專利名稱：含β－葡聚糖的組合物以及利用該組合物的便秘緩解劑、免疫賦活劑和皮膚保濕劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有含β-1，3-1，6-葡聚糖的短梗霉屬菌培養(yǎng)物和乳酸菌菌體作為有效成分的含β-葡聚糖組合物，并涉及利用該組合物的便秘緩解劑、免疫賦活劑以及皮膚保濕劑。
背景技術(shù)：
已知短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌(通稱黑酵母)產(chǎn)生的β-1，3-1，6-葡聚糖具有免疫賦活作用、抗腫瘤作用、癌細(xì)胞增殖抑制作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗炎作用、降膽固醇作用、抗血栓作用、食物纖維作用、降血壓作用、降血糖作用、增強(qiáng)肝功能等各種生理活性。因此，利用β-1，3-1，6-葡聚糖作為機(jī)能性材料和醫(yī)藥品等，已有許多嘗試。
例如，日本專利特開昭57-149301號(hào)公報(bào)揭示了半知菌類黑色菌科短梗霉屬(Aureobasidium)菌(微工研保藏No.4257號(hào))產(chǎn)生的多糖作為主要成分的整腸劑等醫(yī)藥。
日本專利特公平5-4063號(hào)公報(bào)揭示了以低聚果糖和β-1，3-1，6-葡聚糖為主要成分的飲食品的制造方法，該飲食品據(jù)記載可用于保健飲料(使腸內(nèi)雙歧菌增殖、防止便秘、增強(qiáng)免疫)和整腸劑等。
日本專利特開2002-335926號(hào)公報(bào)揭示了含有β-1，3-1，6-葡聚糖及蘋果提取物的組合物，該組合物作為飲料和皮膚涂布劑有用，預(yù)期該飲料具有減少各種變態(tài)反應(yīng)癥狀的效果、改善異常免疫疾病的作用、抑制癌的作用、改善血管疾病的作用、改善病毒性疾病的作用、改善泌尿系疾病的作用、改善便秘和腹瀉等消化系統(tǒng)疾病的作用。
日本專利特開平6-340701號(hào)公報(bào)揭示了由出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)IFO4466菌株培養(yǎng)上清液得到的含有以β-1，3-鍵結(jié)合的葡萄糖基作為主鏈、在其上含多個(gè)β-1，6-鍵結(jié)合的葡萄糖基的支鏈作側(cè)鏈的數(shù)均分子量1萬～500萬的高度分支的β-葡聚糖，口服具有高度抗腫瘤活性和免疫賦活活性，作為醫(yī)藥、食品添加劑、飼料添加劑等有用。
日本專利特開2002-204687號(hào)公報(bào)記載了以β-1，3-1，6-葡聚糖作主要成分的短梗霉培養(yǎng)液，可作為對(duì)應(yīng)于各種疾病的醫(yī)藥品使用。
日本專利特開昭62-205008號(hào)公報(bào)揭示了含有β-1，3-1，6-葡聚糖這種結(jié)合方式的化妝品等的添加劑。將β-1，3-1，6-葡聚糖形成水溶液，直接涂布于皮膚和毛發(fā)，據(jù)記載比以往的化妝品、整發(fā)劑、軟膏添加材料具有更好的皮膚和毛發(fā)面的保護(hù)膜形成性和保濕性。
日本專利特開平10-310515號(hào)公報(bào)揭示了溶劑，該溶劑特征是，含有微生物產(chǎn)生的至少1種細(xì)胞外同多糖，或者含有該細(xì)胞外同多糖和至少1種氨基酸。據(jù)記載，上述細(xì)胞外同多糖的糖成分是β-D-葡萄糖，上述β-D-葡萄糖是短梗霉屬微生物產(chǎn)生的β-1，3-1，6-葡聚糖。
另一方面，作為利用乳酸菌的免疫賦活劑，例如日本專利特開2001-48796號(hào)公報(bào)揭示了以糞腸球菌(Enterococcus faecalis)AD101菌株的死菌體作為主要成分的免疫調(diào)節(jié)劑。
日本專利特開2003-113114號(hào)公報(bào)揭示了下列免疫賦活材料，該材料的特征是，將屬于腸球菌屬的乳酸菌和曲霉經(jīng)液體培養(yǎng)而得的培養(yǎng)菌體作為有效成分。
作為β-葡聚糖與乳酸菌并用的例子，例如日本專利特開2003-40785號(hào)公報(bào)揭示了具有下列特征的抑制感染的組合物，即含有含β-葡聚糖的素材以及乳酸產(chǎn)生菌經(jīng)加熱處理的菌體作為有效成分。
日本專利特開2001-323001號(hào)公報(bào)揭示了通過促進(jìn)體內(nèi)的TNF等細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增強(qiáng)其作用、增強(qiáng)抗體形成能力或整體免疫作用而對(duì)各種感染和腫瘤產(chǎn)生的預(yù)防有用的低分子量水溶性β-葡聚糖，記載了該β-葡聚糖與乳酸菌并用的例子。
然而，短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌(通稱黑酵母)產(chǎn)生的β-1，3-1，6-葡聚糖單用時(shí)，上述各種生理活性作用還不能令人滿意，還要尋求效果更高的素材。
發(fā)明的揭示本發(fā)明的目的在于提供短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌培養(yǎng)物中所含的β-1，3-1，6-葡聚糖的生理活性作用有了進(jìn)一步提高的含β-葡聚糖的組合物以及利用該組合物的便秘緩解劑、免疫賦活劑和皮膚保濕劑。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明之一是含β-葡聚糖的組合物，該組合物的特征是，含有培養(yǎng)短梗霉屬(Aureobasilium sp.)菌而得的含β-1，3-1，6-葡聚糖的培養(yǎng)物以及乳酸菌菌體作為有效成分。
