專利名稱：從深層發(fā)酵獲得的云芝糖肽粗品中提取注射用云芝糖肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥品領(lǐng)域，涉及一種中藥注射用原料，它的制備方法，以及采用其作為原料藥的凍干制劑粉針劑及制備方法。
背景技術(shù)：
從云芝深層發(fā)酵獲得的云芝多糖(PSK)是日本公司開發(fā)的一種抗惡性腫瘤的藥物(商品名Krestin)，用于治療乙型肝炎、遷徙性肝炎、慢性活動性肝炎等，并適用于肝癌的預(yù)防與治療。另一個從云芝深層發(fā)酵獲得的云芝糖肽(PSP)能抑制人肺癌、胃癌、白血病、淋巴癌細(xì)胞及腹水癌等多種癌細(xì)胞的增生；并能顯著提高負(fù)瘤者食欲，緩解疼痛，提高耐缺氧能力；消除因化療或放療引起的白血球降低作用，提高機(jī)體Ig G、補(bǔ)體C#-[3]、溶血素HC#-[50]含量和吞噬指數(shù)等。
上市的云芝提取物(包括云芝多糖和云芝糖肽)的制劑，主要是口服品種，具有以下不足①多糖含量低，約為30～40％；②由于糖肽易在胃液中水解，其生物利用度低，用藥劑量過大；③只有口服劑型，對有些不能口服的病人帶來不便，不能用藥；④由于該品種原料分子量范圍較廣，純度相對較差；⑤起效慢。
本發(fā)明的目的是將從云芝深層發(fā)酵獲得的的粗提物或提取液用新的超濾純化技術(shù)進(jìn)行純化，極大地提高了提取物中云芝多糖的含量，使其多糖含量達(dá)到75％以上，蛋白含量達(dá)到15％以下，平均分子量范圍在3萬～30萬之間(純度達(dá)90％以上)，克服了原有提取工藝中出現(xiàn)的質(zhì)量問題，以及口服制劑的局限性，使原料達(dá)到注射劑純度要求，同時提供一種注射用凍干粉針劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種經(jīng)純化提取分離而得的分子量比較集中的云芝提取物，其特征在于，該純化物的糖含量在65～98％，蛋白含量在2～15％之間，分子量范圍在3萬～30萬之間。命名為供注射用云芝糖肽原料。
本發(fā)明的目的之一是提高現(xiàn)有云芝提取物的藥品質(zhì)量，提供一種能供注射劑使用的原料藥供注射用云芝糖肽原料。
本發(fā)明的目的之二是提供一種上述能供注射劑使用的純化的云芝糖肽的制備方法。
本發(fā)明的目的之三是提供一種能供注射用的以本發(fā)明純化的云芝糖肽為藥物活性成分的注射用藥物制劑及其制備方法。
本發(fā)明的純化的云芝糖肽，其特征在于，該提取物的糖含量為65～98％，蛋白含量為2～15％，分子量范圍在3萬～30萬之間。
本發(fā)明的純化的云芝糖肽的制備方法，其特征在于經(jīng)過以下步驟，水提醇沉；氯仿-正丁醇振搖去除游離蛋白；超濾純化。如取市售的符合國家標(biāo)準(zhǔn)的云芝糖肽或云芝多糖原料藥，或直接用菌絲體提取液，先用水提醇沉工藝進(jìn)行初步純化，經(jīng)氯仿-正丁醇振搖方法去除游離蛋白工藝，再通過超濾膜提取工藝將其多糖含量提高到75％以上，分子量范圍在3萬～30萬之間，蛋白含量在5～15％之間。
所述水提醇沉方法是，加入云芝提取物原料的5-60倍水；80-120℃提取0.5-10小時；濃縮體積為原體積1/3-1/20；加2-10倍的95％乙醇醇沉；靜置過夜，過濾；沉淀物經(jīng)50-150℃烘干或不烘干；所述氯仿-正丁醇振搖去除游離蛋白的方法是，取水提醇沉后的產(chǎn)物，加入5-60倍水溶解，加入2-10倍體積的正丁醇∶氯仿＝1∶4的萃取液，劇烈振搖，靜止分層后取上層，重復(fù)2-6次，將水層減壓蒸干；所述超濾純化的方法是，取去蛋白后的多糖，加水溶解，稀釋至濃度為0.0001-1mg/ml，先用分子量為300K的切割膜將分子量小于30萬的分子濾出，去除分子量大于30萬的分子；再用30K的切割膜將分子量小于30萬的濾出液濃縮，去除分子量小于3萬的分子；采用中性的高純水作為全過程的洗脫液；超濾提取溫度5-60℃，最后將濃縮液蒸干得到分子量為300k-30k的超濾成分。
