專利名稱：人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽、其制備方法及應(yīng)用，尤指通過生物信息學(xué)分析、抑制性競爭受體-配體親合法及體外和體內(nèi)免疫法篩選得到的具有免疫原性的、能與HLA-A1，A2，A3，A11和A24結(jié)合的人類乳頭瘤病毒HPV16和18的E6和E7多肽序列，這些多肽的制備方法以及其用于制備預(yù)防和治療HPV感染和由HPV感染引起的性病和良、惡性腫瘤的藥物的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳頭瘤病毒(Papillomavirus)可感染多種生物，它有種屬特異性。動物乳頭瘤病毒不會感染人類，同樣人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)不會感染動物。HPV屬于雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)無被膜病毒，有嗜組織特異性，易感染人體皮膚和粘膜的上皮組織，常引起男女肛門生殖器炎癥，上皮增生，進而發(fā)展為良性腫瘤，如尖銳濕疣(又稱性病濕疣)或惡性腫瘤，如子宮頸癌。HPV有130余個不同的亞型，在肛門生殖器普查中發(fā)現(xiàn)的HPV約有23種，其中有些常常引起良性病變，稱為低風(fēng)險性HPV(low-risk HPV)，如HPV11和HPV6。有些常常引起惡性病變，稱為高風(fēng)險性HPV(high-risk HPV)，如HPV16和18。85％-90％的子宮頸癌以及35％-50％的外陰癌患者HPV16和HPV18陽性(W.J.vanDriel，et al，Eur J Cancer，35946-952，1999)。子宮頸癌的發(fā)生通常在HPV感染十年以后，多發(fā)生于生育期婦女。有報導(dǎo)稱大約25％-33％子宮頸癌發(fā)生于尖銳濕疣后二十五年。子宮頸癌是全球婦女因腫瘤死亡的第二常見原因。超過百分之九十四的子宮頸癌患者的病灶中可以發(fā)現(xiàn)HPV DNA，說明HPV感染與子宮頸癌相關(guān)。HPV的基因組含有8000個堿基對，可表達兩類基因早期基因(E)參與DNA復(fù)制，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和細胞轉(zhuǎn)化(transformation)，晚期(L)基因負責(zé)指導(dǎo)合成病毒衣殼蛋白。E6基因表達的蛋白能夠與p53蛋白結(jié)合，E7基因表達的蛋白能夠與視網(wǎng)膜母細胞瘤(Rb)蛋白結(jié)合。p53和Rb蛋白是腫瘤抑制蛋白，在正常情況下它們參與控制細胞的分裂和增生。E6和E7蛋白與其結(jié)合后使其失活，激活細胞轉(zhuǎn)錄機制，使被感染細胞進入細胞增殖周期，增生轉(zhuǎn)化和癌變。由于早期基因中的E6和E7表達在HPV導(dǎo)致的腫瘤中最常見，可以促進腫瘤的發(fā)生，并且發(fā)現(xiàn)HPV E6和E7蛋白中含有MHC I類限制性T細胞抗原決定簇(MHC class I restricted Tcell epitopes)，因此，這奠定了一種設(shè)計以HPV 16和18中的E6和E7抗原決定簇為內(nèi)容的、用于預(yù)防和治療HPV感染及其引起的良性或惡性腫瘤疫苗的基礎(chǔ)。
免疫系統(tǒng)是生物體抵抗和清除入侵病原體和突變細胞的保護系統(tǒng)，其可分為體液免疫系統(tǒng)(抗體)和細胞免疫系統(tǒng)。大量基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)研究已經(jīng)證實HPV抗原能夠誘導(dǎo)HPV特異性細胞免疫反應(yīng)，細胞免疫在控制HPV所致病變中起重要作用。臨床觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)婦女在感染HPV 9-15個月后會通過自身免疫把病毒清除掉，甚至有些患者的生殖器疣可以自然消退。重度子宮頸和外陰上皮內(nèi)瘤(Cervical Intraepithelial neoplasia，VulvarIntraepithelial neoplasia，CIN/VIN)病人的T淋巴細胞對HPV L1，E2，E4和E7蛋白刺激可產(chǎn)生增生反應(yīng)。在小鼠試驗中，用表達HPV E7和T細胞共刺激分子(costimulatorymolecule)B7的腫瘤細胞，或轉(zhuǎn)染HPV16完整基因的腫瘤細胞，或用含全長HPV E7cDNA的牛痘病毒構(gòu)件可以誘導(dǎo)產(chǎn)生HPV E7特異性T殺傷細胞。HPV E7多肽聯(lián)合佐劑(IFA)免疫小鼠能夠保護小鼠抵抗隨后的HPV E7陽性腫瘤的攻擊。給已建立HPV腫瘤無T淋巴細胞免疫能力的裸鼠過繼性輸入HPV16 E7多肽性疫苗所誘導(dǎo)的細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)能清除已建立的HPV腫瘤.HPV可以誘導(dǎo)HPV特異性細胞免疫反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)在HPV16陽性子宮頸不典型增生和子宮頸癌患者得到進一步證實。患者外周血和淋巴結(jié)的淋巴細胞在用結(jié)合有HPV E7多肽的抗原提呈細胞反復(fù)刺激后，表現(xiàn)出HPV E7特異殺傷功能。研究還發(fā)現(xiàn)病毒陽性，CIN陰性病人的細胞殺傷功能比CIN陽性病人強。有報導(dǎo)在某些HPV感染患者體內(nèi)存在HPV特異性記憶性T殺傷細胞。另有報導(dǎo)HPV特異性T殺傷細胞在病變的晚期多見于早期，這些發(fā)現(xiàn)提示HPV特異性殺傷細胞功能影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.美國南加州大學(xué)HPV16 E7多肽疫苗一期臨床試驗結(jié)果報告，66％的HPV16陽性高度子宮頸和外陰上皮內(nèi)瘤患者在第四次注射疫苗后子宮頸刮片證明病毒被清除。病灶部分或全部消退率達50％。HPV E6和E7抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能能夠控制HPV急性感染期的病毒活動(M.R.Hilleman，J.Clin.Virology，1979-90，2000)。
