專利名稱：一種sars流感二價聯(lián)合疫苗及其制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種SARS流感二價聯(lián)合疫苗，其含有H1N1、H3N2、B三型血凝素，滅活的SARS抗原，和藥學可接受的載體。本發(fā)明還涉及所述聯(lián)合疫苗的制備工藝。
背景技術：
為了有效控制重癥急性呼吸綜合癥(Severe Acute RespiratorySyndrome，以下簡稱為SARS)的蔓延，目前迫切需要能夠有效預防引起所述病癥的SARS病毒疫苗。根據(jù)目前的臨床實踐，一般認為預防SARS可以從預防常見的流感病毒感染入手，通過接種流感疫苗，獲得了較好的預防效果。
為了便于臨床使用，以方便接種人群，本發(fā)明人在研制出含有滅活SARS病毒疫苗的基礎上進一步開發(fā)出SARS流感病毒二價聯(lián)合疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面涉及一種SARS流感病毒二價聯(lián)合疫苗，其中分別含有免疫有效量的滅活的SARS病毒和裂解流感病毒，以及藥學上可接受的載體，任選的，還含有合適量的佐劑。
在本發(fā)明中，所述免疫有效量是指能夠在接種后有效產(chǎn)生免疫反應的量。本領域技術人員能夠知曉如何依據(jù)疫苗接種的途徑選擇適當?shù)慕臃N量。在本發(fā)明所述二價聯(lián)合疫苗中，含有H1N1、H3N2、B三型血凝素10-40ug/ml，SARS抗原16-128su/ml。優(yōu)選的，所述的SARS流感二價聯(lián)合疫苗，其中所述H1N1、H3N2、B三型血凝素含量為20-40ug/ml。在本發(fā)明中，所述SARS抗原的單位“su”用于表示樣品中sars病毒抗原含量，其對應于用反向間接血凝試驗檢測樣品中sars病毒抗原效價的倒數(shù)值。例如，某樣品效價為1∶160，則稱該樣品sars抗原含量為160su.
本發(fā)明所述二價聯(lián)合疫苗中可以不使用佐劑，或者使用疫苗制備領域中常用的佐劑氫氧化鋁。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述二價聯(lián)合疫苗中，所述H1N1、H3N2、B三型血凝素含量為10-30ug/ml，且還含有濃度為10-30mmol/L的氫氧化鋁。
本發(fā)明還涉及一種制備所述二價聯(lián)合疫苗的制備方法，包括1)制備SARS滅活病毒疫苗原液；2)制備裂解流感病毒疫苗原液；3)將步驟1)和2)中制備的兩種疫苗原液按最終疫苗抗原含量2倍等體積混合后，用選自注射用水、0.01MPBS(pH6.8-7.2)和含有氫氧化鋁的0.01MPBS(pH6.8-7.2)的溶液稀釋，使最終H1N1、H3N2、B三型血凝素為10-40ug/ml，SARS抗原為16-128su/ml，其中任選的含有濃度為10-30mmol/L的氫氧化鋁。
在本發(fā)明所述滅活SARS病毒疫苗原液中，可包含滅活的至少一種選自如下的SARS病毒的毒株Sino1，Sino2，Sino3，Sino4，和Sino5。所述病毒毒株分別于2003年6月26日保藏在國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號)，保藏號分別為0962，0963，0964，0965和0966。
本發(fā)明還涉及預防哺乳動物尤其是人免受SARS病毒和流感病毒感染的方法，包括給需要的個體接種免疫有效量的本發(fā)明的二價聯(lián)合疫苗。優(yōu)選地，接種途徑包括但不限于皮下、鼻內(nèi)、口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、或腸胃外途徑。


圖1顯示不同濃度甲醛溶液對流感病毒滅活效果的比較。
圖2顯示流感病毒親和層析純化的示意圖。
圖3顯示流感病毒分子篩純化的示意圖。