具體可以是(1)水提醇沉粗提取市售的符合國家標(biāo)準(zhǔn)的云芝糖肽或云芝多糖原料藥，或直接采用菌絲體提取液，加入稱樣量30倍水溶解；80～100℃提取3～5小時；濃縮體積為原體積1/6～1/10；加2～4倍的95％乙醇醇沉；靜置過夜，過濾；沉淀物經(jīng)80～110℃烘干，水提醇沉次數(shù)為1～3次，得到多糖粗品。
(2)去除游離蛋白取水提醇沉后的多糖粗品，加入20倍水溶解，按5∶1比例加入萃取液(正丁醇∶氯仿＝1∶4)，劇烈振搖，靜止分層后取上層，重復(fù)2～6次，最后將水層減壓蒸干，得到去蛋白多糖粗品。
(3)超濾進(jìn)行分子量切割；采用切向流過濾原理，取去蛋白多糖粗品，加水溶解，稀釋至濃度為0.001～0.01mg/ml，先用分子量為300K的切割膜將分子量小于30萬的分子濾出，去除分子量大于30萬的分子；再用30K的切割膜將分子量小于30萬的濾出液濃縮，去除分子量小于3萬的分子；采用中性的高純水作為全過程的洗脫液；超濾提取溫度15～25℃，最后將濃縮液蒸干得到分子量為300k～30k的超濾產(chǎn)品。
本發(fā)明還提供以本發(fā)明純化的云芝提取物作為藥物活性成分制備的藥物制劑。優(yōu)選的是注射劑，更優(yōu)選的是凍干注射劑。
本發(fā)明的藥物制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a.稱取權(quán)利要求1的云芝提取物及骨架劑適量置容器中，加驅(qū)氧的注射用水，攪拌溶解后，加藥用活性炭，室溫下攪拌15分鐘，砂芯漏斗濾過并洗滌濾器，藥用堿調(diào)節(jié)pH至4.0～9.0，0.22μm微孔濾膜過濾，注射用水洗滌濾器并定容至1000-5000ml，分裝，裝盤，凍干；b.預(yù)凍至-45℃～-40℃，凍干箱的擱板降溫到-45℃以下，使制品凍實(shí)，凝結(jié)器預(yù)先降溫至-50℃以下，接通凍干箱，對冷凍箱進(jìn)行真空處理，其條件是10-1～10-4mmhg，逐步升溫，使擱板達(dá)到-20℃～0℃后升溫速度，加快使擱板達(dá)到30℃～35℃，使制品溫度與擱板溫度相同，保溫2～6小時，放入無菌的空氣，得到注射用的凍干粉針劑成品；或經(jīng)過以下步驟c.稱取權(quán)利要求1的云芝提取物2g、骨架劑適量置容器中，加經(jīng)高純氮?dú)怛?qū)氧的注射用水，攪拌溶解后，加藥用活性炭適量，室溫下攪拌15分鐘，3號砂芯漏斗濾過，以適量注射用水洗滌濾器，藥用堿調(diào)節(jié)pH至4.0～9.0，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，用適量注射用水洗滌濾器，注射用水定容至1000-5000ml，分裝于透明西林瓶中，裝盤，凍干。
d.預(yù)凍至-45～-40℃，凍干箱的擱板降溫到-45℃以下，使半成品凍實(shí)，凝結(jié)器預(yù)先降溫至-50℃以下，接通凍干箱，對冷凍箱進(jìn)行真空處理，其條件是10-1～10-4mmhg，逐步升溫，使擱板達(dá)到-20℃～0℃后升溫速度，加快使擱板達(dá)到30℃～35℃，使制品溫度與擱板溫度相同，保溫2～6小時，放入無菌的空氣，得到注射用的凍干粉針劑。
以上方法中所述的藥用堿選自碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀，藥用堿調(diào)節(jié)溶液pH范圍優(yōu)選5.0～6.0。所述的骨架劑選自甘露醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖、環(huán)糊精、山梨醇、氯化鈉、右旋糖酐，加入量為100-300mg/支。所述針用活性炭用量為0.5～1‰。40小時內(nèi)將所敘述的凍干機(jī)干燥箱的溫度降至-5℃～-80℃，該溫度優(yōu)選可以是-35℃～-50℃。
