專利名稱：新型用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含煙堿受體激動劑的正性調(diào)節(jié)劑的組合物，所述正性調(diào)節(jié)劑具有增強所述煙堿受體激動劑功效的能力。
背景技術(shù)：
在正常情況下，膽堿能受體結(jié)合內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)，因此引發(fā)離子通道的開放。哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的ACh受體可分為蕈毒堿的(mAChR)和煙堿(nAChR)子型，它們分別以蕈毒堿和煙堿的激動劑活性為基礎(chǔ)。煙堿型乙酰膽堿受體是包含5個子單元并具有配體選通的離子通道(評論文獻參見Colquhon等人(1997)“藥物學(xué)進展”39，191-220；Williams等人(1994)“藥物新聞與前景”7，205-223；Doherty等人(1995)“藥物化學(xué)年報”30，41-50)。nAChR基因族的成員基于其順序分為兩組；一組成員被認為是β子單元，而第二組被歸類稱為α子單元(評論文獻參見Karlin和Akabas(1995)“神經(jīng)原”15，1231-1244；Sargent(1993)“神經(jīng)科學(xué)年度綜述”16，403-443)。當單獨表達時，三個α子單元α7、α8和α9形成功能性受體，并因此可能形成同質(zhì)低聚物受體。
nAChR的異位轉(zhuǎn)變狀態(tài)模型至少涉及休止狀態(tài)、激活狀態(tài)和“脫敏”關(guān)閉通道狀態(tài)(Williams等人，如上所述；Karlin和Akabas，如上所述)。因此，不同的nAChR配體可不同程度地穩(wěn)定它們優(yōu)先結(jié)合的構(gòu)象狀態(tài)。例如，激動劑ACh和(-)-煙堿穩(wěn)定所述激活和脫敏狀態(tài)。
煙堿受體活性的改變涉及許多疾病。其中的一些包括例如重癥肌無力和ADNFLE(常染色體顯性夜發(fā)型前葉癲癇)(Kuryatov等人(1997)“神經(jīng)科學(xué)雜志”17(23)9035-47)與煙堿傳遞活性降低有關(guān)，所述煙堿傳遞活性降低是通過減少受體數(shù)量或增強脫敏作用出現(xiàn)的，這是一種使受體對激動劑不敏感的過程。也有人假設(shè)煙堿受體減少可介導(dǎo)某些疾病，如早老性癡呆和精神分裂癥中所見到的認知缺陷(Williams等人，如上所述)。通過煙堿受體也可以介導(dǎo)來自煙草的煙堿的作用。增強煙堿受體的活性可降低對吸煙的需求。
在McDonald等人(1995)“煙堿型乙酰膽堿受體分子生物學(xué)、化學(xué)和藥理學(xué)”第五章《藥物化學(xué)年報》vol 30，pp 41-50，Academic pressInc.，San Diego，CA和Williams等人(1994)在“神經(jīng)元的煙堿型乙酰膽堿受體”《藥物新聞與前景》vol.7，pp.205-223中討論了利用與煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合的化合物來治療一系列涉及膽堿能功能降低的疾病，如早老性癡呆、認知或注意力障礙、注意力不集中性多動癥、焦慮、抑郁、戒煙癥、自閉癥、精神分裂癥、痛覺缺失、圖雷特氏綜合癥和帕金森氏病。
然而，利用在ACh相同的位點處發(fā)揮作用的煙堿型受體激動劑治療是成問題的，因為ACh通過包括脫敏(評論文獻參見Ochoa等人(1989)“細胞內(nèi)和分子神經(jīng)生物學(xué)”9，141-178)和非競爭性阻斷(打開通道阻斷)(Forman & Miller(1988)生物物理雜志54(1)149-58)在內(nèi)的過程，不僅激活受體活性而且也阻斷受體的活性。因此，預(yù)期ACh激動劑既可降低活性也增強活性。一般對煙堿受體，特別是對α7-煙堿受體來說，脫敏作用限制了激動劑應(yīng)用期間測試時電流的持續(xù)時間。

