專利名稱：具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)。更具體地涉及一種具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌和含有該活菌株的食物組合物或藥物組合物。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌是人體腸道中最重要的生理菌之一，它粘附于腸道上皮細(xì)胞上，形成穩(wěn)定的菌群，對于維持宿主腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗感染、抗衰老等方面發(fā)揮了重要的作用。但是絕大多數(shù)雙歧桿菌嚴(yán)格厭氧，對營養(yǎng)要求比較嚴(yán)格，且耐胃酸、膽汁質(zhì)特性差，人體食用后絕大部分被胃酸及膽汁質(zhì)殺死，難以抵達(dá)腸道發(fā)揮功效。
值得注意的是，即使是相同屬和種的雙歧桿菌，由于菌株間的差異，其特性和功能也存在明顯的差異。例如，A菌株較不耐酸耐膽汁；B菌株能有效抑制或殺滅腸道致病菌；C菌株對腸道細(xì)胞的粘附性能優(yōu)良；D菌株則具有抑制腫瘤的作用；E菌株則對安全性存在一定隱患等等。
然而，目前還沒有既具備安全性，又同時具有耐酸、耐膽汁、抑菌等多重優(yōu)點的雙岐桿菌。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)既具備安全性，又同時具有耐酸、耐膽汁、抑菌等多重優(yōu)點的雙岐桿菌發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種安全性能高、對酸和膽汁具有良好抗性，對腸道上皮細(xì)胞具有良好粘附能力、具有抗腸道致病菌特性和/或抗氧化特性等多重優(yōu)點的雙歧桿菌株。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種耐酸或耐膽汁的長雙歧桿菌。在另一優(yōu)選例中，它是長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BM358，保藏號是CCTCC NO
在另一優(yōu)選例中，所述的長雙岐桿菌對酸和膽汁具有抗性。
在另一優(yōu)選例中，所述的長雙岐桿菌對腸道上皮細(xì)胞具有粘附特性。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種本發(fā)明所述的長雙歧桿菌的用途，它被用于制備組合物，所述的組合物用于殺死或抑制幽門螺旋桿菌和/或大腸桿菌。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是食品組合物或藥物組合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于治療選自下組的疾病(a)幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、或十二指腸炎；或(b)由大腸桿菌引起的腸炎、急性腹瀉、或腸胃不適。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明所述的長雙歧桿菌的用途，它被用于制備組合物，所述的組合物用于提高哺乳動物血液中超氧化岐化酶的活力。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是食品組合物或藥物組合物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種食品組合物，它含有作為有效成份本發(fā)明所述的長雙歧桿菌和食品學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選例中，所述組合物中所述長雙歧桿菌的數(shù)量為組合物的0.001-99wt％，較佳地0.1-90wt％，或者絕對數(shù)量為1.0×103-1.0×107cfu，較佳地1.0×104-1.0×106cfu。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有作為有效成份的權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌和藥學(xué)上可接受載體。
在另一優(yōu)選例中，所述組合物中所述長雙歧桿菌的數(shù)量為組合物的0.001-99wt％，較佳地0.1-90wt％，或者絕對數(shù)量為1.0×103-1.0×107cfu，較佳地1.0×104-1.0×106cfu。