綜上所述，HPV抗原能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生HPV抗原特異性細胞免疫反應(yīng)，這種細胞免疫反應(yīng)有抵抗病毒感染，預(yù)防腫瘤發(fā)生，抑制腫瘤生長和促使腫瘤消退的作用。HPV多肽疫苗的應(yīng)用能夠主動地誘導(dǎo)這種保護性的細胞免疫反應(yīng)，增強機體的免疫能力，預(yù)防HPV感染及其誘發(fā)的感染性疾病和腫瘤。
對于HPV感染病人的治療目前主要有藥物和物理治療兩類。藥物治療有普達非任脂，5-氟尿嘧啶、爭光霉素、干擾素等。物理治療有電烙、激光治療、冷凍外科手術(shù)和外科手術(shù)切除。目前的藥物治療沒有特異性，全身用藥有明顯的副作用，局部用藥不方便。物理治療不適用于HPV感染早中期病人，只適用于病人發(fā)生了上皮不典型增生和癌腫后，而且會給病人帶來痛苦和不良后果。宮頸發(fā)展為侵犯性癌后通常必須采取部分或全部子宮頸切除手術(shù)，這不利于婦女的生育和其它的正常生理功能。在目前的療法下，尖銳濕疣有20％-50％的機會復(fù)發(fā)，侵犯性宮頸癌的死亡率高達60％。由此可見，HPV感染目前還沒有一種特異有效的療法，研發(fā)一種特異有效的療法勢在必行。
HPV感染后發(fā)展為子宮頸癌的潛伏期至少需要十年時間，這非常適合于應(yīng)用一種預(yù)防和治療性疫苗來控制HPV預(yù)防和治療由HPV引起的性病，如尖銳濕疣和男女外生殖器癌等。已經(jīng)公認HPV抗原能夠誘導(dǎo)抗HPV的細胞和體液免疫反應(yīng)，人們普遍認為HPV疫苗是目前預(yù)防和治療由HPV引起的性病，尖銳濕疣和男女外生殖器癌最有希望的療法之一。發(fā)展HPV疫苗是當(dāng)今HPV感染及其所致疾病防治領(lǐng)域的主攻方向之一。由于HPV不能體外培養(yǎng)，所以不適合發(fā)展減毒或滅活的傳統(tǒng)病毒疫苗。目前在臨床試驗應(yīng)用的HPV疫苗基本上可以歸納為DNA、蛋白質(zhì)或多肽三類疫苗。
第一類為DNA疫苗，它屬于基因療法的范疇。DNA疫苗的優(yōu)勢是能夠在體內(nèi)持續(xù)性地表達抗原。另外這種抗原的表達與自然狀況下的抗原表達近似，因此能夠有效持久地誘導(dǎo)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護性的免疫反應(yīng)。在理論上具有這兩大優(yōu)勢的DNA疫苗為古老的疫苗注入了新的活力，曾給免疫學(xué)家和醫(yī)學(xué)家?guī)砹藰O大的鼓舞。然而，由于基因療法在臨床試驗中出現(xiàn)的安全問題以及其在體內(nèi)的作用機制復(fù)雜，F(xiàn)DA對于基因療法的臨床試驗實行更謹慎的態(tài)度，使得基因療法在美國乃至西方國家進展緩慢，這同樣影響到HPVDNA疫苗的發(fā)展。
第二類為蛋白質(zhì)疫苗，用于疫苗的蛋白質(zhì)可用基因工程法獲得，或從生物體液內(nèi)分離提純獲得。蛋白質(zhì)疫苗的優(yōu)點是包含全部或大部分抗原，這符合疫苗的設(shè)計原則。但生產(chǎn)蛋白質(zhì)疫苗有蛋白質(zhì)來源的困難。從生物體液內(nèi)分離提純蛋白質(zhì)一般認為不安全，已不提倡，因為它可能造成隱性傳染源的傳播?；蚬こ谭ㄉa(chǎn)重組蛋白質(zhì)是目前生產(chǎn)蛋白質(zhì)疫苗的主要手段，但現(xiàn)今水平的基因工程法不能高效生產(chǎn)分子量較大的蛋白質(zhì)。如要生產(chǎn)包含二個HPV亞型，如16，18，和每個亞型含二種蛋白，如E6和E7，共四種蛋白質(zhì)的疫苗，基因工程法目前還存在不少技術(shù)難題，至今在國內(nèi)外尚未見任何這方面的報導(dǎo)。Merk公司和GlaxoSlthKline公司等單位用HPV衣殼蛋白L1或/和L2組裝成病毒樣顆粒(Virus-likeParticles，VLPs)作為疫苗。VLPs在形態(tài)上與HPV病毒顆粒相似，但不含HPV DNA，故仍然歸屬于蛋白質(zhì)疫苗或成分疫苗。HPV VLPs已分別進入I，II期臨床試驗，初步報道接種HPV VLPs疫苗的HPV患者體內(nèi)抗HPV抗體滴度比未接種疫苗的HPV患者高40倍(Nature Medicine)。目前的研究顯示機體抵抗HPV致病性主要依賴于細胞免疫功能，而細胞免疫功主要由HPV E6和E7所誘導(dǎo)。HPV VLPs疫苗的適用對象和保護作用尚有待進一步觀察。
第三類為多肽疫苗，多肽可化學(xué)合成或用生化法從細胞膜提取或利用基因工程方法既原核或真核表達系統(tǒng)表達獲得。多肽疫苗的最大特點是安全，來源(合成)容易。由于分子量小，同樣劑量HPV疫苗可以包含更多有效抗原決定簇的多肽。已有足夠的臨床前和臨床試驗表明HPV多肽疫苗安全有效。如前所述美國南加州大學(xué)HPV16E7多肽疫苗一期臨床試驗結(jié)果顯示安全有效(當(dāng)然真正的療效判斷還有待于III期臨床試驗)，但是南加州大學(xué)HPV多肽疫苗僅包含HLA-A2限制性HPV16的E7多肽。已知HLA-A2約占總?cè)巳旱?0％，HPV16感染也只占大約子宮頸癌的50％，所以南加州大學(xué)HPV16的E7多肽疫苗僅能覆蓋25％的HPV感染群體。實際上，目前在臨床試驗中的所有HPV疫苗都存在同樣覆蓋率的問題，因為絕大多數(shù)HPV疫苗只針對一種HPV亞型和一種靶抗原。近年已有人嘗試針對二種HPV亞型的一種靶抗原，或一種HPV亞型的二種靶抗原的HPV疫苗。這些HPV疫苗作用對象各不相同，它們主要分別針對HPV16，18，11和6病毒亞型，但沒有或很少有HPV疫苗針對二種或二種以上不同型別的HPV。就抗原而言，它們也各有選擇。有以早期基因E6或E7產(chǎn)物為抗原的，也有以晚期基因L1或L2產(chǎn)物為抗原的。同樣，沒有或很少有HPV疫苗包含二種或二種以上不同的抗原。
到目前為止，歐美總共大約有近十個HPV疫苗處于臨床試驗的一期或二期；我國尚無開展HPV疫苗臨床試驗的報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供能與HLA-A1，A2，A3，A11和A24結(jié)合的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽。