發(fā)明內(nèi)容
意外地發(fā)現(xiàn)，某些化合物如5-羥基吲哚(5-OHi)可增強激動劑對煙堿受體的功效。所述功效增強可能大于2倍。相信具有該種作用的化合物(下文稱作正性調(diào)節(jié)劑)將特別用于治療與煙堿傳遞減少有關(guān)的疾病。在治療處置中，所述化合物可以恢復(fù)正常的神經(jīng)元間的傳遞，而不影響激活作用的暫時特點。另外它們將不會象長時間應(yīng)用激動劑那樣產(chǎn)生長期的滅活作用。
由現(xiàn)有技術(shù)不可能預(yù)料存在所述功效增強活動。Albuquerque等人報道了煙堿受體的另一異位，他們稱之為“非競爭性激動劑”位點。在該位點發(fā)揮作用的化合物也稱作“異位增效配體”(APL’s)。在該位點發(fā)揮作用的化合物包括幾種膽堿酯酶抑制劑、可待因和5-HT。據(jù)稱，借助所述非競爭性激動劑位點的活動不影響對ACh的最大反應(yīng)水平；它使劑量-反應(yīng)曲線向左移動(Maelicke & Albuquerque(1996)DDT，vol.1，53-59)。其特異性區(qū)別是，在所發(fā)現(xiàn)的位點發(fā)揮作用的化合物可增強對ACh的最大反應(yīng)(其功效)。
APL’s和本發(fā)明之間的另一區(qū)別是在飽和濃度的激動劑存在下調(diào)節(jié)劑對總電流的影響(通過曲線下面積測定)。APL’s對以卵母細胞表達的nAChRα7曲線下面積有很小或沒有影響；在激動劑應(yīng)用1秒鐘后觀察到曲線下面積增加8-10％。相反，在同樣條件下，5-OHi引起曲線下面積大大增加(～400％增加)(參見圖4上部蹤跡)。
煙堿受體族作用的特異性也是APL’s和本發(fā)明之間的另一區(qū)別特征。對所有的試驗煙堿受體，包括肌肉型(α1βδe)煙堿受體，APL’s均發(fā)揮其正調(diào)制作用。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對某些非煙堿受體，化合物可降低受體的脫敏作用。對AMPA-型興奮性氨基酸受體，化合物，如環(huán)噻嗪、某些凝集素，如小麥胚凝集素、吡拉西坦類似物nootropics和AMPA類似物顯示可降低脫敏作用(Partin等人(1993)“神經(jīng)元”11，1069-1082)。據(jù)報道，甘氨酸降低NMDA-型興奮性氨基酸受體的脫敏作用(Mayer等人(1989)“自然”338，425-427)。然而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一般來說降低一類受體脫敏作用的化合物對另一類受體沒有相同的影響。例如環(huán)噻嗪對NMDA和KA子型谷氨酸鹽受體具有很小作用或沒有作用(Partin等人(1993)“神經(jīng)元”11，1069-1082)；而且發(fā)現(xiàn)，環(huán)噻嗪阻斷5-HT3受體(D.A.Gurley，未發(fā)表的結(jié)果)。甘氨酸對5-HT3受體沒有作用(Gurley and Lanthorn，(付印中)“神經(jīng)科學(xué)通訊”)。