圖1顯示了長雙歧桿菌BM358在MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
圖2顯示了長雙歧桿菌BM358的電子顯微鏡圖像。
圖3顯示了長雙歧桿菌BM358對結(jié)腸腺癌系Caco-2細(xì)胞株粘附圖4顯示了長雙歧桿菌BM358對大腸桿菌O157H7的拮抗能力。
圖5顯示了長雙歧桿菌BM358對幽門螺旋桿菌的拮抗能力。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，分離出了一種具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌。該長雙歧桿菌株(Bifidobacterium longum)BM358是從世界五大長壽之鄉(xiāng)之一的廣西巴馬瑤族自治縣的一名健康長壽老人的糞便中分離出來。經(jīng)動物試驗證實具有極高的安全性，此外具有突出的耐酸耐膽汁特性，對腸道上皮細(xì)胞具有粘附特性，以及優(yōu)異的抗腸道致病菌和抗氧化特性。該菌株具有預(yù)防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎以及由大腸桿菌等其它腸道致病菌引起的腸炎、急性腹瀉等腸胃疾病，并具有抗氧化的特性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BM358株，于2004年7月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢)，其保藏編號為CCTCC NOM204053。長雙歧桿菌BM358屬于雙歧桿菌屬。
如本文所用，“本發(fā)明微生物”、“本發(fā)明的長雙歧桿菌”或“本發(fā)明細(xì)菌”指長雙歧桿菌BM358株CCTCC No.M204053。應(yīng)理解，這些術(shù)語還包括衍生自長雙歧桿菌BM358菌株，尤其是具有耐酸性、耐膽汁性、對腸道上皮細(xì)胞具有粘附特性、對腸道致病菌(如幽門螺旋桿菌、大腸桿菌)生長的抑制性等特性的衍生菌株。
如本文所用，“本發(fā)明的活性物質(zhì)”指長雙歧桿菌BM358株或其提取物。
如本文所用，“本發(fā)明的活性物質(zhì)制劑”或“本發(fā)明的活性組合物”指含有長雙歧桿菌BM358或其提取物的藥物組合物和食品組合物(包括保健品組合物)。
長雙歧桿菌BM358的基本生物學(xué)特性與已知的該種屬的典型微生物基本相同，不同點在于具有出色的耐酸性、耐膽汁性、對腸道上皮細(xì)胞具有粘附特性、對腸道致病菌(如幽門螺旋桿菌、大腸桿菌)生長的抑制性等特性。
具體而言，動物試驗已證明，本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358有很高的安全性。
耐酸試驗已證明，本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358具有突出地耐酸性能，在pH2.0-4.0下可存活很長時間。即使在pH值2.0條件下，在5小時后仍能檢測到大量BM358菌株活菌存在。
耐膽鹽實驗已證明，本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358具有突出地耐膽汁質(zhì)性能，在2.0-5.0％膽鹽濃度下可存活很長時間。即使在膽鹽濃度5.0％條件下，在5小時后仍能檢測到大量BM358菌株活菌存在。
粘附實驗已證明，本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358對腸道上皮細(xì)胞具有良好粘附性能。對Caco-2細(xì)胞的平均粘附率在13.4。
抑菌實驗已證明，本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358能有效抑制或殺死大腸桿菌0157H7。長雙歧桿菌BM358產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑達(dá)10.1mm。
抑菌實驗還已證明，本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358能有效抑制或殺死幽門螺旋桿菌。長雙歧桿菌BM358產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑達(dá)10.2mm。
抗氧化實驗已證明，本發(fā)明的長雙歧桿菌株BM358具有出色的抗氧化特性。實驗中測定了血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量和血中超氧化歧化酶(SOD)活力兩種生化指標(biāo)，表明長雙歧桿菌BM358具有抗氧化特性。
因此，本發(fā)明的長雙歧桿菌株BM358具有極高的安全性，突出的耐酸和耐膽汁質(zhì)的性能，人類食用后，大部分的活性菌株可通過胃酸和膽汁質(zhì)抵達(dá)腸道，并且可粘附在人體的腸道細(xì)胞，進(jìn)而能殺死或抑制幽門螺旋桿菌和大腸桿菌等腸道致病菌，并且具有抗氧化的特性?？勺鳛楣δ苄蕴砑游?或添加劑)廣泛的運(yùn)用在食品和藥品等產(chǎn)品中。
