專利名稱：一種用于治療肝臟疾病的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于治療肝臟疾病的中藥組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
肝炎是目前世界上危害最為嚴重的傳染性疾病之一，且又與肝癌發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，目前，全球約有3.5億人為慢性肝炎患者或為無癥狀病毒感染者。這些慢性肝炎的病人有轉(zhuǎn)為肝硬化，肝癌的高危險性，每年有100多萬人死于和肝炎、肝硬化及肝癌有關(guān)的疾病。我國是肝炎病高發(fā)地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計，肝癌患者中有90％有肝炎病毒感染的背景，而目前肝癌已占腫瘤致死率的第二位。
田基黃Herba Hyperici Japonici，本品始載于《生草藥性備要》，《植物名實圖考》稱地耳草。為藤黃科植物地耳草全草。原植物地耳草Hypericum japonicum Thumb.ex Murray。生于田野較濕潤處。廣布于長江流域極其以南各地。田基黃主產(chǎn)于江西、福建、廣東、廣西、四川、貴州等地。近十幾年國內(nèi)外化學(xué)家們對其化學(xué)成分的提取、分離、鑒定；藥理作用；臨床應(yīng)用等做了深一步研究并取得巨大進展。在化學(xué)成分上，提取并確定了近20種的新化合物結(jié)構(gòu)。藥理方面進行了多方面的開發(fā)研究，如田基黃的抑菌作用；保肝作用；抑制腫瘤作用；對心血管系統(tǒng)作用等。在現(xiàn)代臨床研究中，田基黃提煉制成針劑用于臨床治療急、慢性肝炎等。
目前，田基黃的臨床應(yīng)用還多以復(fù)方的形式與其他中藥配伍應(yīng)用，與田基黃的臨床應(yīng)用有關(guān)的中國專利目前有二十余件，多為復(fù)方應(yīng)用；中國專利200310104504.X公開了一種田基黃總黃酮粉針劑的制備方法。
目前對田基黃藥材及田基黃注射液的研究中，尚未見有關(guān)從田基黃中分離純化有效部位及單體，進行肝臟疾病治療方面活性篩選的研究報道及專利申請；本發(fā)明是針對田基黃的保肝活性，在藥理活性篩選的跟蹤指導(dǎo)下，從田基黃中分離純化出有保肝、抗肝炎、抗肝纖維化的有效部位——田基黃總黃酮，并從中分離鑒定了主要的四個單體化合物槲皮苷、異槲皮苷、田基黃雙呫噸酮C及田基黃雙呫噸酮D，其中田基黃雙呫噸酮C及田基黃雙呫噸酮D為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種從藥材田基黃中提取的能治療肝臟疾病的有效成分組合物及其制備方法，以及在治療急性和慢性病毒性肝炎、肝損傷的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明從中藥田基黃中提取具有治療肝臟疾病作用組合物的制備方法，步驟如下1、提取采用溶劑提取法，提取溶劑可以選用水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或乙酸乙酯等有機溶劑或其幾種的混合溶劑，提取方法為超聲提取、滲漉提取或加熱回流提取，提取次數(shù)可以為1-3次。
2、萃取采用溶劑萃取法，可以將步驟1所得的提取物用水分散，再用有機溶劑萃取，有機溶劑可以選用氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯或丁醇等，優(yōu)選乙酸乙酯，萃取次數(shù)可以為1-4次。
3、濃縮干燥步驟2所得萃取液過0.22μm濾膜，濾液減壓濃縮至干，得到有效成份田基黃總黃酮組合物。
采用以上的工藝步驟制得的總黃酮組合物，其中黃酮類重量含量為80～99.5％，且組合物中主要化學(xué)成分明確，含量固定，具有工藝簡潔，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。
本發(fā)明提供的治療急性和慢性病毒性肝炎、肝損傷、肝纖維化等肝臟疾病的藥物組合物，其中含有上述從中藥田基黃提取純化得到的有效成份田基黃總黃酮，該總黃酮中黃酮類成分的重量含量為80％-99.5％。
化學(xué)成分及藥理活性篩選對以上所得到的田基黃總黃酮組合物，應(yīng)用色譜層析技術(shù)，進一步從中分離鑒定了21種黃酮類化合物，經(jīng)藥理活性跟蹤篩選出4個具有肝保護及抗肝纖維化的化合物，分別為槲皮苷、異槲皮苷、田基黃雙呫噸酮C及田基黃雙呫噸酮D，它們?yōu)榭傸S酮的主要成份。
其結(jié)構(gòu)式分別如下所示 槲皮苷結(jié)構(gòu)式異槲皮苷結(jié)構(gòu)式
田基黃雙呫噸酮C結(jié)構(gòu)式 田基黃雙呫噸酮D結(jié)構(gòu)式上述組合物的藥理活性篩選如下一、田基黃總黃酮，對試驗性肝損傷的保護作用的動物驗證(一)硫代乙酰胺致小鼠急性肝損傷模型1、試驗動物昆明種小鼠，性別不限，體重19～22g，隨意進食及飲水，室溫(23±2℃)，自然光照。
2、試驗方法將小鼠隨機分成7組，除正常對照組外，其余各組均以硫代乙酰胺(TAA)30mg/Kg，i.p，中毒后3h、6h、9h，連續(xù)給藥3次，最后一次給藥后24小時，即第二天取血，測定如下指標，同時稱肝重，并進行病理學(xué)檢查。結(jié)果見表1。
表1各組試藥對硫代乙酰胺致小鼠急性肝損傷模型各指標的影響(X±SD，n＝20)