利用已知降低5-HT3受體脫敏作用的化合物(5-OHi)來發(fā)現(xiàn)該位點(Kooyman.A.R.等人(1993)“英國藥理學(xué)雜志”108，287-289)。然而，據(jù)報道，只有另外一個產(chǎn)生或增強5-HT3(OHi)受體和5-HT本身活性的化合物會增強煙堿受體的活性(Schrattenholz等人(1996)“分子藥理學(xué)”49，1-6)，盡管在非洲蟾蜍屬卵母細胞中還未曾有人報道過該活性。大多數(shù)5-HT3受體激動劑沒有激動煙堿受體的活性或者是煙堿受體的拮抗劑(未發(fā)表的結(jié)果)。另外，本發(fā)明者未能再現(xiàn)5-HT增強煙堿受體活性的發(fā)現(xiàn)。因此，也不可能預(yù)見到5-OHi對煙堿受體的增強作用。
所以，一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，它包含煙堿受體激動劑的正性調(diào)節(jié)劑和可藥用載體，所述正性調(diào)節(jié)劑具有增強所述受體激動劑功效的能力。就本發(fā)明目的而言，術(shù)語“正性調(diào)節(jié)劑”或“煙堿受體激動劑的正性調(diào)節(jié)劑”將理解為具有增強煙堿受體激動劑最大功效能力的化合物。
應(yīng)明確，本發(fā)明包括組合物，所述組合物包含作為唯一活性物質(zhì)的正性調(diào)節(jié)劑，由此調(diào)節(jié)內(nèi)源性煙堿受體激動劑活性，或者包含正性調(diào)節(jié)劑和煙堿受體激動劑相結(jié)合。因此，所述包含煙堿受體激動劑正性調(diào)節(jié)劑的藥物組合物可另外還包含煙堿受體激動劑。
在本發(fā)明優(yōu)選形式中，所述正性調(diào)節(jié)劑是5-羥基吲哚。
在本發(fā)明另一優(yōu)選形式中，所述煙堿受體激動劑是α7-煙堿受體激動劑。α7-煙堿受體激動劑的實例是(-)-螺[1-氮雜二環(huán)[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。有幾種α7-煙堿受體激動劑是本領(lǐng)域已知的，例如來自WO96/06098、WO97/30998和WO99/03859。
另一方面，本發(fā)明提供一種治療與煙堿傳遞減少有關(guān)疾病的方法，該方法包括給予需要該治療的病人醫(yī)療有效量的煙堿受體激動劑的正性調(diào)節(jié)劑，所述正性調(diào)節(jié)劑具有增強所述煙堿受體激動劑功效的能力。
應(yīng)明確，本發(fā)明治療方法包括給予作為唯一活性物質(zhì)的正性調(diào)節(jié)劑，由此調(diào)節(jié)內(nèi)源性煙堿受體激動劑活性，或者與煙堿受體激動劑一起給予正性調(diào)節(jié)劑和。
在本發(fā)明優(yōu)選形式中，所述治療方法包含的正性調(diào)節(jié)劑是5-羥基吲哚。
在本發(fā)明另一優(yōu)選形式中，所述治療方法包含的煙堿受體激動劑是α7-煙堿受體激動劑。α7-煙堿受體激動劑的實例是(-)-螺[1-氮雜二環(huán)[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。有幾種α7-煙堿受體激動劑是本領(lǐng)域已知的，例如來自WO96/06098，WO97/30998和WO99/03859。
另一方面，本發(fā)明以本發(fā)明藥物組合物來生產(chǎn)用于治療或預(yù)防下列所述疾病中之一種的、與煙堿受體傳遞減少有關(guān)，或與煙堿密度減少有關(guān)疾病的藥物，其中所述治療或預(yù)防方法包括給予病人醫(yī)療有效量的本發(fā)明化合物。
應(yīng)明確，所述應(yīng)用包括其中包含作為唯一活性物質(zhì)的正性調(diào)節(jié)劑，由此調(diào)節(jié)內(nèi)源性煙堿受體激動劑活性，或者包含正性調(diào)節(jié)劑和煙堿受體激動劑的組合物。因此，所述包含煙堿受體激動劑正性調(diào)節(jié)劑的藥物組合物的應(yīng)用可另外還包含煙堿受體激動劑。
在本發(fā)明優(yōu)選形式中，所述應(yīng)用包含的正性調(diào)節(jié)劑是5-羥基吲哚。
