，至今已被發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶至少有26種，它們都具有很多結(jié)構(gòu)上的共同點(diǎn)，例如具有鋅離子的結(jié)構(gòu)及某些相同序列的勝肽鏈?；|(zhì)金屬蛋白酶可細(xì)分為幾個(gè)次家族，包括膠原蛋白酶(Collagenases；MMP-1、MMP-8與MMP-13)、明膠水解酶(Gelatinases；MMP-2與MMP-9)、基質(zhì)溶酶(Stromelysins；MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11與MMP-12)、以及膜形基質(zhì)金屬活化蛋白酶(Membrane-Type MMP；MMP-14、MMP-15、MMP-16與MMP-17)等。一般而言，基質(zhì)金屬蛋白酶在正常、健康或休止的組織中幾乎都不被表現(xiàn)出來(lái)，或是維持在非常微量的狀態(tài)。但當(dāng)細(xì)胞或組織處于修復(fù)(Repair)或重組(Remodeling)的狀態(tài)時(shí)，例如遭逢組織受傷、發(fā)炎反應(yīng)、皮膚日曬、或各類疾病及癌細(xì)胞等，各類型的基質(zhì)金屬蛋白酶就會(huì)被大量的分泌出來(lái)。舉例而言，在傷口愈合過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表現(xiàn)相當(dāng)重要，正常的角皮細(xì)胞(Keratinocytes)在與第一類膠原蛋白(CollagenType I)接觸的時(shí)候，會(huì)誘導(dǎo)MMP-1(Collagenase)表現(xiàn)，同時(shí)在細(xì)胞激素的參與下，基質(zhì)金屬蛋白酶-1表現(xiàn)量會(huì)更加顯著。另外，在紫外線照射的照射下，人類皮膚纖維母細(xì)胞(Fibroblasts)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Gelatinase)活性會(huì)明顯的增加；而在慢性暴露紫外線照射下，則可刺激膠原蛋白的合成，并增加MMP的表現(xiàn)。
在正常情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶切除結(jié)締組織，有利于傷口的修復(fù)以及組織的重組，且基質(zhì)金屬蛋白酶活性之平衡系由存在于組織中之基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制分子(TIMPs)所調(diào)節(jié)。然而，當(dāng)皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶分泌不正常時(shí)，反而會(huì)造成結(jié)締組織的損害。舉例而言，在光老化(Photoageing)現(xiàn)象中，皮膚受到陽(yáng)光中能量最高且波長(zhǎng)介于320nm至400nm之間的UVA(Ultraviolet A)、以及能量次之且波長(zhǎng)介于280nm至320nm之間的UVB(Ultraviolet B)曝曬后，一方面皮膚結(jié)締組織中的DNA吸收光子后引起結(jié)構(gòu)上的改變而失去作用，另一方面表皮上一些光敏感性物質(zhì)(Photosensitizer)，諸如反式尿刊酸(Trans-Urocanic Acid)吸收光子后會(huì)進(jìn)一步和氧分子反應(yīng)，而形成例如單旋氧(Singlet Oxygen)、超氧陰離子自由基(Superoxide AnionRadical)等反應(yīng)性氧族。反應(yīng)性氧族會(huì)進(jìn)一步破壞組織結(jié)構(gòu)，也會(huì)去活化基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制分子(Tissue Inhibitors of MMP；TIMPs)，使得皮膚基質(zhì)金屬蛋白酶分泌不正常，而引起結(jié)締組織異常的損害。
許多報(bào)告顯示皺紋形成之重要原因是由于皮膚彈性降低，并伴隨彈性纖維(Elastic Fiber)之降解或彎曲所造成。除了上述照射UV會(huì)引起皺紋之外，皮膚彈性降低是因彈性纖維水解酶(Elastase)降解(Degeneration)彈性纖維，而皮膚之纖維母細(xì)胞中之彈性纖維水解酶在降解或彎曲彈性纖維中最為重要。
此外，紫外線亦能誘導(dǎo)皮膚組織中的黑色素(Melanin)的產(chǎn)生。黑色素為一種含氮的化合物，依其結(jié)構(gòu)的不同，可分為褐色、黑色的真黑色素(Eumelanin)和黃色、紅色的嗜鉻黑色素(Pheomelanin)。黑色素大多集中位于皮膚基底層(Basal Layer)的黑色素細(xì)胞(Melanocyte)內(nèi)，此兩種黑色素的比例、分布位置的差異、黑色素細(xì)胞活性大小以及各種外界環(huán)境的刺激，造就了個(gè)體乃至于人種膚色上的差異。黑色素在對(duì)抗紫外光扮演了很重要的角色，能吸收、散射紫外光，保護(hù)人體不受其能量的傷害。然而黑色素的不正常制造，如長(zhǎng)期曝曬陽(yáng)光、黑皮病(Melasma)、雀斑和老人斑等黑色素沉積的病癥，亦帶來(lái)不少困擾。
近年來(lái)的研究朝向于從植物中取得天然成分，以有效解決皮膚老化各種問(wèn)題。舉例而言，蘆薈(Aloe vera Webb.)中的Aloesine及Gvae grsi中的熊果素(Arbutin)具有很好的抑制酪氨酸酶活性并且兩者合用具有協(xié)同效果。番紅花(Crocus sativus L.)的山奈酚(Kaempferol)、苦參(Sophoraflavescens Ait.)中的苦參素(Kurarinone)、人參(Panax ginseng C.A.Meyer)中的p-香豆酸(p-Coumaric Acid)以及Pulsatilla cernua植物中分離的3，4-二羥基肉桂酸(3，4-Dihydroxycinnamic Acid)及4-羥基-3-甲氧基肉桂酸(4-Hydroxy-3-Methoxycinnamic Acid)都具有不錯(cuò)的酪氨酸酶抑制活性。仙草(Mesona procumdens Hemsl)對(duì)于清除α，α-二苯基-β-苦基肼基(α，α-Disphenyl-β-Picryl-Hydrazyl；DPPH)自由基以及超氧自由基有很好的活性。番石榴(Psidium guajava L.)果實(shí)具有不錯(cuò)的DPPH清除活性。朝鮮薊(Cynaa scolymus L.)也有不錯(cuò)的清除DPPH自由基活性。烘培過(guò)后的各種咖啡豆(Coffea spp.)有不錯(cuò)的抗氧化活性。馬尾藻(Sargassumsiliquastrum)萃取物對(duì)酯質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)及清除超氧自由基也有很好的效果。在相思樹(shù)(Acacia confuse Merr.)的心材中，也發(fā)現(xiàn)有保護(hù)脂質(zhì)過(guò)氧化、清除氫氧自由基及超氧自由基的化合物。
綜上所述，皮膚內(nèi)因性老化雖不能避免的，所幸皮膚的外因性老化倒是可以預(yù)防、避免、甚至治療的。因此，企需提出一種能清除反應(yīng)性氧族活性、抑制酪氨酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的物質(zhì)，以期能延緩甚至避免皮膚組織受到破壞，減少皮膚的皺紋、缺乏彈性、干燥、色素表現(xiàn)異常(Dyspigmentation)等老化以及紫外線傷害所造成的光老化現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一就是在提供一種羅漢松屬(Podocarpus spp.)萃取物，其系至少一雙黃酮類(Biflavonoid)化合物且萃取自于有機(jī)溶液。由于本發(fā)明之羅漢松屬萃取物具有抗皮膚老化、皮膚美白以及皮膚抗皺之功效，因此可作為活性成分以添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中。
本發(fā)明的另一目的是在提供一種羅漢松屬萃取物的制造方法，其系利用有機(jī)溶液以及凝膠層析(Gel Chromatography)法萃取羅漢松屬植物之葉片，藉以獲得羅漢松屬萃取物，其中此羅漢松屬萃取物為至少一雙黃酮類化合物。由于本發(fā)明之羅漢松屬萃取物具有抗皮膚老化(清除氫氧自由基、清除超氧自由基)、皮膚美白(抑制酪氨酸酶活性)以及皮膚抗皺(抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性)之功效，因此可作為活性成分以添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中。
根據(jù)本發(fā)明之上述目的，提出一種羅漢松屬萃取物，此羅漢松屬萃取物為至少一雙黃酮類化合物且利用有機(jī)溶液萃取而得，其中此雙黃酮類化合物之結(jié)構(gòu)式如下式(I)之所示 其中R1基之結(jié)構(gòu)式系如式(II)或式(III)之所示 依照本發(fā)明一較佳實(shí)施例，上述R2基可例如為甲氧基(H3CO-)或烴基(HO-)。
依照本發(fā)明一較佳實(shí)施例，上述有機(jī)溶液可例如為甲醇、水或其上述之任意組合。
依照本發(fā)明一較佳實(shí)施例，上述羅漢松屬萃取物系萃取自羅漢松屬植物之葉片，而羅漢松屬植物可包括但不限于大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實(shí)百日青(Podocarpus nakaii Hayata)或叢花百日青(Podocarpus fasciculus deLaubenfels)。
