專利名稱：中期因子基因為靶的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說涉及靶向中期因子(Midkine，MK)基因，抑制人MK表達、新生血管生成及肝癌生長的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。
背景技術(shù)：
肝癌是一種高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的實體惡性腫瘤。盡管目前針對肝癌細胞本身進行的手術(shù)切除、化療和放療等治療方案日趨完善，但仍難以取得滿意的療效，因此探索新的有效的治療途徑已成為提高肝癌生存率的關(guān)鍵。
近年研究表明，與其他實體惡性腫瘤一樣，腫瘤血管生成(angiogenesis)是肝癌無限制侵襲生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，如果沒有新生血管生成，原發(fā)腫瘤的生長不會超過1～2mm3。腫瘤組織必須依賴從新生血管中獲取營養(yǎng)和排泄代謝產(chǎn)物。因此，以新生血管為靶點，抑制肝癌血管生成，切斷肝癌和轉(zhuǎn)移的“命脈”，對腫瘤進行生物基因治療已成為近幾年新的研究熱點；它與傳統(tǒng)的以腫瘤細胞為靶點的治療手段相比，具有廣譜、放大的抗腫瘤作用，且毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性的特點。中期因子(Midkine，MK)是一個新發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子，其基因最初是在視黃酸(retinoic acid，RA)誘導(dǎo)分化早期的胚胎瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)的，定位于染色體11q11.2，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，故又稱視黃酸反應(yīng)性肝素結(jié)合性生長/分化因子。它是一種具有促細胞轉(zhuǎn)化、促有絲分裂作用、促血管生成、抗細胞凋亡和增強纖維蛋白溶解等腫瘤形成相關(guān)活性的堿性肝素結(jié)合性蛋白質(zhì)，僅在胚胎中期和成年腎臟表達。已有的研究表明，MK能促進內(nèi)皮細胞分化，對人腦與臍靜脈內(nèi)皮細胞、PC12細胞、神經(jīng)外胚層前體細胞和NIH 3T3成纖維細胞具有有絲分裂原活性。在軟瓊脂培養(yǎng)中，MK能促進SW13細胞克隆形成，而將經(jīng)MK轉(zhuǎn)染的SW13細胞和NIH 3T3細胞接種無胸腺裸鼠，則能形成富含血管的腫瘤。在肝癌等許多人類惡性腫瘤組織中MKmRNA及蛋白均呈高度表達，而各種正常組織僅有低水平表達或無表達，并與肝癌的發(fā)生、浸潤轉(zhuǎn)移，血管生成及預(yù)后密切相關(guān)。因此，MK可能是抗血管生成治療肝癌的理想靶位。
反義技術(shù)是繼基因工程以后又一項重大突破。根據(jù)核酸雜交原理，與某一些癌基因或生長因子基因互補的反義脫氧寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)，被導(dǎo)入癌細胞后，可與靶基因的mRNA或前體hnmRNA互補結(jié)合，阻斷mRNA的成熟和翻譯，在基因水平調(diào)節(jié)由基因到蛋白質(zhì)的遺傳信息傳導(dǎo)，從而抑制蛋白質(zhì)表達，達到抗腫瘤的目的。自從1978年Zamecnik和Stephenson首次利用人工合成反義寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒基因獲得成功以來，已經(jīng)有多個針對不同靶基因的反義寡核苷酸逐步從臨床前研究走向臨床試驗研究，這些癌基因包括Bcl-2、c-Raf、H-Ras、P53等。由于反義寡核苷酸具有高度靶特異性，因此靶向肝癌腫瘤血管生成促進因子基因的反義寡核苷酸有望成為理想的抗肝癌血管生成基因治療的新藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于尋找特異高效的新型抗肝癌血管生成基因治療的新藥，即對肝癌腫瘤血管生成促進因子MK基因具有較好抑制活性的ASODN及能改善其生物活性的化學(xué)修飾衍生物。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是，根據(jù)GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的MidkinemRNA參考序列(GeneBank序列號24475622)，通過對其進行基于多預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)的計算機輔助設(shè)計，選擇了10個不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為ASODN的作用靶點。通過與GeneBank聯(lián)機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會干擾人類其它正?；虻谋磉_。另外，作為評價MK5作用的特異性，設(shè)計了其正義序列(SEN)和組成與MK5完全相同而序列不同的錯配序列(MIS)(見表1)。在自動DNA合成儀上合成硫代反義寡核苷酸(S-ASODN)。分別采用三種人肝癌細胞系HepG2、SMMC7721和BEL7402對上述ASODNs進行活性篩選和評價。