在本發(fā)明另一優(yōu)選形式中，所述應(yīng)用所采用的煙堿受體激動劑是α7-煙堿受體激動劑。α7-煙堿受體激動劑的實例是(-)-螺[1-氮雜二環(huán)[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。有幾種α7-煙堿受體激動劑是本領(lǐng)域已知的，例如來自WO96/06098，WO97/30998和WO99/03859。
所述疾病的實例包括精神分裂癥、躁狂和躁狂性抑郁、焦慮、早老性癡呆、學(xué)習(xí)缺陷、認知缺陷、注意力不集中、記憶喪失和注意力不集中性多動癥、帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病、圖雷特氏綜合癥、乘噴氣式飛機引起的神經(jīng)紊亂和煙堿成癮(包括暴露于含煙堿產(chǎn)品引起的疾病)。
應(yīng)明確，所述正性調(diào)節(jié)劑系以對內(nèi)源性煙堿受體激動劑發(fā)揮作用的目的給藥，或者以與外源性煙堿受體激動劑組合物的形式給藥。
另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防上述由哺乳動物，優(yōu)選人類的煙堿型乙酰膽堿受體神經(jīng)傳遞機能障礙引起的疾病的藥物組合物，所述組合物包含作為唯一活性物質(zhì)的正性調(diào)節(jié)劑，由此調(diào)節(jié)內(nèi)源性煙堿受體激動劑活性，或者包含正性調(diào)節(jié)劑和煙堿受體激動劑相結(jié)合。因此，所述包含煙堿受體激動劑正性調(diào)節(jié)劑的藥物組合物可另外還包含治療或預(yù)防所述疾病有效量的煙堿受體激動劑和惰性可藥用載體。
當然，就上述應(yīng)用而言，所給予的劑量將依賴于所使用的組合物、給藥方式和所需要的治療效果。然而，一般地，當以每公斤體重哺乳動物大約0.1mg-約20mg的每日劑量，優(yōu)選分為每日1-4次，或以緩釋形式給予所述活性組分時，將得到令人滿意的結(jié)果。對人來說，每日總劑量為5mg-1400mg，更優(yōu)選10mg-100mg，并且適用于口服給藥的單位劑量形式包含2mg-1400mg與固態(tài)或液態(tài)可藥用載體或稀釋劑混合的活性組分。
上述組合物可以單獨或以其適宜的藥用制劑形式通過腸內(nèi)、非腸道、口服、直腸或鼻給予。
適宜的稀釋劑或載體的實例為-對于片劑和糖錠劑來說乳糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸；對于膠囊劑來說酒石酸或乳糖；-對于可注射溶液劑來說水、醇、甘油、植物油；對于栓劑來說天然或硬化油或蠟。
本發(fā)明也提供一種制備所述藥物組合物的方法，它包括將所述組分同時或相繼混合。
另一方面，本發(fā)明提供識別煙堿受體激動劑正性調(diào)節(jié)劑的方法。如果在飽和濃度nAChRα7受體激動劑ACh存在下，測定基線到峰值的電流(參見實驗方法)，當所誘發(fā)的電流超過對照電流200％(100％增效)時，認為化合物是“正性調(diào)節(jié)劑”。對照電流定義為在不存在調(diào)節(jié)劑情況下由激動劑誘發(fā)的電流。ACh飽和濃度的定義為對所使用特異性nAChRα7型而言為EC50的10倍。EC50定義為誘發(fā)一半最大反應(yīng)的濃度。一般來說，nAChRα7子型的EC50值的范圍在100-300μM(Bertrand等人(1992)“神經(jīng)科學(xué)通訊”146，87-90；Peng等人(1994)“分子藥理學(xué)”45，546-554)。此外，如果在飽和濃度激動劑存在下，通過所述受體的總電流(流出)超過200％對照電流，認為該化合物是“正性調(diào)節(jié)劑”?？傠娏鞯囊环N度量是在激動劑施用過程中曲線(電流蹤跡)下的面積。