依照本發(fā)明一較佳實(shí)施例，上述羅漢松屬萃取物具有清除氫氧自由基、清除超氧自由基、抑制酪氨酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性之功效，因此可作為活性成分以添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中。
根據(jù)本發(fā)明之上述目的，另提出一種羅漢松屬萃取物的制造方法。首先，進(jìn)行萃取過(guò)濾步驟，其系利用有機(jī)溶液萃取并過(guò)濾含有羅漢松屬植物之葉片的有機(jī)溶液，以獲得粗萃取物。接著，利用第一有機(jī)溶劑對(duì)上述粗萃取物進(jìn)行部份劃分(Partitioning)步驟，以獲得第一有機(jī)溶劑層萃取物以及水層萃取物。然后，進(jìn)行第一分離步驟，其系將上述第一有機(jī)溶劑層萃取物通過(guò)第一層析管柱并以第二有機(jī)溶劑沖提后，收集第二有機(jī)溶劑萃取物。之后，進(jìn)行第二分離步驟，其系將第二有機(jī)溶劑萃取物至少通過(guò)逆相層析管柱，以獲得羅漢松屬萃取物，其中上述羅漢松屬萃取物為上述式(I)之所示之至少一雙黃酮類化合物。由于上述之雙黃酮類化合物之結(jié)構(gòu)式(I)以及羅漢松屬植物等之較佳態(tài)樣已悉如前述，故不另贅述。
應(yīng)用本發(fā)明的羅漢松屬萃取物的制造方法，其系利用有機(jī)溶劑以及凝膠層析法萃取羅漢松屬之葉片，藉以獲得羅漢松屬萃取物，其中此羅漢松屬萃取物為至少一雙黃酮類化合物，且具有抗皮膚老化(清除氫氧自由基、清除超氧自由基)、皮膚美白(抑制酪氨酸酶活性)以及皮膚抗皺(抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性)之功效，因此可作為活性成分以添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明系揭露一種羅漢松屬萃取物及其制造方法，其系利用有機(jī)溶液以及凝膠層析法萃取羅漢松屬植物之葉片，藉以獲得含有雙黃酮類化合物之羅漢松屬萃取物。以下配合第1圖藉此詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的羅漢松屬萃取物及其制造方法。
羅漢松屬植物系屬于常綠喬木，在臺(tái)灣，羅漢松屬植物廣布于中低海拔地區(qū)，而此屬的植物常做為造林用樹(shù)種。本發(fā)明所指之羅漢松屬(Podocarpus sp.)植物一般可包括但不限于大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實(shí)百日青(Podocarpus nakaiiHayata)或叢花百日青(Podocarpus fasciculus de Laubenfels)。上述適用于制造羅漢松屬萃取物之物種，均可運(yùn)用于本發(fā)明中，然而本發(fā)明系以大葉羅漢松為較佳實(shí)施例，來(lái)闡明本發(fā)明所揭露的羅漢松屬萃取物的制造方法。
請(qǐng)參閱第1圖，其系繪示根據(jù)本發(fā)明一較佳實(shí)施例之羅漢松屬萃取物之制程流程圖。首先，如步驟101之所示，進(jìn)行萃取過(guò)濾步驟101，其系利用有機(jī)溶液萃取并過(guò)濾羅漢松屬植物之葉片，以獲得濾液。上述之有機(jī)溶液一般可例如甲醇、水或其上述之任意組合，然以80體積百分比之甲醇溶液為較佳。進(jìn)一步而言，在萃取過(guò)濾步驟101中，其系利用粉碎裝置，例如粉碎機(jī)，在室溫或略低于室溫之溫度下，打碎羅漢松屬葉片后，將打碎之葉片浸于上述有機(jī)溶液中。接著，進(jìn)行至少一次過(guò)濾步驟，其系利用過(guò)濾裝置，例如紗布、濾紙、棉花、具有預(yù)定篩孔大小之濾網(wǎng)或其上述之任意組合，過(guò)濾上述含有粉碎葉片之有機(jī)溶液，以獲得濾液。然后，去除濾液中之有機(jī)溶液，以獲得粗萃取物102。上述適用于去除濾液中之有機(jī)溶液的方法一般可包括但不限于減壓濃縮、冷凍干燥處理(Lyophilization)、低溫噴霧干燥處理(Spray-Drying)或低溫蒸發(fā)處理(Evaporation)，然以減壓濃縮為較佳。
之后，利用第一有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯(Ethyl Acetate)，對(duì)上述粗萃取物102進(jìn)行部份劃分(Partitioning)步驟103，以獲得第一有機(jī)溶劑層萃取物105以及水層萃取物106。然后，進(jìn)行第一分離步驟107，其系將上述第一有機(jī)溶劑層萃取物105利用凝膠層析法，而得到羅漢松屬萃取物。
進(jìn)一步而言，在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中，第一分離步驟107系將上述第一有機(jī)溶劑層萃取物105通過(guò)第一層析管柱109并以第二有機(jī)溶劑沖提后，收集第二有機(jī)溶劑萃取物111。在第一分離步驟107中適用之凝膠材質(zhì)一般可包括但不限于聚葡聚醣(Polydextran；其商品名為Sephadex)、聚丙醯烯胺(Polyacrylamide；其商品名為Bio Gel P)、瓊脂醣(Agarose；其商品名為Separose)或聚丙醯烯胺與瓊脂醣之交聯(lián)物等，然而第一層析管柱以Sephadex LH-20層析管柱為較佳，而第二有機(jī)溶劑以甲醇為較佳。
接下來(lái)，如步驟113之所示，進(jìn)行第二分離步驟113，其系將上述第一分離步驟107所得之第二有機(jī)溶劑萃取物111通過(guò)高效率液向?qū)游?High PerformanceLiquid Chromatography；HPLC)儀之逆相層析管柱117，其中逆相層析管柱117以Biosil 5 Octadecyl Silane(ODS)-W逆相層析管柱為較佳，以獲得羅漢松屬萃取物119。在本發(fā)明的另一個(gè)例子中，上述第一分離步驟107之第二有機(jī)溶劑萃取物111更可先通過(guò)第二層析管柱115后，再通過(guò)逆相層析管柱117，其中第二層析管柱115適用之凝膠材質(zhì)一般可包括但不限于聚葡聚醣(Sephadex)、聚丙醯烯胺(Bio Gel P)、瓊脂醣(Separose)或聚丙醯烯胺與瓊脂醣之交聯(lián)物等，然以MCI凝膠層析管柱或Sephadex LH-20層析管柱為較佳。
上述所得之羅漢松屬萃取物119為至少一雙黃酮類化合物，且此雙黃酮類化合物之結(jié)構(gòu)式如下式(I)之所示 其中R1基之結(jié)構(gòu)式可例如式(II)或式(III)之所示
，其中式(II)以及式(III)之R2基以甲氧基(H3CO-)或烴基(HO-)為較佳。
本發(fā)明之羅漢松屬萃取物經(jīng)過(guò)一系列測(cè)試后，發(fā)現(xiàn)更具有清除氫氧自由基、清除超氧自由基、抑制酪氨酸酶活性以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性之功效，因此可作為活性成分與皮膚外用劑合并使用。本發(fā)明之皮膚外用劑通常系指化妝品或醫(yī)藥品中之外用成分。當(dāng)本發(fā)明之羅漢松屬萃取物與皮膚外用劑合并使用時(shí)，適用之皮膚外用劑一般可包括但不限于其它美白劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、接口活性劑、增稠劑、色料、皮膚營(yíng)養(yǎng)劑等。
本發(fā)明之羅漢松屬萃取物應(yīng)用于皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品時(shí)，亦可搭配其它已知美白作用劑及/或其它活性成分，諸如維生素C、熊果素、曲酸、懈皮酮(Quercetin)與兒茶素(Catechin)等酪胺酸酵素抑制劑、抗痘劑、抗菌劑、鎮(zhèn)痛劑、麻醉劑、抗皮膚發(fā)炎劑、止癢劑、抗發(fā)炎劑、抗過(guò)角化劑(Antihyperkeratolytic Agents)、抗干皮膚劑(Anti-Dry Skin Agents)、抗汗劑(Antipsoriatic Agents)、抗老化劑、抗皺劑(Antiwrinkle Agents)、抗皮脂溢出劑(Antiseborrheic Agents)、美黑劑(Self-TanningAgents)、傷口治療劑(Wound-Healing Agents)、皮質(zhì)類固醇(Corticosteroids)或激素(Hormones)等等。
此外，當(dāng)本發(fā)明之羅漢松屬萃取物應(yīng)用于皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品時(shí)，此化妝品或醫(yī)藥品之配方更至少包含佐劑及其它成分。佐劑一般可包括但不限于親水性或疏水性之膠凝劑(Gelling Agent)、親水性或疏水性之活性劑(Active Agent)、保存劑(Preserving Agent)、抗氧化劑(Antioxidant)、溶劑、香料(Fragrance)、填料(filler)、遮蔽劑(Screening Agent)、螯合劑(Chelating Agents)、氣味吸收劑(Odor Absorbers)以及染料。其它成分一般可包括但不限于乳糖與葡萄糖之醣類，諸如葡聚糖、纖維素、硅酸鹽與碳酸鈣之賦形劑，則諸如纖維素、淀粉、明膠、醣類之黏結(jié)劑，以及諸如瓊脂粉末、明膠粉末、藻酸鈉、纖維素衍生物以及碳酸鈣之崩解劑來(lái)一起形成于所需的化妝品或醫(yī)藥品之配方中。至于上述佐劑及其它成分之用量為此技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者所熟知，在此不另贅述。
