專利名稱：胡黃連苷ii在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥新藥研究開發(fā)領(lǐng)域，具體而言，涉及胡黃連苷II在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前世界上有3.5億慢性乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者，占世界人口的5％。亞洲和非洲HBV攜帶率為8％-15％，HBV攜帶者中50％-70％病毒復(fù)制活躍，為慢性乙肝。5年隨訪研究表明，慢性乙肝病人肝硬化發(fā)生率為2％-20％，代償性肝硬化發(fā)展成失代償性肝硬化為20％-23％，發(fā)展成肝癌的占6％-15％。據(jù)調(diào)查推算，中國(guó)的慢性乙肝病人中，約25％-40％最終將死于肝硬化或合并肝癌。HBV攜帶者最終死于相關(guān)肝病的危險(xiǎn)性，男性為50％，女性為15％。尋求理想的抗HBV藥物一直是亟待解決的研究課題。
以往α干擾素(IFN-α)被認(rèn)為是唯一有效的抗病毒治療藥物，但它的適應(yīng)癥有限，耐藥性較強(qiáng)，易出現(xiàn)反彈，不良反應(yīng)的發(fā)生率較高，且價(jià)格高昂貴。近年來，許多核苷類藥物被發(fā)現(xiàn)具有很強(qiáng)的HBV作用，如拉米夫定、阿昔洛韋或其口服制劑泛昔洛韋、Adefovir及Lobucavir等，其中以拉米夫定的研究較為深入，但長(zhǎng)期拉米夫定治療慢性乙型肝炎可引起HBV DNA多聚酶基因酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)位點(diǎn)突變，使病毒對(duì)拉米夫定產(chǎn)生耐藥，難以推廣應(yīng)用。
中藥胡黃連原出于《唐本草》謂其“大寒”，“主骨蒸勞熱，補(bǔ)脾膽，明目”。《新修本草》曰“主骨蒸勞熱，補(bǔ)肝膽，明目，……厚腸胃”?！堕_寶本草》謂其“味苦、平、無毒”?！独谆馃椭扑幮越狻分?，其歸經(jīng)“入肝、膽、胃三經(jīng)”?？娤Ｓ骸侗静萁?jīng)疏》曰“胡黃連，善除濕熱，……一切濕熱，邪熱，陰分伏熱所生諸病，莫不消除?！薄端幤坊x》曰“胡黃連，獨(dú)入血分而清熱?！薄侗静菡x》言“濕火結(jié)聚，非此不能直達(dá)病所?！焙S連善除濕熱、消積聚，補(bǔ)肝膽，可清除慢性乙型肝炎的濕熱病邪，保肝膽以助除疫毒，為徹底治療本病提供了依據(jù)。
胡黃連是玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell干燥根莖，是多年生草本植物，生長(zhǎng)于高寒地區(qū)的巖石上及土堆中，或者淺土層的向陽處，分布于四川西部，云南西北部、西藏南部。據(jù)文獻(xiàn)記載，胡黃連中含有環(huán)烯醚萜苷類、葫蘆素類、酚苷類，另外還含有少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黃連苷II(Picroside II，Amphicoside)是屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物。目前對(duì)西藏胡黃連的化學(xué)成分研究已有較大進(jìn)展，對(duì)胡黃連苷II的醫(yī)療用涂也有報(bào)道，如申請(qǐng)?zhí)枮?2125544.X中記載胡黃連苷II可用于治療、預(yù)防過敏性炎性疾病，但至今尚未有胡黃連苷II用于治療乙型肝炎的詳細(xì)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種胡黃連苷II在制備治療乙型肝炎藥物中的新應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了含有胡黃連苷II的治療乙型肝炎的藥物組合物。
本發(fā)明人經(jīng)過多年不懈的努力，終于研制出治療乙型肝炎的中藥藥物，該中藥藥物的主要成分是從胡黃連藥材中提取的胡黃連苷II單體，可以通過口服、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、靜脈途徑給藥，該藥物可以以片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、注射劑、貼劑等形式存在。實(shí)驗(yàn)證明含有胡黃連苷II的藥物組合物具有明顯的治療乙型肝炎的作用，包括治療急、慢性乙型肝炎。該成果必將為胡黃連及其制劑走向國(guó)際市場(chǎng)提供重要的科學(xué)理論依據(jù)，為我國(guó)眾多的乙型肝炎疾病患者提供了新型高效低毒的治療乙肝中藥。
胡黃連苷II是一種植物成分，主要存在于玄參科植物胡黃連屬植物中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 分子式C23H28O13分子量512熔 點(diǎn)214℃-215℃溶解性水、甲醇、乙醇易溶，丙酮溶解，乙酸乙酯稍溶。
本發(fā)明人通過系列實(shí)驗(yàn)證明胡黃連苷II具有明顯的治療乙型肝炎的作用。它具有抑制乙肝病毒復(fù)制、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能，且毒副作用較低、作用機(jī)理明確。
為了證明胡黃連苷II對(duì)乙型肝炎有治療作用，包括對(duì)急性、慢性乙型肝炎的治療作用，本發(fā)明人采用口服和注射途徑對(duì)胡黃連苷II進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)四氯化碳、D-胺基半乳糖和對(duì)乙酰氨基酚造成急性肝損傷大鼠和小鼠的肝臟有一定的預(yù)防保護(hù)作用；對(duì)免疫性肝炎和四氯化碳造成慢性肝損傷大鼠的肝臟有明顯的保護(hù)作用；對(duì)四氯化碳(CCL4)、D-胺基半乳糖和對(duì)乙酰氨基酚造成急性肝損傷大鼠和小鼠肝臟有明顯的治療作用；對(duì)免疫性肝炎和四氯化碳造成慢性肝損傷大鼠的肝臟有明顯的治療作用；對(duì)鴨乙型病毒性肝炎有明顯的治療作用；能明顯降低2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙肝病毒表面抗原和e抗原的含量。上述實(shí)驗(yàn)證明胡黃連苷II為一種治療乙型肝炎的有效化合物。
