專利名稱：白蛋白溶液及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用于治療的病毒滅活的白蛋白及其制備方法。
背景技術：
白蛋白是血漿中比例最高的血漿蛋白。白蛋白可以將許多內源和外源物質結合到其分子上。這種結合能力也是其主要功能之一轉運與白蛋白結合的物質的基礎。
由于這種結合能力，白蛋白也是許多種類化合物的主要儲存庫，所述化合物如長鏈脂肪酸、膽紅素、色氨酸、甲狀腺素或金屬離子。藥物使用的活性物質，如華法令、洋地黃毒苷或萘普生也可以與白蛋白結合而被轉運。
然而，就此而論，關鍵在于知道只有各藥物活性物質的游離部分，即未與白蛋白結合的部分表現(xiàn)出藥理作用。減少與白蛋白結合的部分就增加了游離部分，因而也增加了藥理活性。
所有可商業(yè)購得的白蛋白制劑是通過改進的Cohn分級法制備的，該方法通常由幾個分級步驟所組成。白蛋白濃縮物的巴氏滅菌(60℃下10小時)作為病毒滅活步驟已被應用了幾十年。為了避免此步驟期間白蛋白的變性，使用了穩(wěn)定劑。根據(jù)歐洲藥典，使用辛酸鈉或N-乙酰基色氨酸或二者的組合作為穩(wěn)定劑。
為了獲得病毒滅活的因子VIII制劑或其它血漿蛋白，采用例如EP-A-0 131 740所述的所謂SD方法。該公開(laid-open)說明書通過引用并入本文。
根據(jù)他們自己的研究，申請人認識到可商業(yè)購得的白蛋白的結合能力明顯低于天然白蛋白。這被解釋為用于巴氏滅菌法的穩(wěn)定劑被白蛋白所結合，因而占據(jù)了重要的轉運位點，由此結合能力下降。這意味著當施用藥物活性物質時，獲取該白蛋白制劑的患者暴露于濃度明顯上升的游離活性物質，即未與白蛋白結合的物質，這自然意味著對于患者的過量藥理作用和副作用風險增加。
本發(fā)明的目的在于提供沒有該缺點的白蛋白制劑。


圖1示出層析分離過程中不同來源的白蛋白的紫外吸收行為與洗脫時間的函數(shù)關系。
圖2示出在不同濃度的苯基丁氮酮存在下不同來源的白蛋白的結合行為。
圖3示出在不同濃度的華法令存在下不同來源的白蛋白的結合行為。
該目的通過可用于治療的病毒滅活的白蛋白來實現(xiàn)，所述白蛋白具有與巴氏滅菌法病毒滅活的白蛋白相比更高的物質結合能力。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的白蛋白具有的結合能力與巴氏滅菌法病毒滅活的白蛋白相比提高至少10％，通常提高20-500％，尤其是提高100-500％。在個別情況下，甚至可以得到更高的值，這取決于所結合的物質。
所述物質主要是由天然白蛋白所結合和轉運的物質，具體包括低分子量的活性物質。具體而言，所述低分子量活性物質是分子量通?！?0000Da的有機或無機物質、核酸、多肽。
對于上述藥物用途來說，根據(jù)本發(fā)明的白蛋白可以是液體溶液形式或固體狀態(tài)，尤其是凍干形式。
根據(jù)本發(fā)明的白蛋白也可以通過特征為以下步驟的組合的方法來獲得(a)在低于45℃的溫度下，利用與SD試劑接觸的SD方法，對第一白蛋白水溶液進行病毒滅活處理；(b)通過油提取和隨后的疏水作用層析至少基本除去SD試劑，其中將疏水性基質，尤其是可任選結合疏水性基團的基質用于所述層析，前提條件是所述基團為多于24個碳原子的脂肪族基團，以得到第二白蛋白溶液；(c)任選向第二白蛋白溶液中加入選自糖、氨基酸和糖醇的一種或多種穩(wěn)定劑，前提條件是不將吲哚穩(wěn)定劑和C6-C10脂肪酸用作所述穩(wěn)定劑；隨之(d)將任選加入穩(wěn)定劑的所述第二白蛋白溶液進行最終包裝和除菌過濾，并且任選將其裝入最終容器中。
術語“吲哚穩(wěn)定劑”應該包括所有具有吲哚骨架的穩(wěn)定劑，如N-乙酰基色氨酸。
已由EP-A-0 131 740得知病毒滅活的SD(＝溶劑/表面活性劑(solvent/detergent))方法。其說明書除了其它蛋白質之外也提及了白蛋白。