圖4顯示病毒純化液的電鏡照片。
圖5顯示單型疫苗原液的電鏡照片。
實施例實施例1 SARS病毒滅活在本發(fā)明中，采用選自福爾馬林溶液和β-丙內(nèi)酯的滅活劑，對含有SARS病毒的樣品進行滅活。
1)福爾馬林溶液滅活分別以等體積向待處理的SARS病毒樣品中加入經(jīng)1∶100(體積比)稀釋的福爾馬林溶液，在37℃下用工作濃度分別為1∶1000、1∶2000、1∶4000(體積比)稀釋的福爾馬林溶液處理SARS病毒液，得到SARS病毒推算滅活時間分別為2.9小時、6.0小時和12.5小時。
2)β-丙內(nèi)酯溶液滅活分別以等體積向待處理的SARS病毒樣品中加入經(jīng)1∶10(體積比)稀釋的β-丙內(nèi)酯溶液，在4℃下用工作濃度分別為1∶4000、1∶6000、1∶8000(體積比)稀釋的β-丙內(nèi)酯溶液處理SARS病毒液，得到SARS病毒推算滅活時間分別為2.9小時、7.2小時和11.6小時，在此基礎上延長至少2倍時間即為首次滅活時間。
實施例2 在規(guī)?；苽銼ARS病毒的細胞工廠中原位滅活病毒在本發(fā)明中還可以在規(guī)模化制備SARS病毒的細胞工廠中原位滅活病毒。
將制備好的滅活劑，即經(jīng)1∶100(體積比)稀釋的福爾馬林溶液，等量加入盛有待滅活SARS病毒的細胞工廠(購自丹麥NUNC公司)內(nèi)，混勻，在攪拌下，經(jīng)37℃原位滅活2.9～12.5小時后收獲。
或者當采用β-丙內(nèi)酯溶液作為滅活劑時，將1∶10稀釋后加入，使得β-丙內(nèi)酯溶液與總樣品體積比為1∶6000～1∶8000。滅活溫度2～8℃ 16～24小時。
實施例3 SARS病毒超時滅活或二次滅活1)對由實施例2所得采用福爾馬林為滅活劑處理得到的滅活病毒液，將其在與如實施例2所述相同的滅活條件下以首次滅活時間的3倍進行超時滅活。
2)對由實施例2所得采用β-丙內(nèi)酯為滅活劑處理得到的滅活病毒液，進行二次滅活。再次加入與病毒樣品總體積比為1∶4000～1∶6000(為兩次加β-丙內(nèi)酯工作濃度之和)的量進行二次滅活，第二滅活條件是在2-8℃下滅活SARS病毒16-24小時，室溫2天或37℃水浴作用2小時，以將SARS病毒徹底滅活。
實施例4 滅活SARS病毒的純化將如實施例3所得病毒滅活液進行如下操作，以純化所得病毒滅活液1)離心澄清，即以2000～4000g離心力在2-8℃離心10～35分，吸上清，得到病毒澄清液；2)超濾濃縮將病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包進行超濾濃縮10倍以上，等體積透析3-7次，透析液用0.01MPBS(pH7.0～7.6)，獲得病毒超濾液；3)柱層析將病毒超濾液用Sepharose four fast flow進行層析，收集第一穿流峰即為病毒純化液。洗脫液0.01M PBS。
或者，將如實施例3所得病毒滅活液進行如下操作，以純化所得病毒滅活液1)將病毒滅活液進行離心澄清，具體的以2000～4000g離心力在2-8℃離心10～35分，吸上清，即為病毒澄清液；2)超濾濃縮將病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包進行超濾濃縮10倍以上，等體積透析3-7次，透析液用0.01MPBS(pH7.0～7.6)獲得病毒超濾液；3)向步驟2)所的經(jīng)純化的滅活病毒液中加入終濃度10-100單位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg2+室溫處理4小時以上，消化體系中Vero細胞殘留DNA和體系的RNA；消化體系中Vero細胞殘留DNA；4)再次超濾；5)柱層析將病毒超濾液用Sepharose four fast flow進行層析，洗脫液0.01M PBS，收集第一穿流峰即為病毒精純液。