胡黃連苷II在治療乙型肝炎中的應(yīng)用，其主要優(yōu)點(diǎn)是該藥物較西藥如拉米夫定、阿西洛韋等毒性較小，宜長(zhǎng)期服用。
本發(fā)明同時(shí)對(duì)胡黃連苷II治療乙型肝炎的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，主要進(jìn)行了如下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)體外培養(yǎng)小鼠、大鼠肝細(xì)胞凋亡和相關(guān)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)和對(duì)小鼠肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)及抗氧化作用的機(jī)理實(shí)驗(yàn)。兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該化合物作用機(jī)理為通過抑制Fas蛋白表達(dá)，上調(diào)Bc1-2蛋白表達(dá)來影響肝細(xì)胞凋亡；通過減少膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，提高機(jī)體清除氧自由基能力，強(qiáng)化抗氧化解毒系統(tǒng)，對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，從而達(dá)到治療乙型肝炎的作用。
本發(fā)明同時(shí)進(jìn)行了胡黃連苷II的一般藥理實(shí)驗(yàn)，包括對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)及其它系統(tǒng)影響；對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響(戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn))；對(duì)麻醉貓呼吸、血壓、心電的影響實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給小鼠灌胃胡黃連苷II(22mg/kg、44mg/kg、88mg/kg)，對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)、神經(jīng)系統(tǒng)有其它系統(tǒng)未見影響；對(duì)麻醉貓經(jīng)十二指腸給予胡黃連苷II(7mg/kg、14mg/kg、28mg/kg)后，也未見對(duì)其血壓、ECG、心率、心律，呼吸頻率及呼吸深度有影響。
本發(fā)明還進(jìn)行了胡黃連苷II的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，包括(1)胡黃連苷II灌胃大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)胡黃連苷II以20mg/kg、142mg/kg、500mg/kg三個(gè)劑量分別給Wistar大鼠灌胃，每天1次，每周6次，連續(xù)26周。各給藥組的一般情況、攝食量、體重、尿常規(guī)分析、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、臟器重量、臟器系數(shù)、系統(tǒng)尸解及病理組織檢查，與對(duì)照品比較均無顯著性差異，未見明顯毒性反應(yīng)。停藥后4周的恢復(fù)期，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均未見遲緩毒性。
(2)Beagle犬口服胡黃連苷II長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)給Beagle犬口服胡黃連苷II 10mg/kg、70mg/kg、250mg/kg三種劑量，每天1次，每周6次，連續(xù)給藥26周。3個(gè)劑量組動(dòng)物的一般情況、體重增長(zhǎng)、心電圖、血液學(xué)指標(biāo)、血清生化學(xué)指標(biāo)、尿常規(guī)、系統(tǒng)尸解、臟器系數(shù)及病理組織學(xué)檢查，與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未見明顯毒性反應(yīng)。停藥后4周的恢復(fù)期，觀察以所有檢測(cè)指標(biāo)均未見遲緩毒性反應(yīng)。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的結(jié)果表明，Beagle犬連續(xù)口服胡黃連苷II26周，未見有明顯的毒性反應(yīng)。
上述長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)證明胡黃連苷II的用藥是安全的。
具體實(shí)施例方式
用以下的實(shí)施例對(duì)胡黃連苷II治療乙型肝炎的有益效果作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例包含的內(nèi)容。
胡黃連苷II對(duì)CCL4致小鼠急性肝損傷的治療作用取昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重22±2g，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性甘利欣(50mg/kg)、胡黃連苷II小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(30mg/kg)共6組，每組10只。除正常組給予等體積的花生油外，其余各組均腹腔注射0.12％的CCL4花生油溶液0.1mL/10g，造成小鼠急性肝損傷模型。除正常與模型組給予等體積的生理鹽水外，其余各組均于造模后1小時(shí)、10小時(shí)及21小時(shí)靜脈注射胡黃連苷II或甘利欣一次，均按0.1mL/10g體積給藥。于造模后22小時(shí)摘眼球取血，測(cè)血清ALT、AST。結(jié)果如下表1胡黃連苷II對(duì)小鼠CCl4急性肝損傷血清ALT的影響(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，；與正常組比較△△△P＜0.001。
