專利名稱：一種干細(xì)胞靶向定位富集的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞靶向定位富集的方法。
背景技術(shù)：
隨著器官移植學(xué)、移植免疫學(xué)的發(fā)展及免疫抑制劑的開發(fā)和應(yīng)用，器官移植已經(jīng)成為治療臨床終末期疾病的有效手段。對(duì)于各種原因(包括毒物、藥物中毒、遺傳代謝性疾病等)引發(fā)的終末期肝衰竭來講，原位肝移植是目前唯一有效的治療手段。然而，由于供肝的極度短缺、手術(shù)及移植本身相關(guān)的較高死亡率、終生服用免疫抑制劑及其所帶來的嚴(yán)重甚至致命的并發(fā)癥使得肝移植在臨床的廣泛應(yīng)用受到極大限制。
隨著干細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入，以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的細(xì)胞治療在糖尿病、肝衰竭、心肌梗塞、早老性癡呆、帕金森病、視網(wǎng)膜損傷、癌癥、血友病、脊髓損傷、先天性免疫性疾病等難治性、終末期疾病的治療中越來越顯示出良好的應(yīng)用前景。研究中發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物體內(nèi)多種組織(包括骨髓、臍帶血等)來源的成體干細(xì)胞均具有“可塑性”(即具有向多種組織細(xì)胞分化潛能)的特點(diǎn)，比如，其中的CD34+Lin-細(xì)胞向造血系統(tǒng)各系細(xì)胞分化；c-Met+β2M-細(xì)胞可以向成熟的肝細(xì)胞分化；間充質(zhì)干細(xì)胞可以向神經(jīng)元、心肌細(xì)胞或胰島β細(xì)胞分化等等。
干細(xì)胞移植后有一個(gè)趨化、遷移并定居于靶組織，最終在該微環(huán)境中增殖，并向靶組織細(xì)胞分化、成熟，乃至發(fā)揮功能代償作用的過程。一般說來，只有在靶組織中富集足夠數(shù)量的干細(xì)胞，才能發(fā)揮理想的功能。目前，干細(xì)胞移植的常用方法有靶組織直接注入和外周靜脈輸注法等。前者雖然可以保證干細(xì)胞能相對(duì)集中富集于靶組織中，但需通過開放性的手術(shù)實(shí)現(xiàn)，操作復(fù)雜，受者創(chuàng)傷大，并發(fā)癥多；后者方法簡(jiǎn)單，易于操作，但是目的干細(xì)胞隨血液循環(huán)流至全身各個(gè)器官，而易于被某些富含網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的組織吞噬、滯留，使得定位于靶組織的目的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，嚴(yán)重影響其代償功能的發(fā)揮。而尋找一種高效、簡(jiǎn)單的干細(xì)胞靶向定位富集方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、簡(jiǎn)單的干細(xì)胞靶向定位富集的方法。
本發(fā)明所提供的干細(xì)胞靶向定位富集的方法，包括如下步驟1)將干細(xì)胞用粒徑為30-70nm的免疫磁珠標(biāo)記，得到標(biāo)記后的細(xì)胞；2)將所述標(biāo)記后的干細(xì)胞注入靶組織的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)；3)將所述靶組織正對(duì)放置于兩個(gè)異性磁極之間，在所述循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)過程中，將所述干細(xì)胞定位富集于所述靶組織內(nèi)；所述兩個(gè)異性磁極間的磁場(chǎng)強(qiáng)度為9200-24500Gs。
其中，所述干細(xì)胞為具有特定細(xì)胞表面標(biāo)志的、具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可以來源于人或其它哺乳動(dòng)物骨髓、動(dòng)員的外周血、臍帶血或其他組織等。如以大鼠骨髓c-Met+β2M-細(xì)胞為例，采用免疫磁珠標(biāo)記所述干細(xì)胞的過程如下將針對(duì)所述干細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原的特異性抗體與所述干細(xì)胞孵育，經(jīng)清洗后再與偶聯(lián)有抗所述特異性抗體的免疫磁珠孵育，清洗得到所述標(biāo)記后的細(xì)胞。所述特異性抗體為兔抗大鼠c-Met抗體和β2M-抗體；所述免疫磁珠偶聯(lián)有山羊抗兔IgG。
為了能提高目的細(xì)胞在靶組織中的定位富集效果，所述兩個(gè)異性磁極的材料通常選用銣鐵硼等永磁性材料，兩個(gè)異性磁極呈圓柱狀，且兩磁極靠近相對(duì)的一端直徑縮??；所述兩個(gè)異性磁極端面的距離為5-25mm。此時(shí)，在兩個(gè)磁極之間形成高強(qiáng)度、高梯度的磁場(chǎng)，磁場(chǎng)的高強(qiáng)度使免疫磁珠標(biāo)記的目的細(xì)胞具有良好的富集效果，磁場(chǎng)的高梯度則使免疫磁珠標(biāo)記的細(xì)胞能選擇性地滯留于靶組織而不是靶組織以外的其他組織。