本發(fā)明的第二個目的是提供人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽的制備方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供人類免疫原性多肽用于制備預(yù)防和治療HPV感染和由HPV感染引起的性病和良、惡性腫瘤的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的最后一個目的是提供一種預(yù)防和治療HPV感染以及預(yù)防由HPV感染引起的男女性病、肛門、外陰、宮頸和陰莖良惡性腫瘤的新型疫苗。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽，其具有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.33所示的氨基酸序列。本發(fā)明中的使用的多肽序列為13-22氨基酸，每一個多肽均包括多個抗原表位，各表位由7-10個氨基酸構(gòu)成，均可獨立或組合成人類乳頭瘤病毒多肽疫苗。


人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽的獲得方法，該方法包括以下步驟(1)從蛋白質(zhì)文庫調(diào)出人類乳頭瘤病毒16，18-E6和E7蛋白質(zhì)序列，用生物信息學(xué)(Bioinformatics)分析預(yù)測HLA-A1，A2，A3，A11和A24限制性抗原決定簇，建立HPV16，18-E6和E7多肽文庫(Peptide Library)；(2)用抑制性競爭受體-配體親和法從該多肽文庫篩選出與HLA-A1，A2，A3，A11和A24有結(jié)合能力的多肽；(3)用體外免疫法進一步篩選出具有免疫原性的多肽；(4)用體內(nèi)免疫法進一步篩選和證實了這些免疫原性多肽在體內(nèi)誘導(dǎo)HPV16，18-E6和E7多肽特異性T細胞免疫反應(yīng)的能力。
體外免疫篩選是在特定的細胞培養(yǎng)條件下用HPV多肽反復(fù)刺激正常人的淋巴細胞，能夠刺激和誘導(dǎo)正常人淋巴細胞產(chǎn)生HPV多肽特異性免疫反應(yīng)的多肽稱為免疫原性多肽，具有作為疫苗的可能性。為了證實被體外免疫篩選出的多肽的免疫原性，這些多肽被用來免疫動物。本發(fā)明用多肽分別免疫Balb/c，C57和C3H小鼠，二周后進行一次加強免疫，第四周分離試驗小鼠的脾臟淋巴細胞，用免疫酶聯(lián)斑點技術(shù)(ELISPOT)檢測小鼠的HPV多肽特異性T細胞免疫反應(yīng)，以及用51Cr釋放法分析細胞毒性T淋巴細胞殺傷功能。結(jié)果表明本發(fā)明篩選出的HPV多肽能夠成功地在體內(nèi)誘導(dǎo)出HPV多肽特異性T細胞保護性免疫反應(yīng)。
本發(fā)明公開的具有免疫原性的人類乳頭瘤病毒抗原多肽具有以下應(yīng)用一、人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽用于制備預(yù)防和治療人類乳頭瘤病毒感染所引起的感染性疾病和腫瘤性疾病的疫苗的應(yīng)用。所述感染性疾病為人類乳頭瘤病毒感染性性病。所述腫瘤性疾病包括人類乳頭瘤病毒感染所致子宮頸、外陰、肛門、陰莖和口咽增生性病變，良性腫瘤、癌前病變及其癌。
二、人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽用于制備檢測人類乳頭瘤病毒感染所引起的感染性疾病和腫瘤性疾病的試劑的應(yīng)用。
針對現(xiàn)有HPV疫苗覆蓋率不足等問題，本發(fā)明設(shè)計了一種新型HPV疫苗，該疫苗能覆蓋誘發(fā)子宮頸癌的主要HPV亞型-16和18亞型；能誘導(dǎo)對HPV患者起主要保護作用的細胞免疫功能；疫苗能應(yīng)用于多個HLA亞型的群體(HLA-A1，A2，A3，A11和A24)；疫苗的活性成分為多肽，使用安全，便于生產(chǎn)和質(zhì)量保證。
已知子宮頸癌主要由HPV16和18引起，誘導(dǎo)細胞免疫功能主要是HPV的E6和E7抗原，所以我們的疫苗包含了HPV16和18二種亞型以及E6和E7二種抗原。
人類乳頭瘤病毒預(yù)防和治療性疫苗，該疫苗中的活性成分由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.33所示的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽組成。
該疫苗還包括佐劑或其它輔助性多肽。
能增強機體免疫應(yīng)答的物質(zhì)稱為佐劑。佐劑與抗原物質(zhì)(如本專利中的多肽)注入機體后，在局部形成抗原儲存庫，使抗原緩慢釋放至免疫系統(tǒng)，抗原作用時間延長；能刺激機體形成局部炎癥或肉芽腫，增強抗原與免疫細胞接觸的機會；能刺激免疫細胞產(chǎn)生細胞因子，擴大由抗原所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本專利所述佐劑為無機佐劑，如氫氧化鋁，有機佐劑，如IFA(Montanide ISA-51)，細菌佐劑，如BCG，核酸佐劑，如CpG，或細胞因子佐劑，如IL2，IFNα，IFNγ，GM-CSF等，但不限于上述佐劑。
所述輔助性多肽為MHC II限制性多肽。在體內(nèi)T殺傷細胞實施其殺傷功能時有賴于T輔助細胞的幫助。MHC II限制性多肽可以激活T輔助細胞。因此，在HPV多肽疫苗中加入MHC II限制性多肽會增強HPV多肽疫苗的免疫預(yù)防和治療作用。
該疫苗可制成制劑，包括HPV免疫原性多肽、溶劑和佐劑。例如白色粉末狀HPV多肽；一種溶劑，如無菌生理鹽水，但不限于生理鹽水；和一種佐劑，如不完全弗氏佐劑(IFA)，但不限于不完全弗氏佐劑。裝于小玻璃瓶的白色粉末狀HPV多肽可儲藏于4℃-20℃臨用前溶解于無菌生理鹽水，然后與不完全弗氏佐劑等量混合，用震動儀(Votex)震動成乳劑后用于皮下注射，但不限于皮下注射。
本發(fā)明選擇多肽作為HPV疫苗的載體，因為作為疫苗的多肽來源容易，應(yīng)用安全。在體內(nèi)蛋白性抗原降解為多肽后，結(jié)合于細胞表面的HLA分子，然后由HLA遞呈給相應(yīng)的T淋巴細胞，誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)。多肽只有結(jié)合于HLA以后才能發(fā)揮免疫誘導(dǎo)作用，這種多肽與HLA的結(jié)合具有專一性。例如HLA-A2限制性多肽，只能結(jié)合于A2而不能結(jié)合于其它的HLA亞型。HLA-A2是HLA的最主要亞型，約占總?cè)后w的50％。目前已進入臨床試驗的HPV多肽性疫苗基本上都是針對HLA-A2群體，但是還有50％的非A2 HPV患者得不到保護。本發(fā)明公開的疫苗不僅針對HLA-A2群體，還針對HLA-A1、A3、A11和A24，從而提高了疫苗的人群覆蓋率。
