專利名稱：重組水皰性口炎病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的病毒基因工程領(lǐng)域，具體地講，本發(fā)明涉及腫瘤生物治療領(lǐng)域的腫瘤特異性增殖溶瘤病毒治療領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及既能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖以裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)又隨著病毒的增殖復(fù)制能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因蛋白的重組水皰性口炎病毒的構(gòu)建、制備、生產(chǎn)方法，含有該重組水皰性口炎病毒的藥物或藥物組合物，以及使用含該重組水皰性口炎病毒的藥物或藥物組合物治療局部腫瘤及轉(zhuǎn)移腫瘤的方法。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)后期近30年以來我國的癌癥發(fā)病率一直呈上升的趨勢。隨著烈性傳染病得以控制，新生兒死亡率大幅度下降，平均壽命延長，到90年代初，癌癥已僅次于心腦血管病，成為排在第二位的死亡原因，90年代末，則升至第一位。根據(jù)1973-1975年及1990-1992年兩次中國范圍的死因調(diào)查，近20年期間惡性腫瘤在死因中的構(gòu)成比，自70年代的12.6％升至90年代的17.9％。惡性腫瘤的病死率在此近20年期間也呈上升趨勢，1997年公布的中國90年代人口死亡原因抽樣結(jié)果顯示，癌癥死亡率為124.46/10萬(世界調(diào)整標(biāo)化率)，比70年代增長了29.4％，消除年齡構(gòu)成不同的影響，增長率為11.6％，年死亡人數(shù)也已由90萬人增至130萬人以上。
據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，1997年世界新發(fā)癌癥患者924萬人，死亡623.5萬人；我國每年新發(fā)癌癥患者160萬人，死亡130萬人。在不到20年的時(shí)間里，我國癌癥發(fā)病率上升69％，死亡率增長29％；在我國2.7億個(gè)家庭中，平均每90個(gè)家庭中就有1個(gè)癌癥病人。
根據(jù)國家衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及專家的保守估計(jì)，我國目前現(xiàn)有癌癥患者450萬人，每年我國新診腫瘤患者約160萬人，腫瘤患者年死亡約130萬人。
眾所周知，臨床上治療腫瘤最常用的傳統(tǒng)的腫瘤手術(shù)切除和放化療療法，在給患者帶來極大的痛苦和負(fù)擔(dān)的同時(shí)，并沒有獲得理想的治療效果，特別是對中晚期惡性腫瘤患者，甚至有加速其死亡的可能。而且，對轉(zhuǎn)移性腫瘤患者而言，一方面很難將腫瘤徹底手術(shù)切除或通過放化療療法徹底殺滅；另一方面，切除原位腫塊，往往有引發(fā)腫瘤在身體其它部位生長的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果反而加速了腫瘤的擴(kuò)散。腫瘤的免疫治療是以激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，以達(dá)到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。腫瘤免疫治療的方法包括應(yīng)用一些免疫調(diào)節(jié)劑通過非特異性地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，以達(dá)到治療腫瘤的目的非特異性免疫治療；給機(jī)體輸入具有抗原性的瘤苗，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤免疫以治療腫瘤的主動(dòng)免疫治療；以及給機(jī)體輸注外源的免疫效應(yīng)物質(zhì)，由這些外源性效應(yīng)物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮治療腫瘤作用的被動(dòng)免疫治療。腫瘤的免疫治療只能清除少量的、播散的腫瘤細(xì)胞，對于晚期的實(shí)體腫瘤療效有限，因而僅作為一種輔助療法與手術(shù)、化療、放療等常規(guī)療法聯(lián)合應(yīng)用。一般先用常規(guī)療法清掃大量的腫瘤細(xì)胞后，再用免疫療法清除殘存的腫瘤細(xì)胞。雖然目前已經(jīng)建立了多種免疫方法，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了一些良好療效，但在臨床應(yīng)用時(shí)受到很多因素的影響，其臨床治療的效果尚很有限。
由于惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，且目前仍缺乏有效的治療手段，常規(guī)治療的治愈率低，復(fù)發(fā)率及死亡率高、預(yù)后較差，因此，通過改造基因來治療疾病的基因治療概念一經(jīng)提出，很快就被應(yīng)用至腫瘤治療。從80年代初提出腫瘤的基因治療，到90年初進(jìn)入臨床試驗(yàn)，人們對腫瘤的基因治療抱有很高的熱情，一段時(shí)間以來腫瘤基因治療研究如火如荼，基因治療被普遍認(rèn)為是人類最終征服腫瘤的希望。
腫瘤基因治療常使用下列基因自殺基因HSV-TK(單純皰疹病毒的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶)，CD(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)及細(xì)胞色素P450；抑癌基因P53，P16及Rb，抗血管生成基因Angiostatin(血管生成抑制因子)和Endostatin(內(nèi)皮抑制素)；免疫基因白細(xì)胞介素IL-4、12，干擾素IFN-α、β、γ，熱休克蛋白HSP70和GRP94/GP96等。然而經(jīng)過近二十年500多個(gè)腫瘤的基因治療臨床試驗(yàn)方案的研究，其結(jié)果遠(yuǎn)非象人們所希望的哪樣理想，臨床研究的結(jié)果顯示腫瘤的基因治療是非常安全的，但其抗腫瘤效應(yīng)也非常低，有的單獨(dú)應(yīng)用甚至無任何治療作用。分析起來，主要原因是現(xiàn)階段基因治療的載體系統(tǒng)在人體內(nèi)既不能特異性轉(zhuǎn)染所有的腫瘤細(xì)胞，也不能使治療基因在腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)，因而不能徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，這嚴(yán)重阻礙著腫瘤基因治療的臨床療效。在腫瘤病人體內(nèi)，如果只能殺滅部分腫瘤細(xì)胞，殘留少部分細(xì)胞(那怕只有1％腫瘤細(xì)胞)也會(huì)很快生長，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此如何進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)染率、抗癌基因的表達(dá)量及靶向腫瘤的特異性成為目前腫瘤基因治療的關(guān)鍵難題，直接決定著腫瘤治療的療效，甚至腫瘤基因治療的成敗。
腫瘤特異性增殖溶瘤病毒治療的發(fā)現(xiàn)曾為腫瘤的治療帶來了一線曙光。約百年來前就偶有腫瘤病人在某種病毒感染后會(huì)出現(xiàn)腫瘤暫時(shí)性消退的現(xiàn)象，引起醫(yī)學(xué)家的關(guān)注，開始尋找能殺滅腫瘤細(xì)胞的病毒。至1970年，人們已發(fā)現(xiàn)了38種在動(dòng)物或人體體內(nèi)具有抗腫瘤活性的病毒，并開始在晚期腫瘤病人中進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但當(dāng)時(shí)只能應(yīng)用病毒的粗提物，其療效并不顯著，治療后病人平均生存期很短。溶瘤病毒具有多方面的性質(zhì)，其經(jīng)改造后能產(chǎn)生更加有選擇性的抗腫瘤效果。在將來，有可能獲得靶向特異性腫瘤抑制途徑或靶向腫瘤細(xì)胞表面不同受體的溶瘤病毒。溶瘤病毒治療腫瘤在臨床上已取得了初步成功，但大量經(jīng)驗(yàn)表明，許多治療腫瘤的新方法在研究早期均有明確療效，最終往往令人失望，雖然可以肯定溶瘤病毒可使腫瘤萎縮甚至消失，但其最終對腫瘤的療效的判斷還需要更長時(shí)間，并且溶瘤病毒單獨(dú)應(yīng)用的臨床療效均不十分理想，需要聯(lián)合常規(guī)化療才能取得令人滿意的臨床療效。