或者，將如實施例3所得病毒滅活液進行如下操作，以純化所得病毒滅活液1)將病毒滅活液進行離心澄清，具體的以2000～4000g離心力在2-8℃離心10～35分，吸上清，即為病毒澄清液；2)超濾濃縮將病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包進行超濾濃縮10倍以上，等體積透析3-7次，透析液用0.01MPBS(pH7.0～7.6)獲得病毒超濾液；3)柱層析將病毒超濾液用Sepharose 4 fast flow進行層析，洗脫液0.01M PBS，收集第一穿流峰；4)向步驟3)中收集的經(jīng)純化的滅活病毒液中加入終濃度10-100單位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg2+室溫處理4小時以上，消化體系中Vero細胞殘留DNA和體系的RNA；5)再次超濾，獲得病毒精純液。
實施例5 滅活SARS病毒疫苗原液的制備將經(jīng)過實施例1-3所述方法滅活的病毒滅活液依照上述方法純化后，將所得病毒純化液進一步將病毒精純液用選自0.2μm濾器或4-10千戈瑞劑量的鈷60照射樣品(體積不限)60分，除菌，獲得滅活SARS病毒疫苗原液。
實施例6 流感病毒的擴增和收獲
1.三級種子批建立原始種子批建立流感病毒原始毒種自WHO或中檢所引進，鑒于流感為全球監(jiān)控的傳染病，該毒種每年都改變的事實，采用來自WHO流感中心免費提供的當年毒株。
主種子批建立主種子批從原始種子批擴增一代后制備而成。選用SPF種蛋，在一定溫度和濕度下孵化9-11天。原始毒種按規(guī)定稀釋后，接種雞胚，0.2ml/胚，繼續(xù)培養(yǎng)，在無菌條件下收獲尿囊液，同一型別的混合在一起。然后分裝，每安瓿1ml。檢定合格后貼標簽入庫。主種子批僅用于工作種子批的制備。
工作種子批建立選用SPF種蛋，在一定溫度和濕度下孵化9-11天。主種子經(jīng)適當稀釋后，接種雞胚，0.2ml/胚，繼續(xù)培養(yǎng)，在無菌條件下收獲尿囊液，同一型別的混合在一起。然后分裝，每安瓿1ml，檢定合格后貼標簽入庫。工作種子僅用于流感病毒的生產(chǎn)。
2.雞胚孵化選用健康雞群所產(chǎn)的新鮮受精蛋。經(jīng)新潔爾滅溶液浸泡消毒后，在一定溫度和濕度下孵化9-11天，孵化期間檢出無精蛋、終止胚和發(fā)育不良的胚。
3.病毒擴增和收獲取工作種子適當稀釋后，用無菌注射器接種9-11日齡雞胚，0.2ml/胚，石蠟封口。在一定的溫度和濕度下培養(yǎng)48-72小時，無菌條件下收獲尿囊液，即為單型病毒收獲液。
實施例7 流感病毒的滅活方法及滅活效果比較如實施例6所述制備的流感病毒收獲液經(jīng)澄清，緩慢加入1∶200福爾馬林，使其終濃度為1∶2000，在2-8℃條件下攪拌至少16小時。流感病毒被滅活，此步產(chǎn)品稱為流感病毒滅活液。流感病毒經(jīng)滅活效果驗證，要求達到完全滅活。
具體的，滅活效果驗證方法如下將單型流感病毒滅活液按原液、1∶10、1∶100稀釋液分別接種9-11日齡雞胚，每組10個雞胚，0.2ml/胚，33-35℃培養(yǎng)3天，每組雞胚至少存活8個；從每個雞胚取0.5ml尿囊液，按組混合后再盲傳一代，即每組各接種10個胚，0.2ml尿囊液/胚，同樣每組雞胚至少存活8個，最后收獲尿囊液進行血凝試驗，結果不出現(xiàn)血凝反應，判為合格；否則判為不合格。實驗中設陽性對照，接種5個雞胚；陰性對照，接種5個雞胚。
病毒滅活曲線研究做滅活動力學曲線時，滅活后樣品用亞硫酸氫鈉中和游離甲醛。不同濃度甲醛溶液滅活效果比較甲1型流感病毒分別用終濃度1∶2000、1∶4000和1∶6000的甲醛溶液在2-8℃下滅活。結果表明，甲1型流感病毒經(jīng)1∶2000甲醛溶液滅活12小時后已完全滅活，1∶4000和1∶6000的甲醛溶液滅活時間需延長。
由于流感疫苗生產(chǎn)周期要求較短，因此選擇1∶2000的甲醛溶液滅活流感病毒，并將滅活時間定為至少16小時，以保證流感病毒完全滅活。結果如圖1所示。做滅活動力學曲線時，滅活后樣品用亞硫酸氫鈉中和游離甲醛。