本發(fā)明涉及HPV多肽的重迭(Overlapes)和組合。本發(fā)明中的免疫原性多肽或抗原表位為8到10個氨基酸長。有些抗原表位中的氨基酸序列部分或大部分相同，但在它們的氨基端或羧基端有一個或一個以上的氨基酸不同，表現(xiàn)為部分序列重迭現(xiàn)象。為了便于臨床應(yīng)用同時考慮到合成方便，本發(fā)明利用序列重迭現(xiàn)象將一個以上抗原表位編入一條多肽，其最短不短于13個氨基酸，最長不長于22個氨基酸。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種較現(xiàn)有技術(shù)相比特異性更強、覆蓋率更高、安全性更好的HPV多肽疫苗。
在本發(fā)明說明書中，多肽、抗原、抗原決定簇(Antigenic Determinant)和抗原表位(Epitope)視為同義詞或近義詞而互用。


圖1為HPV16和18的E6和E7免疫原性多肽在Balb/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HPV特異性細胞免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為HPV多肽特異性IFNγ陽性T細胞產(chǎn)生。
圖2為HPV16和18的E6和E7免疫原性多肽在C57小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HPV特異性細胞免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為HPV多肽特異性IFNγ陽性T細胞產(chǎn)生。
圖3為HPV16和18的E6和E7免疫原性多肽在C3H小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HPV特異性細胞免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為HPV多肽特異性IFNγ陽性T細胞產(chǎn)生。
圖4為HPV16和18的E6和E7免疫原性多肽能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生HPV多肽特異性T殺傷細胞。
具體實施例方式
實施例1預(yù)測抗原決定簇從NIH數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.org)調(diào)出HPV 16和18的E6和E7蛋白質(zhì)序列，用Rammensee軟件(Rammensee，F(xiàn)riede，Stevanovic，MHC ligands and peptide motifs1stlisting，Immunogenestics，41，178-228，1995)分析預(yù)測可能作為疫苗抗原決定簇的寡多肽序列，建立HPV16和18的E6和E7多肽文庫(Peptide Library)。該軟件從化學(xué)結(jié)構(gòu)，如氨基酸組成，序列，固定氨基酸(Anchor amino acid)的位置來預(yù)測寡多肽與MHC的結(jié)合能力，給序列內(nèi)的每一個氨基酸打分。最理想的固定氨基酸給15分，具有最低結(jié)合能力的氨基酸給1分，不具有結(jié)合能力的氨基酸給負分。該軟件會自動為每一寡多肽序列給出總分。用此法本發(fā)明者建立了擁有2435個9個氨基酸長的多肽序列。在每一HPV亞型和HLA亞型的多肽序列中取積分處于前十位的多肽用于篩選實驗。HLA-A2多肽取積分處于前二十位的多肽用于篩選實驗。用于本發(fā)明篩選實驗的多肽共240個，由哈佛醫(yī)學(xué)院合成。
表1 本發(fā)明中用生物信息學(xué)所建立的HPV多肽文庫有關(guān)數(shù)據(jù)

實施例2應(yīng)用競爭性受體-配體親和法測試多肽與MHC的結(jié)合能力實施例1得到的240條待測多肽與HLA各型的結(jié)合能力由競爭性受體-配體親和法判斷。將固定濃度(50μM)的標記125I的MHC限制性多肽以及不同濃度(1-50μM)的MHC限制性待測多肽(哈佛醫(yī)學(xué)院)加入反應(yīng)體系(磷酸鹽緩沖液和MHC，例如HLA-A2)，在反應(yīng)體系中形成二種復(fù)合物，即待測多肽MHC復(fù)合物和125I標記多肽復(fù)合物。待測多肽與125I標記多肽競爭與MHC的結(jié)合。用超過濾(Ultrafiltration，Microcon 30，Amicon，Beverly，MA，USA)分離游離多肽和多肽MHC復(fù)合物，然后測定多肽MHC復(fù)合物的125I放射量，將此放射量與沒有競爭性抑制的多肽MHC復(fù)合物(沒有加待測多肽的樣本)的放射量比較，求待測多肽在抑制50％標記多肽與MHC結(jié)合時的濃度，即IC50。待測多肽IC50值≤10μM定為結(jié)合能力陽性多肽。用上述同樣方法測定HLA-A1，A2，A3，A11和A24限制性多肽與MHC結(jié)合能力。從240多種HPV多肽中篩選出98種與MHC具有有效結(jié)合能力的多肽。
表2 HPV 16的E6和E7多肽與MHC結(jié)合實驗結(jié)果

表3 HPV 18的E6和E7多肽與MHC結(jié)合實驗結(jié)果

實施例3體外免疫試驗用體外免疫試驗進一步篩選經(jīng)MHC結(jié)合試驗篩選出的98個HPV多肽。本發(fā)明中的體外免疫試驗分三步第一步是分離HLA特異性的外周血單個核細胞(PBMC)，第二步是用HPV多肽與PBMC共培養(yǎng)，第三步是測定培養(yǎng)上清中的IFNγ細胞因子。
用FICOLL密度梯度離心法(Boyum AScand J Clin Lab Invest 21(Supp197)77，1968)分離正常人(HLA-A1，A2，A3，A11和A24)外周血單個核細胞(PBMC)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液(10％人AB血清RPMI1640培養(yǎng)液，5ml青霉素/鏈霉素，5ml L-谷氨酸，0.5ml 2-巰基乙醇(mercaptoethanol))調(diào)整PBMC于2×106/ml。在48-孔板上每孔種加1ml含PBMC培養(yǎng)液，加HPV多肽刺激，多肽濃度為10μg/ml。對照組僅加培養(yǎng)液不加HPV多肽。細胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)21天，7天為一周期。在第一刺激周期，多肽直接加入PBMC中刺激培養(yǎng)。在第二和三刺激周期，用裝有多肽(peptide-pulsed)的抗原提呈細胞刺激培養(yǎng)。具體做法如下在第7和14天，在新的48-孔板上的每孔里加1ml濃度為2×106/ml的自體PBMC，在室溫孵育1小時。用PBS洗去非粘附細胞，加10μg/ml多肽于PBS室溫孵育2小時。從前一刺激周期的培養(yǎng)板收集已被刺激的細胞。細胞在洗滌后用1ml培養(yǎng)液重懸每孔細胞，并將細胞種植于安裝有多肽的抗原提呈細胞的新培養(yǎng)板。在每一個刺激周期的第2天加入10單位IL2(R&D Systems，Minneapolis，MN 55413，USA)于培養(yǎng)液。在第21天終止細胞培養(yǎng)。