腫瘤生長最顯著的特征之一是通過新生血管的形成以滿足腫瘤的血供需要。腫瘤細(xì)胞能分泌大量促進(jìn)血管生長的許多血管生長因子，使腫瘤形成新的血管而快速生長，而血管內(nèi)皮細(xì)胞也可分泌血管生長因子促使血管內(nèi)皮細(xì)胞自身乃至腫瘤細(xì)胞的增殖。毛細(xì)血管如果沒有血管生長因子誘導(dǎo)不會(huì)同腫瘤相連接，腫瘤如果沒有血管生長和得不到源源不斷的血液供應(yīng)就只能處于休眠狀態(tài)。因此，利用血管生成抑制劑特異性地抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和活性，從而抑制腫瘤新生血管的生成，阻斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡，同時(shí)達(dá)到抑制腫瘤的生長和阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移通路的目的而不影響其它正常細(xì)胞，這就是腫瘤的抗血管生成療法。內(nèi)皮抑素(Endostatin)及血管抑素(Angiostatin)是目前認(rèn)為最強(qiáng)的血管生成抑制因子，具有高效抑制腫瘤新生血管的形成從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、即使數(shù)百倍劑量在人體中也無毒副作用及反復(fù)應(yīng)用也無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。目前內(nèi)皮抑素在國內(nèi)外均已進(jìn)入II期臨床研究，但目前使用其蛋白質(zhì)治療的最大難題是需要每天進(jìn)行，同時(shí)需要量也極大，即使作用最強(qiáng)的內(nèi)皮抑素治療的劑量也高達(dá)500～1000mg，無論從經(jīng)濟(jì)上或生產(chǎn)上均不堪負(fù)擔(dān)切極不現(xiàn)實(shí)。近年，國內(nèi)有人將內(nèi)皮抑素轉(zhuǎn)入經(jīng)過基因改造過的腺病毒載體而構(gòu)建出重組人內(nèi)皮抑素腺病毒Ad-Endo，但使用的重組腺病毒不是腫瘤增殖病毒，僅僅是攜帶Endostatin基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的一種基因治療載體。
因此，迄今為止，傳統(tǒng)的手術(shù)治療和放化療對機(jī)體本身造成傷害而且難以消除轉(zhuǎn)移性腫瘤；瘤基因治療在臨床上均證實(shí)是非常安全的，但急需進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染率、抗癌基因的表達(dá)量及靶向腫瘤的特異性，現(xiàn)階段用病毒等作為載體對腫瘤進(jìn)行的基因治療不僅只能針對局部腫瘤，對轉(zhuǎn)移性腫瘤也無能為力，而且療效非常有限；腫瘤溶瘤病毒治療雖和腫瘤基因治療一樣在臨床上均證實(shí)是非常安全的，但單獨(dú)應(yīng)用的臨床療效均不十分理想，需要聯(lián)合常規(guī)化療才能取得令人滿意的臨床療效；腫瘤的抗血管生成療法使用蛋白質(zhì)治療，需要每天進(jìn)行極高劑量的治療，似乎僅具有研究意義而從經(jīng)濟(jì)上和生產(chǎn)上均不太現(xiàn)實(shí)；用白介素、干擾素等細(xì)胞因子對腫瘤進(jìn)行免疫治療只能激發(fā)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)和很少的CTL細(xì)胞介導(dǎo)的對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)；最近發(fā)展的“癌癥疫苗”療法強(qiáng)調(diào)個(gè)體特性，不僅非常昂貴且沒有普遍適用性。
近二十年來，隨著分子生物學(xué)、分子病毒學(xué)及腫瘤學(xué)的發(fā)展，特別是基因組學(xué)的重大進(jìn)展，已完成了許多病毒的全部基因組測序工作，并對其基因的結(jié)構(gòu)及其功能進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，能有效地對病毒基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。病毒具有感染、復(fù)制增殖和溶解細(xì)胞的能力，經(jīng)過修飾的病毒使其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的這些效應(yīng)得到有效加強(qiáng)，病毒一旦感染腫瘤細(xì)胞即可在細(xì)胞內(nèi)增殖并裂解腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞裂解后釋放的病毒顆粒再次感染其它細(xì)胞，直至將全部腫瘤細(xì)胞殺滅，修飾后的病毒其特異性更高，已經(jīng)不能在正常細(xì)胞內(nèi)增殖，故對正常細(xì)胞影響不太，從而使修飾后的病毒只能在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖，這樣正常細(xì)胞損害不大，這種病毒即是腫瘤特異性增殖溶瘤病毒，簡稱為腫瘤增殖病毒或溶瘤病毒。與此同時(shí)，對各種病毒的純化及濃集方案也日趨成熟，能夠大量制備高純度、高效價(jià)的病毒，為開發(fā)這種病毒制劑在腫瘤治療的應(yīng)用提供了可能性。
近年來，對呼吸道腸道病毒(reovirus)、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、自主微小病毒(parvovirus)及水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)等幾種天然存在的可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的溶瘤病毒的研究為腫瘤的治療帶來了新的希望，它不僅可能拯救陷入困境的腫瘤基因治療和抗血管生成蛋白治療，更可能最終成為人類戰(zhàn)勝癌癥惡魔的制勝武器。
水泡狀口炎病毒(VSV)對干擾素非常敏感，廣泛應(yīng)用于干擾素的活性檢測。在正常細(xì)胞中由于干擾素傳導(dǎo)信號(hào)途徑正常，故干擾素發(fā)揮有效的功能，從而抑制VSV在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)由于干擾素傳導(dǎo)信號(hào)途徑異常，故干擾素不能起效，VSV能有效復(fù)制，從而達(dá)到特異性殺滅腫瘤細(xì)胞。
VSV在分類上屬于彈狀病毒科(rhabdovirus)水泡病毒屬，是彈狀病毒科的典型代表。在已經(jīng)過去的30年里，被廣泛用作分子和細(xì)胞生物學(xué)工具，其被普遍應(yīng)用是由于其結(jié)構(gòu)簡單并能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和許多其它種類細(xì)胞中快速生長并達(dá)到高滴度。VSV同樣為其他具有單一負(fù)鏈RNA基因組的RNA病毒的研究提供了模式，這使得其基因組結(jié)構(gòu)被研究得十分清楚。VSV病毒每一個(gè)均編碼并產(chǎn)生一個(gè)RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)，此酶轉(zhuǎn)錄11161nt的基因組RNA并產(chǎn)生亞基因組mRNA(subdenomic mRNA)，也可通過不同的機(jī)制復(fù)制完整的基因組RNA。VSV亞基因組mRNA編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白1個(gè)核殼體蛋白(nucleocapsid protein)N，兩個(gè)多聚酶亞單位(polymerase subunits)L和P，1個(gè)基質(zhì)蛋白(matrix protein)M及1個(gè)轉(zhuǎn)膜糖蛋白(transmembrane glycoprotein)G。VSV的轉(zhuǎn)錄從基因組RNA的3’端順序進(jìn)行，先產(chǎn)生一短的引導(dǎo)序列(Leader)，再依次是五個(gè)mRNA。
病毒作為選擇性溶解及殺滅腫瘤的制劑雖已有很長的歷史，但是進(jìn)一步用基因操縱和基因重組技術(shù)、通過遺傳工程改造基因成分產(chǎn)生腫瘤選擇性的病毒則是近幾年的事。雖然VSV mRNA和基因組的完整序列已經(jīng)明了多年，但直到最近利用重組DNA技術(shù)改造VSV并從DNA重獲VSV才成為可能?；贒NA的單一負(fù)鏈RNA病毒重獲系統(tǒng)使得傳染性病毒的基因工程和遺傳工程成為可能。
迄今的研究發(fā)現(xiàn)，VSV具有如下優(yōu)良的特性特異性和有效性水泡狀口炎病毒(VSV)對干擾素非常敏感，廣泛應(yīng)用于干擾素的活性檢測。在正常細(xì)胞中由于干擾素傳導(dǎo)信號(hào)途徑正常，故干擾素發(fā)揮有效的功能，從而抑制VSV在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制(病毒滴度＜10PFU/ml；而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)由于干擾素傳導(dǎo)信號(hào)途徑異常，故干擾素不能起效，VSV能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性增殖(除個(gè)別例外，病毒滴度＞3×106PFU/ml，甚至高達(dá)5×109PFU/ml)，并導(dǎo)致其裂解從而達(dá)到特異性高效殺滅腫瘤細(xì)胞。
安全性及可控性VSV基因組結(jié)構(gòu)簡單清楚，遺傳穩(wěn)定，增值機(jī)理及致病基因清晰，不整合到人的基因組，感染所導(dǎo)致的人類疾病輕微并已熟知，且由于其對干擾素非常敏感，在不需要或發(fā)生緊急情況時(shí)可用干擾素予以徹底清除，因而安全性及可溶性均非常高。可獲得性VSV能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和許多其它種類細(xì)胞中快速生長并達(dá)到高滴度，病毒生產(chǎn)及純化工藝簡單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高。
適用性VSV在體內(nèi)能感染多種組織及細(xì)胞，能在除腦部腫瘤外(因血腦屏障原因)絕大部分腫瘤細(xì)胞中，包括血液腫瘤細(xì)胞中特異性增殖并溶解殺死腫瘤細(xì)胞，抗瘤譜廣，具有廣泛的適應(yīng)性。
資源適應(yīng)性可以使用現(xiàn)有的抗腫瘤藥物研究的動(dòng)物模型來進(jìn)行臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，包括藥效學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)既要代動(dòng)力學(xué)等研究。