因此，本發(fā)明識別煙堿受體激動劑正性調(diào)節(jié)劑的方法可包括步驟(a)在細胞表面表達煙堿受體；(b)將所述煙堿受體與已知是煙堿受體激動劑的化合物和準備測定其正調(diào)節(jié)活性的化合物接觸；(c)測定所述待測定化合物對所述煙堿受體激動劑的作用是否顯示正調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致電流振幅(通過測定基線到峰值間的電流值)或總電流(通過電流蹤跡曲線下面積測定)大于對照物200％(100％增效)。所述細胞可以是非洲蟾蜍屬卵母細胞、HEK-293細胞或培養(yǎng)的神經(jīng)元。所述煙堿受體可以是人、大鼠、雞、小鼠或牛的煙堿受體。
另一方面，本發(fā)明涉及識別煙堿受體激動劑正性調(diào)節(jié)劑的方法，所述煙堿受體是α7-煙堿受體。
另一方面，本發(fā)明提供識別作為煙堿受體激動劑化合物的方法，所述方法包括步驟(a)在細胞表面表達煙堿受體；(b)在煙堿受體激動劑的正性調(diào)節(jié)劑存在下，將所述煙堿受體與準備測定其煙堿受體激動劑活性的化合物接觸；(c)測定所述待測定化合物是否顯示煙堿受體激動劑活性。所述細胞可以是非洲蟾蜍屬卵母細胞、HEK-293細胞或培養(yǎng)的神經(jīng)元。所述煙堿受體可以是人、大鼠、雞、小鼠或牛的煙堿受體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，“煙堿受體激動劑活性”可通過本領(lǐng)域已知的方法，如下面的“實驗方法”部分所描述的那些方法測定。
另一方面，本發(fā)明涉及識別作為煙堿受體激動劑化合物的方法，所述煙堿受體是α7-煙堿受體。
實驗方法(a)非洲蟾蜍屬卵母細胞的電流記錄非洲蟾蜍屬卵母細胞提供了一種估價認為是配體選通離子通道子單元的蛋白質(zhì)功能的有力手段。注射由編碼適宜受體子單元的cDNA克隆轉(zhuǎn)錄的RNA，或注射其編碼序列置于啟動子下游的cDNA，結(jié)果在卵母細胞表面出現(xiàn)功能性配體選通離子通道(例如參見Boulter等人(1987)“美國國家科學(xué)院學(xué)報”84，7763-7767)。
因此，一種方便的評價煙堿功效增強作用的技術(shù)是記錄表達來自cRNA的α7-煙堿受體的非洲蟾蜍屬卵母細胞的雙電極箝位電壓。
將有爪蟾蜍屬青蛙(非洲蟾蜍屬I，Kalamazoo，MI)用0.15％三卡因麻醉。將卵母細胞取出放到OR2溶液(82mM NaCl，2.5mM KCl，5mM HEPES，1.5mM NaH2PO4，1mM MgCl2，0.1mM EDTA；pH7.4)中。在以1Hz的頻率振動的振動臺上，在25ml含0.2％膠原酶1A(Sigma)的OR2中孵育兩次60分鐘，將所述卵母細胞去卵泡(defolliculate)，并貯存在Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基(50μg/ml慶大霉素、10單位/ml青霉素和10μg/ml鏈霉素)中。第二天，每個卵母細胞注射大約50ng cRNA。cRNA是通過使用Message Machine(購于Abion)，由cDNA合成的。
外部的記錄用溶液是由90mM NaCl、1mM KCl、1mM MgCl2、1mM BaCl2和5mM HEPES組成，pH7.4。通過使用卵母細胞箝位放大器(OC 725C；Warner Instrument，Hamden，CT)進行雙電極箝位電壓記錄。將卵母細胞用充滿3M KCl并且尖端電阻為1-2MΩ的兩個電極刺穿。當膜電位穩(wěn)定在負值至-20mV時開始記錄(當槽液中用Ba++代替Ca++時，靜止膜電位是較小負值)。膜電位固定在-80mV。ACh購于Sigma.