本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物由于含有對(duì)短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌培養(yǎng)而得的含β-1，3-1，6-葡聚糖的培養(yǎng)物作為有效成分，所以不僅可利用β-1，3-1，6-葡聚糖，還可不損失培養(yǎng)物中所含的各種有用成分對(duì)其加以利用。而且，因?yàn)楹腥樗峋w作為有效成分，所以通過上述培養(yǎng)物中所含的有用成分與乳酸菌菌體的協(xié)同作用，可預(yù)期具有各種生理活性作用。此外，因?yàn)槭潜挥糜陲嬍称返鹊奶烊粊碓吹某煞?，故安全性很高?br> 上述發(fā)明中，上述短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌較好是出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans M-1)(FERM BP-08615)。由此可簡單地調(diào)制生理活性更高的β-1，3-1，6-葡聚糖。
另外，較好的是固形成分中含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為1～80重量％的上述培養(yǎng)物，且含有上述乳酸菌菌體4～95質(zhì)量％。
上述乳酸菌較好是糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
這樣可進(jìn)一步期待β-1，3-1，6-葡聚糖與乳酸菌菌體的協(xié)同生理活性作用。
此外，上述乳酸菌較好是經(jīng)加熱殺菌的菌體。這樣可廣泛添加于必須經(jīng)加熱處理的商品中。而且貯存穩(wěn)定性高，作為飲食品和醫(yī)藥品等的原料使用時(shí)安全性也非常高。
本發(fā)明還提供了含有上述含β-葡聚糖的組合物作為有效成分的便秘緩解劑。
本發(fā)明的便秘緩解劑由于含有上述含β-葡聚糖的組合物作為有效成分，通過短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌經(jīng)培養(yǎng)而得的含β-1，3-1，6-葡聚糖的培養(yǎng)物中所含的各種有用成分和乳酸菌菌體的協(xié)同作用，預(yù)期具有優(yōu)良的便秘緩解作用。
本發(fā)明還提供了含有上述含β-葡聚糖的組合物作為有效成分的免疫賦活劑。
本發(fā)明的免疫賦活劑由于含有上述含β-葡聚糖的組合物作為有效成分，通過短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌經(jīng)培養(yǎng)而得的含β-1，3-1，6-葡聚糖的培養(yǎng)物中所含的各種有用成分和乳酸菌菌體的協(xié)同作用，預(yù)期具有優(yōu)良的免疫賦活作用。
本發(fā)明還提供了含有上述含β-葡聚糖的組合物作為有效成分的皮膚保濕劑。
本發(fā)明的皮膚保濕劑由于含有上述含β-葡聚糖的組合物作為有效成分，通過短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌經(jīng)培養(yǎng)而得的含β-1，3-1，6-葡聚糖的培養(yǎng)物中所含的各種有用成分和乳酸菌菌體的協(xié)同作用，可提供保濕效果的持續(xù)性和使用感優(yōu)良的皮膚保濕劑。
附圖的簡單說明

圖1是表示利斯特氏菌攝取后的生存率與經(jīng)過天數(shù)的關(guān)系的圖。
圖2是表示供試物質(zhì)對(duì)利斯特氏菌攝取后的生存率的影響的圖。
圖3是表示利期特氏菌攝取后的平均生存天數(shù)與供試物質(zhì)的關(guān)系的圖。
圖4是表示供試物質(zhì)對(duì)利斯特氏菌攝取后的脾臟內(nèi)菌數(shù)隨時(shí)間的變化的影響的圖。
圖5是表示利期特氏菌攝取后用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面分子進(jìn)行解析的結(jié)果的圖(照片)。
圖6是表示測定受試者1(20歲左右女性)表皮角質(zhì)層水分量(表皮電導(dǎo)μS)隨時(shí)間變化的結(jié)果的圖。
圖7是表示測定受試者2(20歲左右女性)表皮角質(zhì)層水分量(表皮電導(dǎo)μS)隨時(shí)間變化的結(jié)果的圖。
圖8是表示測定受試者3(30歲左右女性)表皮角質(zhì)層水分量(表皮電導(dǎo)μS)隨時(shí)間變化的結(jié)果的圖。
圖9是表示測定受試者4(40歲左右女性)表皮角質(zhì)層水分量(表皮電導(dǎo)μS)隨時(shí)間變化的結(jié)果的圖。
圖10是表示測定受試者5(50歲左右女性)表皮角質(zhì)層水分量(表皮電導(dǎo)μS)隨時(shí)間變化的結(jié)果的圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明中，作為培養(yǎng)短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌而得的培養(yǎng)物(以下簡稱培養(yǎng)物)可以是培養(yǎng)屬于短梗霉屬具有產(chǎn)生β-1，3-1，6-葡聚糖能力的菌而得的培養(yǎng)液本身、該培養(yǎng)液的濃縮液或從該培養(yǎng)液除去水分后的固形物等，但較好是使用培養(yǎng)液本身或該培養(yǎng)液的濃縮液，這時(shí)，固形成分濃度較好為0.5～5質(zhì)量％，更好為1～3質(zhì)量％。