近二十年來，隨著分子生物學(xué)、分子病毒學(xué)及腫瘤學(xué)的發(fā)展，特別是基因組學(xué)的重大進(jìn)展，已完成了許多病毒的全部基因組測序工作，并對其基因的一結(jié)構(gòu)及其功能進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，能有效地對病毒基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。病毒具有感染、復(fù)制增殖和溶解細(xì)胞的能力，經(jīng)過修飾的病毒使其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)這些效應(yīng)得到有效加強(qiáng)，病毒一旦感染腫瘤細(xì)胞即可在細(xì)胞內(nèi)增殖并裂解腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞裂解后釋放的病毒顆粒再次感染其它細(xì)胞，直至將全部腫瘤細(xì)胞殺滅，但修飾后的病毒應(yīng)該不能在正常細(xì)胞內(nèi)增殖，故對正常細(xì)胞影響不太，從而使修飾后的病毒只能在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖，這樣正常細(xì)胞損害不大，這種病毒即是腫瘤特異性增殖溶瘤病毒，簡稱為腫瘤增殖病毒或溶瘤病毒。與此同時(shí)，對各種病毒的純化及濃集方案也日趨成熟，能夠大量制備高純度、高效價(jià)的病毒，為開發(fā)這種病毒制劑在腫瘤治療的應(yīng)用提供了可能性。
病毒作為選擇性溶解及殺滅腫瘤的制劑已有很長的歷史，但是進(jìn)一步用基因工程改造基因成分產(chǎn)生腫瘤選擇性的病毒則是近幾年的事。腫瘤特異性增殖溶瘤病毒具有多方面的性質(zhì)，并經(jīng)改造后能產(chǎn)生更加有選擇性的抗腫瘤效果。在將來，有可能獲得靶向特異性腫瘤抑制途徑的腫瘤特異性增殖溶瘤病毒或靶向腫瘤細(xì)胞表面不同受體的腫瘤特異性增殖溶瘤病毒。無論是毒性還有有效性方面，進(jìn)一步明確免疫系統(tǒng)在限制或增強(qiáng)抗腫瘤效果的作用可進(jìn)一步完善病毒作用。
腫瘤特異性增殖溶瘤病毒治療的高特異性和安全性為腫瘤基因治療所面臨的難題提供了一種極好的解決方法，一種全新的結(jié)合基因治療與病毒治療的腫瘤治療新策略—腫瘤基因-病毒療法為腫瘤治療開辟了廣闊的前景。
腫瘤基因-病毒療法，即應(yīng)用腫瘤特異性增殖病毒攜帶抗癌基因，利用該病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖及復(fù)制，其抗癌基因基因拷貝數(shù)成千上萬倍增加，從而數(shù)百倍乃至上萬倍提高抗癌基因的表達(dá)量。由于病毒在正常細(xì)胞內(nèi)不增殖，從而使抗癌基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性且高效表達(dá)，它克服了傳統(tǒng)腫瘤基因治療的轉(zhuǎn)染率低、靶向性差、抗瘤基因表達(dá)量低以及病毒治療對腫瘤殺傷力不足的缺點(diǎn)。這種新型的腫瘤治療新方案充分利用了病毒體積小、彌散力及復(fù)制力均較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶局部形成高濃度病毒，從而達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。同時(shí)由于病毒攜帶抗癌基因，該基因隨著病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，從而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)抗癌基因，兩者協(xié)同作用將進(jìn)一步提高抗腫瘤的療效。這種方案與傳統(tǒng)腫瘤基因治療的病毒載體有本質(zhì)不同，所謂載體從本意上講是一種運(yùn)送工具，即將抗癌基因運(yùn)輸至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而其載體本身而言并無治療作用。而基因-病毒系統(tǒng)是利用病毒將基因特異地運(yùn)至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，其抗癌基因隨著病毒在腫瘤細(xì)胞復(fù)制，使基因拷貝數(shù)成千上萬倍增加，數(shù)百倍乃至上萬倍提高抗癌基因的表達(dá)量，從而殺滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)病毒本身也有直接裂解腫瘤的作用，并激發(fā)疫苗反應(yīng)，因此基因-病毒系統(tǒng)對腫瘤具有雙重治療作用。
腫瘤基因治療常使用下列基因同樣可以應(yīng)用于腫瘤基因-病毒療法自殺基因HSV-TK(單純皰疹病毒的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶)，CD(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)及細(xì)胞色素P450；抑癌基因P53、pRB，抗血管生成基因Angiostatin(血管生成抑制因子)和Endostatin(內(nèi)皮抑制素)；免疫基因白細(xì)胞介素IL-4、12，干擾素IFN-α、β、γ，熱休克蛋白HSP70和GRP94/GP96等。利用分子生物學(xué)手段，通過基因工程方法將這些基因與腫瘤特異性增殖溶瘤病毒進(jìn)行基因重組，獲得的基因工程重組病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖及復(fù)制，從而使攜帶的抗癌基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性且高效地表達(dá)，由此而產(chǎn)生對腫瘤的雙重治療作用，而在正常細(xì)胞內(nèi)既不增殖，也不表達(dá)，確保對正常細(xì)胞和組織的安全性。現(xiàn)有的研究表明，VSV的M蛋白是具有多種功能，并為包括宿主基因表達(dá)抑制等幾種關(guān)鍵的病毒功能所要求。VSV M所具有的抑制宿主基因表達(dá)的特性是由于其阻斷宿主RNA聚合酶活性或抑制蛋白和mRNA進(jìn)出宿主細(xì)胞核的核轉(zhuǎn)運(yùn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與野生型印第安那株VSV(VSVwt)相比，其VSV M發(fā)生了點(diǎn)突變的VSV天然減毒突變株51位氨基酸點(diǎn)突變的VSVM51R、221位和226位氨基酸點(diǎn)突變的VSVM221F+226R。細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，這兩種天然減毒突變株在表皮細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性IFN-α的能力比VSVwt高20～50倍，從而使得其在保有原有溶解腫瘤能力的基礎(chǔ)上，特異性大大提高而對正常細(xì)胞和組織的毒性大大降低。
近年，國內(nèi)有人將內(nèi)皮抑素轉(zhuǎn)入經(jīng)過基因改造過的腺病毒載體而構(gòu)建出重組人內(nèi)皮抑素腺病毒Ad-Endo，但使用的重組腺病毒僅僅是攜帶Endostatin基因選擇性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的一種基因治療載體，尚不能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性高滴度增殖，如上海韋池生物技術(shù)公司的鄭嚴(yán)光的公開發(fā)明專利“01119903肝癌細(xì)胞特異的基因工程腺病毒的構(gòu)建及應(yīng)用”和廣東黃文林的授權(quán)發(fā)明專利“01127894一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子的重組病毒”。
發(fā)明概述本發(fā)明總的目的在于以水皰性口炎病毒為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)手段、通過基因工程方法構(gòu)建一種能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖并同時(shí)表達(dá)具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因的基因重組溶瘤病毒，并以其為主要藥效成分組成藥物或藥物組合物，以及施用這種藥物或藥物組合物于腫瘤患者以殺滅其體內(nèi)的腫瘤。具體來講，本發(fā)明包括如下幾個(gè)方面本發(fā)明是以水皰性口炎病毒為基礎(chǔ)，首先人工合成帶有限制性酶且位點(diǎn)XhoI和NheI的連接序列，利用分子生物學(xué)手段、通過基因工程方法，將其插入到VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或VSVM51Δ基因組中G蛋白與L蛋白之間G蛋白的非編碼區(qū)，并以此結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)分別構(gòu)建出用于創(chuàng)建重組水皰性口炎病毒的pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因組質(zhì)粒；以四個(gè)pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因組質(zhì)粒為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)手段、通過基因工程方法構(gòu)建一種能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖并同時(shí)表達(dá)具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因(Anti-tumor foreign gene，ATFG)的基因重組溶瘤病毒rVSVwt-ATFG、rVSVM51R-ATFG、rVSVM221F+226R-ATFG或rVSVM51 Δ-ATFG。