表2胡黃連苷II對(duì)小鼠CCl4急性肝損傷血清AST的影響(x±s)


注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△△P＜0.01。
從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，胡黃連苷II能明顯降低CCl4急性肝損傷小鼠血清ALT、AST值，因此胡黃連苷II對(duì)CCL4誘發(fā)的小鼠急性肝損傷有明顯的治療作用。
胡黃連苷II對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用方法取SD大鼠78只，雌雄各半，體重300g左右。根據(jù)體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(甘利欣30mg/kg)、胡黃連苷II小(7mg/kg)、中(14mg/kg)和大(28mg/kg)劑量組，共6組。除正常對(duì)照組皮下注射花生油外，其余各組均皮下注射25％CCL4花生油溶液2mL/kg，每周二、五各一次，連續(xù)8周，造成大鼠慢性肝損傷模型。除正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水外，陽性對(duì)照組、胡黃連苷II各劑量組于造模第2周均尾靜脈注射給藥0.5mL/100g(陽性組按0.6mL/100g體積給藥，尾靜脈注射給藥不成功者腹腔注射給藥)，每天1次，連續(xù)6周，并于給藥第二周、第四周眶后取血測(cè)血清ALT、AST、TP、ALB。于第6周末次給藥1小時(shí)后，各組腹腔注射劑量為30mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，測(cè)血清ALT、AST、TP、ALB，取肝臟測(cè)定羥脯胺酸及肝糖原水平。結(jié)果如下1.胡黃連苷II給藥1周后對(duì)血清AST、ALT、TP及ALB的影響表3胡黃連苷II給藥1周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(AST，ALT)(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△△△P＜0.001。
表4胡黃連苷II給藥1周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(TP，ALB)(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△△P＜0.01。
表5胡黃連苷II給藥1周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(白蛋白/球蛋白-A/G)(x±s)

由上表結(jié)果可見，無論是模型組與正常組比較，還是其余各組與模型組比較，A/G均無明顯變化(P＞0.05)。
2.胡黃連苷II給藥3周后對(duì)血清AST、ALT、TP及ALB的影響表6胡黃連苷II給藥3周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(AST，ALT)(x±s)


注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與正常組比較△△△P＜0.001。
表7胡黃連苷II給藥3周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(TP，ALB)(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△△＜0.01，△△△P＜0.001。
表8胡黃連苷II給藥3周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(A/G)(x±s)

由上表結(jié)果可見，無論是模型組與正常組比較，還是其余各組與模型組比較，A/G均無明顯變化(P＞0.05)。
3.胡黃連苷II給藥6周后對(duì)血清AST、ALT、TP、ALB、肝糖原及肝臟羥脯氨酸的影響表9胡黃連苷II給藥6周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(AST，ALT)(x±s)


注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與正常組比較△△△P＜0.001。
表10胡黃連苷II給藥6周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(TP，ALB)(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△△△P＜0.001。
表11胡黃連苷II給藥6周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(A/G)(x±s)


由上表結(jié)果可見，無論是模型組與正常組比較，還是其余各組與模型組比較，A/G均無明顯變化(P＞0.05)。
表12胡黃連苷II給藥6周后對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(肝糖原和肝臟羥脯氨酸)(x±s)

注與模型對(duì)照組比較**P＜0.01，***P＜0.001；與正常組比較△△△P＜0.001。
從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出胡黃連苷II能明顯降低血清ALT、AST及肝羥脯胺酸，升高TP、ALB及肝糖原值，肝損傷明顯減輕。因此胡黃連苷II對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷有明顯的治療作用。