實施例4 ELISA我們運用ELISA檢測HPV多肽特異性IFNγ細胞因子。該ELISA實驗過程分二個階段刺激階段和ELISA階段。
一.刺激階段收集經(jīng)過上述三個周期HPV多肽刺激的細胞，洗滌后用新鮮培養(yǎng)液將細胞調(diào)整到1×106細胞/ml作為ELISA刺激期的效應(yīng)細胞。安置相關(guān)HPV多肽于抗原提呈細胞(自體粘附性PBMC)。對照組為不安置任何多肽和安置無關(guān)多肽的抗原提呈細胞。將經(jīng)上述處理過的抗原提呈細胞與效應(yīng)細胞置于96-孔板，37℃，5％CO2共同孵育2-4小時。收集上清用ELISA測定IFNγ的釋放以判斷經(jīng)過HPV多肽反復(fù)刺激的效應(yīng)細胞是否能夠產(chǎn)生HPV多肽特異性免疫反應(yīng)，進而判斷被測試的多肽有沒有免疫原性。
二.ELISA階段用結(jié)合溶液稀釋捕獲抗體(鼠抗人IFNγ，PharMingen)至2μg/ml，加50μl稀釋過的抗體于ELISA板的每孔內(nèi)，于4℃包被過夜。用PBS/Tween洗板以除去未結(jié)合的捕獲抗體。每孔加200μl封閉液，蓋板并于室溫放置2小時。用PBS/Tween洗一次.每三孔加50μl同樣的標準IFNγ，樣本(上述的培養(yǎng)上清)和空白對照，室溫下反應(yīng)2-4小時。用PBS/Tween洗三次以除去未結(jié)合的IFNγ。用稀釋液稀釋生物素標記的鼠抗人IFNγ抗體(PharMingen)至1μg/ml。每孔加50μl稀釋后抗體，蓋板后于室溫反應(yīng)1小時.用PBS/Tween洗三次以除去未結(jié)合的生物素標記的鼠抗人IFNγ抗體。用稀釋液稀釋Streptavidin-HRP至1∶4,000。每孔加50μl稀釋的Streptavidin-HRP。蓋板后于室溫反應(yīng)半小時。用PBS/Tween洗5次以除去未結(jié)合的Streptavidin-HRP。每孔加50μlABTS/3％H2O2于室溫反應(yīng)半小時。
用ELISA閱讀機在405nm讀每孔的OD值。根據(jù)標準曲線算出IFNγ的濃度(pg/ml)。陽性結(jié)果的判斷設(shè)多肽實驗組IFNγ的濃度均值為陰性對照組IFNγ的濃度均值的倍數(shù)為刺激指數(shù)，刺激指數(shù)≥2.0為陽性結(jié)果。
至此，本發(fā)明篩選出41種有免疫原性的HPV多肽，能夠在體外誘導(dǎo)HPV多肽特異性T細胞免疫反應(yīng)，具有作為疫苗的可能性。
表4 HPV 16和18的E6和E7多肽體外免疫實驗結(jié)果

實施例5 小鼠體內(nèi)免疫試驗我們最后用小鼠體內(nèi)免疫試驗證實經(jīng)生物信息預(yù)測法、結(jié)合試驗和體外免疫試驗篩選出的41個多肽的免疫原性。如第6頁所述，為了將來產(chǎn)品生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的方便，也為了減少試驗樣本，根據(jù)多肽氨基酸序列的重迭性(Overlapes)將41個具有9個氨基酸長的多肽組合成十個具有20個左右氨基酸長的多肽，分別命名為HPV多肽1、2、3……10。用這十個多肽分別免疫Balb/C，C57和C3H小鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)。在8-10周齡雌性小鼠的后足墊分別注射50μg HPV多肽和佐劑(IFB)混合乳劑，每組注射三只小鼠。對照組注射50μl PBS；二周后進行一次加強免疫，第四周后殺死小鼠取其脾臟分離其T淋巴細胞用于免疫測定。用免疫酶聯(lián)斑點技術(shù)(ELISPOT)檢測小鼠體內(nèi)有沒有和有多少HPV多肽特異性T細胞產(chǎn)生(HPV多肽特異性T細胞頻率)。用51Cr釋放法分析HPV多肽特異性細胞毒性T淋巴細胞殺傷功能(CTL)。
實施例6 ELISPOT每孔加150μl封閉液(RPMI1640完全培養(yǎng)液)，37℃孵育2小時以阻斷非特異性結(jié)合位點反應(yīng)；安置相關(guān)HPV多肽于抗原提呈細胞(同源脾細胞)，37℃孵育1小時；用每組內(nèi)所含多肽分別制備相應(yīng)的抗原提呈細胞；用無關(guān)多肽和未經(jīng)多肽處理的同源脾細胞作為陰性對照；用3000拉德放射劑量照射該同源脾細胞；重懸經(jīng)上述處理的同源脾細胞于2×106/ml的細胞；收集效應(yīng)細胞(T淋巴細胞)于T-細胞培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為2×106/ml；根據(jù)每組內(nèi)所含多肽數(shù)將效應(yīng)細胞相應(yīng)分成若干份；棄封閉液并加100μl T淋巴細胞和100μl抗原提呈細胞于ELISPOT板；用0.5μg/ml ConA(Sigma)作陽性對照；37℃，5％CO2室溫反應(yīng)24小時；從孵箱中取出ELISPOT板并棄細胞；用PBS/0.05％Tween 20洗板6次；每孔加100μl生物素標記的鼠抗人IFNγ抗體(3ug/ml)(PharMingen)，37℃反應(yīng)2小時；在用二抗反應(yīng)結(jié)束前30分鐘準備Avidin-Peroxidase-復(fù)合物(APC/Vector)，即加1滴溶液A和1滴溶液B于10ml PBS/Tween 0.1％?；旌暇鶆颍檬覝刂辽?0分鐘；二抗反應(yīng)后，用PBS/Tween 0.05％洗板6次；每孔加100μlAPC并于室溫反應(yīng)1小時；棄APC并用PBS/Tween 0.05％洗板3次，接著用PBS洗3次；每孔加100μl底物(AEC)并在室溫反應(yīng)4分鐘。用蒸溜水終止反應(yīng)；除去ELISPOT板的底板；用吸水紙將培養(yǎng)孔吸干，并在黑暗中空氣干燥過夜。
在解剖顯微鏡下記數(shù)斑點數(shù)，一個斑點代表一個HPV多肽特異性IFNγ陽性T細胞；將斑點數(shù)轉(zhuǎn)換為每百萬T細胞中的斑點數(shù)(SPC/1×106)。如果處理組的每百萬脾細胞中的斑點數(shù)是陰性對照組斑點數(shù)的兩倍，則結(jié)果為陽性。其結(jié)果表明在經(jīng)體外免疫法篩選的HPV多肽中，有38個(92.7％)多肽在小鼠體內(nèi)能夠誘導(dǎo)HPV多肽特異性T細胞的產(chǎn)生。