*與NS對照組比較P＜0.05；P＜0.01結(jié)果與NS對照組比較，田基黃總黃酮可顯著降低硫代乙酰胺致小鼠急性肝損傷模型造成的肝損害。
(二)四氯化碳致大鼠急性肝中毒模型1、試驗動物成年SD大鼠，性別不限，體重在250～350g左右，喂飼普通顆粒飼料，隨意飲水。
2、試驗方法將大鼠隨機分成6組，除正常對照組外，其余各組均以50％四氯化碳0.5ml/100g，皮下注射中毒，同時給藥一次，中毒后4h、8h各給藥一次，最后一次給藥后12小時，取血測定ALT，AST等指標的變化，處死動物稱肝重，并進行病理學(xué)檢查。結(jié)果見表2。
表2各組試藥對四氯化碳致大鼠急性肝損傷模型各指標的影響(X±SD，n＝20)

*與NS對照組比較P＜0.05；P＜0.01結(jié)果與NS對照組比較，田基黃總黃酮可顯著降低四氯化碳致大鼠急性肝中毒模型造成的肝損害。
(三)D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型1、試驗動物成年SD大鼠，性別不限，體重在250～350g左右，喂飼普通顆粒飼料，隨意飲水。
2、試驗方法將大鼠隨機分成4組，除正常對照組外，其余各組均以D-氨基半乳糖800mg/Kg，腹腔注射中毒，同時給藥一次，給藥后12小時，取血測定SGPT，TBIL等指標的變化，處死動物稱肝重，并進行病理學(xué)檢查。結(jié)果見表3。
表3各組試藥對D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型各指標的影響(X±SD，n＝20)

*與NS對照組比較P＜0.05；P＜0.01結(jié)果與NS對照組比較，田基黃總黃酮可顯著降低D-氨基半乳糖致大鼠肝中毒模型造成的肝損害。
(四)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型1、試驗動物雄性Wistar大鼠，試驗開始時體重100～150g，飼育22℃室溫，光照周期12h12h環(huán)境中，隨意進食及飲水。
2、試驗方法雄性Wistar大鼠，皮下注射0.3ml/100g體重CCl4(溶于花生油中，CCl4體積比為40％)，每周2次，注射12周形成肝纖維化，均為IV期。隨后將肝纖維化大鼠隨機分為以下各組生理鹽水對照組，各樣品組，陽性對照組。每日肌肉注射樣品1次，共8周。生理鹽水對照組每日肌肉注射0.2ml生理鹽水，共進行8周。于治療8周后從下腔靜脈采血作生化測定，然后處死動物，取右葉肝組織，用10％的中性甲醛溶液固定，用于組織學(xué)檢查。結(jié)果見表4
表4各組試藥對四氯化碳致大鼠慢性肝中毒模型各指標的影響(X±SD，n＝20)(連續(xù)11周后)

*與NS對照組比較P＜0.05；P＜0.01結(jié)果與NS對照組比較，田基黃總黃酮可顯著降低四氯化碳致大鼠慢性肝中毒模型造成的肝損害。
(二)田基黃雙呫噸酮C及田基黃雙呫噸酮D對肝纖維化模型的影響藥物配制a.根據(jù)藥物溶解度用DMSO稀釋配制成濃度為10mg/mL；b.0.45um濾過膜濾過；c.4℃保存復(fù)蘇HSC-T6細胞株，其表型為活化的HSC每2-3天換液、傳代，所用培養(yǎng)液為DMEM+FCS(滅活的10％小牛)+PS(100u/mL的青霉素和鏈霉素)試驗方法取對數(shù)生長期HSC5×103/孔接種于96孔板，37℃，5％CO2，24小時把培養(yǎng)液換成無血清的DMEM，37℃，5％CO2，24小時加入不同濃度的藥物，使其終濃度為(3.125、6.25、12.5、25、50、100ug/mL)，37℃，5％CO2，48小時加入顯色劑KIT-8 10uL/孔，37℃，5％CO2，60分鐘，測定OD值結(jié)果如表5、6、7、8
表5田基黃雙呫噸酮C不同時間不同濃度作用于HSC細胞OD值