胡黃連苷II對(duì)小鼠免疫性肝損傷的治療作用方法取昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重24±3g按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性甘利欣(50mg/kg)、胡黃連苷II小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(30mg/kg)共6組，每組12只。除正常組給予等體積的生理鹽水外，其余各組均尾靜脈注射卡介苗5×107U/只一次，12天后小鼠再尾靜脈注射LPS 6.0ug/只一次，造成小鼠肝損傷模型。除正常與模型組給予等體積的生理鹽水外，其余各組均于注射卡介苗造模后每天尾靜脈注射胡黃連苷II或甘利欣一次。胡黃連苷II及甘利欣均按0.1mL/10g體積給藥。于注射LPS后12h，摘眼球取血，離心血清測(cè)ALT、AST；取肝臟、脾、胸腺，稱重計(jì)算臟器系數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表13胡黃連苷II對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△△△P＜0.001。
表14胡黃連苷II對(duì)免疫性肝損傷小鼠臟器系數(shù)影響(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△△△P＜0.001。
從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出胡黃連苷II能降低肝損傷小鼠血清ALT、AST；亦能降低肝臟、脾系數(shù)、但對(duì)胸腺系數(shù)無明顯影響；因此胡黃連苷II對(duì)免疫性肝損傷小鼠有明顯的治療作用。
胡黃連苷II口服給藥對(duì)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響方法采用巨噬細(xì)胞中性紅法。取ICR小鼠60只，雄性，體重17-19g，按體重隨機(jī)分為五組，即正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組(左旋米唑，20mg/kg)、胡黃連苷II小(20mg/kg)、中(40mg/kg)和大(80mg/kg)劑量組。各給藥組均灌胃給藥，每日一次，連續(xù)5天。給藥第5天，給藥1小時(shí)后摘眼球放血處死小鼠，浸于75％酒精中消毒后，在超凈臺(tái)中以6mL的PBS注入腹腔內(nèi)，按摩腹腔取出腹腔液，離心，洗細(xì)胞2次，以胎盤蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞(活細(xì)胞數(shù)＞98％)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200ul/孔，置37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)使巨噬細(xì)胞貼壁，取出板甩去未貼壁的細(xì)胞，用PBS洗滌培養(yǎng)板3次，加入0.072％中性紅溶液100ul/孔，繼續(xù)溫育30分鐘，甩去多余的中性紅溶液，再洗板3次。最后加入細(xì)胞溶解液(蒸餾水50mL，無水乙醇50mL，冰醋酸0.3mL)100ul/孔，搖動(dòng)后4℃靜置過夜，取出板室溫靜置30分鐘后，用酶標(biāo)儀測(cè)吸光值(A)，波長(zhǎng)570nm。比較各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活力。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用組間t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表15胡黃連苷II對(duì)正常小鼠腹腔小鼠吞噬功能(x±s)

注與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果表明胡黃連苷II可以明顯增強(qiáng)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，能夠增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。
胡黃連苷II口服給藥對(duì)CCL4致大鼠慢性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用方法取Wistar大鼠72只，根據(jù)體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯，150mg/kg)、胡黃連苷II小(2mg/kg)、中(4mg/kg)、大(8mg/kg)劑量組。各給藥組按1mL/100g體積灌胃，正常及模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌胃給藥28天。灌胃給藥7天后，除正常對(duì)照組皮下注射花生油溶液外，其余各組均皮下注射25％CCL4花生油溶液5mL/kg，每周2次，共3周，造成慢性肝損傷模型。于末次給藥后1小時(shí)，腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，測(cè)血清AST、ALT、TP及ALB，處死動(dòng)物取肝臟，測(cè)定肝糖元和羥腹氨酸的含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用組間t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表16胡黃連苷II口服給藥對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用(AST，ALT)(x±s)


注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與正常組比較△△P＜0.01；△△△P＜0.001。
表17胡黃連苷II口服給藥對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用(TP，ALB)(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較△P＜0.05；△△△P＜0.001。