圖1顯示上述一系列小鼠體內(nèi)免疫試驗中的一個實驗三只一組的HPV多肽免疫和非免疫(僅注射PBS)小鼠斷頸處死；取出它們的脾臟分離T淋巴細胞；用IFNγELISPOT檢測HPV多肽特異性IFNγ陽性T細胞的產(chǎn)生。T淋巴細胞在ELISPOT的短期培養(yǎng)中，在只有培養(yǎng)液沒有多肽情況下產(chǎn)生的值為基礎(chǔ)水平(Baseline)值，作為陰性對照，高于陰性對照值兩倍為陽性反應(yīng)。HPV多肽免疫組的T淋巴細胞當(dāng)再次遇到HPV多肽時產(chǎn)生顯著的HPV抗原特異性的免疫回憶反應(yīng)(Recall response)，表現(xiàn)為IFNγ的產(chǎn)生。HPV多肽免疫組的T淋巴細胞對在無關(guān)多肽刺激下不產(chǎn)生HPV抗原特異性的免疫回憶反應(yīng)。非免疫組的T淋巴細胞對HPV多肽同樣表現(xiàn)為陰性免疫反應(yīng)。圖1說明按照本發(fā)明的實施方案所發(fā)明的HPV16和18的E6和E7免疫原性多肽能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)HPV特異性細胞免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為HPV多肽特異性IFNγ陽性T細胞的產(chǎn)生。
實施例7小鼠體內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞分析(CTL)一.準備效應(yīng)細胞分離HPV多肽免疫過的Balb/c小鼠的脾臟淋巴細胞，制備單個細胞懸液，合并組內(nèi)三個脾臟的淋巴細胞；用RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌效應(yīng)細胞，稀釋細胞濃度至5×105/ml；用同樣方法準備對照組細胞(未免疫小鼠脾臟淋巴細胞)。
二.準備靶細胞收獲P815細胞(ATCC)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌P815細胞，稀釋細胞濃度至5×105/ml后將細胞加入96孔板，每孔3ml；加HPV多肽于P815細胞至終濃度為50μg/ml，不加任何多肽和無關(guān)多肽的P815細胞為對照組；37℃，5％CO2孵育過夜后收獲P815細胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌P815細胞，離心1×107細胞(～200g，室溫，5分鐘)，吸去上清，僅在管內(nèi)留下約0.1ml培養(yǎng)液，混勻細胞，加0.2～1mCi/ml51Cr和20μl小牛血清(FCS)到上述細胞中；于37℃，5％CO2放置60分鐘；用RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌細胞兩次除去未標記的51Cr，調(diào)節(jié)細胞濃度為2×104/ml備用。
三.CTL反應(yīng)測定分別加100μl效應(yīng)細胞和靶細胞于圓底96孔板，效應(yīng)細胞/靶細胞比例為25∶1，12.5∶1，6.25∶1，3.125∶1，1.56∶1，每份樣本重復(fù)3孔；對照設(shè)3孔100μl靶細胞中加入100μl 1％Triton X-100(最大同位素釋放量)以及設(shè)3孔100μl靶細胞中加入100μl培養(yǎng)液(自發(fā)同位素釋放量)，37℃，5％CO25小時，離心并收集每孔40μl上清液于γ記數(shù)儀測定樣本中靶細胞特異性溶解引起的同位素釋放量；靶細胞特異性溶解百分率公式特異性溶解％＝(樣本同位素釋放量-自發(fā)同位素釋放量/最大同位素釋放量-自發(fā)同位素釋放量)×100。
示于圖4的結(jié)果證實了對帶有HPV多肽抗原的靶細胞(實驗組P815)的有效殺傷，而對不帶有HPV多肽抗原的靶細胞(對照組P815)的殺傷力很低，證實了本發(fā)明的HPV多肽能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生HPV多肽特異性T殺傷細胞(CTL)，這些HPV多肽特異性T殺傷細胞能夠識別帶有HPV抗原的靶細胞，并予以殺傷清除。由于CTL反應(yīng)在清除HPV感染細胞和腫瘤細胞中起關(guān)鍵作用，因此本發(fā)明的HPV免疫原性多肽可開發(fā)用作為預(yù)防和治療性疫苗，預(yù)防和治療HPV感染以及由HPV感染引起的性病和良，惡性腫瘤。
序列表<110>宋碩 汪淵<120>人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽、其制備方法及應(yīng)用<130>
<160>33<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>17<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>1Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro1 5 10 15Arg<210>2<211>19<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>2Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr1 5 10 15Glu Leu Gln<210>3<211>17
<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>3Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp1 5 10 15Leu<210>4<211>14<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>4Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys1 5 10<210>5<211>14<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>5Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr1 5 10<210>6<211>21<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>6Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu1 