用于制備本發(fā)明的純化的云芝糖肽的起始原料為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的云芝糖肽或云芝多糖原料藥，可以從市場上買到，起始原料也可以從云芝菌發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液或菌絲體得到。
本發(fā)明注射用云芝糖肽凍干劑的最大優(yōu)點(diǎn)是藥品易于保存，方便運(yùn)輸，質(zhì)量穩(wěn)定，療效優(yōu)越，副作用少。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究證明(1)本品能通過對單核-巨噬細(xì)胞的增殖增強(qiáng)及對每個吞噬細(xì)胞本身功能的激活從而增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)功能?？墒剐∈笳T生血清干擾素濃度明顯增高；可在不增加白細(xì)胞數(shù)的情況下，通過對白細(xì)胞本身功能的激活而使中性白細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)；可促使SRBC單次免疫所致615小鼠特異性溶血素抗體的生成；可拮抗環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、5-FU、絲裂霉素C等所致細(xì)胞免疫強(qiáng)烈抑制，使細(xì)胞免疫功能改善，恢復(fù)正常。
(2)注射用云芝糖肽具有明顯的恢復(fù)肝臟功能，對于D-氨基半乳糖、四氯化碳所致大鼠和小鼠急性肝損傷，本品能顯著抑制SGP的升高，肝細(xì)胞的脂肪性變出現(xiàn)率較對照組低，并能完全避免灶性壞死的出現(xiàn)(3)研究表明本品能強(qiáng)烈地激活機(jī)體本身防御免疫系統(tǒng)，具有繼發(fā)性的非特異性抗感染和抗休克作用，能明顯降低黃金色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌感染所致的死亡率，對于流感病毒感染所致小鼠死亡，本品也有明顯保護(hù)作用，本品可延緩癌變過程，提高生存質(zhì)量在多種動物腫瘤中能使腫瘤縮小及延長動物的生存時間。其作用機(jī)制不是直接對腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，而是通過激活宿主的防病機(jī)制，其中包括殺傷T細(xì)胞和活化巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)和抗體依賴性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(ADMC)。
藥理毒理試驗(yàn)表明(1)給藥后5分鐘各臟器中均有分布，依次為肝、脾、肺、腎。給藥初期大部由尿中排出，以后相當(dāng)長的時間由尿和糞中慢慢排出。
(2)對小鼠一般精神狀態(tài)、活動情況、平衡功能及胃腸運(yùn)動均無顯著影響。對麻醉犬心率、心電圖無顯著影響。
(3)急性毒性、長期毒性、溶血、局部刺激、過敏試驗(yàn)表明本品用藥是安全的，不具有依賴性，無溶血、紅細(xì)胞凝集反應(yīng)、局部刺激反應(yīng)、過敏反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1、純化的云芝糖肽原料藥取符合國家標(biāo)準(zhǔn)的云芝糖肽原料藥，按重量比加30倍水溶解，90～100℃提取3小時，離心(過濾)去沉淀，上清液濃縮10倍，加2倍的95％乙醇醇沉，靜置過夜，沉淀干燥即得水提醇沉產(chǎn)品，加20倍水溶解，按體積比5∶1加氯仿∶正丁醇(4∶1)溶液，振搖分層后取上清液，重復(fù)5次，合并上清液蒸干，即得去蛋白多糖粗品，取去蛋白多糖粗品加水溶解，稀釋至濃度為0.001～0.01mg/ml，先用分子量為300K的超濾膜將分子量小于30萬的分子濾出，去除分子量大于30萬的分子；再用30K的超濾膜將分子量小于30萬的濾出液濃縮，去除分子量小于3萬的分子；采用中性的高純水作為全過程的洗脫液；超濾提取溫度15～25℃，最后將濃縮液蒸干得到分子量范圍為300k～30k的超濾純化物。