表18胡黃連苷II口服給藥對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用(肝糖元和羥腹氨酸)(x±s)

注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與正常組比較，△△△P＜0.001。
以上結(jié)果表明，胡黃連苷II口服給藥能顯著降低四氯化碳大鼠慢性肝損傷血清ALT、AST的水平，也能抑制血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及肝糖元的降低和肝臟羥腹氨酸的升高的作用，說明胡黃連苷II口服給藥對(duì)CCL4致大鼠慢性肝損傷有預(yù)防保護(hù)作用。
胡黃連苷II對(duì)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的抑制作用方法①胡黃連苷II對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)方法將在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG22.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中上清液棄去，加入0.25％的胰酶1-2mL，消化后加培養(yǎng)液吹打，將細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，配制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞濃度，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將胡黃連苷II用培養(yǎng)液稀釋6個(gè)濃度(35.0mg/mL、30.0mg/mL、15.0mg/mL、10.0mg/mL、7.5mg/mL、5.0mg/mL)。加于96孔培養(yǎng)板，每濃度5孔，每4天換同濃度藥液，設(shè)無藥物細(xì)胞為對(duì)照組，8天后觀察結(jié)果。棄去96孔板各孔中上清，每孔加入MTT培養(yǎng)液0.4mg/mL200μL，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄去各孔中液體，每孔加DMSO200μL震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。
觀察指標(biāo)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率、半數(shù)毒性濃度及無毒濃度。
抑制率＝(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-給藥組平均OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)×100％用BLiss法計(jì)算胡黃連苷II對(duì)2.2.15細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50及無毒濃度(近似使95％的細(xì)胞存活的藥物濃度)。
進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)(檢測(cè)藥物對(duì)2.2.15細(xì)胞的毒性)，目的是為胡黃連苷II對(duì)乙肝病毒HBsAg、HBeAg的抑制實(shí)驗(yàn)中藥物濃度的設(shè)置提供依據(jù)；同對(duì)乙肝病毒HBsAg、HBeAg的抑制實(shí)驗(yàn)平行操作的MTT實(shí)驗(yàn)與藥效實(shí)驗(yàn)相同均重復(fù)三次，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于治療指數(shù)(TI)的計(jì)算。
②胡黃連苷II對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中乙肝病毒HBsAg、HBeAg的抑制方法將HepG22.2.15細(xì)胞按1×105個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將藥液用培養(yǎng)液稀釋，終濃度分別為5mg/mL、3mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL。每濃度6孔，陽性藥物用阿昔洛韋(0.5mg/mL)，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換取培養(yǎng)液，換同濃度藥液，將收集的上清液-20℃冰凍保存，第8天收集上清液，采用酶免法以實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)450nm同時(shí)測(cè)定OD值。
觀察指標(biāo)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算抗原抑制百分率、半數(shù)抑制濃度(IC50)及治療指數(shù)(TI)。
抗原抑制百分率(％)＝(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-給藥組平均OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)×100％；用BLiss法算出胡黃連苷II和拉米夫定對(duì)HBsAg和HBeAg的半數(shù)抑制濃度(IC50)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，觀察藥效穩(wěn)定性。