5 10 15Gln Gln Tyr Asn Lys20<210>7<211>16<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>7Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15<210>8<211>19<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>8Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu1 5 10 15Tyr Cys Tyr<210>9<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>9Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu1 5 10 15Gln Leu Asn Asp20<210>10<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>10Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His1 5 10 15Tyr Asn Ile Val20<210>11<211>16<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>11Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys1 5 10 15<210>12<211>16<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>12Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr1 5 10 15<210>13<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>13Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr1 5 10 15Leu Gly Ile Val20<210>14<211>19<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>14Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val1 5 10 15Cys Pro Ile<210>15<211>17<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>15Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys1 5 10 15Pro<210>16<211>13<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>16Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro1 5 10<210>17<211>18<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>17Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr1 5 10 15Glu Leu<210>18<211>17<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>18
Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp1 5 10 15Ile<210>19<211>21<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>19Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile1 5 10 15Thr Cys Val Tyr Cys20<210>20<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>20Thr Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu1 5 10 15Phe Ala Phe Lys20<210>21<211>14<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>21Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr1 5 10<210>22<211>14<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>22Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu1 5 10<210>23<211>18<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>23Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr1 5 10 15Gly Leu<210>24<211>18<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>24
Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg1 5 10 15Cys Leu<210>25<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>25Leu Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys1 5 10 15Gln Lys Pro Leu20<210>26<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>26Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu1 5 10 15Pro Gln Asn Glu20<210>27<211>21<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>27Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu1 5 10 15Ile Pro Val Asp Leu20<210>28<211>18<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>28Leu His Leu Glu Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His1 5 10 15Glu Gln<210>29<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>29Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His1 5 10 15Leu Pro Ala Arg20<210>30<211>15<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>30Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro1 5 10 15<210>31<211>22<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>31Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys Cys1 5 10 15Glu Ala Arg Ile Glu Leu20<210>32<211>20<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)<400>32Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe1 5 10 15Val Cys Pro Trp20<210>33<211>19<212>PRT<213>Human Papillomavirus(Homo Papillomavirus)
<400>33Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala1 5 10 15Ser Gln Gln
權(quán)利要求
1.人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽，其具有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.33所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽的獲得方法其特征在于該方法包括以下步驟(1)從蛋白質(zhì)文庫調(diào)出人類乳頭瘤病毒16，18-E6和E7蛋白質(zhì)序列，用生物信息學(xué)分析預(yù)測HLA-A1，A2，A3，A11和A24限制性抗原決定簇，建立HPV16，18-E6和E7多肽文庫；(2)用抑制性競爭受體-配體親和法從該多肽文庫篩選出與HLA-A1，A2，A3，A11和A24有結(jié)合能力的多肽；(3)用體外免疫法進一步篩選出具有免疫原性的多肽；(4)用體內(nèi)免疫法進一步篩選和證實了這些免疫原性多肽在體內(nèi)誘導(dǎo)HPV16，18-E6和E7多肽特異性T細胞免疫反應(yīng)的能力。
3.權(quán)利要求1所述的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽用于制備預(yù)防和治療人類乳頭瘤病毒感染所引起的感染性疾病和腫瘤性疾病的疫苗的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽用于制備預(yù)防和治療人類乳頭瘤病毒感染所引起的感染性疾病和腫瘤性疾病的疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述感染性疾病為人類乳頭瘤病毒感染性性病。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽用于制備預(yù)防和治療人類乳頭瘤病毒感染所引起的感染性疾病和腫瘤性疾病的疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤性疾病包括人類乳頭瘤病毒感染所致子宮頸、外陰、肛門、陰莖和口咽增生性病變，良性腫瘤、癌前病變及其癌。
6.權(quán)利要求1所述的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽用于制備檢測人類乳頭瘤病毒感染所引起的感染性疾病和腫瘤性疾病的試劑的應(yīng)用。
7.人類乳頭瘤病毒預(yù)防和治療性疫苗，其特征在于該疫苗基本上包括權(quán)利要求1所述的人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人類乳頭瘤病毒預(yù)防和治療性疫苗，其特征在于所述疫苗還包括佐劑或其它輔助性多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人類乳頭瘤病毒預(yù)防和治療性疫苗，其特征在于所述佐劑為無機佐劑，有機佐劑，細菌佐劑，核酸佐劑，或細胞因子佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的人類乳頭瘤病毒預(yù)防和治療性疫苗，其特征在于所述輔助性多肽為MHC II限制性多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類乳頭瘤病毒免疫原性多肽、其制備方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。通過生物信息學(xué)分析、抑制性競爭受體－配體親合法及體外和體內(nèi)免疫法篩選得到的具有免疫原性的、能與HLA－A1，A2，A3，A11和A24結(jié)合的人類乳頭瘤病毒HPV16和18的E6和E7多肽序列，其具有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.33所示的氨基酸序列。這些多肽的制備方法以及其用于制備預(yù)防和治療HPV感染和由HPV感染引起的性病和良、惡性腫瘤的藥物的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK1775802SQ20041009105
公開日2006年5月24日 申請日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者汪淵, 宋碩, 周青 申請人:宋碩, 汪淵