結(jié)果顯示10條ASODNs中，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8在0.4μM時對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用。綜合10條S-ASODN三對上述三系細胞的抑制率得出其IC50值，結(jié)果表明MK5的抑制活性最強。采用MK5轉(zhuǎn)染人HepG2肝癌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞，結(jié)果顯示MK5能特異性抑制人HepG2肝癌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖及MK的表達；并具明顯的劑量依賴效應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的抗肝癌腫瘤血管生成促進因子MK基因的反義寡核苷酸的最佳序列為MK5。
根據(jù)本發(fā)明，針對MKmRNA編碼區(qū)的硫代反義寡核苷酸MK5能特異性抑制人HepG2肝癌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的生長及肝癌腫瘤血管生成促進因子基因MK的表達，具有成為用于抑制MK高表達的肝癌細胞生長及與新生血管形成相關(guān)疾病的新型生物工程藥物的潛力。
根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的化學(xué)修飾物可以是硫代修飾。
根據(jù)本發(fā)明，包括有效成分的本發(fā)明的反義寡核苷酸或其修飾物以及藥物學(xué)可以接受的載體的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物能用于抑制高表達MK的肝癌等惡性腫瘤細胞的生長及與新生血管形成相關(guān)疾病。
本發(fā)明參照附圖及下列實施例進行解釋，這些實施例的目的只是為了解釋而不是為了以任何方式限制本發(fā)明。


表1硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)圖1a，1b，1c，分別表示10條硫代MK mRNA反義寡核苷酸對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞增殖的抑制率及劑量依賴效應(yīng)。圖中水平軸上列出的數(shù)字1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表本發(fā)明的反義寡核苷酸MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8、MK9、MK10.
表2為10條硫代反義寡核苷酸的IC50值圖2a，2b分別表示反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MK mRNA表達的序列特異性及相對表達率圖3a，3b分別表示反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MK蛋白表達的序列特異性及相對表達率圖4表示反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞增殖的序列特異性圖5a，5b分別表示反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2細胞MK mRNA表達的劑量依賴效應(yīng)圖6a，6b分別表示反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MK蛋白表達的劑量依賴效應(yīng)圖7.表示反義寡核苷酸MK5對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖的抑制作用及劑量依賴效應(yīng)
具體實施例方式實施例一靶向MK基因硫代反義寡核苷酸的設(shè)計和篩選材料和方法1、靶向MK基因硫代反義寡核苷酸的設(shè)計與合成檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的Midkine mRNA參考序列(GeneBank序列號24475622)，通過對其進行基于多預(yù)測RNA二級結(jié)構(gòu)的計算機輔助設(shè)計，選擇了10個不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為ASODN的作用靶點。通過與GeneBan聯(lián)機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不會干擾人類其它正常基因的表達。作為評價MK5作用的特異性，設(shè)計了其正義序列(SEN)和組成與MK5完全相同而序列不同的錯配序列(MIS)(見表1)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自動DNA合成儀合成并在合成時進行硫代修飾，過程如下將硫代試劑(Beaucage regent，Transgenomic)溶于無水乙腈中使其終濃度為1g/100ml，置于DNA合成儀AUX位置處，采用合成儀上提供的DNA硫化程序進行自動合成硫代寡核苷酸。合成完畢濃氨水55℃切割并脫保護15小時后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Oligo Prep OP120，SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，一20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.細胞培養(yǎng)實驗所用的細胞系有人肝癌細胞系HepG2、SMMC7721，BEL7402由軍事科學(xué)院放射研究所提供。實驗所用細胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。