不同批次流感病毒收獲液滅活效果比較流感病毒的滅活方法確定以后，通過多批流感病毒收獲液的滅活實驗和中試生產(chǎn)驗證，表明甲1型、甲3型和乙型流感病毒均可完全滅活，病毒血凝效價基本沒有下降，結果見表1。
表1 不同型別流感病毒收獲液滅活結果

實施例8 滅活流感病毒液的純化如實施例7制備的滅活流感病毒液純化工藝分為超濾濃縮、親和層析和分子篩層析連續(xù)三個步驟。
1.超濾濃縮超濾膜包截留分子量100KD-1000KD(Pall公司)。
操作方法在超濾器貯液瓶內(nèi)加入一定體積的單型病毒滅活液，啟動蠕動泵，進行超濾濃縮。當貯液瓶內(nèi)液體下降到一定體積時，注入與瓶內(nèi)等體積0.01M PBS(pH7.2)進行透析。重復上步操作5次，排出貯液池內(nèi)液體即為流感病毒單型病毒超濾液。
流感病毒滅活液經(jīng)超濾濃縮后，病毒回收率在95％以上，雜蛋白去除率在70％以上，而且流感病毒被濃縮10倍左右。
2.親和層析(Affinity chromatography)材料層析系統(tǒng)YC-1層析試驗冷柜，Millipore公司Masterflex C/L蠕動泵，Waters746積分儀，Waters486紫外檢測器，Waters Fractioncollector收集器。層析柱Pharmacia XK26/70。溶液平衡緩沖液為0.01M PBS(pH7.2)溶液，洗脫液為加入高濃度NaCl(1.5M)的0.01MPB溶液(pH6-8)。層析填料Matrex cellufine sulfate(密理博公司)方法將如前述制備的滅活流感病毒超濾液上親和層析，層析過程中通過紫外監(jiān)測器測定樣品在280nm處的吸光(O.D)值。根據(jù)吸光值收集樣品，然后檢測血凝效價。親和層析過程如圖2所示，共有兩個峰，第一個峰血凝效價經(jīng)檢測呈陰性，為雜蛋白峰；后一個峰為流感病毒峰。收集洗脫抗原峰。為單型流感病毒親和層析液。
流感病毒超濾液經(jīng)親和層析后，病毒回收率在95％以上，雜蛋白去除率在95％以上，而且流感病毒被濃縮5倍左右。
3.分子篩層析(Molecular-sieve chromatography)材料層析系統(tǒng)YC-1層析試驗冷柜，Millipore公司Masterflex C/L蠕動泵，Waters74積分儀、Waters486檢測器、Waters Fractioncollector。層析柱Pharmacia XK26/100。溶液平衡緩沖液為0.01MPBS(pH7.2)。層析填料Sepharose4FF(Pharmacia)方法將介質(zhì)勻漿裝柱，用平衡液平衡完全后測柱效，柱效達到要求后上樣，收集蛋白峰。
分子篩層析過程如圖3所示，分子篩層析過程一般有兩個以上蛋白峰。前一個峰為流感病毒峰(抗原峰命名為純化液)，后面的峰為雜蛋白峰。
分子篩層析中流感病毒回收率較高，也可使流感病毒進一步純化，而且可以脫鹽，將純化的流感病毒的緩沖液NaCl濃度調(diào)整為接近生理鹽水濃度。經(jīng)多次實驗表明，分子篩層析工藝穩(wěn)定，重復性好，可以用于流感病毒的純化。
實施例9 單型流感疫苗原液制備如實施例8制備的滅活流感病毒純化液中加入1.0％Triton X-100裂解病毒1.5-4小時。裂解后用康林公司porzorb膠吸附去除裂解劑，再經(jīng)高速8000-100,000g離心純化，0.22μm濾膜除菌過濾即為單型流感疫苗原液。
實施例10 SARS流感二價聯(lián)合疫苗的配制將如上述實施例5和9中制備的兩種單型滅活SARS病毒和流感病毒疫苗原液用注射用水或0.01MPBS(pH6.8-7.2)稀釋，也可以采用含有氫氧化鋁，0.01MPBS(pH6.8-7.2)釋液稀釋。