TI＝TC50(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50％時(shí)的藥物濃度)/IC50(抗原抑制率為50％時(shí)的藥物濃度)；結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)TI＞2為有效；1≤TI≤2為有毒有效；TI＜1為毒性作用?？蓪⑹茉囁幬锱c陽性對(duì)照藥進(jìn)行比較研究。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別計(jì)算出了胡黃連苷II和陽性藥拉米夫定(各三批)對(duì)乙肝病毒兩抗原的治療指數(shù)(TI)，如下表所示表19胡黃連苷II對(duì)HBsAg、HbeAg的治療指數(shù) 由上表可以看出，胡黃連苷II僅在第一批實(shí)驗(yàn)中對(duì)HBeAg TI的為1.9，其余各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果無論對(duì)HBsAg還是HBeAg的TI均＞2，綜合三批實(shí)驗(yàn)結(jié)果，胡黃連苷II對(duì)HBsAg和HBeAg TI的平均值分別為3.0和2.9；陽性藥拉米夫定在三批實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HBsAg均顯示出較強(qiáng)的抑制作用，TI的平均值約7.2，但對(duì)HBeAg則無明顯的抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果說明胡黃連苷II對(duì)乙肝病毒表面抗原和e抗原有明顯的抑制作用。
胡黃連苷II對(duì)鴨乙型肝炎病毒(DHBV)感染的鴨血清DHBV-DNA的抑制作用方法(1)建立鴨乙型肝炎動(dòng)物模型1日齡北京麻鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清，每只0.3mL，以構(gòu)建鴨乙型肝炎動(dòng)物模型。7天后取血，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血清中DHBV-DNA含量，篩選感染陽性麻鴨。(2)實(shí)驗(yàn)分組及給藥選取感染陽性麻鴨，隨機(jī)分為5組，每組15只，分別為模型組(給予生理鹽水)、陽性藥組(靜脈注射ACV，100mg/kg)、注射用胡黃連苷II小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)三個(gè)劑量給藥組；同時(shí)取至少10只麻鴨作為正常對(duì)照組(給予生理鹽水)。藥物經(jīng)鴨脛靜脈注射給藥，每天1次，每次給藥體積為0.2mL/只，連續(xù)給藥10天。
觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)鴨血清DHBV-DNA含量，按照Dig標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。將上述鴨血清進(jìn)行點(diǎn)膜，用Dig標(biāo)記的DHBV全基因組DNA作為探針，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，NBT/BCIP底物顯色，用CMIAS系列-—多功能真彩色病理圖象分析系統(tǒng)分析膜上斑點(diǎn)的積分光密度值，以該值來代表樣本中DHBV-DNA水平。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法將每組鴨給藥后T5、T10和停藥后P3鴨血清DHBV-DNA水平與同組T0比較(采用成對(duì)t檢驗(yàn))，分析差異的顯著性；判斷藥物對(duì)該兩指標(biāo)的抑制效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果三批實(shí)驗(yàn)中，模型組在T5、T10和P3的血清DHBV-DNA水平與T0天比較均未見顯著性差異(P＞0.05)，說明每批實(shí)驗(yàn)全程13天內(nèi)模型組動(dòng)物血清中DHBV-DNA水平基本平穩(wěn)，可以在此時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行抗乙肝病毒藥物的體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。三批實(shí)驗(yàn)中，陽性藥給藥后第5、10天的血清DHBV-DNA水平與給藥前相比均有顯著性下降(P＜0.05)，但停藥后又有所回升。此三批實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明陽性藥ACV注射給藥對(duì)DHBV-DNA有明顯的抑制作用，實(shí)驗(yàn)方法成功。
第一批實(shí)驗(yàn)中，胡黃連苷II大劑量組給藥后第5天、第10天的鴨血清DHBV-DNA含量與給藥前比較有顯著性下降(P＜0.05)，停藥后第三天有下降趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；中、小劑量組給藥后第5天的鴨血清DHBV-DNA含量有下降趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；第二批實(shí)驗(yàn)中，小劑量組全程13天內(nèi)鴨血清DHBV-DNA含量沒有顯著性變化(P＞0.05)；中、大劑量組給藥后第5天能明顯降低鴨血清DHBV-DNA含量(P＜0.01)；第三批實(shí)驗(yàn)中，小、中劑量給藥T10血清中DHBV-DNA含量顯著性下降(P＜0.05或P＜0.01)，大劑量組給藥T10和P3血清中DHBV-DNA含量亦顯著性下降(P＜0.01)。三批實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胡黃連苷II對(duì)DHBV-DNA有較好的抑制作用。詳細(xì)結(jié)果結(jié)果見表20表20胡黃連苷II對(duì)鴨血清中DHBV-DNA的影響


注1.統(tǒng)計(jì)處理方法成對(duì)t檢驗(yàn)。