作為上述短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌，可使用例如日本專利特開昭57-149301號(hào)公報(bào)、特公平5-4063號(hào)公報(bào)、特開2002-335926號(hào)公報(bào)等記載的菌株。但本發(fā)明最好使用出芽短梗霉M-1(Aureobasidium pullulans M-1，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心保藏編號(hào)FERM BP-08615)。本發(fā)明中的β-1，3-1，6-葡聚糖是指具有自葡萄糖以β-1，3鍵結(jié)合的主鏈上葡萄糖以β-1，6鍵結(jié)合分支的結(jié)構(gòu)的葡聚糖。
上述短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌的培養(yǎng)可按照公知的方法(參照日本專利特開昭57-149301號(hào)公報(bào)等)進(jìn)行。即，將菌接種于加有碳源(蔗糖)0.5～5.0質(zhì)量％、氮源0.1質(zhì)量％及其它微量物質(zhì)(例如維生素類、無機(jī)物)的培養(yǎng)基(pH5.2～6.2)中，于溫度20～30℃通氣培養(yǎng)2～7天，較好是通氣攪拌培養(yǎng)。隨著β-1，3-1，6-葡聚糖的生成，培養(yǎng)液的粘度上升，成為高粘性的凝膠狀。這樣得到的培養(yǎng)液中通常含0.6～1.8質(zhì)量％的固形成分，該固形成分中含β-1，3-1，6-葡聚糖5～80質(zhì)量％。由于在β-1，3-1，6-葡聚糖以外例如還含有幫助葡聚糖的吸收的成分磷、鉀、鎂、維生素C等其它有用成分，所以可以更有效地發(fā)揮β-1，3-1，6-葡聚糖所具有的生理活性作用。
本發(fā)明使用固形成分中含β-1，3-1，6-葡聚糖1質(zhì)量％以上、較佳是5質(zhì)量％以上、更好是10質(zhì)量％以上、特別好是20質(zhì)量％以上的培養(yǎng)物。如果培養(yǎng)物中的β-1，3-1，6-葡聚糖濃度過低，則不能期望該葡聚糖有充分的生理活性作用。
β-1，3-1，6-葡聚糖的定量例如可用以下的方法進(jìn)行。即，培養(yǎng)液用淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、蛋白酶等進(jìn)行酶處理，除去蛋白質(zhì)、支鏈淀粉(pullulan)等α-葡聚糖，用乙醇進(jìn)行沉淀。再經(jīng)玻璃濾器過濾，得高分子試樣。這時(shí)，為了除去含單糖的低分子物質(zhì)，用80％乙醇充分洗滌。經(jīng)洗滌的高分子試樣再以丙酮洗滌，加硫酸進(jìn)行水解。水解后中和，收集該濾液，用葡萄糖氧化酶法定量葡萄糖，將按下列數(shù)學(xué)式1算出的值作為葡聚糖的量。
數(shù)學(xué)式1β-葡聚糖(g/100g)＝葡萄糖(g/100g)×0.9β-1，3-1，6-葡聚糖的定量也可按日本專利特公平3-48201號(hào)公報(bào)記載的方法進(jìn)行。即，在培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)培養(yǎng)液殺菌，經(jīng)離心分離除去菌體，在所得溶液中加氯仿/丁醇混合液10％(v/v)，振蕩(Sevage法)后經(jīng)離心分離除去氯仿和不溶物。該操作重復(fù)2次，經(jīng)乙醇沉淀，回收沉淀物，溶解于蒸餾水，經(jīng)酶處理分解支鏈淀粉，在蒸餾水中進(jìn)行透析，透析液用乙醇沉淀，回收沉淀粉(β-1，3-1，6-葡聚糖)，求出產(chǎn)量。
本發(fā)明中，可將以上得到的培養(yǎng)液直接加熱或加壓加熱殺菌后使用，也可經(jīng)離心分離等分離除去菌體后殺菌再使用。并可根據(jù)需要濃縮后或再經(jīng)干燥后使用。短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌的培養(yǎng)物作為增粘穩(wěn)定劑等食品添加劑使用時(shí)的安全性高。
另一方面，本發(fā)明所用的乳酸菌只要是可用于食品的乳酸菌即可，沒有特別限制，具體可例舉類腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、乳酸乳球菌乳脂亞種(酪鏈球菌，Streptococcus cremoris)、乳酸乳球菌乳亞種(乳鏈球菌，Streptococcus lactis)、唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcusthermophilus)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)等。上述乳酸菌可單獨(dú)使用，也可以2種以上并用。
糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)是用于乳酸菌制劑等的乳酸菌，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是用于干酪、發(fā)酵乳品、酸奶、乳酸菌飲料等的乳酸菌，乳酸乳球菌乳脂亞種(Streptococcus cremoris)、乳酸乳球菌乳亞種(Streptococcus lactis)、唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus thermophilus)是用于干酪、酸奶等的乳酸菌，長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)是用于發(fā)酵乳品等的乳酸菌。因此這些乳酸菌都是從業(yè)者容易得到的。
本發(fā)明中，上述乳酸菌中特別好的是使用糞腸球菌(例如ATCC 19433，ATCC 14508，ATCC 123655，IFO 16803等)。通過并用上述培養(yǎng)物和糞腸球菌，可期望獲得這些成分的更理想的協(xié)同生理活性作用(如便秘緩解作用、免疫賦活作用、保濕作用等)。
本發(fā)明中，上述乳酸菌經(jīng)加熱殺菌比較好。這樣可廣泛添加入必需加熱處理的商品中。而且，貯存穩(wěn)定性高，作為飲食品和醫(yī)藥品等的原料使用時(shí)安全性也非常高，特別適合于皮膚保濕劑。
上述乳酸菌的培養(yǎng)可依常法進(jìn)行，例如從按常法培養(yǎng)上述乳酸菌而得到的培養(yǎng)物中經(jīng)過濾、離心分離等方法回收菌體，水洗后懸浮于水等，于80～115℃加熱處理30分鐘～3秒鐘。經(jīng)加熱殺菌的乳酸菌可根據(jù)需要濃縮、干燥后使用。
本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物，例如可將上述乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體混合分散于上述短梗霉屬菌經(jīng)殺菌的培養(yǎng)液中而得到。并可根據(jù)需要制成片劑、膠囊劑、粉末、顆粒、溶液劑、糊劑、凝膠劑等各種形式。
本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物，較好是固形成分中含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為1～80質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌菌體4～95質(zhì)量％。除上述基本成分以外，可適當(dāng)包含香精、甜味劑、維生素類、礦物質(zhì)等、寡糖、增粘多糖類、糊精、植物提取物、其它植物成分等。
本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物可直接用作便秘緩解劑、免疫賦活劑、皮膚保濕劑等。
例如，本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合用作便秘緩解劑的場合，較好的是固形成分中含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為1～40質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌菌體4～95質(zhì)量％，更好的是含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為2～40質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌菌體10～95質(zhì)量％，特別好的是含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為3～40質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌菌體30～95質(zhì)量％。
本發(fā)明的便秘緩解劑的有效劑量是成人每天換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為0.01～10g的上述培養(yǎng)物，上述乳酸菌菌體0.01～10g，較好的是換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為0.5～5g的上述培養(yǎng)物，上述乳酸菌菌體0.05～1g。
本發(fā)明的便秘緩解劑也可以摻入在例如清涼飲料、果凍飲料、果汁飲料、蔬菜汁、肉汁、醬湯、冷凍食品、其它加工食品等各種飲食品中。上述各種飲食品中的本便秘緩緩劑的添加量可根據(jù)上述成人每天的有效劑量設(shè)定，通常較好為1～50重量％，更好為10～20質(zhì)量％。對(duì)其添加方法沒有特別限制，可以最初與用于各種飲食品的其它原料一起添加。
本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物用作免疫賦活劑的場合，較好的是固形成分中含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為5～80質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌菌體10～80質(zhì)量％，更好的是含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為25～70質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌菌體20～70質(zhì)量％，特別好的是含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為30～60質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌菌體30～60質(zhì)量％。