這些具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因ATFG包括但不限于自殺基因HSV-TK(單純皰疹病毒的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶)，CD(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)及細(xì)胞色素P450；抑癌基因p53，p16及pRB；抗血管生成基因Angiostatin(血管生成抑制因子)和Endostatin(內(nèi)皮抑制素)；免疫基因白細(xì)胞介素IL-4、12，干擾素IFN-α、β、γ，熱休克蛋白HSP70和GRP94/GP96；以及保有這些基因的作用功能的多肽片斷。本發(fā)明的又一目的在于提供一種藥物或藥物組合物，其主要藥效成分為本發(fā)明的基因工程重組水皰性口炎病毒rVSVwt-ATFG、rVSVM51R-ATFG、rVSVM221F+226R-ATFG或rVSVM51Δ-ATFG。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種治療腫瘤、特別是惡性腫瘤的方法，該方法包括給腫瘤患者施用有效劑量的本發(fā)明的藥物或藥物組合物以殺滅其體內(nèi)的腫瘤。
附表簡述附表1是本發(fā)明所述的野生型水皰性口炎病毒印第安娜株的基因組核酸序列。
野生型水皰性口炎病毒印第安娜株的基因組核酸序列全長共11161個(gè)堿基。
附表2是野生型水皰性口炎病毒VSVwt、發(fā)生了M蛋白點(diǎn)突變的兩個(gè)VSV天然減毒突變株及一個(gè)重組減毒突變株的M蛋白氨基酸序列。
其中天然減毒突變株VSVM51R突變位點(diǎn)為51R，VSVM221F+226R突變位點(diǎn)為221F及226R，VSVM51Δ為M51缺失突變。
附表3是人內(nèi)皮抑素Endostatin基因核苷酸序列及蛋白質(zhì)氨基酸序列附圖簡述

圖1是本發(fā)明所述的野生型水皰性口炎病毒印第安娜株的基因組mRNA結(jié)構(gòu)圖。整個(gè)基因組由引導(dǎo)序列(Leader)、核蛋白N、非結(jié)構(gòu)蛋白NS或磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M、糖蛋白G、聚合酶蛋白L及非轉(zhuǎn)錄序列(nontranscribed sequence)組成。從3’端開始至5’端依次為引導(dǎo)序列1-50，N蛋白51-1376，NS蛋白或P蛋白1386-2199，M蛋白2209-3039，G蛋白3049-4713，L蛋白4723-11095，非轉(zhuǎn)錄序列11102-11161；基因間為由UUUUUUU和G/CA形成的長度為9nt的基因間隔序列。
圖2水皰性口炎病毒基因組圖及連接序列人工合成的帶有限制性酶且位點(diǎn)XhoI和NheI的連接序列插入到水皰性口炎病毒基因組中G蛋白與L蛋白之間的G蛋白的非編碼區(qū)。
圖3用于創(chuàng)建基因工程重組水皰性口炎病毒的pVSV-XN2質(zhì)粒結(jié)構(gòu)其中的VSV可以分別是VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或VSVM51Δ。
圖4是攜帶抗癌基因的基因工程重組水皰性口炎病毒pVSV-ATFG基因組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖其中的VSV可以分別是VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或VSVM51Δ。所攜帶的抗癌基因是具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因(ATFG)，包括但不限于自殺基因HSV-TK、CD及細(xì)胞色素P450；抑癌基因p53、p16及RB；抗血管生成基因Angiostatin和Endostatin；免疫基因白細(xì)胞介素IL-4、12，干擾素IFN-α、β、γ；熱休克蛋白HSP70等；以及保有這些基因的作用功能的多肽片斷。
圖5Vero細(xì)胞固定化培養(yǎng)生產(chǎn)重組VSV的動(dòng)力學(xué)圖6重組水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo表達(dá)Endostatin的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重組人內(nèi)皮抑素水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo治療肝癌施用48小時(shí)后，Endostatin在肝癌(BEL-7402)裸鼠體內(nèi)的分布情況圖7重組水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo治療原位及轉(zhuǎn)移腫瘤試驗(yàn)結(jié)果發(fā)明詳述本發(fā)明的重組水皰性口炎病毒是綜合腫瘤基因療法、溶瘤病毒療法、免疫療法及蛋白質(zhì)療法的所有優(yōu)勢來治療惡性腫瘤的創(chuàng)新藥物。它是利用目前有效性和特異性最好的天然溶瘤病毒、運(yùn)用基因操縱和基因重組技術(shù)、采用遺傳工程和基因工程方法創(chuàng)造性設(shè)計(jì)構(gòu)建的，并通過高滴度重組病毒生產(chǎn)工藝和富集純化工藝而制備。因其具有感染多種組織及細(xì)胞但僅在腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶高度特異性高滴度增殖、且同時(shí)高水平表達(dá)具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因的廣譜雙重超強(qiáng)抗癌活性，既能高效特異地徹底殺滅患者體內(nèi)的原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移腫瘤又無傳統(tǒng)療法傷害正常組織和細(xì)胞的嚴(yán)重并發(fā)癥，有望成為徹底治愈惡性腫瘤的特效藥物。
本發(fā)明的基因重組溶瘤病毒具有下列獨(dú)特的優(yōu)勢1)、在腫瘤細(xì)胞中高特異性高滴度增值及復(fù)制，通過溶解腫瘤細(xì)胞而高效殺滅腫瘤，產(chǎn)生的病毒繼續(xù)感染臨近腫瘤細(xì)胞直至消滅所有腫瘤。
2)、具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因因重組病毒的增值及復(fù)制，基因拷貝數(shù)成千倍上萬倍增加，從而使外源基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)得到高效、特異性表達(dá)，利用患者本身腫瘤細(xì)胞作為外源基因生產(chǎn)的加工廠，不僅大大降低成本及提高抗腫瘤療效，而且能在體內(nèi)長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)直至腫瘤完全消褪。
3)、具有的感染多種組織和細(xì)胞的能力使其不僅能在多種腫瘤原發(fā)灶也能在轉(zhuǎn)移灶高滴度增殖復(fù)制，具有徹底殺滅患者體內(nèi)各種腫瘤的廣譜抗腫瘤作用。
4)、超強(qiáng)的腫瘤特異性使其具有不傷害正常組織和細(xì)胞、毒副反應(yīng)輕微的高度耐受性。
5)、獨(dú)具的誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素的能力更為正常組織和細(xì)胞提供有力的保護(hù)。
6)、對干擾素的高度敏感性使得必要時(shí)可以迅速徹底地清除重組病毒，為產(chǎn)品提供了高度的安全性保障。
在本發(fā)明中，我們采用的水皰性口炎病毒可以是野生型VSVwt，或兩個(gè)發(fā)生了M蛋白點(diǎn)突變的VSV天然減毒突變株(其中天然減毒突變株VSVM51R突變位點(diǎn)為51R，VSVM221F+226R突變位點(diǎn)為221F及226R。)及人工減毒突變株VSVM51Δ四種中的任意一種，他們均在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖而在正常細(xì)胞中基本上不生長。
本發(fā)明中的重組病毒在腫瘤細(xì)胞中特異性增值及復(fù)制的同時(shí)，表達(dá)具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因蛋白。這些具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因包括但不限于自殺基因HSV-TK(單純皰疹病毒的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶)，CD(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)及細(xì)胞色素P450；抑癌基因p53，p16及pRB，抗血管生成基因Angiostatin(血管抑素)和Endostatin(內(nèi)皮抑素)；免疫基因白細(xì)胞介素IL-4、12，干擾素IFN-α、β、γ，熱休克蛋白HSP70和GRP94/GP96；以及保有這些基因的作用功能的多肽片斷。