實(shí)施例2、純化的云芝糖肽原料藥取市售的粗的云芝多糖原料藥，按重量比加30倍水溶解，90～100℃提取3小時，離心(過濾)去沉淀，上清液濃縮10倍，加2倍的95％乙醇醇沉，靜置過夜，沉淀干燥即得水提醇沉產(chǎn)品，加20倍水溶解，按體積比5∶1加氯仿∶正丁醇(4∶1)溶液，振搖分層后取上清液，重復(fù)5次，合并上清液蒸干，即得去游離蛋白多糖粗品，加水溶解并稀釋至濃度為0.001～0.01mg/ml，先用分子量為300K的超濾膜將分子量小于30萬的分子濾出，去除分子量大于30萬的分子；再用30K的超濾膜將分子量小于30萬的濾出液濃縮，去除分子量小于3萬的分子；采用中性的高純水作為全過程的洗脫液；超濾提取溫度15～25℃，最后將濃縮液蒸干得到分子量范圍為300k～30k的超濾純化物。
實(shí)施例3、純化的云芝糖肽原料藥取云芝發(fā)酵液或菌絲體的提取物料液，90～100℃提取3小時，離心(過濾)去沉淀，上清液濃縮10倍，加2倍的95％乙醇醇沉，靜置過夜，沉淀干燥即得水提醇沉產(chǎn)品，加20倍水溶解，按體積比5∶1加氯仿∶正丁醇(4∶1)溶液，振搖分層后取上清液，重復(fù)5次，即得去蛋白多糖粗品，取去蛋白多糖粗品加水溶解，稀釋至濃度為0.001～0.01mg/ml，先用分子量為300K的超濾膜將分子量小于30萬的分子濾出，去除分子量大于30萬的分子；再用30K的超濾膜將分子量小于30萬的濾出液濃縮，去除分子量小于3萬的分子；采用中性的高純水作為全過程的洗脫液；超濾提取溫度15～25℃，最后將濃縮液蒸干得到分子量范圍為300k～30k的超濾純化物。
實(shí)施例4、純化的云芝糖肽原料藥制備注射用云芝糖肽針劑在100級以下車間內(nèi)，稱取純化的云芝糖肽原料2.5g及氯化鈉40g甘露醇適量置容器中，加驅(qū)氧的注射用水，攪拌溶解后，加1‰藥用活性炭，攪拌15分鐘，過濾除炭并洗滌濾器，藥用堿調(diào)節(jié)pH至6.0，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，注射用水洗滌濾器并定容至1000ml，1.0ml/支分裝于透明西林瓶中，裝盤，預(yù)凍至-45℃～-40℃，凍干箱的擱板降溫到-45℃以下，使制品凍實(shí)，凝結(jié)器預(yù)先降溫至-50℃以下，接通凍干箱，對冷凍箱進(jìn)行真空處理，其條件是10-1～10-4mmhg，逐步升溫，使擱板達(dá)到-10℃，保溫至水線消失，逐步升溫至0℃后，加快升溫速度使擱板達(dá)到30℃～35℃，使制品溫度與擱板溫度相同，保溫3小時，壓蓋，即得到注射用的凍干制劑成品。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)純化提取分離而得的分子量比較集中的云芝提取物，其特征在于，該純化物的糖含量在65～98％，蛋白含量在2～15％之間，分子量范圍在3萬～30萬之間。命名為注射用云芝糖肽原料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝提取物，其中云芝提取物為從云芝菌發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲體中提取純化的產(chǎn)物，可以是市售的云芝多糖或云芝糖肽的純化物，也可以是發(fā)酵液或菌絲體的提取物的純化產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝提取物的純化物的制備方法，其特征在于經(jīng)過水提醇沉步驟進(jìn)行純化，再經(jīng)氯仿-正丁醇振搖去除游離蛋白，再經(jīng)過超濾純化的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述經(jīng)過水提醇沉步驟進(jìn)行純化的方法是，加入云芝提取物原料5-60倍水；80-120℃提取0.5-10小時；濃縮體積為原體積1/3-1/20；加2-10倍的95％乙醇醇沉；靜置過夜，過濾；沉淀物經(jīng)50-150℃烘干或不烘干。