本發(fā)明的免疫賦活劑的有效劑量是成人每天換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為0.02～0.50g的上述培養(yǎng)物，上述乳酸菌菌體0.10～0.90g，較好的是換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為0.06～0.40g的上述培養(yǎng)物，上述乳酸菌菌體0.15～0.45g。
本發(fā)明的免疫賦活劑也可以摻入例如清涼飲料、果凍飲料、蔬菜汁、肉汁、醬湯、冷凍食品、其它加工食品等各種飲食品中。上述各種飲食品中本免疫賦活劑的添加量可根據(jù)上述成人每天的有劑效量設(shè)定，通常較好為換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為0.02～0.50質(zhì)量％，更好是0.06～0.40質(zhì)量％；乳酸菌菌體較好是0.10～0.90質(zhì)量％，更好是0.15～0.45質(zhì)量％。對(duì)添加方法沒有特別限制，可以最初與用于各種飲食品的其它原料一起添加。
本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物用作皮膚保濕劑的場合，較好的是固形成分中含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為1～40質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體4～95質(zhì)量％；更好的是含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為2～40質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含上述乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體10～95質(zhì)量％，特別好的是含有換算成β-1，3-1，6-葡聚糖為3～40質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有上述乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體30～95質(zhì)量％。如果含β-葡聚糖的素材的配比量過少，則不能得到充分的保濕效果，如果過多則產(chǎn)品的流動(dòng)性(易涂勻性)低下，使用感降低。而乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體的配比量如果過少，則不能得到充分的保濕作用的持續(xù)性，過多則在產(chǎn)品中的分散性下降，不能得到均勻的產(chǎn)品。
對(duì)上述培養(yǎng)物和上述乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體并用以提高保濕效果的持續(xù)性的理由雖不十分清楚，但可以考慮是因?yàn)槔缛樗峋?jīng)加熱殺菌的菌體作為載體保持了β-葡聚糖和水分的緣故。特別是糞腸球菌與乳桿菌、雙歧桿菌等其它乳酸菌相比，菌體體積小，所以單位添加質(zhì)量的菌體數(shù)變多，而使保濕作用提高。
本發(fā)明的皮膚保濕劑可直接用作化妝水或化妝液，也可摻入在各種皮膚化妝品(如乳液、霜、潤膚膏等)中使用。該皮膚保濕劑在皮膚化妝品中的配比量較好是0.5～50重量％，更好是5～20質(zhì)量％。
實(shí)施例以下列舉實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。此外，以下說明中，未特別指出時(shí)“％”表示“質(zhì)量％”。
實(shí)施例1(1)短梗霉的培養(yǎng)接種適量的出芽短梗霉M-1(Aureobasidium pullulans M-1)(FERM BP-08615)的種子培養(yǎng)液于含蔗糖1％、抗壞血酸0.2％、米糠0.2％的液體培養(yǎng)基(pH5.3)中，于25℃通氣攪拌培養(yǎng)2天。培養(yǎng)結(jié)束后，將此培養(yǎng)液在121℃殺菌15分鐘。該培養(yǎng)液含固形成分1％，該固形成分中含β-1，3-1，6-葡聚糖35％。
(2)糞腸球菌的培養(yǎng)將糞腸球菌(Enterococcus faecalis，IFO 16803)于ロゴサ培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24小時(shí)的種子培養(yǎng)液適量接種于含酵母膏4％、聚蛋白胨3％、乳糖10％的液體培養(yǎng)基中，一邊用恒pH裝置(pH stat)以氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH為6.8～7.0，一邊于37℃中和培養(yǎng)22～24小時(shí)。
培養(yǎng)結(jié)束后，用連續(xù)離心機(jī)分離、回收菌體，然后加水稀釋至原來的液量，再次用連續(xù)離心機(jī)分離、回收菌體。該操作重復(fù)4次，將菌體洗凈。然后，將洗凈的菌體懸浮于適量的水中，于100℃殺菌30分鐘后，用噴干器將菌體干燥，調(diào)制出經(jīng)加熱殺菌的菌體粉末(5×1012cfu/g)。