再者，當(dāng)本發(fā)明之羅漢松屬萃取物應(yīng)用于皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品時(shí)，其形式一般可包括但不限于水性溶液、水-醇溶液或油性溶液、呈水包油型(Oil-In-Water)或油包水型(Water-In-Oil)或復(fù)合型之乳劑(Emulsions)、水性或油性凝膠、乳霜(Cream)、油膏(Ointment)、乳(Milk)、乳液(Lotion)、乳漿(Sserum)、軟膏(Paste)、泡沫(Foam)或分散液(Dispersion)等。
除了上述形式之外，本發(fā)明之羅漢松屬萃取物應(yīng)用于皮膚用化妝品時(shí)，其形式更可例如化妝水(Tonic Water)、唇彩(Lip Colors)、粉底(Foundations)、膚乳(Milk)、面霜(Cream)、面膜(Masks)、凝膠(Gel)、氣霧(Aerosol)、乳狀的乳液(Milky Lotions)、慕斯(Mousse)、分散液(Dispersions)、乳霜(Cream)、衛(wèi)浴用水液(Toilet Waters)、貼布(Packs)與清潔劑(Cleansings)，以及卸妝用的清潔乳、洗面皂(Wash Soap)等。
以下利用數(shù)個(gè)實(shí)施例并配合第2圖至第14圖，藉此更詳盡闡述本發(fā)明之羅漢松屬萃取物及其制造方法，然其并非用以限定本發(fā)明，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視后附之申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。
實(shí)施例一請(qǐng)參閱第2圖，其系繪示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物之制程流程圖。首先，進(jìn)行萃取步驟201，其系利用粉碎機(jī)，在室溫或略低于室溫之溫度下，打碎約8公斤之大葉羅漢松葉片后，將打碎之葉片浸于80體積百分比之甲醇溶液中。接著，進(jìn)行過(guò)濾步驟203，其系利用紗布以及濾紙，過(guò)濾上述含有粉碎葉片之80％甲醇溶液，重復(fù)三次后，以獲得濾液。然后，利用減壓濃縮法去除甲醇溶液后，獲得大葉羅漢松之粗萃取物204。
之后，利用乙酸乙酯對(duì)上述粗萃取物204進(jìn)行部份劃分步驟205，以獲得乙酸乙酯層萃取物207以及水層萃取物209。然后，進(jìn)行第一分離步驟211，其系將上述乙酸乙酯層萃取物205利用凝膠層析法，而得到大葉羅漢松之萃取物。
進(jìn)一步而言，第一分離步驟211系將上述乙酸乙酯層萃取物207通過(guò)第一層析管柱213，例如Sephadex LH-20層析管柱，并以100體積百分比之甲醇沖提后，收集甲醇萃取物214。此甲醇萃取物214經(jīng)薄層層析片分析后，分成第一部分215、第二部分217以及第三部份219。其中第一部分215可進(jìn)行第二分離步驟225，即先通過(guò)第二層析管柱231，例如MCI凝膠層析管柱，再通過(guò)逆相層析管柱233后，可得到大葉羅漢松之第一萃取物241。
實(shí)施例二實(shí)施例二系參照實(shí)施例一之方式進(jìn)行萃取過(guò)濾步驟201、過(guò)濾步驟203、部份劃分步驟205后，即進(jìn)行第一分離步驟211，如第2圖之所示。進(jìn)一步而言，實(shí)施例二之第一分離步驟211系將上述乙酸乙酯層萃取物207通過(guò)第一層析管柱213，例如Sephadex LH-20層析管柱，并以100體積百分比之甲醇沖提后，收集甲醇萃取物214。如實(shí)施例一之所述，其中甲醇萃取物214之第二部分217可進(jìn)行第二分離步驟225，即通過(guò)上述之逆相層析管柱233后，可得到大葉羅漢松之第二萃取物243。
實(shí)施例三實(shí)施例三亦參照實(shí)施例一之方式進(jìn)行萃取過(guò)濾步驟201、過(guò)濾步驟203、部份劃分步驟205后，即進(jìn)行第一分離步驟211，如第2圖之所示。進(jìn)一步而言，實(shí)施例三之第一分離步驟211系將上述乙酸乙酯層萃取物207通過(guò)第一層析管柱213，例如Sephadex LH-20層析管柱，并以100體積百分比之甲醇沖提后，收集甲醇萃取物214。如實(shí)施例一之所述，其中甲醇萃取物214之第三部份219可進(jìn)行第二分離步驟225，即通過(guò)第二層析管柱231，例如Sephadex LH-20層析管柱，先分成第四部分221及第五部分223后，再分別將第四部分221及第五部分223通過(guò)逆相層析管柱233，可分別得到大葉羅漢松之第三萃取物245以及第四萃取物247。
實(shí)施例四將實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第一萃取物，利用1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜等，進(jìn)行萃取物之結(jié)構(gòu)分析。
實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第一萃取物外觀為淺黃色粉末，與10體積百分比之稀硫酸一起加熱反應(yīng)后呈黃色，與氯化鐵反應(yīng)后呈深藍(lán)色。另在UV光譜(圖未繪示)中270nm(log∈2.5)以及370nm(log∈2.5)有最大吸收峰，又在IR光譜(圖未繪示)中3339cm-1有OH基的吸收峰，1725cm-1和1649cm-1有酮基的吸收峰，又另于質(zhì)譜(ESI-MS)(圖未繪示)測(cè)定其偽分子離子峰在m/z 583[M+H]+，故推測(cè)其分子式為C33H26O10。請(qǐng)參閱第3圖以及第4圖，其系分別顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第一萃取物之1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜。在第3圖以及第4圖中，可以很明顯觀察到兩組典型黃酮類的訊號(hào)。在第3圖中，第一組黃酮類的訊號(hào)包括δ5.80(1H，d，J＝2.1 Hz)和δ5.81(1H，d，J＝2.1Hz)位于黃酮類骨架的A環(huán)呈間位偶合的H6及H8位置，訊號(hào)δ7.47(1H，d，J＝2.3Hz)、δ7.20(1H，d，J＝8.6Hz)和δ7.58(1H，dd，J＝2.3，8.6Hz)這組三個(gè)氫分別是黃酮類骨架B環(huán)上呈現(xiàn)ABX type偶合的H2′、H5′及H6′位置，δ2.72(1H，m)和δ3.15(1H，m)則是位于C環(huán)上H3位置的兩個(gè)氫，δ5.54(1H，dd，J＝2.7，12.5Hz)是位于H2位置的氫。在第4圖中的δ195.5則推定是C環(huán)上C4位置接有酮基的訊號(hào)。另外，由異核多鍵關(guān)聯(lián)(Heteronuclear Multiple BandCorrelation；HMBC)分析(圖未繪示)得知，δ12.16(1H，s)是位于A環(huán)上C5位置OH基的訊號(hào)，由于和C4位置的酮基形成氫鍵而往低磁場(chǎng)處移動(dòng)。
請(qǐng)?jiān)賲㈤喌?圖，第二組黃酮類的訊號(hào)包括δ6.63(1H，s)位于黃酮類骨架A環(huán)上H6”位置，訊號(hào)δ7.63(2H，d，J＝8.7Hz)、δ6.97(2H，d，J＝8.7Hz)分別是B環(huán)上互呈鄰位偶合的H2，H6及H3，H5，訊號(hào)δ6.92(1H，s)位于C環(huán)上H3″位置。第4圖中的δ182.4推定是C環(huán)上C4″接有酮基的訊號(hào)，配合HMBC(圖未繪示)得知δ13.17(1H，s)則是C5″位置OH基的訊號(hào)。
綜合以上數(shù)據(jù)，推定實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之萃取物為雙黃酮類的黃烷酮(Flavanone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)，如式(IV)所示。又，經(jīng)由HMBC(圖未繪示)得知這兩組黃酮結(jié)構(gòu)是由第一組黃酮C環(huán)上δ120.3(C3’)與第二組黃酮A環(huán)上的δ105.4(C8″)相連，另外δ56.4、δ55.6和δ55.5有OCH3的訊號(hào)，經(jīng)由HMBC(圖未繪示)確定是在C7、C4′及C4的位置有OCH3取代基。
透過(guò)以上的分析，并配合相關(guān)文獻(xiàn)的比對(duì)，證實(shí)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第一萃取物為2，3-二氫金松雙黃酮(2，3-Dihydrosciadopitysin)，即如式(IV)所示 實(shí)施例五將實(shí)施例二所得之大葉羅漢松之第二萃取物，利用1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜等，進(jìn)行萃取物之結(jié)構(gòu)分析。