將卵母細胞用含或不含ACh的記錄溶液連續(xù)灌注(5ml/min)。
測定基線到峰值的電流振幅。通過用GraphPad Prism(GraphPadSoftware，Inc.，San Diego，CA)將數(shù)據(jù)調(diào)整使之適合對數(shù)方程式來估測EC50值、最大作用和Hill斜率。
可通過兩種方法計算由正性調(diào)節(jié)劑誘發(fā)的激動劑功效的提高(1)、以電流振幅增強百分數(shù)計算，所述電流振幅增強定義為100(Im-Ic)/Ic，其中Im是調(diào)節(jié)劑存在下的電流振幅，而Ic是不存在調(diào)節(jié)劑下的電流振幅(圖1)。
(2)、以激動劑蹤跡“曲線下面積”增效百分數(shù)計算。曲線下面積是通過通道的總離子流量的一般表示方法(圖2)。在圖2所顯示的實例中，盡管電流振幅不增加，但在激動劑應(yīng)用的持續(xù)時間內(nèi)，曲線下面積大約超過對照組100％。
(b)Ca2+流量成像將在細胞系中瞬時表達的nAChRα7受體中流過的Ca2+流量成像，是評價調(diào)節(jié)劑活性的另一方法。
將表達α7受體的細胞(例如HEK-293細胞或細胞培養(yǎng)的神經(jīng)元)在96孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并加入熒光鈣指示劑fluo-3。為了篩選α7的調(diào)節(jié)活性，將96孔培養(yǎng)皿放在熒光成像板讀數(shù)器(FLIPR)上，并將試驗化合物與α7激動劑一起同時加于所有孔中。通過流入細胞中的鈣來測定受體的激活作用，其中所述流入細胞中的鈣是由各孔中熒光強度的增強來定量的。同時由FLIPR進行記錄。通過超過單獨應(yīng)用激動劑的熒光增強來測定調(diào)節(jié)劑作用。類似地，為了測定nAChRα7激動劑的活性，將試驗化合物與α7調(diào)節(jié)劑一起同時加于所有孔中。通過流入細胞中的鈣來測定受體的激活作用，其中所述流入細胞中的鈣是由各孔中熒光強度的增強來定量的。同時由FLIPR進行記錄。通過超過單獨應(yīng)用調(diào)節(jié)劑的熒光增強來測定激動劑的作用。
按照下列方法制備細胞培養(yǎng)的神經(jīng)元將18天齡的Sprague-Dawley鼠胎兒(E-18)從懷孕雌性鼠的體內(nèi)無菌取出，處死，取出腦的額皮質(zhì)，將腦膜剝離，并將干凈的皮質(zhì)放到冷卻的HBSS中。如果想要海馬，將海馬從所述皮質(zhì)中切下來，然后放到冷卻的HBSS中。通過機械操作將組織分散開，在HBSS中洗滌一次(在4℃下，200g 30分鐘)，重新懸浮在其中補加了谷氨酰胺、抗生素、氯化鉀、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和5％加熱滅活胎牛血清(FBS；不含內(nèi)毒素)的改良Sato氏培養(yǎng)基中，并放入24孔培養(yǎng)皿的各孔(涂布聚L-賴氨酸)中。各孔上也可能包括涂布了PLL的條狀玻璃蓋板。將培養(yǎng)皿在37℃下的CO2恒溫箱中培養(yǎng)。24小時后除去培養(yǎng)基，加入新鮮的培養(yǎng)基，并讓細胞再生長至少11天，必要時供給細胞養(yǎng)料。


圖1由激動劑激起的電流蹤跡模型，它表示通過測定電流振幅來測定激動劑功效的提高。橫杠表示施用化合物的持續(xù)時間。
圖2由激動劑激起的電流蹤跡模型，它表示通過測定“曲線下面積”來測定激動劑功效的提高。箭頭表示ACh電流和ACh+調(diào)節(jié)劑電流重迭部分。橫杠表示施用化合物的持續(xù)時間。
圖35-羥基吲哚對α7-煙堿受體的ACh活性的影響。100％的電流值是由ACh曲線外推到的最大值。
(●)Ach(O)Ach+0.5mM 5-羥基吲哚圖45-羥基吲哚對以非洲蟾蜍屬卵母細胞表達的α7-煙堿受體(人、鼠和小雞)的ACh活性的影響。
圖55-羥基吲哚對以非洲蟾蜍屬卵母細胞表達的α7-煙堿受體的Ach(公開出售的產(chǎn)品)和(-)-螺[1-氮雜二環(huán)[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮(提供的產(chǎn)品)活性的影響。