(3)便秘緩解作用的確認(rèn)將上述(1)得到的短梗霉培養(yǎng)物和上述(2)得到的乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體，用以下方法進(jìn)行試驗(yàn)，確認(rèn)便秘緩解作用。
試驗(yàn)時(shí)間定為4周，對(duì)有便秘體質(zhì)的志愿者10名，最初1周(第1周)不給藥，下1周(第2周)給予乳酸菌菌體(200mg/日)，再下1周(第3周)給予短梗霉培養(yǎng)物(15ml/日)，最后1周(第4周)給予短梗霉培養(yǎng)物(15ml/日)和乳酸菌菌體(200mg/日)。請(qǐng)患者核算各試驗(yàn)樣品給藥1周內(nèi)的排便次數(shù)。其結(jié)果示于表1。
表1

由表1可知，僅給予乳酸菌菌體的場合，有一些便秘緩解作用，而僅給予短梗霉培養(yǎng)物的場合，幾乎未見便秘緩解作用。另一方面，并用短梗霉培養(yǎng)物和乳酸菌菌體的場合，排便次數(shù)增加，便秘得到明顯改善。
實(shí)施例2在實(shí)施例1(1)所得的短梗霉培養(yǎng)物1L中加入實(shí)施例1(2)所得的乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體10g，均勻混合，得含β-葡聚糖的組合物。用該含β-葡聚糖的組合物按以下方法研究對(duì)初期感染的防御效果。
(1)生存率的測定將預(yù)先飼養(yǎng)1周的BALB/c小鼠(7周齡，雌性)28只(購自日本エスエルシ-株式會(huì)社)分成4組(每組7只)，對(duì)各組給予下列供試物質(zhì)，每只小鼠200μl，每日1次，在試驗(yàn)期間連續(xù)口服。
試驗(yàn)組上述含β-葡聚糖的組合物比較組1短梗霉培養(yǎng)液(實(shí)施例1(1)制得)比較組2乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體(實(shí)施例1(2)制得)懸浮于PBS(1g菌體/10ml)對(duì)照組PBS各組小鼠連續(xù)口服上述各供試物質(zhì)1周后，在其尾靜脈內(nèi)接種細(xì)胞內(nèi)寄生性細(xì)菌利斯特氏菌(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，Listeria moncytogenes，EGD株)，達(dá)到5.4×104cfu/200μl/小鼠(2×LD50)，其后觀察2周，求出各組小鼠的生存率及平均生存期。
其結(jié)果示于表2及圖1～3。試驗(yàn)期間任其自由攝取水及飼料(商品名“粉末飼料CRF-1”，オリエンタル酵母株式會(huì)社制)。
表2

由表2及圖1～3可知，試驗(yàn)組中僅1例死亡(接種細(xì)菌后第6日)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)生存率為85.7％，而對(duì)照組中所有動(dòng)物均死亡(細(xì)菌接種后第4天)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)生存率為0％。比較組1中，2例死亡(細(xì)菌接種第6天1例，第7天1例)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)生存率71.4％。而比較組2中，5例死亡(細(xì)菌接種第4天3例，第5天2例)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)生存率28.6％。用Mann-Whitney的U檢驗(yàn)法檢定試驗(yàn)組與其它組之間的差異的顯著性，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組、比較組2之間有顯著差異(p＜0.01)。
平均生存期，試驗(yàn)組為12.7天，而對(duì)照組為3.0天，比較組1為11.5天，比較組2為6.4天。用Mann-Whitney的U檢驗(yàn)法檢定試驗(yàn)組與其它組之間的差異的顯著性，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組及比較組2之間有顯著差異(p＜0.01)。
由上述結(jié)果可知，口服本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物，在細(xì)菌感染時(shí)能增強(qiáng)宿主對(duì)感染的抵抗力。
(2)臟器內(nèi)菌數(shù)的測定由于在上述(1)中提示含β-葡聚糖的本組合物對(duì)于抗利斯特氏菌的感染抵抗力起作用，進(jìn)行了對(duì)作為除菌指標(biāo)的臟器內(nèi)細(xì)菌數(shù)隨時(shí)間變化的解析。
使用預(yù)先飼養(yǎng)了1周的BALB/c小鼠(7周齡，雌性)，每組30只，與上述同樣給予各供試物質(zhì)。各組小鼠連續(xù)口服上述供試物質(zhì)1周后，在尾靜脈內(nèi)接種作為細(xì)胞內(nèi)寄生性細(xì)菌的利斯特氏菌(單核細(xì)胞增生利斯特氏菌，EGD株)，達(dá)到2.7×103cfu/200μl/小鼠(1/10×LD50)，于接種細(xì)菌后第1天、第3、第5天、第7天及第10天每組小鼠各處死5只，收集脾臟。