本發(fā)明中重組病毒所表達(dá)的一類蛋白為能抑制腫瘤新生血管的生成，阻斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡，同時(shí)也達(dá)到阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移通路目的的血管生成抑制因子。腫瘤生長最顯著的特征之一是通過新生血管的形成以滿足腫瘤的血供需要。例如，目前認(rèn)為最強(qiáng)的Angiostatin及Endostatin，具有高效抑制腫瘤新生血管的形成從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，即使數(shù)百倍劑量在人體中也無毒副作用及反復(fù)應(yīng)用也無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。但目前使用其蛋白質(zhì)治療，需要每天進(jìn)行，同時(shí)需要量也極多，治療的劑量為500～1000mg，無論從經(jīng)濟(jì)上或生產(chǎn)上均不堪負(fù)擔(dān)，也不太現(xiàn)實(shí)。而利用本發(fā)明的攜帶Angiostatin或Endostatin基因的重組病毒，其在患者腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖及復(fù)制，使Angiostatin或Endostatin基因拷貝數(shù)上千倍乃至上萬倍增加，從而使Angiostatin或Endostatin在腫瘤細(xì)胞內(nèi)得到高效、特異性表達(dá)。利用患者本身腫瘤細(xì)胞作為Angiostatin或Endostatin生產(chǎn)的加工廠，不僅大大降低成本及提高抗腫瘤療效，而且能在體內(nèi)長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，直至腫瘤完全消褪。
本發(fā)明中重組病毒所表達(dá)的一類蛋白為能夠粘附腫瘤抗原并對抗原提呈細(xì)胞有親和性的蛋白，這類蛋白能夠結(jié)合腫瘤特異抗原多肽形成蛋白-多肽復(fù)合物，并通過抗原肽伴侶轉(zhuǎn)移作用將抗原提交給樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，抗原被加工提呈，激發(fā)機(jī)體特異性CTL免疫反應(yīng)。這類蛋白的實(shí)例包括以熱休克蛋白為主的分子伴侶蛋白。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)是一類高度保守并具有ATP酶活性的蛋白家族，在所有的原核生物以及大多數(shù)真核細(xì)胞中都存在。無論是否存在外界壓力，熱休克蛋白在蛋白質(zhì)代謝中都起著重要作用，包括在蛋白質(zhì)從頭合成途徑中蛋白質(zhì)的折疊和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及錯(cuò)誤折疊后的降解。熱休克蛋白，包括從腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌感染的細(xì)胞中得到的hsp70和grp94/gp96，都能夠激發(fā)細(xì)胞性的免疫反應(yīng)。熱休克蛋白的免疫原性主要是由結(jié)合到其分子上的多肽所產(chǎn)生。產(chǎn)生的熱休克蛋白—抗原多肽通過一種不表達(dá)內(nèi)生性抗原的特異性細(xì)胞將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞后，從而激活免疫系統(tǒng)。這些結(jié)果表明熱休克蛋白作為分子伴侶能夠?qū)⒖乖缘亩嚯某蔬f給抗原提呈細(xì)胞，可能是通過使這些多肽與MHC I和MHC II分子結(jié)合而進(jìn)入MHC I和MHC II呈遞抗原途徑；這些抗原多肽會(huì)進(jìn)一步被提呈給CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+輔助性T細(xì)胞。
重要的一點(diǎn)是，本發(fā)明中重組病毒正確進(jìn)行蛋白表達(dá)并不需要病毒整合到受體細(xì)胞的基因組中。重組病毒可以以游離體狀態(tài)存在于靶細(xì)胞中。
本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是重組病毒直接加入到瘤內(nèi)，利用其所具有的優(yōu)良特性來達(dá)到殺死局部腫瘤和轉(zhuǎn)移的腫瘤。給予重組病毒進(jìn)行治療可以單獨(dú)使用，也可以和其它形式的免疫治療劑聯(lián)合使用，包括細(xì)胞因子和傳統(tǒng)中藥。本研究領(lǐng)域的技術(shù)人員從本發(fā)明中可以認(rèn)識(shí)到重組病毒可以應(yīng)用于腫瘤的治療。
在適當(dāng)?shù)那闆r下，重組病毒可根據(jù)其給予的途徑不同被加工成固體，半固體，液體或氣霧劑形式?？梢岳靡阎姆椒▉碜柚菇M合物在到達(dá)靶器官前被釋放和吸收。本發(fā)明中可采用任何一個(gè)可以接受的藥劑形式保證本發(fā)明組分的有效性。在制劑時(shí)，本發(fā)明中的重組病毒可以單獨(dú)使用，也可和其它的藥學(xué)上活性組分以適當(dāng)?shù)谋壤Y(jié)合/配合使用。應(yīng)保證在給藥時(shí)有足夠多量的重組病毒，從而保證能提供藥學(xué)上有效劑量的重組病毒及基因產(chǎn)物。本發(fā)明的重組病毒可以單獨(dú)使用也可以和不同的佐劑共同配制。
通常，可將本發(fā)明的重組病毒以治療有效量通過本領(lǐng)域已知的各種常規(guī)的和可接受的方式單獨(dú)或與其它治療劑一起聯(lián)合給藥。治療有效量將根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度、個(gè)體的年齡和相對健康狀況、所用重組病毒的效力以及其它因素有很大變化。通常，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)個(gè)人知識(shí)以及本申請所公開的內(nèi)容確定出用于治療給定腫瘤時(shí)的本發(fā)明的重組病毒的治療有效量。
本發(fā)明的重組病毒可以以藥物組合物的形式通過下列途徑之一給藥瘤內(nèi)注射、口服、全身性給藥(例如，經(jīng)皮、鼻內(nèi)或通過栓劑給藥)或胃腸外給藥(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。組合物可以是片劑、丸劑、膠囊、半固體、散劑、緩釋制劑、溶液劑、混懸劑、氣霧劑的形式或是任何其它適宜的組合物，并且通常由本發(fā)明重組病毒以及至少一種可藥用賦形劑組成?？伤幱觅x形劑是無毒的、對所述重組病毒的活性沒有實(shí)質(zhì)性損害的、有助于給藥的并且不會(huì)對其他活性成分的免疫或治療效果產(chǎn)生不利影響物質(zhì)。所述賦形劑可以是任何固體、液體、半固體，或者在氣霧劑組合物的情況下，可以是氣體賦形劑。這些賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于得到的。
固體藥物賦形劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘露糖醇、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、脫脂奶粉等。液體和半固體賦形劑可以選自水、乙醇、甘油、丙二醇和各種油，包括來源于石油、動(dòng)物、植物或合成的油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。優(yōu)選的液體載體，特別是用于可注射溶液的液體載體包括水、鹽水、葡萄糖水溶液和二甘醇。
本發(fā)明的組合物中重組病毒的用量可以根據(jù)制劑的種類、單位劑量的大小、賦形劑的種類以及藥學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素有很大變化。而且，實(shí)際的劑量和治療方案會(huì)根據(jù)其它因素如該發(fā)明的組分是否和其它治療組分結(jié)合，個(gè)體的藥物動(dòng)力學(xué)，藥物分布和代謝等各不相同而有所變化。而且，加入細(xì)胞的重組病毒量也隨著插入載體的治療基因的長度、穩(wěn)定性和序列的性質(zhì)而不同，是一個(gè)由經(jīng)驗(yàn)決定的變量，很可能被非本發(fā)明中方法之外的其它因素所改變。一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況的出現(xiàn)很容易的進(jìn)行調(diào)整。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例實(shí)施例1 pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因組質(zhì)粒的構(gòu)建以水皰性口炎病毒為基礎(chǔ)，首先人工合成帶有限制性酶且位點(diǎn)XhoI和NheI的連接序列(Linker Insert)GCTAGGTATGAAAAAAACTAACAGATATCACGCTCGAGAATTAAGCTAG，利用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的分子生物學(xué)手段與基因重組技術(shù)，將其插入到VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或者VSVM51Δ基因組中G蛋白與L蛋白之間G蛋白的非編碼區(qū)，并以此結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)分別構(gòu)建出用于創(chuàng)建重組水皰性口炎病毒的pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2及pVSVM51Δ-XN2基因組質(zhì)粒。pVSV-XN2基因組質(zhì)粒(其中VSV可以是VSVwt、VSVM51R、VSVM221F+226R或者VSVM51 Δ)包含了完整的VSV基因組，并分別在緊接著外源基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)之外具有特異性的XhoI和NheI酶切位點(diǎn)，以便于外源基因的插入。