實(shí)施例二所得之大葉羅漢松之第二萃取物外觀呈淺黃色粉末，與10體積百分比之稀硫酸一起加熱反應(yīng)后呈黃色，和氯化鐵反應(yīng)呈深藍(lán)色。另在UV光譜(圖未繪示)中267nm(log∈3.0)和365nm(log∈3.2)有最大吸收峰，又在IR光譜(圖未繪示)中3330cm-1有OH基的吸收峰，1648cm-1有酮基的吸收峰，又另于質(zhì)譜(ESI-MS)(圖未繪示)測(cè)定其偽分子離子峰在m/z 581[M+H]+，故推測(cè)其分子式為C33H24O10。請(qǐng)參閱第5圖以及第6圖，其系分別顯示根據(jù)實(shí)施例二所得之大葉羅漢松之第二萃取物之1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜。在第5圖以及第6圖中，可以很明顯觀察到有兩組典型黃酮類的訊號(hào)。在第5圖中，第一組黃酮類的訊號(hào)包括δ6.35(1H，d，J＝2.2Hz)和δ6.79(1H，d，J＝2.2Hz)位于黃酮類骨架的A環(huán)呈間位偶合的H6及H8位置，訊號(hào)δ8.07(1H，d，J＝2.4Hz)、δ7.36(1H，d，J＝8.9Hz)及δ8.22(1H，dd，J＝2.4，8.9Hz)這組三個(gè)氫分別是黃酮類骨架B環(huán)上呈現(xiàn)ABX type偶合的H2′、H5′及H6′位置，δ7.00(1H，s)則是位于C環(huán)上H3位置。在第6圖中的δ182.0則推定是C環(huán)上C4位置接有酮基的訊號(hào)，由HMBC(圖未繪示)得知，δ12.90(1H，s)是位于A環(huán)上C5位置OH基的訊號(hào)，由于和C4位置的酮基形成氫鍵而往低磁場(chǎng)處移動(dòng)。
請(qǐng)?jiān)賲㈤喌?圖，第二組黃酮類的訊號(hào)包括6.40(1H，s)位于黃酮類骨架A環(huán)上H6″位置，訊號(hào)δ7.58(2H，d，J＝9.0Hz)、δ6.92(2H，d，J＝9.0Hz)分別是B環(huán)上互呈鄰位偶合的H2，H6及H3，H5，訊號(hào)δ6.89(1H，s)位于C環(huán)上H3″位置。第6圖中的δ182.1推定是C環(huán)上C4″接有酮基的訊號(hào)，配合HMBC(圖未繪示)得知δ13.04(1H，s)則是C5″位置OH基的訊號(hào)。
綜合以上數(shù)據(jù)，推定實(shí)施例二所得之大葉羅漢松之第二萃取物為雙黃酮類的黃酮(Flavone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)，如式(V)所示。又，經(jīng)由HMBC(圖未繪示)得知這兩組黃酮結(jié)構(gòu)是由第一組黃酮C環(huán)上δ122.8(C3′)與第二組黃酮A環(huán)上的δ103.6(C8″)相連，另外δ55.5、δ55.9和δ56.1有OCH3的訊號(hào)，經(jīng)由HMBC(圖未繪示)確定是在C4、C4′和C7的位置有OCH3取代基。
透過(guò)以上的分析，并配合相關(guān)文獻(xiàn)的比對(duì)，證實(shí)實(shí)施例二所得之大葉羅漢松之第二萃取物為金松雙黃酮(Sciadopitysin)，即如式(V)所示
實(shí)施例六將實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第三萃取物，利用1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜等，進(jìn)行萃取物之結(jié)構(gòu)分析。
實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第三萃取物外觀呈淺黃色粉末，與10體積百分比之稀硫酸一起加熱反應(yīng)后呈黃色，和氯化鐵反應(yīng)呈深藍(lán)色。另在UV光譜(圖未繪示)中265nm(log∈2.5)和370nm(log∈2.5)有最大吸收峰，又在IR光譜(圖未繪示)中1640cm-1有酮基的吸收峰，又另于質(zhì)譜(FAB-MS)(圖未繪示)測(cè)定其偽分子離子峰在m/z 569[M+H]+，故推測(cè)其分子式為C32H24O10。請(qǐng)參閱第7圖以及第8圖，其系分別顯示根據(jù)實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第三萃取物之1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜。在第7圖以及第8圖中，可以很明顯觀察到有兩組典型黃酮類的訊號(hào)。在第7圖中，第一組黃酮類的訊號(hào)包括δ5.94(1H，br s)和δ5.97(1H，br s)位于黃酮類骨架的A環(huán)呈間位偶合的H6及H8位置，訊號(hào)δ7.62(1H，d，J＝1.6Hz)、δ7.23(1H，d，J＝8.4Hz)和δ7.65(1H，dd，J＝1.6，8.4Hz)這組三個(gè)氫分別是黃酮類骨架B環(huán)上呈現(xiàn)ABX type偶合的H2′、H5′及H6′位置，δ2.81(1H，m)和δ3.27(1H，m)則是位于C環(huán)上H3位置的兩個(gè)氫，δ5.57(1H，dd，J＝2.6，12.8Hz)是位于H2位置的氫。在第8圖中的δ196.9則推定是C環(huán)上C4位置接有酮基的訊號(hào)，由HMBC(圖未繪示)得知，δ12.16(1H，s)是位于A環(huán)上C5位置OH基的訊號(hào)，由于和C4位置的酮基形成氫鍵而往低磁場(chǎng)處移動(dòng)。
請(qǐng)?jiān)賲㈤喌?圖，第二組黃酮類的訊號(hào)包括δ6.41(1H，s)位于黃酮類骨架A環(huán)上H6″位置，訊號(hào)δ7.67(2H，d，J＝8.7Hz)、δ6.98(2H，d，J＝8.7Hz)分別是B環(huán)上互呈鄰位偶合的H2，H6及H3，H5，訊號(hào)δ6.67(1H，s)位于C環(huán)上H3″位置，13C-NMR光譜中的δ183.3推定是C環(huán)上C4″接有酮基的訊號(hào)，配合HMBC(圖未繪示)得知δ13.08(1H，s)則是C5″位置OH基的訊號(hào)。
綜合以上數(shù)據(jù)，推定實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第三萃取物為雙黃酮類的黃烷酮(Flavanone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)，如式(VI)所示。又經(jīng)由HMBC(圖未繪示)得知這兩組黃酮結(jié)構(gòu)是由第一組黃酮C環(huán)上δ121.8(C3’)與第二組黃酮A環(huán)上的δ105.7(C8″)相連，另外δ56.0和δ55.9有OCH3的訊號(hào)，經(jīng)由HMBC(圖未繪示)確定是在C4′及C4的位置有OCH3取代基。
透過(guò)以上的分析，并配合相關(guān)文獻(xiàn)的比對(duì)，證實(shí)實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第三萃取物與第一萃取物的結(jié)構(gòu)十分類似，差別在于第三萃取物第7位為OH基。由于實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第三萃取物并未見(jiàn)于其它文獻(xiàn)之中，為一個(gè)新化合物，其結(jié)構(gòu)命名為2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮(2，3-Dihydro-4′，4-Dimethoxyamentoflavone)，即如式(VI)所示 實(shí)施例七將實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第四萃取物，利用1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜等，進(jìn)行萃取物之結(jié)構(gòu)分析。
實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第四萃取物外觀為淺黃色粉末，與10體積百分比之稀硫酸一起加熱反應(yīng)后呈黃色，和氯化鐵反應(yīng)呈深藍(lán)色。另在UV光譜(圖未繪示)中265nm(log∈3.0)和370nm(log∈2.8)有最大吸收峰，又在IR光譜中1651cm-1有酮基的吸收峰，又另于質(zhì)譜(FAB-MS)測(cè)定其偽分子離子峰在m/z 567[M+H]+，故推測(cè)其分子式為C32H22O10。請(qǐng)參閱第9圖以及第10圖，其系分別顯示根據(jù)實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第四萃取物之1H-NMR光譜以及13C-NMR光譜。在第9圖以及第10圖中，可以很明顯觀察到有兩組典型黃酮類的訊號(hào)。在第9圖中，第一組黃酮類的訊號(hào)包括δ6.22(1H，br s)和δ6.52(1H，br s)位于黃酮類骨架的A環(huán)呈間位偶合的H6及H8位置，訊號(hào)δ8.12(1H，br s)、δ7.32(1H，d，J＝9.0Hz)和δ8.09(1H，d，J＝9.0Hz)這組三個(gè)氫分別是黃酮類骨架B環(huán)上的H2′、H5′及H6′位置，δ6.70(1H，s)則是位于C環(huán)上H3位置。在第10圖中的δ182.9則推定是C環(huán)上C4位置接有酮基的訊號(hào)，由HMBC(圖未繪示)得知，δ12.94(1H，s)是位于A環(huán)上C5位置OH基的訊號(hào)，由于和C4位置的酮基形成氫鍵而往低磁場(chǎng)處移動(dòng)。
請(qǐng)?jiān)賲㈤喌?圖，第二組黃酮類的訊號(hào)包括δ6.43(1H，s)位于黃酮類骨架A環(huán)上H6″位置，訊號(hào)δ7.63(2H，d，J＝8.8Hz)、δ6.91(2H，d，J＝8.8Hz)分別是B環(huán)上互呈鄰位偶合的H2，H6及H3，H5，訊號(hào)δ6.65(1H，s)位于C環(huán)上H3″位置。第10圖中的δ183.2推定是C環(huán)上C4″接有酮基的訊號(hào)，配合HMBC(圖未繪示)得知δ13.08(1H，s)則是C5″位置OH基的訊號(hào)。
