專利名稱：一枝蒿有效部位在制備抗呼吸道病毒的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種一枝蒿有效部位酮酸和黃酮的新制藥用途。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒和副流感病毒均屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，為單負(fù)股RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病。目前對病毒性感冒尚無有效的治療措施，我們將一枝蒿有效部位酮酸和黃酮用于臨床，對呼吸道病毒引起的上呼吸道疾病有一定療效。本發(fā)明是在CN2004100083763的基礎(chǔ)上，將一枝蒿有效部位酮酸和黃酮在制備抗呼吸道病毒的藥物用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一枝蒿有效部位酮酸和黃酮在制備抗呼吸道病毒的藥物用途。
研究一枝蒿有效部位對呼吸道合胞病毒(RSV)及副流感病毒(PIV)的體外抑制作用。方法①選用雞胚法考察一枝蒿有效部位對PIV的抑制作用；②微量細(xì)胞病變抑制法計算各藥物的半數(shù)有效量(IC 50)及治療指數(shù)(TI)。結(jié)果①血凝滴度實驗表明，在對PIV的直接作用，治療作用和預(yù)防作用三方面一枝蒿有效部位有效；②一枝蒿有效部位抗RSV的IC 50為33.15±8.12mg/L，TI值為38.45±5.16；而病毒唑的IC 50和TI值分別為22.23±6.09mg/L及91.89±11.50mg/L。結(jié)論一枝蒿有效部位對PIV和RSV具有抑制作用。
具體實施例方式
實施例一枝蒿有效部位酮酸和黃酮抗呼吸道病毒作用的實驗研究本研究對該藥進(jìn)行了PIV及RSV的體外抗病毒試驗，并判斷一枝蒿有效部位酮酸和黃酮的抗病毒效果。
1材料1.1藥物一枝蒿有效部位酮酸和黃酮，顆粒型，分別取10g溶解于20m l無菌雙蒸水中，0.22μm濾膜除菌過濾，無菌試驗96h(-)，4℃保存待測。病毒唑注射液，劑型1ml裝(100mg)。
1.2病毒病毒毒株P(guān)IV為省防疫站提供；RSV-Long株，購自北京病毒所。
1.3細(xì)胞 為HeLa細(xì)胞傳代株。
1.4雞胚 將雞胚在實驗室39℃下孵育至12d胚齡，備用。
2方法2.1副流感病毒抑制實驗①藥物的直接滅活作用將一枝蒿酮酸、一枝蒿黃酮和病毒唑分別與病毒等量混合，37℃作用2h，接種量為0.2ml/胚。②藥物的治療作用先將病毒以0.1ml/胚接種至雞胚內(nèi)，4h后再以0.1ml/胚分別接種三種藥品注射液。每組實驗均接種3個雞胚，35℃孵育3d，4℃過夜后收獲尿囊液，進(jìn)行血凝實驗。在大孔塑料板內(nèi)用生理鹽水將尿囊液先按1∶10稀釋，再進(jìn)行倍比稀釋1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，共得7個濃度梯度。每孔加入1％的雞紅細(xì)胞懸液，搖勻，靜置45min后觀察。根據(jù)血細(xì)胞凝集程度的不同來進(jìn)行判斷，以“++”為終點(diǎn)，即觀察到紅細(xì)胞在孔底形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊，以此為標(biāo)準(zhǔn)測定血凝滴度。以上實驗均設(shè)生理鹽水對照(排除血細(xì)胞自身的非特異凝集)和病毒對照。判斷結(jié)果時如果藥物實驗組血凝滴度為病毒對照組的1/4以下，即說明藥物對病毒增殖有抑制作用。
2.2呼吸道合胞病毒抑制實驗①藥物對HeLa細(xì)胞的毒性測定以50mg/ml一枝蒿酮酸為原液，用無血清的DMEM作連續(xù)10倍系列稀釋后接種于已形成單層的HeLa細(xì)胞中，每孔100μl，每一稀釋度重復(fù)4孔，以DMEM液代替藥物作為正常細(xì)胞對照，37℃0.05(體積分?jǐn)?shù)，下同)CO2孵育。動態(tài)觀察結(jié)果，記錄由藥物產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)(cvtopathiceffect，CPE)，按Reed-Muench法計算CPE不再進(jìn)展時(約72h)藥物的半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。一枝蒿酮酸和陽性對照病毒唑的細(xì)胞毒性測定以同法同時進(jìn)行。
②藥物對RSV-Long株病毒的抑制作用一枝蒿有效部位酮酸和黃酮和病毒唑3種藥物在同一塊96孔板中同時進(jìn)行。傾去已形成單層的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入100 TCID 50RSV-Long株病毒(種子病毒取0.1ml作1×10-3.6倍稀釋即得)，每孔100μl，37℃吸附1h后甩去上清，用PBS洗2次，洗去游離病毒。選用3種藥物的最大無毒濃度(TD0)為第一孔，以無血清的DMEM作連續(xù)2倍系列稀釋6個濃度，每個濃度均做4孔，分別加入上述已感染病毒的HeLa細(xì)胞孔內(nèi)，每孔100μl，33℃0.05 CO2培養(yǎng)，同時分別設(shè)立正常細(xì)胞對照及病毒對照。連續(xù)動態(tài)觀察，以細(xì)胞對照形態(tài)正常，CPE(-)，病毒對照CPE達(dá)“++”時記錄結(jié)果(RSV致CPE特征是感染細(xì)胞與鄰近細(xì)胞融合，形成合胞體。病變范圍＜25％為+，25％～50％為++，50％～75％為+++，＞75％為++++。按Reed-Muench法計算3種藥物對RSV致CPE產(chǎn)生50％抑制的濃度，即藥物的半數(shù)有效量(IC 50)。整個實驗重復(fù)3次(n＝3)，計算IC50平均值，并對3種藥物的結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)固定染色后拍照。③藥物治療指數(shù)(TI)按TI＝TD 50/IC 50進(jìn)行計算。
3結(jié)果3.1藥物對副流感病毒的抑制作用實驗中測得病毒對照組的血凝滴度為1∶340，生理鹽水對照組為“0”，所以，若實驗組血凝滴度低于1∶80，則說明有效。由表1可見，一枝蒿有效部位酮酸和黃酮和病毒唑在對副流感病毒的直接作用、治療作用上均有效，且一枝蒿酮酸對副流感病毒直接作用有效率較好。
表1 不同藥物抗副流感病毒作用