實(shí)施例2自殺基因TK、白細(xì)胞介素IL-4、內(nèi)皮抑素Endostatin、熱休克蛋白HSP70及綠色熒光蛋白GFP基因的克隆利用PCR方法從pKO-TK質(zhì)粒(Clontech Laboratories)中擴(kuò)增得到自殺基因TK基因，引物序列為5-CTTGTAGACTCGAGTATGGCTTCGTACCCCGGCCATCAG和5-GTATTGTCTGCTAGCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATC(斜體下劃線表示限制性酶切位點(diǎn)，黑體表示外源基因，下同).；利用PCR方法從pGexp質(zhì)粒(Clontech Laboratories)中擴(kuò)增得到白細(xì)白介素IL-4基因，引物序列為5-GGCACTCGAGATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTTG和5-GCCGGCTAGCCTACGAGTAATCCATTTGCATGATGC.；利用PCR方法從pE18質(zhì)粒中擴(kuò)增得到內(nèi)皮抑素Endostatin基因，引物序列為5’-TAGCATCTCGAGGTACGATGTAG和5’-ATCGTCGCTAGCAACCTAGCAG；利用PCR方法從人腫瘤細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增HSP70基因，引物序列為TACTAATCTCTCGAGACCTCCTCAATGGTGGG和GGTATGGAAGCTAGCGATCCCTCGAGATC；利用PCR方法從pLEGFP-C1質(zhì)粒(Clontech Laboratories)中擴(kuò)增得到綠色熒光蛋白GFP基因，引物序列為5-GGCACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG和5-GCTTGAGCGCTAGCTCTGAGTCCCTACTTGTACAGC。
使用PE公司的PCR儀，反應(yīng)條件是每個(gè)反應(yīng)的引物終濃度是30pM，dNTP為100mM，模板DNA為100ng，Taq DNA聚合酶為2.5個(gè)單位。其他反應(yīng)條件依照GeneAmp DNA擴(kuò)增試劑盒中的使用說明進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)總體積為100微升。每份反應(yīng)混合物上覆蓋以75微升礦物油。擴(kuò)增共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括變性步驟92℃1分鐘，退火步驟50℃1分鐘，延長步驟72℃2分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，使用Qiagen公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化所得產(chǎn)物。
實(shí)施例3重組人ATFG水皰性口炎病毒基因組質(zhì)粒pVSV-ATFG的構(gòu)建將從實(shí)施例2回收得到的TK PCR產(chǎn)物、IL-4 PCR產(chǎn)物、Endostatin PCR產(chǎn)物、HSP70 PCR產(chǎn)物及GFP PCR產(chǎn)物分別用XhoI+NheI進(jìn)行雙酶切，所切下基因片段分別插入由實(shí)施例1得到的已用XhoI+NheI雙酶切的pVSVwt-XN2、pVSVM51R-XN2、pVSVM221F+226R-XN2或pVSVM51Δ-XN2基因組質(zhì)粒中，獲得攜帶外源抗癌基因的基因工程重組水皰性口炎病毒基因組質(zhì)粒pVSVwt-ATFG、pVSVM51R-ATFG、pVSVM221F+226R-ATFG或pVSVM51Δ-ATFG(其中ATFG＝TK、IL-4、Endostatin、HSP70或GFP)。
實(shí)施例4重組人ATFG水皰性口炎病毒rVSV-ATFG的轉(zhuǎn)染和重獲將幼倉鼠腎細(xì)胞BHK-21在10cm培養(yǎng)皿中用添加5％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DME(Dubecco’s modified Eagle)培養(yǎng)基培養(yǎng)，到BHK-21細(xì)胞有約70％融合時(shí)，以MOI 10劑量vTF7-3株(表達(dá)T7 RNA聚合酶)重組痘苗病毒感染細(xì)胞。30分鐘后，由實(shí)施例3獲得的重組病毒基因組質(zhì)粒pVSVwt-ATFG、pVSVM51R-ATFG、pVSVM221F+226R-ATFG或pVSVM51Δ-ATFG(其中ATFG＝TK、IL-4、Endostatin、HSP70或GFP)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒按廠家說明轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，重組病毒基因組質(zhì)粒使用總量10μg。于37℃3％CO2濃度的空氣中孵育48小時(shí)后，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下，并凍溶三個(gè)循環(huán)(-70℃，37℃)以釋放附著于細(xì)胞上的病毒，然后離心沉淀5分鐘(1250×g)，分離細(xì)胞碎片，所得約5ml細(xì)胞裂解液。
將BHK-21細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿中用10ml添加5％FBS的DME培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到約106個(gè)，將所得的細(xì)胞裂解也加入培養(yǎng)皿。48小時(shí)后，離心10分鐘(1250×g)收養(yǎng)培養(yǎng)液，并用孔徑0.2μm的濾器過濾以除去絕大部分痘苗病毒。
將1ml濾液直接加在平鋪于蓋玻片上并置于35mm培養(yǎng)皿中的BHK-21細(xì)胞上，其余濾液-70℃凍存。4小時(shí)后，細(xì)胞用3％多聚甲醛固化，并用經(jīng)若丹明偶聯(lián)抗鼠單克隆抗體包被的抗印地安那株VSV G蛋白(GI)單克隆抗體GI-Mab染色。經(jīng)直接免疫熒光分析檢測，100％的細(xì)胞均顯示VSV G蛋白特有的典型的亮色，證明重組病毒rVSV-ATFG重獲成功。
實(shí)施例5用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)制備重組病毒rVSV-ATFG將BHK-21細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿中用10ml添加5％FBS的DME培養(yǎng)基培養(yǎng)至長成單層，棄去上清營養(yǎng)液，用無血清的維持液洗2次，用實(shí)施例4凍存的重組病毒rVSV-ATFG原液接種BHK-21細(xì)胞，37℃吸附1小時(shí)，換維持液，于37℃培養(yǎng)。當(dāng)出現(xiàn)75％細(xì)胞病變(CPE)時(shí)，收獲感染病毒的細(xì)胞，凍溶三次(-70℃，37℃)，離心沉淀(1250×g)分離細(xì)胞碎片，所得細(xì)胞裂解液凍存于-70℃。然后按照常規(guī)方法，測定TCID50(病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)。
實(shí)施例6 Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)固定化培養(yǎng)生產(chǎn)重組病毒rVSV-ATFG培養(yǎng)條件工作體積300ml的轉(zhuǎn)瓶；固定化培養(yǎng)用微載體固體微載體1.0g/L、多孔微載體CultiSpher-G 0.5g/L；生產(chǎn)用細(xì)胞Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)；培養(yǎng)基添加5％FBS、100μg/ml硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate)及100U/ml青霉素G(penicillin G)的DME；轉(zhuǎn)速30rpm。
細(xì)胞培養(yǎng)基病毒生產(chǎn)過程按上述細(xì)胞培養(yǎng)條件在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)Vero細(xì)胞至不再生長后，沉積微載體，移去150ml培養(yǎng)基以降低反應(yīng)器的容積。以0.01 MOI(Multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù))劑量接種實(shí)施例5所制備的重組病毒rVSV-ATFG毒種于附著于微載體的Vero細(xì)胞。在重組病毒rVSV-ATFG毒種添加完畢、細(xì)胞已經(jīng)培養(yǎng)滿166小時(shí)，通CO2將pH將抵至6.8。吸附一小時(shí)，在此期間維持pH 6.5～6.8，并使用斷續(xù)旋轉(zhuǎn)(1分鐘/15分鐘)。吸附過程結(jié)束，加入150ml培養(yǎng)基，重新調(diào)整pH到7.2并恢復(fù)連續(xù)旋轉(zhuǎn)。在接種病毒后5小時(shí)內(nèi)，留在上清液中99％以上的病毒顆粒被快速吸附到細(xì)胞上。