綜合以上數(shù)據(jù)，推定實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第四萃取物為雙黃酮類的黃酮(Flavone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)，如式(VII)所示。又經(jīng)由HMBC(圖未繪示)得知這兩組黃酮結(jié)構(gòu)是由第一組黃酮C環(huán)上δ122.9(C3′)與第二組黃酮A環(huán)上的δ104.9(C8″)相連，另外δ55.9和δ56.3有OCH3的訊號(hào)，經(jīng)由HMBC確定是在C4及C4′的位置有OCH3取代基。
透過(guò)以上的分析，并配合相關(guān)文獻(xiàn)的比對(duì)，證實(shí)實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第四萃取物與第二萃取物的結(jié)構(gòu)十分類似，差別在于第四萃取物少了第7位置OCH3取代基，為異銀杏黃素(Isoginkgetin)，即如式(VII)所示
實(shí)施例八將實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物以及正對(duì)照組(水溶性維他命E；Trolox)分別配制成不同的濃度(0.3μg/ml至15.0μg/mL)，進(jìn)行氫氧自由基之清除測(cè)試。
首先，樣品溶液200μL加入A試劑400μL，其中A試劑含2.8mM之2-去氧-D-核醣(2-Deoxy-D-Ribose)80μl、20mM磷酸緩沖液(Phosphate Buffer，pH 7.4)120μL、100μM氯化鐵(FeCl3)80μL、780μM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid；EDTA)80μL、100μM抗壞血酸(AscorbicAcid)20μL、以及1mM過(guò)氧化氫(H2O2)20μL，混合均勻后，于37℃恒溫反應(yīng)1小時(shí)。接著，混合液中再加入800μL之硫巴比妥酸(ThiobarbituricAcid；TBA)/三氯醋酸(Trichloroacetic Acid；TCA)溶液[即0.5％硫巴比妥酸溶于10％三氯醋酸中]，在水浴100℃下加熱15分鐘。待反應(yīng)完成后，以分光光度計(jì)(波長(zhǎng)532nm)測(cè)定混合液之吸光值，并依下式(VIII)計(jì)算各萃取物的氫氧自由基之清除率，而所得之結(jié)果如第1表以及第11圖之所示。
第1表

由第1表以及第11圖之結(jié)果得知，實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物對(duì)于清除氫氧自由基之濃度與抑制率皆成正相關(guān)。
人體內(nèi)的反應(yīng)性氧族(ROS)，如超氧自由基(·O2-)和過(guò)氧化氫(H2O2)在具有金屬離子的環(huán)境下能被轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈叨然钚缘臍溲踝杂苫?·OH)，對(duì)人體組織會(huì)造成最直接的傷害。實(shí)施例八系以Fenton反應(yīng)，利用Fe2+與過(guò)氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生氫氧自由基。由第1表以及第11圖之結(jié)果得知，四種大葉羅漢松之萃取物中，金松雙黃酮以及異銀杏黃素的IC50很接近，其原因可能源自于具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，皆為黃酮(Flavone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)。同理可證，2，3-二氫金松雙黃酮以及2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮的IC50也是很接近，推測(cè)也是由于化學(xué)結(jié)構(gòu)之相似度，兩者皆為黃烷酮(Flavanone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)。不過(guò)在第1表以及第11圖之結(jié)果中，黃酮(Favone)-黃酮(Flavone)的活性系高于黃烷酮(Flavanone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例九將實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物以及正對(duì)照組(水溶性維他命E；Trolox)分別配制成不同的濃度(2.5μg/ml到125.0μg/mL)，進(jìn)行超氧自由基之清除測(cè)試。
首先，依序加入樣品溶液200μL、630μM硝基藍(lán)四唑(NitroblueTetrazolium；NBT)200μL、33μM吩嗪硫酸甲酯(Phenazine Methosulfate；PMS)200μL、以及156μM β-煙堿醯胺腺嘌呤還原態(tài)(β-NicotinamideAdenine Dinucleotide Reduced Form；β-NADH)200μL，混合均勻后，隨即于560nm測(cè)其一分鐘內(nèi)吸光值之變化(ΔA560nm)，并依下式(IX)計(jì)算各萃取物的超氧自由基之清除率，而所得之結(jié)果如第2表以及第12圖之所示。

第2表

由第2表以及第12圖之結(jié)果得知，除了金松雙黃酮在濃度100μg/mL下沒(méi)有抑制活性外，其余大葉羅漢松之萃取物的抑制率皆與濃度成正相關(guān)。
超氧自由基(·O2-)亦是屬于反應(yīng)性氧族(ROS)之一。實(shí)施例九利用吩嗪硫酸甲酯(Phenazine Methosulfate；PMS)和β-煙堿醯胺腺嘌呤還原態(tài)(β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide Reduced Form；β-NADH)反應(yīng)形成超氧自由基，和硝基藍(lán)四唑(Nitroblue Tetrazolium；NBT)呈色的變化來(lái)測(cè)量對(duì)氫氧自由基的清除能力。在實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物中，以2，3-二氫金松雙黃酮以及2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮之活性較佳，其次為異銀杏黃素，而金松雙黃酮在100μg/ml不具有活性。2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮以及2，3-二氫金松雙黃酮屬于黃烷酮(Flavanone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)，異銀杏黃素以及金松雙黃酮屬于黃酮(Flavone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)。相較于上述兩組雙黃酮類結(jié)構(gòu)，在2、3位置為單鍵的黃烷酮(Favanone)-黃酮(Flavone)結(jié)構(gòu)對(duì)于超氧自由基的抑制作用高于黃酮(Flavone)-黃酮(Flavone)類的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例十將實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物以及正對(duì)照組(熊果素；Arbutin)分別配制成不同的濃度(2μg/ml至30μg/mL)，于96格微量盤(96-Well Microtiter Plate)中進(jìn)行酪氨酸酶之抑制活性測(cè)試。
首先，在每格中加入反應(yīng)液，其中反應(yīng)液含0.4M HEPES緩沖溶液(pH 6.8)140μL、400u/ml酪氨酸酶20μL以及測(cè)試樣品20μL，并以不含酪氨酸酶為空白對(duì)照組，混合均勻靜置10分鐘。接著，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)第一次吸光值。然后，加入2.5mM左旋酪胺酸(L-Tyrosine)20μL，混合均勻后靜置20分鐘。之后，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)第二次吸光值。以兩次吸光值的差異并依下式(X)計(jì)算各萃取物之抑制率
其中式(X)中下標(biāo)的A代表不含樣品但含有酪氨酸酶之吸光值，下標(biāo)的B代表不含樣品且無(wú)酪氨酸酶之吸光值，下標(biāo)的C代表含樣品且有酪氨酸酶之吸光值，而下標(biāo)的D代表含樣品但無(wú)酪氨酸酶之吸光值，而所得之結(jié)果則如第3表以及第13圖之所示。
第3表


由第3表以及第13圖之結(jié)果得知，所有大葉羅漢松之萃取物對(duì)于抑制酪氨酸酶都與濃度成正相關(guān)。
人體內(nèi)酪氨酸酶扮演黑色素生合成過(guò)程中重要的角色，催化酪胺酸生合成黑色素中間數(shù)個(gè)重要的步驟。實(shí)施例十系以酪氨酸酶催化酪胺酸形成黑色素，藉此比較各大葉羅漢松之萃取物抑制此反應(yīng)的能力。由第1表以及第11圖之結(jié)果得知，2，3-二氫金松雙黃酮以及2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮之活性較佳，其次為金松雙黃酮以及異銀杏黃素。相較于實(shí)施例九之超氧自由基抑制作用的結(jié)果，本發(fā)明大葉羅漢松之萃取物對(duì)于酪氨酸酶抑制作用的結(jié)果與實(shí)施例九之結(jié)果相似。