事實上，從EP-A-0 366 946得知SD試劑可用植物油，例如大豆油除去，隨后進行疏水作用層析。因而，由于與根據(jù)EP-A-0 366 946的方法部分一致，因此認為根據(jù)權利要求8的方法在一個方面類似于根據(jù)該發(fā)明的白蛋白制備方法。然而，對于層析而言，上述專利優(yōu)選建議一種基質，例如結合疏水性側鏈，即支化或非支化的C6-C24烷基鏈的二氧化硅基質。
令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用疏水性基質代替具有例如C18烷基鏈作為疏水性側鏈的基質，得到更高的吸附洗滌劑的結合能力。因此，無需將其它疏水性基團結合到根據(jù)本發(fā)明采用的基質上。因此，本發(fā)明也涉及使用該基質的方法。
有利的是，病毒滅活在25-40℃的溫度范圍內完成。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，病毒滅活在4-6小時的時間內完成。
甘氨酸非常適合作為穩(wěn)定劑。
蓖麻油非常適合用于油提取法。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果將聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物或甲基丙烯酸酯基聚合物用作所述疏水性基質，則特別有利于純化效果。
根據(jù)本發(fā)明使用的疏水性基質可以具有多于24個碳原子的支化或線性脂肪族基團。
根據(jù)所采用的起始材料不同，可能需要脫除所謂的前激肽釋放酶活化因子(PKA)活性的步驟。已知PKA通過從高分子量激肽原(HMWK)釋放血管活性物質血管舒緩激肽，導致在施用含PKA的制劑之后血壓下降。
PKA通常在蛋白質制劑的巴氏滅菌期間失活。由于上述原因，根據(jù)先前的經(jīng)驗而知至少使PKA部分失活的熱處理不利于根據(jù)本發(fā)明制備的白蛋白，因此如果需要可以通過特殊手段除去PKA。這包括與活性炭孵育，之后過濾，優(yōu)選使用深度過濾器，或者通過含活性炭的過濾器直接過濾。
此外，離子交換劑，如陽離子或陰離子交換劑非常適合用來除去PKA。這可以通過使含白蛋白的溶液接觸柱內基質，或通過技術人員所公知的間歇方法來實現(xiàn)。作為選擇，硫酸葡聚糖或肝素基質可用來減少PKA。
在所得的含白蛋白溶液中，PKA得以減少，并且在最優(yōu)情況下不再能被檢測到。根據(jù)現(xiàn)有技術，PKA等同于產(chǎn)生自其酶原形式(FXII)的活化(凝血)因子XII(FXIIa)。這可以通過自催化或酶催化作用，例如激肽釋放酶作用在表面發(fā)生。因此，同樣可推薦脫除作為PKA前體的FXII(酶原)，但并非必需。然而，為了防止PKA從酶原形式的重新產(chǎn)生，也可以將酶原通過離子交換層析除去?？扇芜x進行FXII的脫除以便能夠長期保存液態(tài)白蛋白。將已經(jīng)以冰凍狀態(tài)儲存的白蛋白溶液解凍之后，這也很重要。因此，在將白蛋白溶液裝入最終容器之后可將其深度冷凍，但也可以將其冷卻至液態(tài)或凍干狀態(tài)并在至多40℃的溫度下貯存。
因而，為了去除PKA或PKA前體物質，可以通過本身已知的方式除去存在于步驟(a)、(b)或(c)之前或之后的任何前激肽釋放酶活化因子(PKA)的活性，其中具體是使白蛋白溶液A)與活性炭接觸，隨后從白蛋白溶液中除去活性炭；或B)進行離子交換層。
步驟(A)在白蛋白濃度為1-25重量％，尤其是5-10重量％下完成。
步驟(B)具體而言在白蛋白濃度為5-10重量％下進行。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一實施方案中，離子交換劑是陰離子交換劑，并將白蛋白溶液用100-150mmol/l的乙酸鈉緩沖，pH在5.0-6.0范圍內，尤其是＜5.5。
此外，所述方法的特征在于所述離子交換劑是陽離子交換劑，并且將白蛋白溶液用20-30mmol/l的乙酸鈉緩沖，pH在4.8-6.0的范圍內，尤其是在4.8-5.2的范圍內。