本發(fā)明將直徑在50納米左右的免疫磁珠通過抗原抗體親和反應(yīng)來特異性標(biāo)記細(xì)胞，由于該免疫磁珠的超順磁性，使得目的細(xì)胞在磁場(chǎng)的作用下定向富集于磁場(chǎng)中的靶組織，而且當(dāng)磁場(chǎng)消失后，免疫磁珠失去磁性，在靶組織內(nèi)細(xì)胞不會(huì)因?yàn)橄嗷ノ奂汕蚨鴮?dǎo)致血管阻塞。在本發(fā)明中，免疫磁珠的主要制備原料均可以被生物體吸收、排泄，最終以卟啉鐵的形式被機(jī)體吸收代謝，對(duì)機(jī)體無毒副作用。本發(fā)明巧妙地利用超順磁性磁珠的磁特性，采用磁靶向技術(shù)使目的細(xì)胞在靶組織的定位富集，具有富集效率高、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1為免疫磁珠標(biāo)記的干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為磁場(chǎng)篩分細(xì)胞的示意圖；圖3A為靶向定位儀的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3B為圖3A的俯視圖；圖4為免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞的體外富集操作流程示意圖；圖5為免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞在大鼠肺、肝中的富集照片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、c-Met+β2M-細(xì)胞的靶向定位富集本實(shí)施例以肝損傷大鼠模型的肝臟作為靶組織，也可以其他組織作為靶組織。本實(shí)施例中所用免疫磁珠購(gòu)于天津大學(xué)材料學(xué)院，該磁珠偶聯(lián)了山羊抗兔IgG，粒徑在50nm左右，具有良好的超順磁性。
1、大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的獲得斷頸處死的大鼠經(jīng)75％乙醇消毒后，用剖腹的方法取出股骨，以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作為沖洗液，用5ml注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，用100目篩網(wǎng)過濾沖出的細(xì)胞制成大鼠骨髓單細(xì)胞懸液，1000rpm離心后，將細(xì)胞重懸于PBS中，經(jīng)Ficoll(相對(duì)密度1.083g/ml)密度梯度離心后收集大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后重懸于PBS中。
2、用兩步間接免疫磁珠分離方法富集并標(biāo)記大鼠骨髓來源的c-Met+β2M-細(xì)胞如圖1所示，將步驟1所得細(xì)胞1先與兔抗大鼠β2M抗體2于4℃孵育30min，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后，再將其與偶聯(lián)了山羊抗兔IgG 4的免疫磁珠3于4℃孵育30min，再經(jīng)PBS洗滌，這樣，凡是表達(dá)β2M的細(xì)胞則被免疫磁珠所標(biāo)記。
如圖2所示，將該群細(xì)胞流過位于兩個(gè)磁極9之間的塑料軟管7，其中被免疫磁珠所標(biāo)記的表達(dá)β2M的細(xì)胞5(即陽性細(xì)胞)滯留于磁場(chǎng)內(nèi)，而未被標(biāo)記的細(xì)胞6(即陰性細(xì)胞)流出磁場(chǎng)，用Eppendorf管8收集細(xì)胞6；而滯留于磁場(chǎng)內(nèi)的細(xì)胞5在去掉磁場(chǎng)后用緩沖液沖洗收集。
按照前上述操作將收集到的β2M-細(xì)胞群6先后與兔抗大鼠c-Met抗體及免疫磁珠標(biāo)記的山羊抗兔IgG孵育，再經(jīng)PBS洗滌。這樣，在β2M-的細(xì)胞群中，凡是表達(dá)c-Met的c-Met+β2M-細(xì)胞均被免疫磁珠所標(biāo)記，流經(jīng)磁場(chǎng)時(shí)，該細(xì)胞滯留于磁場(chǎng)內(nèi)，將塑料軟管移離磁場(chǎng)后，用PBS將細(xì)胞沖出，獲得目的細(xì)胞——免疫磁珠標(biāo)記的c-Met+β2M-細(xì)胞。為了有效檢測(cè)移植細(xì)胞在受者體內(nèi)的富集效率，該群細(xì)胞以熒光染料DAPI標(biāo)記并充分洗滌。
3、近交系F344大鼠的飼養(yǎng)和肝損傷模型的制備雄性一級(jí)近交系F344大鼠，體重180～200g，室溫20～22℃飼養(yǎng)，光線12小時(shí)明暗交替，自由飲水、進(jìn)食。將丙烯醇按0.62μmol/Kg體重經(jīng)腹膜下注射至F344大鼠體內(nèi)，制備藥物所致大鼠肝損傷模型，常規(guī)飼養(yǎng)3天后備用。