3.2 藥物對呼吸道合胞病毒的抑制作用(1)藥物對HeLa細(xì)胞的毒性作用以量化單位藥物半數(shù)中毒量TD50和最大無毒量TO0來表示，結(jié)果見表2。可見3種藥物在高濃度時對HeLa細(xì)胞均有一定的毒性作用。我們在進(jìn)行藥物的抗病毒試驗時選用藥物的最大無毒量TD0開始，以排除藥物本身的CPE干擾，保證結(jié)果的正確性、可靠性。
(2)藥物對RSV-Long株的抑制作用將一枝蒿有效部位酮酸和黃酮及陽性對照藥分別作連續(xù)2倍系列稀釋后，與100TCID50RSV-Long株進(jìn)行抑病毒試驗，計算藥物的抑病毒百分率及半數(shù)有效量IC50，結(jié)果見表3。由表3可見，一枝蒿有效部位酮酸和黃酮的IC50介于陽性對照藥之間，其體外抗RSV-Long株的效果較病毒唑差。
(3)TI值大小經(jīng)計算3種藥物的TI結(jié)果見表4。TI值愈大，表明藥物的安全范圍愈大，可見一枝蒿酮酸的安全范圍大于一枝蒿黃銅，小于病毒唑。
表2 藥物對HeLa細(xì)胞的毒性作用(mg/L)

表3 藥物對RSV-Long株的IC50(±s，mg/L)

表4 藥物的治療指數(shù)TI(±s)

討論 呼吸道感染是一種常見病、多發(fā)病，臨床表現(xiàn)多種多樣，其病原相當(dāng)復(fù)雜。但呼吸道感染中90％以上是由呼吸道病毒引起，如RSV、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)等等。目前對病毒性疾病尚缺乏有效的防治措施，特別是對易產(chǎn)生變異的病毒如RSV、IFV等。實踐一枝蒿有效部位酮酸和黃酮，對呼吸道病毒引起的上呼吸道疾病有顯著療效。
從抗病毒試驗結(jié)果表明，一枝蒿有效部位酮酸和黃酮對于副流感病毒的抑制作用同病毒唑相近，一枝蒿酮酸抑制呼吸道合胞病毒作用的半數(shù)有效量(IC50)為33.15±8.12mg/L，與一枝蒿黃酮和病毒唑相比，小于一枝蒿黃酮而大于病毒唑；并且一枝蒿酮酸的安全范圍大于一枝蒿黃酮而小于病毒唑，其中一枝蒿酮酸的抗PIV和RSV效果優(yōu)于一枝蒿黃酮和病毒唑。
權(quán)利要求
1.一枝蒿有效部位酮酸和黃酮在制備抗呼吸道病毒的藥物用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一枝蒿有效部位酮酸和黃酮在制備抗呼吸道病毒的藥物用途。
文檔編號A61P31/00GK1754552SQ200410084850
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者斯拉甫·艾白, 哈木拉提·吾甫爾 申請人:斯拉甫·艾白