具體而言，本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358可作為有效成份，用于預(yù)防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎以及由大腸桿菌等其它腸道致病菌引起的腸炎、急性腹瀉等腸胃疾病。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種含有本發(fā)明的長雙歧桿菌BM358作為有效成份的組合物(包括藥物組合物和食品組合物)。這些組合物可用于預(yù)防、治療或輔助治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎以及由大腸桿菌等其它腸道致病菌引起的腸炎、急性腹瀉、腸胃不適等疾病。還可作為腸道調(diào)理劑用于調(diào)理腸胃。
在獲得長雙歧桿菌BM358后，可用常規(guī)方法將其與藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑相混合，形成本發(fā)明的藥物組合物或食品組合物。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
本發(fā)明藥物組合物或食品組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其他合適的形狀。本發(fā)明的活性成分(長雙歧桿菌BM358或其提取物)的含量通常為組合物重量的1-99％，較佳地為2-95％，更佳地為5-90％，最佳地10-80％。
可以為單劑或多劑形式。按施用劑量計，通常含有1-1000mg/劑，較佳地約2-500mg/劑，更佳地5-100mg/劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，優(yōu)選方式是口服。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明藥物的施用量，按活性物質(zhì)計算，通常為每天約0.01-500mg/kg體重，較佳地約0.1-50mg/kg體重。此外，本發(fā)明的制劑還可與其他治療劑一起使用，例如，其他治療劑包括各種現(xiàn)有的幽門螺旋桿菌抑制劑等。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于本發(fā)明的長雙歧桿菌株BM358具有極高的安全性，突出的耐酸和耐膽汁質(zhì)性能，對腸道上皮細(xì)胞具有粘附特性、對腸道致病菌(如幽門螺旋桿菌、大腸桿菌)生長的抑制性等特性。因此人們食用后，大部分的活性菌株可通過胃酸和膽汁質(zhì)抵達(dá)腸道，并且可粘附在人體的腸道細(xì)胞，進(jìn)而能殺死或抑制幽門螺旋桿菌和大腸桿菌等腸道致病菌，并且具有抗氧化的特性。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1從世界五大長壽之鄉(xiāng)的健康長壽老人分離獲得長雙歧桿菌BM358廣西巴馬瑤族自治縣是我國長壽老人較為密集的地區(qū)之一，1991年被國際自然醫(yī)學(xué)會評為世界第五大長壽之鄉(xiāng)，該地工業(yè)較少，污染程度極低，且當(dāng)?shù)厝藷o基本不服用抗生素。本發(fā)明人于1999年，自廣西巴馬瑤族自治縣挑選15名90歲以上的健康長壽老人，采集其糞便中后段，冷藏保存(0℃左右)，直至試驗。
然后，以無菌玻棒將糞便搗碎，沉靜片刻后，取出清液1mL，放入裝有9mL的稀釋液中，按照十倍稀釋法依次稀釋至10-7，10-8，10-9。取不同稀釋倍數(shù)的菌液各1mL于無菌培養(yǎng)皿中，分別倒入多種不同的選擇性培養(yǎng)基，充分混合均勻后，冷卻凝固。每個稀釋度二次重復(fù)，37℃厭氧培養(yǎng)三天。經(jīng)分離篩選獲得一株性能優(yōu)異的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BM358。
長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BM358于2004年7月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢)，其保藏編號為CCTCC NOM204053。
長雙岐桿菌BM358的生理生化特征如下1、形態(tài)和染色革蘭氏陽性，不規(guī)則桿狀，頂端多膨大或分叉。
2、培養(yǎng)特性接觸酶為陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣。氣相色譜測定葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)物有乳酸和乙酸產(chǎn)生，厭氧培養(yǎng)生長良好，好氧培養(yǎng)生長不好，在石蕊牛奶中產(chǎn)酸、凝固。
3、生化生化特征