本發(fā)明還涉及可通過根據(jù)本發(fā)明的方法得到的白蛋白溶液。該方法可用于得自不同來源的白蛋白溶液，例如得自血漿或血清，得自分級血漿的含白蛋白級分，得自重組子制備之后從培養(yǎng)物上清液回收的白蛋白，或得自轉基因制備的白蛋白，或得自含白蛋白的介質，如奶。
通過以下實施例進一步描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
實施例向通過Cohn方法(透濾/超濾之后)得到的蛋白質含量約23％的1000g白蛋白水溶液中各加入Triton X-100和三-正丁基磷酸酯(TNBP)至濃度為1％。隨后，將該白蛋白溶液在30℃下攪拌4小時。
為了除去SD試劑，首先在攪拌下加入蓖麻油直至濃度為5％，同時使溶液溫度為20-25℃。之后，攪拌該混合物30分鐘。攪拌后，使該混合物靜置60分鐘形成重水相和輕相。分離出重相并經(jīng)孔徑＜1μm和＜0.45μm的膜的過濾器過濾。將含有TNBP的輕相(油相)棄去。
為了分離出Triton X-100，使經(jīng)過濾的溶液流過固相抽提柱。將沒有疏水性側鏈的聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物(Amberchrome CG 161)用作疏水性基質。使用注射用水來清洗柱子，該過程通過測量280nm處的紫外吸收來監(jiān)控。所述柱在使用后進行再生。
以下物質可作為穩(wěn)定劑加入甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、麥芽糖、山梨糖醇或這些物質的混合物。
將所得溶液調節(jié)至pH7.0，并調節(jié)蛋白質含量至200g/l，鈉含量至80mmol/l Na+。隨后，將該溶液通過孔徑≤0.2μm的膜過濾器進行除菌過濾。
在無菌條件下，將經(jīng)除菌過濾的溶液裝入無菌且無致熱原的PVC袋中，并在袋上作標記。
將作有標記的袋在＜-60℃的溫度下深度冷凍，使袋內溫度達到＜-30℃。在該溫度(≤-30℃)貯存所述袋。
前激肽釋放酶的脫除脫除PKA時，可以采用以下程序變換方式a)將蛋白質濃度為1-25重量％、尤其是5-10重量％的白蛋白溶液與3-10重量％、尤其是5重量％的活性炭在pH＝5的條件下攪拌一小時。隨后，濾除活性炭。
b)使蛋白質濃度為5-10重量％的白蛋白溶液在用100-150mM的乙酸鈉緩沖的pH5-6、尤其是＜5.5的體系中進行離子交換層析(DEAE Sepharose，QSepharose)。由于高離子強度，從而在濾液中得到不含PKA的白蛋白溶液。
c)將蛋白質濃度為5-10重量％的白蛋白溶液在用20-30mmol/l乙酸鈉緩沖的pH5-6、優(yōu)選4.8-5.2的體系中進行離子交換層析(SP Toyopearl，CMSepharose)。在濾液中得到不含PKA的白蛋白溶液。
最終配方將各所得溶液調節(jié)至pH＝7.0，并調節(jié)蛋白質含量至200g/l，鈉含量至80mmol/lNa+。隨后，將該溶液通過孔徑＜0.2μm的膜過濾器進行除菌過濾。
在無菌條件下，將經(jīng)除菌過濾的溶液裝入無菌且無致熱原的PVC袋中，并在袋上作標記。
將作有標記的袋在溫度＜-60℃的溫度下深度冷凍，以使袋內溫度達到＜-30℃。在該溫度(≤-30℃)貯存所述袋。
物質對不同白蛋白制劑的結合的測量確定物質對白蛋白的結合性質的直接方法是根據(jù)Hummel和Dreyer(BiochimBiophys Acta 1962；63530-532)的尺寸排阻層析(size-exclusion chromatography，SEC)。
因而，SEC柱使用含結合配體(例如苯基丁氮酮或華法令)的緩沖溶液進行平衡。連續(xù)監(jiān)測在紫外區(qū)域的吸收。將蛋白質加到柱上并在平衡緩沖液中進行洗脫。結合配體與白蛋白一道被洗脫，而大多數(shù)情況下更小的未結合配體較遲得以洗脫。結合配體的吸收常常干擾白蛋白和可能的伴隨物質如穩(wěn)定劑的吸收。較遲洗脫的“負向”或所謂的“空白”峰是由隨后的緩沖液中的配體耗盡所致的，其占據(jù)的表面積越大，與先洗脫的白蛋白發(fā)生結合越多。Koizumi等人(Biomed Chromatogr 1998；12203-210)對該方法稍加改進，用來檢驗物質對白蛋白的結合能力或其親合力，例如通過在獨立試驗中向恒定濃度的白蛋白中加入增加量的配體，由此結合能力可以通過白蛋白物質的比率來確定。