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述再經(jīng)氯仿-正丁醇振搖去除游離蛋白的方法是，取水提醇沉后的產(chǎn)物，加入5-60倍水溶解，加入2-10倍體積的正丁醇∶氯仿＝1∶4的萃取液，劇烈振搖，靜止分層后取上層，重復(fù)2-6次，將水層減壓蒸干。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述再經(jīng)過超濾純化的方法是，取去蛋白后的多糖，加水溶解，稀釋至濃度為0.0001-1mg/ml，先用分子量為300K的切割膜將分子量小于30萬的分子濾出，去除分子量大于30萬的分子；再用30K的切割膜將分子量小于30萬的濾出液濃縮，去除分子量小于3萬的分子；采用中性的高純水作為全過程的洗脫液；超濾提取溫度5-60℃，最后將濃縮液蒸干得到分子量為300k-30k的超濾成分。
7.用權(quán)利要求1所述的云芝提取物的純化物作為藥物活性成分制備的藥物制劑。
8.權(quán)利要求7的藥物制劑，是注射劑
9.權(quán)利要求8的藥物制劑，是冷凍干燥注射劑、輸液和注射液。
10.權(quán)利要求9的藥物制劑的制備方法，冷凍干燥注射劑的特征在于，包括以下步驟a.稱取權(quán)利要求1或2的純化原料及骨架劑適量置容器中，加驅(qū)氧的注射用水，攪拌溶解后，加藥用活性炭，室溫下攪拌15分鐘，砂芯漏斗濾過并洗滌濾器，藥用堿調(diào)節(jié)pH至4.0～9.0，0.22μm微孔濾膜過濾，注射用水洗滌濾器并定容至1000-5000ml，分裝，裝盤，凍干；b.預(yù)凍至-45℃～-40℃，凍干箱的擱板降溫到-45℃以下，使制品凍實(shí)，凝結(jié)器預(yù)先降溫至-50℃以下，接通凍干箱，對冷凍箱進(jìn)行真空處理，其條件是10-1～10-4mmhg，逐步升溫，使擱板達(dá)到-20℃～0℃后升溫速度，加快使擱板達(dá)到30℃～35℃，使制品溫度與擱板溫度相同，保溫2～6小時，放入無菌的空氣，得到注射用的凍干粉針劑成品?；蚪?jīng)過以下步驟c.稱取權(quán)利要求1或2的純化原料2g、骨架劑適量置容器中，加經(jīng)高純氮?dú)怛?qū)氧的注射用水，攪拌溶解后，加藥用活性炭適量，室溫下攪拌15分鐘，3號砂芯漏斗濾過，以適量注射用水洗滌濾器，藥用堿調(diào)節(jié)pH至4.0～9.0，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，用適量注射用水洗滌濾器，注射用水定容至1000-5000ml，分裝于透明西林瓶中，裝盤，凍干。d.預(yù)凍至-45～-40℃，凍干箱的擱板降溫到-45℃以下，使半成品凍實(shí)，凝結(jié)器預(yù)先降溫至-50℃以下，接通凍干箱，對冷凍箱進(jìn)行真空處理，其條件是10-1～10-4mmhg，逐步升溫，使擱板達(dá)到-20℃～0℃后升溫速度，加快使擱板達(dá)到30℃～35℃，使制品溫度與擱板溫度相同，保溫2～6小時，放入無菌的空氣，得到注射用的凍干粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及從深層發(fā)酵獲得的云芝糖肽粗品中提取注射用云芝糖肽的方法，以及采用其作為原料藥的凍干制劑粉針劑及制備方法。本發(fā)明的制備方法，其特征在于經(jīng)過以下步驟，水提醇沉；氯仿－正丁醇振搖去除游離蛋白；超濾純化。
文檔編號A61P1/16GK1651076SQ20041010341
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者鄒巧根, 趙聿秋, 衣學(xué)福, 朱宏彬 申請人:江蘇華源藥業(yè)有限公司