3.S-ASODN轉(zhuǎn)染、MTT法測細胞生長抑制率待細胞出現(xiàn)50％-60％融合后，在無血清狀態(tài)下，采用Lipofection(Gibco，1mg/mL)試劑，并參照說明書操作進行硫代反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染，每條反義寡核苷酸設(shè)置四個濃度，分別為0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM。每個濃度三孔，每孔總體積100uL，并設(shè)置細胞和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染5小時后，換含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)19小時，然后每孔加20uLMTs(Promega)，37℃孵育90min，測定490nm光吸收(A490)，計算以抑制率＝(A對照-A用藥)/A對照，通過細胞生長倍增數(shù)量評價反義寡核苷酸對細胞生長得影響，計算細胞增殖的抑制率。所用反義寡核苷酸為MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8、MK9、MK10，并均為硫代修飾。
結(jié)果1、靶向MK基因硫代反義寡核苷酸的設(shè)計與合成共選擇了10作用靶點的ASODN，分別為MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8、MK9、MK10，并均為硫代修飾。作為評價MK5作用的特異性，設(shè)計了其正義序列(SEN)和組成與MK5完全相同而序列不同的錯配序列(MIS)(見表1)。
2、靶向MK基因硫代反義寡核苷酸的篩選圖1a，b，c中可見10條S-ASODN對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞均有不同程度的抑制作用。MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8在0.4μM時對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用。在0.1-0.8μM濃度范圍內(nèi)，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞的增殖具有明顯的劑量依賴性抑制活性。結(jié)果表明，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8可以有效地抑制HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞的生長。
3、通過S-ASODN對HepG2、SMMC7721、和BEL7402三種人肝癌細胞增殖的抑制率得出其IC50值(表2)，結(jié)果MK5的IC50值最小，表明MK5對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種肝癌細胞增殖的抑制效果最好。
結(jié)論1、靶向MK的10條ASODNs對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞的增殖具有不同程度的抑制活性。
2、在0.1-0.8μM濃度范圍內(nèi)，MK1、MK2、MK3、MK4、MK5、MK6、MK7、MK8對HepG2、SMMC7721和BEL7402三種人肝癌細胞的增殖均有明顯的劑量依賴效應(yīng)。
3、根據(jù)S-ASODN對三種人肝癌細胞的抑制率得出的IC50值表明MK5對人肝癌細胞生長的抑制效果最好。
實施例二反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞生長及MK表達的序列特異性材料和方法1、細胞培養(yǎng)人HepG2肝癌細胞系由軍事科學(xué)院放射研究所提供，細胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。
2、實驗分組根據(jù)在人HepG2肝癌細胞中加藥的不同，分為反義寡核苷酸MK5組、正義序列組和錯配序列組，并設(shè)不加藥組作為對照。
3、MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MKmRNA表達的序列特異性各組以0.4μM加藥處理人HepG2肝癌細胞，24小時后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍后，按TRIzol試劑盒(Invitrogen)說明書提取總RNA，紫外分光光度計定量，OD 260/280在1.8-2.0之間，RNA甲醛變性電泳顯示無降解。然后進行逆轉(zhuǎn)錄，具體方法如下各取RNA1μl，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制劑(40U)0.1μl，共10.3μl，混勻，70℃溫育10min，立即冰上冷卻。