將裝在Shimadzu HPLC裝置上的Biosep-SEC-s 4000柱，300×4.6mm微米(Phenomenenx)用于這些檢測。緩沖液流速為0.35ml/min，使用50mM pH7.4的磷酸鉀緩沖液來平衡所述柱。蛋白質濃度為50μM，注射體積為80μl。在263nm檢測苯基丁氮酮，在308nm處檢測華法令。預先確定線性吸收區(qū)域。
使用如本申請所述的白蛋白(1)以及兩種商業(yè)可得(穩(wěn)定的)的白蛋白制劑(2，3)。它們均為20％的白蛋白溶液。
圖1示出四種不同層析圖譜的疊加，柱子已用50mM的苯基丁氮酮(溶于磷酸鹽緩沖液中)進行平衡。在保留時間11分鐘時，白蛋白首先被洗脫出來，該峰表明蛋白質吸光度的總量和結合物質的總量。在14.5分鐘，通常在商用白蛋白中發(fā)現(xiàn)N-乙?；彼?穩(wěn)定劑)峰。18.5分鐘后，出現(xiàn)相對于包括所述物質的平衡緩沖液濃度“負向”表示吸收的“空白”峰。該峰越高(在負向上)或峰面積越大，則與先洗脫的白蛋白結合的物質就越多。
圖2示出結合白蛋白的三種濃度的苯基丁氮酮的紫外吸收(減去緩沖液峰)。因而，將兩種商業(yè)可得的白蛋白(含有辛酸鹽和N-乙?；彼?和由本發(fā)明所述方法制備的白蛋白進行層析，并比較結合性質。對于和白蛋白摩爾濃度相當?shù)谋交〉?，明顯發(fā)現(xiàn)在新白蛋白的情況下峰在高度和面積上明顯較大。類似地，這也適用于第二實施例，即華法令，如圖3所示。
這些結果強調商用白蛋白在結合性質上不如本文所述的白蛋白。
RP-18柱與苯乙烯二乙烯基苯聚合物(Amberchrome 161M)的結合能力的比較測試體系柱容積44ml流速4ml/分鐘所述柱充入1％的Triton X-100溶液。利用反相HPLC在每淋洗柱體積之后測量洗脫液中Triton X的含量。如果可以在洗脫液中檢測出Triton，則凝膠的容量被耗盡。
結果RP-18凝膠結合140mg Triton X-100/ml凝膠，Amberchrome凝膠結合160mg TritonX-100/ml凝膠。
權利要求
1.一種可用于治療的病毒滅活的白蛋白，所述白蛋白的物質結合能力與通過巴氏滅菌法病毒滅活的白蛋白相比得以提高。
2.根據(jù)權利要求1的白蛋白，其中所述結合能力與巴氏滅菌法病毒滅活的白蛋白相比提高至少10％。
3.根據(jù)權利要求1和/或2的白蛋白，其中所述結合能力與巴氏滅菌法病毒滅活的白蛋白相比提高至少20％-500％。
4.根據(jù)權利要求1-3中至少一項的白蛋白，其中所述物質是低分子量的活性物質。
5.根據(jù)權利要求1-4中至少一項的白蛋白，其中所述低分子量的活性物質是分子量至多為10000Da的有機物質、核酸、多肽。
6.根據(jù)權利要求1-5中至少一項的白蛋白，為液體溶液或固態(tài)形式。
7.根據(jù)權利要求6的白蛋白，為凍干形式。
8.一種制備白蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟(a)通過在低于45℃的溫度下，利用與SD試劑接觸的SD方法，對第一白蛋白水溶液進行病毒滅活處理；(b)通過油提取和隨后的疏水作用層析來至少基本除去SD試劑，其中將疏水性基質，尤其是可任選結合疏水性基團的基質用于所述層析，前提條件是所述基團為多于24個碳原子的脂肪族基團，以得到第二白蛋白溶液；(c)任選在第二白蛋白溶液中加入選自糖、氨基酸和糖醇的一種或多種穩(wěn)定劑，前提條件是不將吲哚穩(wěn)定劑和C6-C10脂肪酸用作所述穩(wěn)定劑；隨之(d)將任選加入穩(wěn)定劑的所述第二白蛋白溶液進行最終包裝和除菌過濾，并且任選將其裝入最終容器中。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其特征在于所述病毒滅活在25-40℃的溫度下進行。