長雙歧桿菌BM358可以在MRS液體培養(yǎng)基或PTYG液體培養(yǎng)基中生長良好，在MRS固體培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)72小時，形成直徑大致在1.0-2.5mm的菌落，形態(tài)為白色、光滑、中間隆起，菌落特征如圖1。
長雙歧桿菌BM358個體形態(tài)呈細(xì)小桿菌，成對或成長鏈，其電子顯微鏡下形態(tài)如圖2。長雙歧桿菌遺傳性狀穩(wěn)定，經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)性狀的變異。
實施例2長雙歧桿菌株BM358對昆明種小鼠連續(xù)灌胃的安全性昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，雙歧桿菌BM358接種至MRS培養(yǎng)基，置于36±1℃厭氧培養(yǎng)培養(yǎng)48小時，分別將培養(yǎng)物的原液和5倍濃縮液，經(jīng)口以20mL/KgBW給小鼠連續(xù)灌胃3天，并觀察7天。
結(jié)果如下表1所示。與對比組相比，未觀察到受試小鼠有毒性反應(yīng)及引起死亡。
表1長雙歧桿菌BM358活菌對小鼠毒性作用死亡表

實施例3長雙歧桿菌株BM358對健康成年ICR小鼠腹腔注射的安全性健康成年ICR小鼠40只，雌雄各半，雌性小鼠體重范圍19.5-22.0g，雄性小鼠體重范圍20.0-22.2g。隨機(jī)分成4組，將長雙歧桿菌BM358菌種轉(zhuǎn)種到MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，36±1℃厭氧培養(yǎng)48h后，刮取平板上的菌苔，用MRS液體培養(yǎng)基制成菌懸液，將濃度調(diào)整為5×109cfu/mL，每天小鼠一次性腹腔注射0.3mL菌懸液，連續(xù)觀察反應(yīng)7天。
結(jié)果如下表2所示，未見受性小鼠有毒性反應(yīng)或死亡。
表2長雙歧桿菌BM358對小鼠毒性作用結(jié)果

實施例4長雙歧桿菌BM358對酸的耐受性以滅菌的1％HCl溶液將滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基的pH調(diào)至2.0、3.0、4.0，將長雙歧桿菌株BM358接種到MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)18h后，以無菌水調(diào)整活菌數(shù)至5×108cfu/mL左右。以2％的接種量接種于pH分別為2.0、3.0、4.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別測定0、1、2、3、4、5小時的BM358活菌數(shù)。
結(jié)果如下表3所示，表明長雙歧桿菌BM358在pH2-4的酸性條件下有極其優(yōu)異的耐酸性。一般雙岐桿菌(對照)在pH4下4.0小時后的活菌數(shù)就小于1.0×105。
表3長雙歧桿菌株BM358在不同pH值條件下的活菌數(shù)變化狀況cfu/mL

實施例5長雙歧桿菌BM358對膽汁質(zhì)的耐受性將滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基膽鹽濃度調(diào)至2.0％、3.0％、4.0％、5.0％。將長雙歧桿菌株BM358接種到MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)18h后，以無菌水調(diào)整活菌數(shù)至5×108cfu/mL左右。以2％的接種量接種于膽鹽濃度分別為2.0％、3.0％、4.0％、5.0％的MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別測定0、1、2、3、4、5小時的BM358活菌數(shù)。
結(jié)果如下表4所示，表明長雙歧桿菌BM358在2.0％-5.0％膽鹽濃度下有極其優(yōu)異的耐受性。一般雙岐桿菌(對照)在2.0％膽鹽下4.0小時后的活菌數(shù)就小于1.0×105。
表4長雙歧桿菌株BM358在不同膽鹽濃度條件下的活菌數(shù)變化狀況cfu/mL