加入第一鏈反應(yīng)緩沖液5μl，DTT 2.5μl，RNA酶抑制劑0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混勻，42℃反應(yīng)2min，加入逆轉(zhuǎn)錄酶superscript II 0.5μl，42℃反應(yīng)1min，最后70℃變性15min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5μl作為PCR擴增的模板，以看家基因三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)源對照，進行雙重PCR。靶基因MK上游引物為5’GAAAGGGAAGGGAAAGGA 3’，下游引物為5’AAAGCG GGC TCT GGG ACT 3’，擴增片段為307bp。GAPDH的上游引物為5’ACCACAAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物為5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’，擴增片段499bp。PCR反應(yīng)體系總體積20μl，上下游引物終濃度為1μM，Mg2+濃度1.5mM，加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5μl，Taq酶1U。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性2min，94℃ 20s，61℃ 30s，72℃ 20s，循環(huán)22次，最后72℃延伸2min。2％瓊脂糖凝膠(Sigma)電泳檢測。BIO-RAD圖像分析系統(tǒng)檢測。
4、MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MK蛋白的序列特異性各組采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法以0.4μM給藥濃度轉(zhuǎn)染人HepG2肝癌細胞，用RIPA-PICT(Pharmacia)提取細胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。每孔50μg總蛋白，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PROTRAN_BA-S83Reinforced NC，Schleicher & Schuell)上，以β-actin(43KD)作為對照。4℃封閉過夜，封閉液組成10％脫脂奶粉，1×TBST。然后與羊抗人MK抗體(Santa cruz)或鼠抗人β-actin抗體(Sigma)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再與辣根過氧化酶標(biāo)記的抗羊或抗鼠二抗(中山)結(jié)合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)顯色系統(tǒng)顯色，X光片曝光。
5、MK5抑制HepG2肝癌細胞增殖的特異性分析各組人HepG2肝癌細胞接種至6孔板，3×103/每孔，37℃，5％CO2條件下孵育24小時，待80-90％細胞融合后，在無血清狀態(tài)下，采用Lipofection(Invitrogen，1mg/mL)試劑，并參照說明書操作，以0.4μM給藥濃度進行寡核苷酸轉(zhuǎn)染，孵育5小時后，換含10％新鮮小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，然后每孔加20μl MTs(Promega)，37℃，5％CO2孵箱孵育90min，測定490nm光吸收(A490)，通過細胞生長倍增數(shù)量評價反義寡核苷酸MK5對肝癌HepG2細胞生長的影響，計算細胞增殖抑制率。
結(jié)果1、MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MK mRNA表達的序列特異性反義寡核苷酸MK5組對人HepG2肝癌細胞中MKmRNA表達的抑制作用，與正義序列組、錯配序列組和不加藥組比較有顯著性差異(P＜0.01)，其正義序列組、錯配序列組與不加藥組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)(見圖2a)。另外，采用Quantity One圖像系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，以對照組MK與內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的灰度比值為標(biāo)準(zhǔn)(灰度比值定為100％)，其他幾組與之比較，MK5組、正義序列組和錯配序列組MKmRNA的相對表達率分別是對照組的96％、92.79％和35.48％(見圖2b)。
2、MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MK蛋白的序列特異性反義寡核苷酸MK5組人HepG2肝癌細胞中MK蛋白的抑制作用，與其正義、錯配序列和不加藥組比較有顯著性差異(P＜0.01)。正義序列組、錯配序列組與不加藥組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)(見圖3a)。采用Quantity One圖像系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，以對照組MK與內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的灰度比值為標(biāo)準(zhǔn)(灰度比值定為100％)，其他幾組與之比較，MK5組、正義序列組和錯配序列組MK蛋白的相對表達率分別是對照組的96.79％、99.59％和6.3％(見圖3b)。