10.根據(jù)權利要求8和/或9的方法，其特征在于所述病毒滅活在4-6小時的時間內完成。
11.根據(jù)權利要求8-10中任一項的方法，其特征在于將甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或賴氨酸或其組合用作所述穩(wěn)定劑。
12.根據(jù)權利要求8-10中任一項的方法，其特征在于將麥芽糖和/或山梨糖醇用作所述穩(wěn)定劑。
13.根據(jù)權利要求8-12中任一項的方法，其特征在于將蓖麻油用于油提取。
14.根據(jù)權利要求8-13中任一項的方法，其特征在于將聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物或甲基丙烯酸酯基聚合物用作所述疏水性基質。
15.根據(jù)權利要求8-14中任一項的方法，其特征在于將具有多于24個碳原子的支化或線性脂肪族基團結合至所述基質。
16.根據(jù)權利要求8-15中任一項的方法，其特征在于將所述白蛋白溶液在裝入最終容器之后進行深度冷凍。
17.根據(jù)權利要求8-16中任一項的方法，其特征在于通過本身已知的方式除去存在于步驟(a)、(b)或(c)之前或之后的任何前激肽釋放酶活化因子(PKA)的活性。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其特征在于使所述白蛋白溶液a)與活性炭接觸，隨后從所述白蛋白溶液中除去活性炭；或b)進行離子交換層析；以除去存在的所述前激肽釋放酶活化因子的活性。
19.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于步驟a)在白蛋白濃度為1-25重量％下進行。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其特征在于所述白蛋白濃度為5-10重量％。
21.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于步驟b)在白蛋白濃度為5-10重量％下進行。
22.根據(jù)權利要求18或21中任一項的方法，其特征在于所述離子交換劑是陰離子交換劑，并且將所述白蛋白溶液用100-150mmol/l的乙酸鈉緩沖，并且pH為5.0-6.0。
23.根據(jù)權利要求22的方法，其特征在于所述pH＜5.5。
24.根據(jù)權利要求18或21中任一項的方法，其特征在于所述離子交換劑是陽離子交換劑，并且將所述白蛋白溶液用20-30mmol/l的乙酸鈉緩沖，并且pH為4.8-6.0。
25.根據(jù)權利要求24的方法，其特征在于所述pH為4.8-5.2。
26.一種可由根據(jù)權利要求1-25中任一項的方法得到的白蛋白溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于治療的病毒滅活的白蛋白以及生產(chǎn)可用于治療的病毒滅活的白蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟(a)根據(jù)使所述白蛋白水溶液在低于45℃的溫度下與SD試劑接觸的SD方法對第一白蛋白水溶液進行病毒滅活處理；(b)利用油提取和隨后的疏水作用層析，至少基本上將所述SD試劑除去，將疏水性基質、尤其是可以結合任選的疏水性基團的基質用于所述層析方法，前提是所述基團為C＞24的脂肪族基團，以得到第二白蛋白溶液；(c)任選向第二白蛋白溶液中加入選自糖、氨基酸和糖醇的一種或多種穩(wěn)定劑，前提條件是不將吲哚穩(wěn)定劑和C
文檔編號A61K38/38GK1798573SQ200480003864
公開日2006年7月5日 申請日期2004年2月13日 優(yōu)先權日2003年2月13日
發(fā)明者維爾納·格林格, 卡塔琳娜·波克, 于爾根·勒米施, 托爾·艾納·斯韋, 克里斯托夫·坎尼希特 申請人:奧克塔法馬股份有限公司