1)用注射用水或0.01MPBS(pH6.8-7.2)稀釋疫苗原液用注射用水或0.01MPBS(pH6.8-7.2)稀釋疫苗原液，最終H1N1、H3N2、B三型血凝素分別20-40ug/ml，SARS抗原16-128su/ml，即為SARS、裂解流感病毒二價聯(lián)合疫苗。
2)用含有氫氧化鋁，0.01MPBS(pH6.8-7.2)釋液稀釋疫苗原液用含有氫氧化鋁，0.01MPBS(pH6.8-7.2)釋液稀釋疫苗原液，最終H1N1、H3N2、B三型血凝素分別10-30ug/ml，SARS抗原16-128su/ml，氫氧化鋁濃度為10-30mmol/L，即為SARS、裂解流感病毒二價聯(lián)合疫苗。
實施例11 聯(lián)合疫苗的免疫原性實驗將如實施例10所述制備的聯(lián)合疫苗，按照0.5-1.0ml劑量通過腹腔注射接種小鼠，進行疫苗的安全性、免疫原性和有效性試驗。
結果接種疫苗組與未接種疫苗組(接種注射用水或0.01MPBS或10-30mmol/L氫氧化鋁)的動物，經(jīng)觀察均無臨床癥狀，其糞便、排泄物均未檢測到SARS病毒、流感病毒，組織器官也無病理改變，動物試驗結果初步驗證了滅活疫苗的安全性。
疫苗接種后10、15、30天采血，采用常規(guī)EIA法檢測SARS病毒IgG抗體及常規(guī)細胞中和試驗法、血凝抑制法檢測保護性中和抗體，其結果IgG總抗體10天均已陽轉，表明該疫苗具有良好的免疫原性，結果詳見表2。
用10、15、30天免疫血清與不同SARS毒株中和后進行細胞中和試驗，結果證實其免疫血清對不同SARS毒株均有良好的中和作用，其中和抗體效價平均可達1∶16-1∶32，即疫苗的有效性得以初步證實，結果詳見表3。
表2 聯(lián)合疫苗免疫接種后10、15、30天兩種抗原IgG總抗體檢測結果

表3 聯(lián)合疫苗免疫接種后10、15、30天SARS病毒中和抗體檢測結果

聯(lián)合疫苗免疫接種小鼠30天后小鼠較對照疫苗抗體增長倍數(shù)大于4倍，見表4。
表4 聯(lián)合疫苗免疫接種30天后流感病毒中和抗體檢測結果

動物預試驗結果基本證實，該本發(fā)明所制備的聯(lián)合疫苗，不僅具有良好的安全性和免疫原性，中和試驗結果進一步證實了該疫苗的有效性。
權利要求
1.一種SARS流感二價聯(lián)合疫苗，其中含有H1N1、H3N2、B三型血凝素10-40ug/ml，SARS抗原16-128su/ml，和任選的，藥物可接受的載體。
2.權利要求1所述的SARS流感二價聯(lián)合疫苗，其中所述H1N1、H3N2、B三型血凝素含量為20-40ug/ml。
3.權利要求1所述的SARS流感二價聯(lián)合疫苗，其中，所述H1N1、H3N2、B三型血凝素含量為10-30ug/ml，且還含有濃度為10-30mmol/L的氫氧化鋁。
4.權利要求1所述聯(lián)合疫苗的制備方法，包括1)制備SARS滅活病毒疫苗原液；2)制備裂解流感病毒疫苗原液；3)將步驟1)和2)中制備的兩種疫苗原液混合后，用選自注射用水、0.01MPBS(pH 6.8-7.2)和含有氫氧化鋁的0.01MPBS(pH6.8-7.2)的溶液稀釋，使最終H1N1、H3N2、B三型血凝素為10-40ug/ml，SARS抗原為16-128su/ml，其中任選的含有濃度為10-30mmol/L的氫氧化鋁。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SARS流感二價聯(lián)合疫苗，其含有H1N1、H3N2、B三型血凝素，滅活的SARS抗原，和藥學可接受的載體。本發(fā)明還涉及所述聯(lián)合疫苗的制備工藝。
文檔編號A61P31/00GK1775287SQ20041009266
公開日2006年5月24日 申請日期2004年11月16日 優(yōu)先權日2004年11月16日
發(fā)明者張振山, 高強, 韓中山, 劉瑜瑄, 劉玉芬, 劉長民, 張建三, 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興生物制品有限公司