3、MK5對HepG2肝癌細胞生長抑制特異性的分析反義寡核苷酸MK5對HepG2肝癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，與其正義、錯配序列和不加藥組比較有顯著性差異(P＜0.01)。正義序列組和錯義序列與不加藥組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。(見圖4)結(jié)論1、MK5能特異性抑制人HepG2肝癌細胞中MK mRNA的表達，具有明顯的序列特異性2、MK5能特異性抑制人HepG2肝癌細胞中MK蛋白的表達，具有明顯的序列特異性3、MK5能特異性抑制人HepG2肝癌細胞的生長，具有明顯的序列特異性實施例三反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞生長及MK表達的的劑量依賴效應(yīng)材料和方法1、細胞培養(yǎng)。HepG2肝癌細胞系由軍事科學(xué)院放射研究所提供，細胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。
2、實驗分組根據(jù)在人HepG2肝癌細胞中加入反義寡核苷酸MK5藥量的不同，分為0.2μM、0.4μM和0.8μM組，并設(shè)不加藥組作為對照。
3、反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2細胞中MK mRNA表達的劑量依賴效應(yīng)各組以不同的給藥濃度處理人HepG2肝癌細胞，其余操作同實施例二的3。
4、反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞中MK蛋白表達的劑量依賴效應(yīng)各組采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法以不同的給藥濃度轉(zhuǎn)染人HepG2肝癌細胞，其余操作同實施例二的4。
5、反義寡核苷酸MK5抑制人HepG2肝癌細胞生長的劑量依賴效應(yīng)各組人HepG2肝癌細胞接種至6孔板，3×103/每孔，37℃，5％CO2條件下孵育24小時，待細胞出現(xiàn)50％-60％融合后，在無血清狀態(tài)下，采用Lipofection(Gibco，1mg/mL)試劑，并參照說明書操作進行各組硫代反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染，每個濃度三孔，每孔總體積100uL，并設(shè)置細胞和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染5小時后，換含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)19小時，然后每孔加20uLMTs(Promega)，37℃孵育90min，測定490nm光吸收(A490)，計算以抑制率＝(A對照-A用藥)/A對照，通過細胞生長倍增數(shù)量評價反義寡核苷酸對細胞生長得影響，計算細胞增殖的抑制率。
結(jié)果1、反義寡核苷酸MK5的3個濃度組0.2、0.4、0.8μM處理48小時后，MK mRNA的表達均受到抑制，采用Quantity One圖像系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，以對照組MK與內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的灰度比值為標(biāo)準(zhǔn)(灰度比值定為100％)，其他幾組與之比較，0.2μM、0.4μM和0.8μM組的MKmRNA的相對表達率分別是對照組的65.06％、40.88％和22.96％。故反義寡核苷酸MK5對人HepG2肝癌細胞MK mRNA的表達具有濃度依賴性抑制作用(P＜0.05)(圖5a，5b)。
2、反義寡核苷酸MK5的3個濃度組0.2、0.4、0.8μM處理48小時后，MK蛋白的表達均受到抑制，采用Quantity One圖像系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，以對照組MK與內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的灰度比值為標(biāo)準(zhǔn)(灰度比值定為100％)，其他幾組與之比較，0.2μM、0.4μM和0.8μM組的MK蛋白的相對表達率分別是對照組的54.16％、17.16％和3.6％。故反義寡核苷酸MK5對人HepG2肝癌細胞MK蛋白的表達具有明顯的濃度依賴性抑制作用(P＜0.05)(圖6a，6b)。
3、反義寡核苷酸MK5的3個濃度組0.2、0.4、0.8μM處理48小時后，細胞增殖受到明顯抑制，MTT法測得其抑制率分別為67.4％、74.7％和80.5％。故反義寡核苷酸MK5對人HepG2肝癌細胞的增殖具有明顯的濃度依賴性抑制作用(P＜0.05)(圖1a)
結(jié)論1、反義寡核苷酸MK5能明顯抑制人HepG2細胞中MK mRNA的表達，并具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。
2、反義寡核苷酸MK5能明顯抑制人HepG2肝癌細胞中MK蛋白的表達，并具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。