4、c-Met+β2M-細(xì)胞的定位富集如圖3A、圖3B所示，磁靶向定位儀包括有一支架10，支架10內(nèi)上下相對(duì)設(shè)置有二磁極，下磁極11垂向設(shè)置在支架10的底面，上磁極12與下磁極11相對(duì)應(yīng)的設(shè)置在支架10的頂面，上磁極12連接于螺桿14下端，而螺桿14上端設(shè)置有轉(zhuǎn)動(dòng)把手13。通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動(dòng)把手13，可以使螺桿14轉(zhuǎn)動(dòng)，從而使螺桿相對(duì)支架10的頂面沿垂向移動(dòng)，也就可以帶動(dòng)上磁極12移動(dòng)，借此來改變上、下磁極之間的距離。二磁極成圓柱狀，為了保證兩磁極間的磁場(chǎng)強(qiáng)度，兩磁極靠近相對(duì)的一端直徑縮小，且直徑縮小的越多，兩磁極間的磁場(chǎng)梯度越大。此外，支架及二磁極的材料均選用永磁性材料，如銣鐵硼，可以有效的提高磁極間的磁場(chǎng)強(qiáng)度。
將大鼠固定于磁靶向定位儀中，使肝臟所對(duì)應(yīng)的體表投射區(qū)正對(duì)上下兩個(gè)磁極，然后通過大鼠外周靜脈(尾靜脈或股靜脈)將步驟2所得目的細(xì)胞——熒光素標(biāo)記的攜帶免疫磁珠的c-Met+β2M-細(xì)胞輸注入體內(nèi)，這樣，標(biāo)記了免疫磁珠的目的干細(xì)胞可在磁力的引導(dǎo)下沿血液循環(huán)向分布于肝臟內(nèi)的各級(jí)血管富集，隨著大鼠在磁場(chǎng)內(nèi)停留時(shí)間的延長(zhǎng)，目的干細(xì)胞可穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入肝組織內(nèi)整合入肝細(xì)胞板，從而使c-Met+β2M-細(xì)胞靶向定位富集于肝組織。
實(shí)施例2、細(xì)胞富集效果的檢測(cè)1、體外富集按照實(shí)施例1中步驟1-2的操作得到免疫磁珠標(biāo)記的β2M+細(xì)胞，PBS洗滌。然后配制含20％葡聚糖的生理鹽水作為流動(dòng)相，將所得細(xì)胞懸浮于其中。調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速為0.1～15cm/s，使磁珠標(biāo)記的細(xì)胞流過磁場(chǎng)(調(diào)節(jié)兩磁極間的距離1.6～2.5cm，使場(chǎng)強(qiáng)波動(dòng)于1.24～0.98T)，顯微鏡下計(jì)數(shù)流出和流入細(xì)胞的比值，得到磁場(chǎng)對(duì)磁珠標(biāo)記細(xì)胞的富集效率。操作過程如圖4所示，圖中15為加有免疫磁珠標(biāo)記的β2M+細(xì)胞的20％葡聚糖生理鹽水溶液；16為蠕動(dòng)泵；17為磁場(chǎng)的兩個(gè)磁極；18為富集的細(xì)胞。
結(jié)果表明，隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增加，β2M+細(xì)胞富集效果逐漸加強(qiáng)，當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度在0.9Te以上時(shí)，均能使磁珠標(biāo)記的細(xì)胞在磁極對(duì)應(yīng)的管道局部很好地富集，其效率達(dá)到90％以上。
2、體內(nèi)富集取近交系F344大鼠，雌雄不限，按實(shí)施例1步驟4的方法制備肝損傷模型。動(dòng)物分為3組G1，外周靜脈(股靜脈)移植+磁場(chǎng)；G2，開腹經(jīng)門靜脈移植；G3，外周靜脈移植(對(duì)照組，不加磁場(chǎng))。其中，G1組的操作如下1)按實(shí)施例1中步驟1-2的方法制備免疫磁珠標(biāo)記的c-Met+β2M-細(xì)胞，然后加入DAPI染液室溫避光染色30min，用PBS洗4次，按4×107/mL將細(xì)胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)基中；2)大鼠常規(guī)麻醉后置于磁靶向定位儀中四肢固定，使其肝臟體表投影部位正對(duì)上下兩個(gè)磁極；3)于腹股溝切開皮膚暴露股靜脈，經(jīng)股靜脈緩慢注入處理好的細(xì)胞懸液，術(shù)后縫皮，燈照保暖，術(shù)后不同時(shí)間將大鼠移離磁場(chǎng)，正常飼養(yǎng)；4)術(shù)后分別于3d和10d活殺大鼠，取肝和肺組織制備冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記細(xì)胞在受體大鼠肝和肺內(nèi)的分布。
結(jié)果如圖5所示，其中圖5A和圖5B分別為經(jīng)股靜脈移植細(xì)胞后，大鼠固定于磁場(chǎng)內(nèi)20h和2h，細(xì)胞在肺內(nèi)的截留；圖5C為經(jīng)門靜脈移植細(xì)胞后，細(xì)胞在肺內(nèi)的滯留；圖5D和圖5E分別為經(jīng)股靜脈移植細(xì)胞后，大鼠固定于磁場(chǎng)內(nèi)20h移離磁場(chǎng)，3d和10d后活殺大鼠觀察到細(xì)胞在肝臟的富集；圖5F為經(jīng)門靜脈移植后細(xì)胞在肝臟的富集；圖5G和圖5H分別為經(jīng)股靜脈移植細(xì)胞后，大鼠固定于磁場(chǎng)內(nèi)2h移離磁場(chǎng)，3d和10d后細(xì)胞在肝臟的富集。