接種后48小時(shí)后收獲感染的細(xì)胞，三次凍融(-70℃，37℃)，低速離心(1250×g)離心去除細(xì)胞碎片，所得細(xì)胞裂解液經(jīng)兩次氯化銫密度梯度離心純化，超濾法濃縮后于-70℃凍存。
對于多孔微載體CultiSpher-G，由于其具有比較大的有效表面積，因而可以使用比較低的濃度。其在接種后48小時(shí)獲得了最高的VSV滴度3.25×108PFU/ml，換算到每個(gè)細(xì)胞上對應(yīng)的病毒產(chǎn)量是315PFU/cell，而固體微載體則單個(gè)細(xì)胞的價(jià)值則只有85PFU/cell。但使用多孔微載體CultiSpher-G并未引起VSV生產(chǎn)過程的動(dòng)力學(xué)變化。
實(shí)施例7雞胚成纖維細(xì)胞固定化培養(yǎng)生產(chǎn)重組病毒rVSV-ATFG采用雞胚成纖維細(xì)胞，其他所有條件同實(shí)施例6，則以多孔微載體CultiSpher-G為固定化培養(yǎng)用微載體的病毒的產(chǎn)量為340PFU/cell。
實(shí)施列8重組人內(nèi)皮抑素水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo抑制原位及遠(yuǎn)端腫瘤生長試驗(yàn)在同系的BALB/c小鼠上評價(jià)重組人內(nèi)皮抑素水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo對CT26腫瘤的治療效果。將小鼠用CT26腫瘤細(xì)胞(1×105)在小鼠肋部對稱部位分別進(jìn)行皮下注射，以此小鼠作為患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的動(dòng)物模型。
1周后，當(dāng)皮下注射的腫瘤迅速生長至腫瘤直徑為0.5cm～0.7cm時(shí)，隨機(jī)分組將動(dòng)物分成3組，每組各10只動(dòng)物，第一和第二組作為實(shí)驗(yàn)組，第三組作為對照組。
將第一組每只動(dòng)物非對稱(右面)的瘤內(nèi)接種rVSVM51R-Endo(1×106PFU)，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種。
將第二組每只動(dòng)物非對稱(右面)的瘤內(nèi)接種VSVM51R(1×106pFU)，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種，以次作為評價(jià)內(nèi)皮抑素影響因素的參照。
將第三組每只動(dòng)物非對稱(右面)的瘤內(nèi)接種紫外滅活的VSVM51R，并于第一次接種7天后進(jìn)行第二次接種，以此作為評價(jià)病毒影響因素的對照。
腫瘤體積用卡尺測量，體積的計(jì)算公式(V＝h×w×d)。如果小鼠垂死或其腫瘤直徑超過18毫米，將被處死，并記錄下日期來研究其存活率。用非配對法t檢驗(yàn)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用重組人內(nèi)皮抑素水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo接種能引起非常顯著的抗腫瘤效果，無論是被注射一側(cè)的腫瘤，還是同只動(dòng)物身體上未經(jīng)注射的對稱端的腫瘤的生長都明顯受到抑制(如圖10所示)。經(jīng)注射重組人內(nèi)皮抑素水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo的小鼠身上的腫瘤無論在注射側(cè)還是在非注射側(cè)都已經(jīng)消退得無法檢測到。而注射VSVM51R同樣能引起對注射側(cè)和非注射側(cè)腫瘤生長的抑制，其抑制作用的影響雖也明顯，但與注射rVSVM51R-Endo有顯著差異。僅注射紫外滅活的VSVM51R的對照組顯示出對注射側(cè)和非注射側(cè)的腫瘤都沒有影響。這些結(jié)果表明重組人內(nèi)皮抑素水皰性口炎病毒rVSVM51R-Endo通過局部瘤內(nèi)注射可以引起系統(tǒng)性感染，從而高度特異性地在體內(nèi)所有腫瘤細(xì)胞內(nèi)高度增殖并表達(dá)內(nèi)皮抑素，以雙重抗腫瘤作用對給藥部位和遠(yuǎn)端腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)烈的生長抑制和殺滅作用。
附表11 acgaagacaa acaaaccatt attatcatta aaaggctcag gagaaacttt aacagtaatc61 aaaatgtctg ttacagtcaa gagaatcatt gacaacacag tcatagttcc aaaacttcct121 gcaaatgagg atccagtgga atacccggca gattacttca gaaaatcaaa ggagattcct181 ctttacatca atactacaaa aagtttgtca gatctaagag gatatgtcta ccaaggcctc241 aaatccggaa atgtatcaat catacatgtc aacagctact tgtatggagc attaaaggac301 atccggggta agttggataa agattggtca agtttcggaa taaacatcgg gaaagcaggg361 gatacaatcg gaatatttga ccttgtatcc ttgaaagccc tggacggcgt acttccagat421 ggagtatcgg atgcttccag aaccagcgca gatgacaaat ggttgccttt gtatctactt481 ggcttataca gagtgggcag aacacaaatg cctgaataca gaaaaaagct catggatggg541 ctgacaaatc aatgcaaaat gatcaatgaa cagtttgaac ctcttgtgcc agaaggtcgt601 gacatttttg atgtgtgggg aaatgacagt aattacacaa aaattgtcgc tgcagtggac661 atgttcttcc acatgttcaa aaaacatgaa tgtgcctcgt tcagatacgg aactattgtt721 tccagattca aagattgtgc tgcattggca acatttggac acctctgcaa aataaccgga781 atgtctacag aagatgtaac gacctggatc ttgaaccgag aagttgcaga tgaaatggtc841 caaatgatgc ttccaggcca agaaattgac aaggccgatt catacatgcc ttatttgatc901 gactttggat tgtcttctaa gtctccatat tcttccgtca aaaaccctgc cttccacttc961 tgggggcaat tgacagctct tctgctcaga tccaccagag caaggaatgc ccgacagcct1021 gatgacattg agtatacatc tcttactaca gcaggtttgt tgtacgctta tgcagtagga1081 tcctctgccg acttggcaca acagttttgt gttggagata acaaatacac tccagatgat1141 agtaccggag gattgacgac taatgcaccg ccacaaggca gagatgtggt cgaatggctc1201 ggatggtttg aagatcaaaa cagaaaaccg actcctgata tgatgcagta tgcgaaaaga1261 gcagtcatgt cactgcaagg cctaagagag aagacaattg gcaagtatgc taagtcagaa1321 tttgacaaat gaccctataa ttctcagatc acctattata tattatgcta catatgaaaa1381 aaactaacag atatcatgga taatctcaca aaagttcgtg agtatctcaa gtcctattct1441 cgtctggatc aggcggtagg agagatagat gagatcgaag cacaacgagc tgaaaagtcc1501 aattatgagt tgttccaaga ggatggagtg gaagagcata ctaagccctc ttattttcag1561 gcagcagatg attctgacac agaatctgaa ccagaaattg aagacaatca aggtttgtat1621 gcacaggatc cagaagctga gcaagttgaa ggctttatac aggggccttt agatgactat1681 gcagatgagg aagtggatgt tgtatttact tcggactgga aaccacctga gcttgaatct1741 gacgagcatg gaaagacctt acggttgaca tcgccagagg gtttaagtgg agagcagaaa1801 tcccagtggc tttcgacgat taaagcagtc gtgcaaagtg ccaaatactg gaatctggca