3、反義寡核苷酸MK5能明顯抑制人HepG2肝癌細胞的生長，并具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。
實施例四反義寡核苷酸MK5對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖的特異性抑制作用及劑量依賴效應(yīng)材料和方法1、細胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(HUVER)購自美國Cascade Biolgics公司。細胞用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。
2、反義寡核苷酸MK5對人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長的特異性抑制及劑量依賴效應(yīng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞接種至6孔板，3×103/每孔，37℃，5％CO2條件下孵育24小時，待80-90％細胞融合后，在無血清狀態(tài)下，采用Lipofection(Invitrogen，1mg/mL)試劑，并參照說明書操作進行寡核苷酸轉(zhuǎn)染，反義寡核苷酸MK5及其正義和錯配序列各設(shè)置三個濃度組，分別為0.2、0.4、0.8μM，并設(shè)置一個空白對照。孵育5小時后，換含10％新鮮小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，然后每孔加20μl MTs(Promega)，37℃，5％CO2孵箱孵育90min，測定490nm光吸收(A490)，通過細胞生長倍增數(shù)量評價反義寡核苷酸MK5對人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長的影響，計算細胞增殖抑制率。
結(jié)果1、反義寡核苷酸MK5抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的序列特異性加反義寡核苷酸MK5組與其正義組、錯配序列組和不加藥空白對照組比較有顯著性差異(均P＜0.05)，其正義組和錯配序列與不加藥組比較沒有顯著性差異(均P＞0.05)。表明反義寡核苷酸MK5能明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，并具有明顯的序列特異性(見圖7)。
2、人臍靜脈內(nèi)皮細胞經(jīng)反義寡核苷酸MK5的3個濃度組0.2、0.4、0.8μM處理48小時后，細胞增殖受到明顯抑制，MTT法測得其抑制率分別為36.48％、51.65％和68.5％。故反義寡核苷酸MK5對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖具有濃度依賴性抑制作用(P＜0.05)(見圖7)。
結(jié)論1、反義寡核苷酸MK5能特異性抑制人HepG2肝癌細胞的生長，具有明顯的序列特異性。
2、反義寡核苷酸MK5能有效抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，并具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種抑制人中期因子(Midkine，MK)表達的反義寡核苷酸，其長度為20個核苷酸，其特征是與MK GeneBank(GeneBank序列號24475622)轉(zhuǎn)錄部分的MK mRNA的一部分互補。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的寡核苷酸，其包括序列如下表。
A反義
3.根據(jù)權(quán)利要求1中的寡核苷酸，其最佳序列是MK5
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的寡核苷酸，經(jīng)過不同化學(xué)修飾后，可以用于治療肝癌等MK高表達的惡性腫瘤及與新生血管形成相關(guān)的疾病。
5.權(quán)利要求4中的寡核苷酸的化學(xué)修飾物可以是硫代修飾。
6.權(quán)利要求5中經(jīng)化學(xué)修飾后的寡核苷酸可以制成各種不同的劑型，通過不同的給藥途徑用于高表達MK的肝癌等惡性腫瘤及與新生血管形成相關(guān)的疾病治療的組合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說涉及靶向中期因子(Midkine，MK)基因，抑制人MK表達、新生血管生成及肝癌生長的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。本發(fā)明采用三種人肝癌細胞系HepG2、SMMC7721和BEL7402的細胞，對10條靶向MK基因的反義寡核苷酸進行了活性篩選和評價，首次發(fā)現(xiàn)互補于MK基因特定功能區(qū)域的寡核苷酸及其化學(xué)修飾物在培養(yǎng)的人肝癌細胞中可有效抑制MK的表達及肝癌細胞的增殖，并抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的生長。因此，本發(fā)明涉及到靶向MKmRNA抗腫瘤及血管生成的反義寡核苷酸的序列與結(jié)構(gòu)及其成為治療肝癌及與新生血管形成相關(guān)疾病的新型藥物。
文檔編號A61P35/00GK1796557SQ200410102719
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月28日
發(fā)明者戴利成, 姚行, 陸永良, 王翔 申請人:湖州市中心醫(yī)院