2.給藥后不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清中DHBV-DNA含量與感染前(T0)比較，呈顯著性下降*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001[實(shí)施例8]胡黃連苷II口服給藥對(duì)鴨乙型肝炎病毒(DHBV)感染的鴨血清DHBV-DNA的抑制作用方法(1)建立鴨乙型肝炎動(dòng)物模型1日齡北京麻鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清，每只0.3mL，以構(gòu)建鴨乙型肝炎動(dòng)物模型。7天后取血，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血清中DHBV-DNA含量，篩選感染陽性麻鴨。(2)實(shí)驗(yàn)分組及給藥選取感染陽性麻鴨，隨機(jī)分為5組，每組15只，分別為模型組(給予生理鹽水)、陽性藥組(靜脈注射ACV，100mg/kg)、胡黃連苷II小(24mg/kg)、中(36mg/kg)、大(54mg/kg)三個(gè)劑量給藥組；同時(shí)取至少10只麻鴨作為正常對(duì)照組(給予生理鹽水)。受試藥物口服給藥，每天1次，連續(xù)給藥10天。
觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)鴨血清DHBV-DNA含量，按照Dig標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。將上述鴨血清進(jìn)行點(diǎn)膜，用Dig標(biāo)記的DHBV全基因組DNA作為探針，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，NBT/BCIP底物顯色，用CMIAS系列-—多功能真彩色病理圖象分析系統(tǒng)分析膜上斑點(diǎn)的積分光密度值，以該值來代表樣本中DHBV-DNA水平。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法將每組鴨給藥后T5、T10和停藥后P3鴨血清DHBV-DNA水平與同組T0比較(采用成對(duì)t檢驗(yàn))，分析差異的顯著性；判斷藥物對(duì)該兩指標(biāo)的抑制效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果三批實(shí)驗(yàn)中，模型組在T5、T10和P3的血清DHBV-DNA水平與T0天比較均未見顯著性差異(P＞0.05)，說明每批實(shí)驗(yàn)全程13天內(nèi)模型組動(dòng)物血清中DHBV-DNA水平基本平穩(wěn)，可以在此時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行抗乙肝病毒藥物的體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。三批實(shí)驗(yàn)中，陽性藥給藥后第5、10及停藥后第3天的血清DHBV-DNA水平與給藥前相比均有顯著性下降(P＜0.05)，說明陽性藥ACV注射給藥對(duì)DHBV-DNA有明顯的抑制作用，實(shí)驗(yàn)方法成功。
第一批實(shí)驗(yàn)中，胡黃連苷II大劑量組口服給藥后第10天及停藥后第3天的鴨血清DHBV-DNA含量與給藥前比較有顯著性下降(P＜0.01；P＜0.05)，中、小劑量組DHBV-DNA含量沒有明顯變化；第二批實(shí)驗(yàn)中，胡黃連苷II大、小劑量組給藥第10天鴨血清DHBV-DNA含量顯著下降(P＜0.05；P＜0.01)；中劑量組給藥后第5、10及停藥后第3天DHBV-DNA均有顯著性下降(P＜0.001；P＜0.01；P＜0.05)；第三批實(shí)驗(yàn)中，胡黃連苷II大劑量組給藥后第5、10天鴨血清DHBV-DNA含量有非常顯著性下降(P＜0.001)；中劑量組給藥后第10天及停藥后第3天鴨血清DHBV-DNA含量有顯著性下降(P＜0.001；P＜0.05)；小劑量組DHBV-DNA含量沒有明顯變化。三批實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胡黃連苷II口服給藥對(duì)DHBV-DNA有較好的抑制作用。詳細(xì)結(jié)果結(jié)果見表21表21胡黃連苷II口服給藥對(duì)鴨血清中DHBV-DNA的影響

統(tǒng)計(jì)處理成對(duì)t檢驗(yàn)。
給藥組不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清DHBV OD值與感染前(T0)OD值比較。
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.00權(quán)利要求
1.一種黃連苷II的醫(yī)療用途，其特征是在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是在制備治療急、慢性乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征是含有黃連苷II的用于治療乙型肝炎的藥物組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征是該組合物可以通過口服、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、靜脈途徑給藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4所述的藥物組合物，其特征在于組合物可以以片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、注射劑、貼劑等形式存在。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥新藥研究開發(fā)領(lǐng)域，具體而言，涉及胡黃連苷II在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明胡黃連苷II具有明顯的抑制乙型肝炎病毒復(fù)制、保肝及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的效果，它具有明顯的治療乙型肝炎的作用，包括治療急、慢性乙型肝炎。用該單體制備成的治療乙型肝炎的藥物毒副作用較低，使用安全性較高。
文檔編號(hào)A61K9/08GK1778308SQ20041009600
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者周亞偉 申請(qǐng)人:周亞偉