實施例6
長雙歧桿菌對腸道細(xì)胞的粘附能力(a)試驗材料(1)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生化所(2)DMEM培養(yǎng)液由78％DMEM，20％滅活(30min，56℃)小牛血清，1％青霉素、鏈霉素雙抗溶液，1％谷氨酰胺組成。
(3)PBS緩沖液由8g NaCl，0.20g KCl，1.14g Na2HPO4·7H2O，0.24g KH2PO4加水定容至1000mL配置而成。
(b)實驗方法將長雙歧桿菌株BM358接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18小時生長至最適后，取菌液離心獲得耗盡培養(yǎng)上清，細(xì)菌濃度用耗盡培養(yǎng)上清稀釋，調(diào)OD600＝0.5±0.05，此時活菌數(shù)約為5×108cfu/mL，制得細(xì)菌懸液。結(jié)腸腺癌系Caco-2細(xì)胞株。按常規(guī)傳代培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，10％CO2和90％空氣中37℃培養(yǎng)，每2天換一次液。
用于粘附實驗的細(xì)胞需是1小時前剛換過培養(yǎng)液的細(xì)胞。將培養(yǎng)好的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(5×104個/mL)，向已放置蓋玻片的24孔板中加入2mL細(xì)胞懸液，10％CO2和90％空氣中37℃培養(yǎng)，待在蓋玻片上形成單層細(xì)胞后，吸出舊的細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)pH7.4無菌PBS清洗2次后，每孔加入1mL細(xì)菌懸液和1mL細(xì)胞培養(yǎng)液。37℃培養(yǎng)2小時。經(jīng)pH7.4無菌PBS漂洗3次，甲醇固定，再經(jīng)pH7.4無菌PBS漂洗3次，革蘭氏染色，高倍鏡下選取Caco-2細(xì)胞的視野，計數(shù)50個細(xì)胞粘附的細(xì)菌數(shù)。
結(jié)果表明，粘附率在13.4±2.8個/細(xì)胞。這說明長雙歧桿菌株BM358對腸道細(xì)胞的粘附能力非常強(qiáng)。
實施例7長雙歧桿菌BM358對大腸桿菌O157H7的抑制作用(a)實驗材料(1)MRS培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20g，無水乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2g，Tween-80 1mL，K2HPO42g，MnSO4.4H2O0.25g，MgSO4.7H2O 0.58g，蒸餾水1000mL，各組分加熱溶解，調(diào)pH6.2-6.4，于121℃下滅菌15min備用。
(2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基牛肉膏2.5g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 2.5g，K2HPO4.3H2O 1.3g，蒸餾水500mL，各組分于中加熱溶解，調(diào)pH7.4，于121℃下滅菌15min備用。
(3)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，將各組分加熱溶解，于121℃下滅菌15min備用。
(4)大腸桿菌O157H7購自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所(b)實驗方法將長雙歧桿菌株BM358接種到MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18h后，測其OD600值，以MRS液體作空白對照。當(dāng)OD600在0.5±0.05時，其活菌數(shù)約為5×108cfu/mL。同時將大腸桿菌接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18h后，調(diào)整至活菌數(shù)至106cfu/mL。將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻到40℃左右時傾注到無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后，吸取大腸桿菌菌液1mL在平板表面均勻涂開，37℃固定培養(yǎng)菌落30min，在平板上打直徑4mm的孔，孔深3mm，將菌液注至滿孔，于37℃培養(yǎng)24h，測定抑菌圈大小。
結(jié)果所有的抑菌圈直徑都在9mm以上(表5)，這證實長雙歧桿菌能有效抑制或殺死大腸桿菌O157H7。
表5長雙歧桿菌BM358對大腸桿菌的抑菌能力的比較 單位mm

實施例8長雙歧桿菌BM358對幽門螺旋桿菌的抑制作用(a)實驗材料(1)MRS培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20g，無水乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2g，Tween-80 1mL，K2HPO42g，MnSO4.4H2O0.25g，MgSO4.7H2O 0.58g，蒸餾水1000mL，各組分加熱溶解，調(diào)pH6.2-6.4，于121℃下滅菌15分鐘備用。
(2)Skirrow氏培養(yǎng)基蛋白胨15.0g，胰蛋白胨2.5g；酵母浸膏5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000.0mL，甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim，TMP)5.0mg，萬古霉素(vancomycin)10.0mg，多粘菌素B(polymyxin)2500.0國際單位，凍溶馬血70.0mL。除甲氧芐氨嘧啶、抗生素和凍溶馬血外，將其他成分混合溶解。校正pH7.4，裝瓶100mL。121℃高壓滅菌15min，備用。此即血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基。臨用前，加熱溶解基礎(chǔ)培養(yǎng)基，冷至60℃。每100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入凍溶兩次的馬血7mL及TMP、抗生素混合液0.5mL，搖勻，傾注無菌平板。
(3)幽門螺旋桿菌購自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所(b)實驗方法將長雙歧桿菌株BM358接種到MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18h后，測其OD600值，以MRS液體作空白對照。當(dāng)OD600在0.50.5±0.05時，其活菌數(shù)約為5×108cfu/mL。同時將幽門螺旋桿菌接種于Skirrow氏培養(yǎng)基上，微氧環(huán)境37℃培養(yǎng)72h后，調(diào)整至幽門螺旋桿菌活菌數(shù)至106cfu/mL。吸取幽門螺旋桿菌菌液0.5mL于Skirrow氏培養(yǎng)基平板上，均勻涂開固定后在平板的表面后打直徑為4mm的孔，孔深3mm。將調(diào)整好濃度的長雙歧桿菌BM358菌液注至滿孔，于37℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。
結(jié)果所有的抑菌圈直徑在9mm以上，平均10.2mm以上(表6)，這證實長雙歧桿菌能有效地抑制或殺死幽門螺旋桿菌。
表6長雙歧桿菌BM358對幽門螺旋桿菌的抑菌能力的比較 單位mm