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附表2VSVwt1 MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAPVSVM51RMSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAPVSVM221F-226RMSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAPVSVM51ΔMSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TSMEYAPSAP41 IDKSYFGVDE MDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRTIDKSYFGVDERDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRTIDKSYFGVDE MDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRTIDKSYFGVDEΔDTYDPNQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT81 YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATPYSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATPYSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATPYSDVAAAVSH WDHMYIGMAG KRPFYKILAF LGSSNLKATP121AVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRRAVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRRAVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRRAVLADQGQPE YHTHCEGRAY LPHRMGKTPP MLNVPEHFRR161PFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSDPFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSDPFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSDPFNIGLYKGT IELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD201FREKALMFGL IVEKKASGAW VLDSISHFKFREKALMFGL IVEKKASGAW VLDSISHFKFREKALMFGL IVEKKASGAWFLDSIRHFKFREKALMFGL IVEKKASGAW VLDSISHFK
附表31 ATGCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTG1 M H S H R D F Q P V L H L V A L N S P L61 TCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCC21 S G G M R G I R G A D F Q C F Q Q A R A121 GTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGC41 V G L A G T F R A F L S S R L Q D L Y S181 ATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTG61 I V R R A D R A A V P I V N L K D E L L241 TTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGC81 F P S W E A L F S G S E G P L K P G A R301 ATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGACCCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTG101 I F S F N G K D V L T H P T W P Q K S V361 TGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGG121 W H G S D P N G R R L T E S Y C E T W R421 ACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTACTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGG141 T E A P S A T G Q A Y S L L G G R L L G481 CAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATG161 Q S A A S C H H A Y I V L C I E N S F M541 ACTGCCTCCAAGTAG181 T A S K
權(quán)利要求
1.一種重組水皰性口炎病毒，其中該病毒能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖以裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)隨著病毒的增殖復(fù)制能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的重組水皰性口炎病毒，其中所述的重組水皰性口炎病毒是重組野生型、重組M蛋白點(diǎn)突變的天然減毒突變株或重組M蛋白點(diǎn)突變的人工減毒突變株。
3.如權(quán)利要求1所述的重組水皰性口炎病毒，其中所述的重組水皰性口炎病毒是重組野生型印第安那株VSVwt、重組M蛋白點(diǎn)突變的天然減毒突變株VSVM51R、M蛋白點(diǎn)突變的天然減毒突變株VSVM221F+226R、或重組M蛋白點(diǎn)突變的人工減毒突變株VSVM51△。
4.如權(quán)利要求1所述的重組水皰性口炎病毒，其中所述的同時(shí)隨著病毒的增殖復(fù)制能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因是以下幾類(a)自殺基因HSV-TK(單純皰疹病毒的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶)，CD(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)或細(xì)胞色素P450；(b)抑癌基因p53，p16或pRB；(c)抗血管生成基因VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)、Angiostatin(血管抑素)或Endostatin(內(nèi)皮抑素)；(d)免疫基因白細(xì)胞介素IL-4、12，干擾素IFN-α、β、γ，熱休克蛋白HSP70；(e)和/或保有這些基因的作用功能的多肽片斷。
5.一種含有由權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組水皰性口炎病毒的治療腫瘤的藥物，用于治療包括良性腫瘤、惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移腫瘤在內(nèi)的各種腫瘤。
6.一種含有由權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)或幾項(xiàng)所述的重組水皰性口炎病毒和其他藥用活性組分構(gòu)成的藥物組合物，用于治療包括良性腫瘤、惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移腫瘤在內(nèi)的各種腫瘤。
7.權(quán)利要求5-6所述的藥物或藥物組合物，其進(jìn)一步含有可作藥用的稀釋劑、載體或賦型劑。
8.權(quán)利要求5-7所述的藥物或藥物組合物，其中所述的惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移腫瘤包括黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、宮頸癌和白血病。
9.權(quán)利要求5-7所述的藥物，其使用方法是通過腫瘤瘤內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、口服、粘膜內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、直腸內(nèi)給藥方式完成的。
全文摘要
本發(fā)明提供了既能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖以裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)又隨著病毒的增殖復(fù)制能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有抗腫瘤或輔助抗腫瘤活性的外源基因蛋白的重組水皰性口炎病毒的構(gòu)建、制備、生產(chǎn)方法，含有該重組水皰性口炎病毒的藥物或藥物組合物，以及使用該重組水皰性口炎病毒治療局部及轉(zhuǎn)移的腫瘤的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1769433SQ20041008880
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日
發(fā)明者張慶勇 申請人:張慶勇