將收集的脾臟用搗碎機(jī)研碎，再懸浮于PBS 5ml中，將此作為原液。該原液用10倍逐步稀釋法稀釋，取原液及各系列稀釋液100μl，涂抹于TSA培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)。測定TSA培養(yǎng)基上發(fā)育的細(xì)菌集落數(shù)，計(jì)算臟器內(nèi)菌數(shù)。臟器內(nèi)菌數(shù)是求出每組平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差。其結(jié)果示于表3及圖4。
表3

由表3可知，對(duì)照組于細(xì)菌接種第3天脾臟內(nèi)細(xì)菌數(shù)達(dá)到峰值，其后緩緩減少，于細(xì)菌接種第10天達(dá)到檢出限附近(3.75±7.5CFU/脾臟)。另一方面，試驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)菌數(shù)自細(xì)菌接種后第1天開始增加，在細(xì)菌接種第3天顯示與第1天幾乎同等的菌數(shù)，其后減少。在細(xì)菌接種第10天降至27±25CFU/脾臟。在比較組1及比較組2中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌接種后第1天開始菌數(shù)增加，在細(xì)菌接種第3天脾臟內(nèi)細(xì)菌數(shù)達(dá)到峰值，其后緩緩減少，于細(xì)菌接種第10天降至檢出限以下(＜3.33CFU/脾臟)。
由上述結(jié)果推測，含β-葡聚糖的本組合物作用于感染早期的免疫機(jī)制，增強(qiáng)對(duì)感染的抵抗力，通過未成熟T細(xì)胞或吞噬細(xì)胞的非特異性免疫機(jī)制發(fā)生的可能性大于成熟T細(xì)胞的攻擊性強(qiáng)的免疫機(jī)制。
(3)細(xì)胞表面分子的解析由于在上述(1)、(2)中確認(rèn)生存率、生存期及臟器內(nèi)菌數(shù)的差異，因此用流式細(xì)胞儀對(duì)與利斯特氏菌的感染抵抗性有關(guān)的機(jī)體細(xì)胞進(jìn)行了解析。
在測定上述(2)的臟器內(nèi)細(xì)菌數(shù)的同時(shí)，收集腸系膜淋巴結(jié)(MLN)。收集的MLN用載玻片玻璃研碎，用不銹鋼網(wǎng)除去剩余的組織片，然后以FACS用Hank’s液再懸浮，使淋巴細(xì)胞為1×106/ml。以下述(a)-(d)所示的4種染色模式對(duì)淋巴細(xì)胞染色，用流式細(xì)胞儀(Epics-XL；Beckman Coulter)進(jìn)行細(xì)胞(T細(xì)胞中心)表面分子的解析。其結(jié)果示于表4及圖5。
(a)Cy-chrome(Cy)標(biāo)記的抗CD3mAb(T細(xì)胞固有的識(shí)別標(biāo)記)/FITC標(biāo)記的抗TCRαβmAb(T細(xì)胞型別識(shí)別標(biāo)記)/PE標(biāo)記的抗CD 4mAb/生物素標(biāo)記的抗TCRrδ(T細(xì)胞型別識(shí)別標(biāo)記)mAb(b)Cy標(biāo)記的抗CD3mAb/FITC標(biāo)記的抗TCRαβmAb/PE標(biāo)記的抗CD4mAb/生物素標(biāo)記的抗CD69mAb(早期活化標(biāo)記)(c)Cy標(biāo)記的抗CD3mAb/FITC標(biāo)記的抗TCRαβmAb/PE標(biāo)記的抗CD4mAb/生物素標(biāo)記的抗CD25mAb(IL-2Rα；活化標(biāo)記)(d)Cy標(biāo)記的抗CD3mAb/FITC標(biāo)記的抗TCRαβmAb/PE標(biāo)記的抗CD122mAb(IL-2Rβ；活化標(biāo)記)/生物素標(biāo)記的抗CD4mAb表4

如表4及圖5所示，試驗(yàn)組、比較組1、2與對(duì)照組相比，確認(rèn)CD4陽性αβ型T細(xì)胞的增加。特別是試驗(yàn)組比比較組1、2增加的比例大。且在細(xì)菌感染3天后，各組均顯示幾乎相同的比例。另一方面，關(guān)于CD4陽性細(xì)胞中的活化標(biāo)記，CD25分子(IL-2Rα)、CD122分子(IL-2Rβ)和CD69分子(早期活化標(biāo)記)不管哪一種均顯示幾乎同等的表達(dá)程度。
由上述結(jié)果，由于未見試驗(yàn)組中感染前和感染后CD4陽性αβ型T細(xì)胞發(fā)生顯著變化，所以推測含β-葡聚糖的組合物對(duì)感染抵抗力的增強(qiáng)是分化程度低的細(xì)胞群的功能亢進(jìn)所致。
此外，對(duì)血液中的細(xì)胞因子用市售的IFN-γ測定盒(グンザイム株式會(huì)社制)的方法進(jìn)行了測定，如表5所示，試驗(yàn)組在感染第3天IFN-γ顯示較高值。由于未見CD4陽性αβ型T細(xì)胞的變化，認(rèn)為產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞可能是巨噬細(xì)胞。
表5

實(shí)施例3用實(shí)施例1(1)所得的短梗霉培養(yǎng)液和實(shí)施例1(2)所得的乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體，調(diào)制下述供試樣品，由5名女性志愿者(20歲左右的2名，30歲左右，40歲左右，50歲左右各1名)進(jìn)行保濕效果的確認(rèn)試驗(yàn)。