實(shí)施例十一將實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之粗萃取物、水層萃取物、乙酸乙酯層萃取物以及第一萃取物至第四萃取物，連同兒茶素與槲皮酮，分別以100μg/mL之濃度添加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)細(xì)胞密度約1×105/孔之人類皮膚纖維母細(xì)胞(ATCC CRL-1502)于24孔盤中培養(yǎng)2天后，換成無(wú)血清之培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)一天，然后取上清液進(jìn)行酪蛋白/明膠酶譜(Casein/Gelatin Zymography)之分析。
由于酶譜系用來(lái)分析基質(zhì)金屬蛋白酶之活性，其中基質(zhì)金屬蛋白酶-1與基質(zhì)金屬蛋白酶-9系分別以酪蛋白與明膠為受質(zhì)(Substrate)?；|(zhì)金屬蛋白酶-1以及基質(zhì)金屬蛋白酶-9會(huì)作用于前述受質(zhì)上并將之切成大小不等之片段，在藉由后續(xù)凝膠電泳分析中，藉由觀察上述片段之產(chǎn)生，而得知基質(zhì)金屬蛋白酶之活性。
接下來(lái)，以大葉羅漢松之萃取物經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后之上清液進(jìn)行酪蛋白/明膠酶譜之分析。制作凝膠時(shí)，首先制備含最終濃度1.0mg/ml之酪蛋白或明膠的約10％硫酸十二酯鈉-聚丙烯胺凝膠(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide GelElectrophoresis；SDS-PAGE)為分離膠體(Separating Gel)，并于其上覆蓋約4％SDS-PAGE之焦集膠體(Stacking Gel)后，然后將樣品混合液與5倍濃縮染劑[溴酚藍(lán)(Bromophenol Blue)與甘油混合溶液]以1∶4之體積比均勻混合，在室溫下靜置10分鐘。之后，取20μL至30μL加入至含酪蛋白或明膠之電泳膠片中，以200V電壓進(jìn)行電泳分析約1.5小時(shí)。上述各凝膠的配制已為此技術(shù)領(lǐng)域中任何具有通常知識(shí)者所熟知，故不另贅述。待染劑移動(dòng)到凝膠底部邊緣后，取出膠片，依序以清洗緩沖液1(Washing Buffer 1；含2.5％Triton X-100以及3mM NaN3)、清洗緩沖液2(含2.5％TritonX-100、3mM NaN3以及50mM Tris Cl，pH 7.5)、清洗緩沖液3(含1μMZnCl2、3mM NaN3、5mM CaCl2以及50mM Tris Cl，pH 7.5)以及清洗緩沖液4(含3mM NaN3、5mM CaCl2、1μM ZnCl2以及50mM Tris Cl，pH 7.5)，在室溫?fù)u晃沖洗各20分鐘后，再以新鮮的清洗緩沖液4在37℃培養(yǎng)1至24小時(shí)。接著，以另一染劑(Commassie Brilliant Blue)染色約30分鐘后，利用去染色溶液將膠片脫色后即可分析，而所得之結(jié)果則如第14A圖以及第14B圖之所示。
就保護(hù)皮膚觀點(diǎn)而言，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1及/或基質(zhì)金屬蛋白酶-9會(huì)有皮膚抗皺的效果，目前已知維生素A酸(Retinoic Acid)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制分子-1(TIMP-1)等具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1的效用。請(qǐng)參閱第14A圖，其系顯示本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性之酪蛋白酶譜分析結(jié)果，由左至右依序分別為蛋白質(zhì)標(biāo)記(即第1行)、大葉羅漢松之粗萃取物(即第2行)、水層萃取物(即第3行)、乙酸乙酯層萃取物(即第4行)、加入兒茶素之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第5行)、加入檞皮酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第6行)、加入2，3-二氫金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第7行)、加入金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第8行)、加入2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第9行)以及加入異銀杏黃素之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第10行)之凝膠電泳分析結(jié)果。上述兒茶素以及槲皮酮可經(jīng)由大葉羅漢松之水層萃取物進(jìn)一步分離而得，而大葉羅漢松之第一萃取物至第四萃取物系經(jīng)由大葉羅漢松之乙酸乙酯層萃取物進(jìn)一步分離而得。由于基質(zhì)金屬蛋白酶-1會(huì)分解酪蛋白，因此被分解的酪蛋白就無(wú)法經(jīng)由另一染劑(Commassie Brilliant Blue)染色，經(jīng)脫色后于箭頭所指約52kDa處的基質(zhì)金屬蛋白酶-1會(huì)呈現(xiàn)透明帶狀，而當(dāng)待測(cè)物越能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性時(shí)，透明帶狀則越不明顯。因此由第14A圖得知，大葉羅漢松之粗萃取物、乙酸乙酯層萃取物、2，3-二氫金松雙黃酮、2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮以及異銀杏黃素對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶-1均有很顯著的抑制效果。在本發(fā)明之四種萃取物中，2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮以及異銀杏黃素之抑制活性又比2，3-二氫金松雙黃酮以及金松雙黃酮還要好，而這四種萃取物之間的差異在于2，3-二氫金松雙黃酮以及金松雙黃酮這組比2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮以及異銀杏黃素少了第7位置上的甲氧基，因此推測(cè)對(duì)雙黃酮類而言，第7位置的甲氧基可能會(huì)影響對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶-1的抑制活性。
接下來(lái)，請(qǐng)參閱第14B圖，其系顯示本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性之明膠酶譜分析結(jié)果，由左至右依序分別為蛋白質(zhì)標(biāo)記(即第1行)、大葉羅漢松之粗萃取物(即第2行)、水層萃取物(即第3行)、乙酸乙酯層萃取物(即第4行)、加入兒茶素之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第5行)、加入檞皮酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第6行)、加入2，3-二氫金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第7行)、加入金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第8行)、加入2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第9行)以及加入異銀杏黃素之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第10行)之凝膠電泳分析結(jié)果。由于基質(zhì)金屬蛋白酶-9會(huì)分解明膠，因此被分解的明膠就無(wú)法經(jīng)由另一染劑(Commassie Brilliant Blue)染色，經(jīng)脫色后于箭頭所指約92kDa處的基質(zhì)金屬蛋白酶-9會(huì)呈現(xiàn)透明帶狀，而當(dāng)待測(cè)物越能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性時(shí)，透明帶狀則越不明顯。因此由第14B圖得知，大葉羅漢松之粗萃取物、乙酸乙酯層萃取物、2，3-二氫金松雙黃酮、2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮以及異銀杏黃素對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶-9均有很顯著的抑制效果。在本發(fā)明之四種萃取物中，2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮以及異銀杏黃素之抑制活性又比2，3-二氫金松雙黃酮以及金松雙黃酮還要好。