表6田基黃雙呫噸酮C不同時間不同濃度作用于L02細胞OD值

表7田基黃雙呫噸酮D不同時間不同濃度作用于HSC細胞的OD值

表8田基黃雙呫噸酮D不同時間不同濃度作用于L02細胞的OD值

藥劑學(xué)研究本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的田基黃總黃酮，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的藥物組合物可用于制備治療急性和慢性病毒性肝炎、肝損傷、肝纖維化的藥物。
上文所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明組合物可以通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑、鼻噴霧劑和注射劑、注射用凍干粉針劑、膠囊劑、滴丸劑等。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明的藥物組合物制劑中含有重量比為0.1％-99.5％的總黃酮活性成分，優(yōu)選含有重量比為0.5％-95％的總黃酮活性成分。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1田基黃干燥藥材5.0Kg，用60％乙醇溶液50升回流提取2次，每次2小時，合并兩次提取液，減壓濃縮得到浸膏620g，用2升水分散后，調(diào)節(jié)pH值至5～6，以乙酸乙酯30升分三次萃取，合并三次萃取液，加入無水硫酸鈉脫水后，過0.45μm過濾，濾液減壓濃縮至干，得到田基黃總黃酮120克。
實施例2取上述田基黃總黃酮組合物10g，與50g硅膠混合拌樣，加到已裝好的硅膠柱頂端，以氯仿∶甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，TLC跟蹤，分別合并氯仿∶甲醇(15∶1、5∶1)部分，經(jīng)柱層析純化后得到田基黃雙呫噸酮C 0.4g、田基黃雙呫噸酮D 0.7g，槲皮苷3.6g及異槲皮苷4.7g。
實施例3片劑田基黃總黃酮 60g乳糖 187g玉米淀粉 50g硬脂酸鎂 3g制備方法將田基黃總黃酮、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重300mg，田基黃總黃酮含量為60mg。
實施例4安瓿劑田基黃總黃酮10g氯化鈉 9g制備方法將田基黃總黃酮和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中，每支含田基黃總黃酮10mg實施例5注射用凍干粉針劑田基黃總黃酮 10g甘露醇20g制備方法將田基黃總黃酮和甘露醇溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入西林瓶中，凍干，每支含田基黃總黃酮10mg。
權(quán)利要求
1.一種用于治療肝臟疾病的中藥組合物，其特征在于含有從中藥田基黃提取、純化得到的有效部位田基黃總黃酮，總黃酮中黃酮類成分的重量含量為80～99.5％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述總黃酮成分主要為槲皮苷、異槲皮苷、田基黃雙呫噸酮C及田基黃雙呫噸酮D。
3.一種如權(quán)利要求1所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于采用以下步驟(1)提取采用溶劑提取法，提取溶劑選用水、甲醇、乙醇、丙酮、丁醇或乙酸乙酯或其幾種的混合溶劑，提取方法為超聲提取、滲漉提取或加熱回流提取，提取次數(shù)為1-3次；(2)萃取采用溶劑萃取法，將步驟(1)所得的提取物用水分散，再用有機溶劑萃取，有機溶劑選用氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯或丁醇，萃取次數(shù)可以為1-4次。(3)濃縮干燥步驟(2)所得萃取液過0.22μm濾膜，濾液減壓濃縮至干，得到有效成份田基黃總黃酮組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于還含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體組成片劑、注射劑、注射用凍干粉針劑、膠囊劑、滴丸劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于總黃酮活性成份的重量含量為0.1％-99.5％。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療肝臟疾病的中藥組合物及其制備方法。該中藥組合物是從中藥田基黃中提取、純化制得的有效部位，其中黃酮類成分的含量為80～99.5％。該黃酮類成分主要為槲皮苷、異槲皮苷、田基黃雙呫噸酮C及田基黃雙呫噸酮D。上述組合物的制備方法是以田基黃藥材為原料，經(jīng)乙醇提取、濃縮、調(diào)節(jié)pH值、乙酸乙酯萃取得到總黃酮有效部位，具有工藝簡單、總黃酮轉(zhuǎn)移率高的優(yōu)點。本發(fā)明所述的中藥組合物可用于肝部疾病如急性和慢性病毒性肝炎、肝纖維化、肝損傷的治療。
文檔編號A61K9/19GK1660307SQ200410099268
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 傅芃, 李慧梁, 張川, 蘇娟, 柳潤 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)