圖6nAChRα7調(diào)節(jié)劑對激動劑活性的影響，它是由Ca2+通過以HEK-293細胞表達的nAChRα7的流量測定的。所述激動劑由(-)-螺[1-氮雜二環(huán)[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮表示。
具體實施例方式
實施例1通過測定煙堿受體激動劑與試驗化合物的聯(lián)合作用來評價煙堿受體激動劑功效的改變。一般地，實驗方法由下列兩步組成，即用試驗化合物預(yù)處理并一同使用激動劑和試驗化合物。進行5-羥基吲哚在500μM濃度下對ACh的濃度范圍的實驗。首先試驗ACh本身以便確定EC50和最大反應(yīng)。然后與5-羥基吲哚一起使用相同濃度的ACh。結(jié)果(見圖3)是ACh的最大反應(yīng)增加(增加的最大幅度為2倍)。
確定5-OHi(0.5mM)對飽和濃度激動劑(3mM ACh)的“曲線下面積”的影響。5-OHi引起曲線下面積的明顯增加(增加～400％)(見圖4)。
使用5-羥基吲哚本身不誘導(dǎo)注射α7煙堿受體cRNA的卵母細胞產(chǎn)生電流。
實施例2試驗5-羥基吲哚對各種煙堿激動劑的影響。由5-羥基吲哚所產(chǎn)生的效果增加見之于所有試驗的煙堿激動劑，如(-)-螺[1-氮雜二環(huán)[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮(圖5)。在有(+)和無(-)調(diào)節(jié)劑下，ACh(3mM)產(chǎn)生斷續(xù)的箱式電流。在有(+)和無(-)調(diào)節(jié)劑下，稱為AR-R 17779(μM)的煙堿激動劑產(chǎn)生連續(xù)的箱式電流。在該例中調(diào)節(jié)劑為1mM5-Ohi。
具有類似結(jié)果的試驗化合物包括(-)煙堿和膽堿(數(shù)據(jù)未顯示)。所以效果對任何膽堿能激動劑來說似乎是普遍的。
實施例3由5-羥基吲哚產(chǎn)生的功效的提高在任何其它煙堿受體，例如，小鼠肌肉型煙堿受體上未觀察到。
實施例4試驗一系列相關(guān)化合物對ACh活性的正調(diào)節(jié)作用。僅僅有少數(shù)化合物保留增強功效的活性。具體來說，5-羥色胺不增強功效。極為相近的類似物的初步分析表明，有相當密切的結(jié)構(gòu)效果關(guān)系，暗示該作用有選擇性位點。
實施例5通過Ca2+在HEK-293細胞中表達的nAChRα7中的流量，測量nAChRα7調(diào)節(jié)劑對激動劑活性的影響。使用煙堿激動劑(-)-螺[1-氮雜二環(huán)[2.2.2.]辛烷-3，5*-噁唑烷]-2*-酮。結(jié)果顯示在圖6中。僅僅存在激動劑(沒有調(diào)節(jié)劑)未獲得可見的信號。在激動劑和調(diào)節(jié)劑同時存在時，可見激動劑活性明顯增加。
權(quán)利要求
1.一種識別煙堿受體激動劑化合物的方法，所述方法包括步驟(a)在細胞表面表達煙堿受體；(b)在煙堿受體激動劑的正性調(diào)節(jié)劑存在下，將所述煙堿受體與準備測定其煙堿受體激動劑活性的化合物接觸；(c)測定是否所述待測化合物顯示煙堿受體激動劑活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞是非洲蟾蜍屬卵母細胞，HEK-293細胞或細胞培養(yǎng)的神經(jīng)元。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述煙堿受體是α7-煙堿受體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述煙堿受體是人、大鼠、雞、小鼠或牛的煙堿受體。
5.一種可通過權(quán)利要求1的方法識別的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及含煙堿受體激動劑正性調(diào)節(jié)劑的藥物組合物，所述正性調(diào)節(jié)劑具有增強所述煙堿受體激動劑功效的能力。
文檔編號A61K45/00GK1637149SQ20041008806
公開日2005年7月13日 申請日期1999年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月4日
發(fā)明者D·古爾利, T·蘭托恩 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司