實(shí)施例十二將實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第一萃取物至第二萃取物連同兒茶素與檞皮酮，分別以100μg/mL之濃度添加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)細(xì)胞密度約1×105/孔之人類皮膚纖維母細(xì)胞(ATCC CRL-1502)于24孔盤培養(yǎng)2天后，換成無(wú)血清之培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)一天，然后取上清液進(jìn)一步進(jìn)行酪蛋白/明膠酶譜之分析，其步驟如實(shí)施例十一之所述。
請(qǐng)參閱第15A圖，其系顯示本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性之酪蛋白酶譜分析結(jié)果，箭頭所指約52kDa處為基質(zhì)金屬蛋白酶-1，而由左至右依序分別為蛋白質(zhì)標(biāo)記(即第1行)、大葉羅漢松之粗萃取物(即第2行)、加入兒茶素之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第3行)、加入檞皮酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第4行)、加入2，3-二氫金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第5行)以及加入金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第6行)之凝膠電泳分析結(jié)果。由第15A圖得知，兒茶素、檞皮酮以及金松雙黃酮對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶-1均有顯著的抑制效果，然以金松雙黃酮之抑制效果較為顯著。
請(qǐng)參閱第15B圖，其系顯示本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之萃取物抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性之明膠酶譜分析結(jié)果，箭頭所指約92kDa處為基質(zhì)金屬蛋白酶-9，而由左至右依序分別為蛋白質(zhì)標(biāo)記(即第1行)、大葉羅漢松之粗萃取物(即第2行)、加入兒茶素之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第3行)、加入檞皮酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第4行)、加入2，3-二氫金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第5行)以及加入金松雙黃酮之基質(zhì)金屬蛋白酶-1(即第6行)之凝膠電泳分析結(jié)果。由第15B圖得知，兒茶素、檞皮酮、2，3-二氫金松雙黃酮以及金松雙黃酮對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶-9均有很顯著的抑制效果。
實(shí)施例十三將實(shí)施例一至實(shí)施例三所得之大葉羅漢松之第一萃取物至第四萃取物連同兒茶素與檞皮酮，分別配制成100μg/mL或50μg/mL之濃度，進(jìn)一步進(jìn)行彈性蛋白水解酶之抑制活性測(cè)試。
首先，在96孔盤中分別加入50μL之樣品、1X反應(yīng)緩沖液(Raction Buffer)作為負(fù)對(duì)照組(Negative Control)，或以0.01mM之N-甲氧基丁二醯-丙胺酸-丙胺酸-脯胺酸-纈胺酸-氯甲基酮(N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-Chloromethyl Ketone)作為正對(duì)照組(Positive Control)。之后加入50μL之100μg/mL DQ彈性蛋白，其最終濃度為25μg/mL。加入100μL彈性蛋白水解酶(0.5U/mL)，使其最終濃度為0.25U/mL。在室溫反應(yīng)2小時(shí)后，以激發(fā)波長(zhǎng)485nm及發(fā)散波長(zhǎng)520nm測(cè)螢光強(qiáng)度(FLUO StarOptima；BMG Labtechnologies)，并依下式(XI)計(jì)算各萃取物之彈性蛋白水解酶之抑制率，而所得結(jié)果如第4表以及第5表之所示抑制率(％)＝(樣品之螢光強(qiáng)度-負(fù)對(duì)照組之螢光強(qiáng)度)/負(fù)對(duì)照組之螢光強(qiáng)度×100％(XI)
第4表

第5表

第4表以及第5表之結(jié)果顯示，大葉羅漢松之粗萃取物、乙酸乙酯層萃取物、水層萃取物、兒茶素、檞皮酮、2，3-二氫金松雙黃酮、金松雙黃酮、2，3-二氫-4′，４-二甲氧基穗花杉雙黃酮以及異銀杏黃素對(duì)于彈性蛋白水解酶均有很顯著的抑制效果，然以2，3-二氫-4′，4-二甲氧基穗花杉雙黃酮對(duì)于彈性蛋白水解酶之抑制較果較為顯著。
由上述數(shù)個(gè)實(shí)施例可知，應(yīng)用本發(fā)明之羅漢松屬萃取物，其優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明之羅漢松屬萃取物為至少一雙黃酮類化合物且利用有機(jī)溶液萃取而得。由于此雙黃酮類化合物具有抗皮膚老化、皮膚美白以及皮膚抗皺之功效，因此可作為活性成分以添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中。
由上述本發(fā)明較佳實(shí)施例可知，應(yīng)用本發(fā)明之羅漢松屬萃取物的制造方法，其優(yōu)點(diǎn)在于利用有機(jī)溶液以及凝膠層析法萃取羅漢松屬植物之葉片，藉以獲得含有至少一雙黃酮類化合物之羅漢松屬萃取物。由于本發(fā)明之羅漢松屬萃取物具有抗皮膚老化(清除氫氧自由基、清除超氧自由基)、皮膚美白(抑制酪氨酸酶活性)以及皮膚抗皺(抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性)之功效，因此可作為活性成分以添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中。
雖然本發(fā)明已以數(shù)個(gè)較佳實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，此技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種之更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視后附之申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。


第1圖系繪示根據(jù)本發(fā)明之一較佳實(shí)施例之羅漢松屬萃取物之制程流程圖；第2圖系繪示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物之制程流程圖；第3圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第一萃取物之1H-NMR光譜；第4圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第一萃取物之13C-NMR光譜；第5圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第二萃取物之1H-NMR光譜；
第6圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第二萃取物之13C-NMR光譜；第7圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第三萃取物之1H-NMR光譜；第8圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第三萃取物之13C-NMR光譜；第9圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第四萃取物之1H-NMR光譜；第10圖系顯示根據(jù)實(shí)施例一所得之大葉羅漢松之第四萃取物之13C-NMR光譜；第11圖系繪示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物清除氫氧自由基之測(cè)試結(jié)果；第12圖系繪示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物清除超氧自由基之測(cè)試結(jié)果；第13圖系繪示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物抑制酪氨酸酶活性之測(cè)試結(jié)果；第14A圖系顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物之抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性之測(cè)試結(jié)果；第14B圖系顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物之抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性之測(cè)試結(jié)果；第15A圖系顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物之抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1活性之另一測(cè)試結(jié)果；以及第15B圖系顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例一至實(shí)施例三之羅漢松屬萃取物之抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性之另一測(cè)試結(jié)果。