結(jié)果表明，經(jīng)股靜脈移植DAPI-免疫磁珠標(biāo)記的細(xì)胞后，大鼠固定于磁場(chǎng)內(nèi)20h與2h者相比，標(biāo)記細(xì)胞在肺內(nèi)的截留明顯減少，而在肝內(nèi)的停留明顯增多；初步統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，滯留于肝臟內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，依次為磁場(chǎng)內(nèi)20h>經(jīng)門靜脈移植>磁場(chǎng)內(nèi)2h和股靜脈移植(無磁場(chǎng)，對(duì)照組)，標(biāo)記細(xì)胞在肺內(nèi)的滯留與此相反。表明采用本發(fā)明方法能有效地將細(xì)胞定向富集于靶組織內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞靶向定位富集的方法，包括如下步驟1)將干細(xì)胞用粒徑為30-70nm的免疫磁珠標(biāo)記，得到標(biāo)記后的干細(xì)胞；2)將所述標(biāo)記后的干細(xì)胞注入靶組織的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)；3)將所述靶組織相對(duì)應(yīng)的體表部位正對(duì)兩個(gè)異性磁極，在所述循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)過程中，將所述干細(xì)胞定位富集于所述靶組織內(nèi)；所述兩個(gè)異性磁極間的磁場(chǎng)強(qiáng)度為9200-24500Gs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述干細(xì)胞來源于人或其它哺乳動(dòng)物骨髓、動(dòng)員的外周血、臍帶血或其他組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠標(biāo)記所述干細(xì)胞的過程如下將針對(duì)所述干細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原的特異性抗體與所述干細(xì)胞孵育，經(jīng)清洗后再與偶聯(lián)有抗所述特異性抗體的免疫磁珠孵育，清洗得到所述標(biāo)記的干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述干細(xì)胞為來源于大鼠骨髓的c-Met+β2M-細(xì)胞；所述特異性抗體為兔抗大鼠c-Met抗體和β2M抗體；所述免疫磁珠偶聯(lián)有山羊抗兔IgG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的方法，其特征在于所述兩個(gè)異性磁極的材料為永磁性材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述永磁性材料為銣鐵硼。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述兩個(gè)異性磁極呈圓柱狀，且兩磁極靠近相對(duì)的一端直徑縮?。凰鰞蓚€(gè)異性磁極端面的距離為5-25mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種干細(xì)胞靶向定位富集的方法。本發(fā)明所提供的干細(xì)胞靶向定位富集的方法，包括如下步驟1)將干細(xì)胞用粒徑為30－70nm的免疫磁珠標(biāo)記，得到標(biāo)記后的干細(xì)胞；2)將所述標(biāo)記后的干細(xì)胞注入靶組織的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)；3)將所述靶組織相對(duì)應(yīng)的體表部位正對(duì)兩個(gè)異性磁極，在所述循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)過程中，將所述干細(xì)胞定位富集于所述靶組織內(nèi)；所述兩個(gè)異性磁極間的磁場(chǎng)強(qiáng)度為9200－24500Gs。本發(fā)明巧妙地利用超順磁性磁珠的磁特性，采用磁靶向技術(shù)使目的細(xì)胞在靶組織的定位富集，具有富集效率高、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1608677SQ20041008378
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月22日
發(fā)明者裴雪濤, 王韞芳, 南雪, 李艷華, 岳 文, 閆舫 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所