實施例9長雙歧桿菌BM358具有抗氧化作用采用SD大鼠，設(shè)老年動物和青年動物對照組，設(shè)置三個劑量組105cfu/Kg、106cfu/Kg、107cfu/Kg，對照組以蒸餾水灌胃連續(xù)30天，第31天，5組動物摘眼球取血，離心，取血清。測定如下生化指標(biāo)；血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量和血中超氧化歧化酶(SOD)活力，實驗結(jié)果用Spss軟件進(jìn)行統(tǒng)計。
樣品對動物體重的影響如表7所示。由表7可見，樣品各劑量組與老年組對照相比，均無顯著差異。
表7樣品對動物體重的影響

血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量如表8所示。由表8可見，樣品107cfu/Kg劑量組與老年組對照相比，有顯著差異。
表8血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量

*P＜0.05與老年對照組相比(經(jīng)方差分析)血中超氧化歧化酶(SOD)活力如表8所示。由表8可見，樣品106cfu/Kg、107cfu/Kg劑量組與老年組對照相比，均有顯著差異。
表9血中超氧化歧化酶(SOD)活力

*P＜0.05與老年對照組相比(經(jīng)方差分析)本實施例的實驗結(jié)果提示，長雙歧桿菌BM358具有抗氧化作用。
實施例10含長雙歧桿菌BM358的藥物組合物原料配比

按上述原料配比制成均勻的液體混合物，滅菌冷卻至37℃，接入長雙歧桿菌BM358發(fā)酵到活菌數(shù)達(dá)109cfu/mL以上，離心，加入含1％甘油和20％脫脂奶粉混合物，冷凍干燥，磨粉，裝入膠囊，即制成活菌數(shù)達(dá)109cfu/mL的藥物膠囊。
實施例11含長雙歧桿菌BM358的食物組合物原料配比

按上述配比，將鮮奶加熱到50℃以上，加入白砂糖攪拌至完全溶解，預(yù)熱，均質(zhì)，殺菌，冷卻，接種(接種數(shù)量嗜熱鏈球菌(1-100×106cfu/mL)、保加利亞乳桿菌(1-100×106cfu/mL)、雙歧桿菌(1-50×106cfu/mL)、40-42℃發(fā)酵至pH值為4.2-4.5，攪拌，充填，冷藏，即制成含活性長雙歧桿菌BM358的酸奶。
菌種保藏長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BM358于2004年7月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢)，其保藏編號為CCTCC NOM204053。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種長雙歧桿菌，其特征在于，它是長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)BM358，保藏號是CCTCC NOM204053。
2.如權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌，其特征在于，所述的長雙岐桿菌對酸和膽汁具有抗性。
3.如權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌，其特征在于，所述的長雙岐桿菌對腸道上皮細(xì)胞具有粘附特性。
4.如權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌的用途，其特征在于，用于制備組合物，所述的組合物用于殺死或抑制幽門螺旋桿菌和/或大腸桿菌。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的組合物是食品組合物或藥物組合物。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的組合物用于治療選自下組的疾病(a)幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍、或十二指腸炎；或(b)由大腸桿菌引起的腸炎、急性腹瀉、或腸胃不適。
7.如權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌的用途，其特征在于，用于制備組合物，所述的組合物用于提高哺乳動物血液中超氧化岐化酶的活力。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的組合物是食品組合物或藥物組合物。
9.一種食品組合物，其特征在于，它含有作為有效成份的權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌和食品學(xué)上可接受的載體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有作為有效成份的權(quán)利要求1所述的長雙歧桿菌和藥學(xué)上可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌，即長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)BM358。該長雙歧桿菌具有極高的安全性，具有突出的耐酸耐膽汁特性，對腸道上皮細(xì)胞具有粘附特性，具有優(yōu)異的抗腸道致病菌，并且具有抗氧化特性。該長雙岐桿菌可用于預(yù)防和治療由幽門螺旋桿菌引起的胃炎、胃潰瘍和十二指腸炎以及由大腸桿菌等其它腸道致病菌引起的腸炎、急性腹瀉、腸胃不適等疾病。
文檔編號A61P1/00GK1796540SQ200410099218
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者王敖喜, 任大寶 申請人:王敖喜, 任大寶