附圖標(biāo)記說(shuō)明101萃取過(guò)濾步驟 102粗萃取物103部份劃分步驟105第一有機(jī)溶劑層萃取物106水層萃取物107第一分離步驟109第一層析管柱 111第二有機(jī)溶劑萃取物113第二分離步驟 115第二層析管柱117逆相層析管柱 119羅漢松屬萃取物201萃取步驟 203過(guò)濾步驟
204粗萃取物 205部份劃分步驟207乙酸乙酯層萃取物 209水層萃取物211第一分離步驟 213第一層析管柱214甲醇萃取物 215第一部分217第二部分 219第三部份221第四部分 223第五部分225第二分離步驟 231第二層析管柱233逆相層析管柱 241第一萃取物243第二萃取物 245第三萃取物247第四萃取物
權(quán)利要求
1.一種羅漢松屬萃取物，這種羅漢松屬萃取物為至少一種雙黃酮類化合物且利用有機(jī)溶液萃取而得，其中雙黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)如下式(I)所示 其中該R1基團(tuán)結(jié)構(gòu)式如式(II)或式(III)所示
2.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中R2基團(tuán)為甲氧基(H3CO-)或烴基(HO-)。
3.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中有機(jī)溶液選自由甲醇、水及其上述物質(zhì)的任意組合所組成的族群。
4.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中有機(jī)溶液為80體積百分比的甲醇溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中羅漢松屬萃取物萃取自羅漢松屬植物的葉片。
6.如權(quán)利要求5所述的羅漢松屬萃取物，其中羅漢松屬植物選自于由大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpus costalis presl)、桃實(shí)百日青(Podocarpus nakaii Hayata)以及叢花百日青(Podocarpus fasciculus deLaubenfels)所組成的族群。
7.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中雙黃酮類化合物具有清除氫氧自由基的功效。
8.如權(quán)利要求1項(xiàng)所述的羅漢松屬萃取物，其中雙黃酮類化合物具有清除超氧自由基的功效。
9.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中雙黃酮類化合物具有抑制酪氨酸酶活性的功效。
10.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中雙黃酮類化合物具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9以及彈性蛋白水解酶活性的功效。
11.如權(quán)利要求1所述的羅漢松屬萃取物，其中雙黃酮類化合物為一種添加至一皮膚用化妝品或一皮膚用醫(yī)藥品中的活性成分。
12.一種羅漢松屬萃取物的制造方法，至少包含進(jìn)行萃取過(guò)濾步驟，利用有機(jī)溶液萃取并過(guò)濾羅漢松屬植物的葉片，以獲得粗萃取物；利用第一有機(jī)溶劑對(duì)粗萃取物進(jìn)行部份劃分(Partitioning)步驟，以獲得第一有機(jī)溶劑層萃取物以及水層萃取物；進(jìn)行第一分離步驟，將第一有機(jī)溶劑層萃取物通過(guò)第一層析管柱并以第二有機(jī)溶劑沖提后，收集第二有機(jī)溶劑萃取物；以及進(jìn)行第二分離步驟，將第二有機(jī)溶劑萃取物至少通過(guò)逆相層析管柱，以獲得羅漢松屬萃取物，其中羅漢松屬萃取物為至少一種雙黃酮類化合物，且此種雙黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式如下式(I)所示 其中R1基團(tuán)的結(jié)構(gòu)式如式(II)或式(III)所示
13.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中羅漢松屬選自于由大葉羅漢松(Podocarpus macrophyllus var.macrophyllus)、蘭嶼羅漢松(Podocarpuscostalis presl)、桃實(shí)百日青(Podocarpus nakaii Hayata)以及叢花百日青(Podocarpusfasciculus de Laubenfels)所組成的族群。
14.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中有機(jī)溶液選自于由甲醇、水及其上述的任意組合所組成的族群。
15.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中有機(jī)溶液為80體積百分比的甲醇溶液。
16.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中萃取過(guò)濾步驟還至少包含利用粉碎裝置打碎羅漢松屬的葉片后，將打碎的葉片浸于有機(jī)溶液中；以及利用過(guò)濾裝置過(guò)濾含有打碎的葉片的有機(jī)溶液。
17.如權(quán)利要求16所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中過(guò)濾裝置選自由紗布、濾紙及其上述的任意組合所組成的族群。
18.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中第一有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
19.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中第一層析管柱為Sephadex LH-20層析管柱。
20.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中第二有機(jī)溶劑為甲醇。
21.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中逆相層析管柱為Biosil 5 ODS-W逆相層析管柱。
22.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中第二有機(jī)溶劑萃取物至少分成第一部分、第二部分以及第三部分。
23.如權(quán)利要求22所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中第一部分以及第三部份在進(jìn)行第二分離步驟前，至少包含將第一部分以及第三部份通過(guò)第二層析管柱。
24.如權(quán)利要求23所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中第一部分通過(guò)的第二層析管柱為MCI凝膠層析管柱。
25.如權(quán)利要求23所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中第三部分通過(guò)的第二層析管柱為Sephadex LH-20層析管柱。
26.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中R2基團(tuán)為甲氧基(H3CO-)或烴基(HO-)。
27.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中雙黃酮類化合物具有清除氫氧自由基的功效。
28.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中雙黃酮類化合物具有清除超氧自由基的功效。
29.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中雙黃酮類化合物具有抑制酪氨酸酶活性的功效。
30.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中雙黃酮類化合物具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9以及彈性蛋白水解酶活性的功效。
31.如權(quán)利要求12所述的羅漢松屬萃取物的制造方法，其中雙黃酮類化合物是一種添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中的活性成分。
全文摘要
一種羅漢松屬萃取物及其制造方法，利用有機(jī)溶液以及凝膠層析法萃取羅漢松屬的葉片，來(lái)獲得羅漢松屬萃取物，其中羅漢松屬萃取物為至少一種雙黃酮類化合物。由于本發(fā)明的羅漢松屬萃取物具有抗皮膚老化、皮膚美白以及皮膚抗皺的功效，因此可作為活性成分添加至皮膚用化妝品或皮膚用醫(yī)藥品中。
文檔編號(hào)A61P39/06GK1800171SQ20041008187
公開(kāi)日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者李美賢, 鄭可大, 陳世輝, 呂思潔 申請(qǐng)人:臺(tái)鹽實(shí)業(yè)股份有限公司