供試樣品1.單用短梗霉培養(yǎng)液2.乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體的1％水懸浮液3.含乳酸菌經(jīng)加熱殺菌的菌體1％的短梗霉培養(yǎng)液4.水(對(duì)照)各受試者以肥皂洗凈測定部位(前臂內(nèi)側(cè)屈曲部下5cm的寬3cm×長10cm的范圍)，在溫度調(diào)節(jié)至18～20℃、濕度50～55％的恒溫恒濕條件的室內(nèi)保持安靜20分鐘。然后，將上述測定部位分成4部分，第一區(qū)域分別涂布上述供試樣品1～4各10μl后，以應(yīng)用高頻阻抗法的表皮角質(zhì)層水分量測定裝置“SKINCON-200”(商品名，アイ·ビイ·エス株式會(huì)社制)測定各區(qū)域的表皮角質(zhì)層水分量(表皮電導(dǎo)μS)。表皮角質(zhì)層水分量的測定在供試樣品涂布前5分鐘(-5分)、剛涂布完畢時(shí)(0分)、涂布后10、20、30、60分鐘進(jìn)行。其結(jié)果示于圖6～10。圖6～10中，1～4分別對(duì)應(yīng)于供試樣品1～4。
由圖6～10可見，涂布供試樣品3的情況與供試樣品1、2相比，即使涂布后經(jīng)過一段時(shí)間，表皮角質(zhì)層水分量仍保持高水平，保濕作用能持續(xù)。調(diào)查受試者的使用感覺，結(jié)果沒有發(fā)粘和油膩感，使用感覺良好。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如上所述，本發(fā)明的含β-葡聚糖的組合物由于含有含短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌培養(yǎng)而得的β-1，3-1，6-葡聚糖的培養(yǎng)物以及乳酸菌菌體，且這些成分的協(xié)同作用預(yù)期具有優(yōu)良的生理活性作用，所以可用作便秘緩解劑、免疫賦活劑、皮膚保濕劑等使用。
權(quán)利要求
1.含β-葡聚糖的組合物，其特征在于，含有培養(yǎng)短梗霉屬(Aureobasidiumsp.)菌而得的含β-1，3-1，6-葡聚糖的培養(yǎng)物以及乳酸菌菌體作為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的含β-葡聚糖的組合物，其特征還在于，上述短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌是出芽短梗霉M-1(Aureobasidium pullulans M-1)(FERM BP-08615)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的含β-葡聚糖的組合物，其特征還在于，固形成分中含有換算成β-1，3，-1，6-β-葡聚糖為1～80質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，且含有4～95質(zhì)量％的上述乳酸菌菌體。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的含β-葡聚糖的組合物，其特征還在于，上述乳酸菌是糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的含β-葡聚糖的組合物，其特征還在于，上述乳酸菌是經(jīng)加熱殺菌的菌體。
6.便秘緩解劑，其特征在于，以權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的含β-葡聚糖的組合物作為有效成分。
7.免疫賦活劑，其特征在于，以權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的含β-葡聚糖的組合物作為有效成分。
8.皮膚保濕劑，其特征在于，以權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的含β-葡聚糖的組合物作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌培養(yǎng)物所含的β－1，3－1，6－葡聚糖的生理活性作用得到了進(jìn)一步提高的含β－葡聚糖的組合物以及利用該組合物的便秘緩解劑、免疫賦活劑和皮膚保濕劑。得到含有培養(yǎng)短梗霉屬菌而得的含β－1，3－1，6－葡聚糖的培養(yǎng)物以及乳酸菌菌體的含β－葡聚糖的組合物。使該含β－葡聚糖的組合物作為便秘緩解劑、免疫激活劑或皮膚保濕劑的有效成分含有。上述短梗霉屬(Aureobasidium sp.)菌較好是出芽短梗霉(Aureobasidium pullalans M－1)(FERM BP－08615)。上述乳酸菌較好是糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，上述乳酸菌最好是經(jīng)加熱殺菌的菌體。較好的是固形成分中含有換算成β－1，3－1，6－葡聚糖為1～80質(zhì)量％的上述培養(yǎng)物，并含有4～95質(zhì)量％的上述乳酸菌菌體。
文檔編號(hào)A61K31/716GK1700926SQ200480001038
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月7日
發(fā)明者守屋直幸, 守屋祐生子, 鈴木健司 申請(qǐng)人:奧力有限公司