專利名稱：含有白介素6拮抗劑的脊髓損傷治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有以白介素6(interleukin-6，IL-6)拮抗劑為有效成分的脊髓損傷治療劑。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代社會，交通事故、跌落·摔倒、運動中的事故等，脊髓受損傷的機會很多，據(jù)說在日本，每年受傷者達到了5000人，累積患者數(shù)達到10萬人。脊髓損傷的癥狀是永久性的，如四肢運動知覺麻痹、膀胱·直腸障礙、呼吸障礙等非常嚴重，作為日常性護理要進行恢復(fù)護理、呼吸管理、褥瘡預(yù)防、排便·排尿護理等。
根本不存在脊髓損傷治療方法，只有包括手術(shù)在內(nèi)的局部穩(wěn)定等處置性療法。以預(yù)防癥狀惡化為目的，大量給予甾體，不能得到對恢復(fù)麻痹有效的效果。多數(shù)脊髓損傷是由外部的機械性作用造成的損傷(一次損傷)開始，經(jīng)過體內(nèi)的反應(yīng)路徑發(fā)展到進一步的組織破壞(二次損傷)。用于抑制這種兩次損傷發(fā)展所使用的唯一藥物是甲基脫氫強的松，需要大量投入近10000mg該藥物。但是，據(jù)報道這種方法具有糖尿病急性惡化或肺炎等副作用。
在19世紀之初，自從神經(jīng)解剖學的巨匠Ramony Cajal在所著書中論述指出“如果成體哺乳類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)一旦受到損傷，將不能再生”以來，這種說法受到長期的信奉。可是，進入19世紀80年代，報告指出針對脊髓損傷的末梢神經(jīng)(A.Aguayo等人，J.Exp.Bilo.95231-240，1981)、胎兒脊髓移植(Bregman B.S.，Dev.Brain Res.，34265-279，1987)，即使在脊髓損傷后，如果能夠在損傷部位導(dǎo)入適當?shù)沫h(huán)境，能看到損傷軸索的再生。而且還有神經(jīng)營養(yǎng)因子促進損傷軸索的再生(Cai，D.等人，Neuron，2289-101，1999)或確認脊索生長阻斷因子(Chen，D.等人，Nature，403434-439，2000)等多個于脊髓再生相關(guān)的報道，使損傷脊髓的再生成為可能?？墒牵驗樘杭顾枰浦泊嬖趽p獻者不足和倫理等問題，臨床應(yīng)用極其困難。
還有，神經(jīng)干細胞(Neural stem cell)是能夠反復(fù)增殖傳代(自我復(fù)制能力)的同時，還能生成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和寡突膠質(zhì)細胞這3種構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞(多分化能力)的未分化的神經(jīng)細胞，因為也存在于成體脊髓中，所以假想能夠修復(fù)損傷后的組織。可是，實際上，在損傷后它們并未分化成神經(jīng)元，而是全部分化成膠質(zhì)細胞，最終形成瘢痕。
時?？梢钥吹疥P(guān)于神經(jīng)干細胞的分化誘導(dǎo)的細胞因子的報道。Weiss等人報道指出用BDNF(brain-derived neurotrophic factor)能促進來自胎兒小鼠線粒體的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化(Ahmed，S.等人，J.Neurosci.，1505765-57781995)。還有，據(jù)報道，Ghosh等人用NT-3(Neurotrophin-3)促進了來自胎兒大鼠大腦皮膚的神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化(Ghosh，A.等人，Neuron 1589-1031995)。Mckay等人有創(chuàng)見性地(instructive)將來自胎兒大鼠海馬層的神經(jīng)干細胞用PDNF(Platelet-derived neurotrophic factor)誘導(dǎo)向神經(jīng)元分化，用CNTF(Ciliary neutrophic factor)誘導(dǎo)向星形膠質(zhì)細胞分化，用甲狀腺激素(T3)誘導(dǎo)向寡突膠質(zhì)細胞分化(J one，K.等人，Gene&Dev.103129-3140 1996)。
還有，近年，據(jù)多賀等人報告，用LIF(Leukemia inhibitoryfactor)和BMP-2(Bone morphogenic protein-2)能促進來自胎兒小鼠神經(jīng)上皮細胞的神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化(Nakashima，K.等人，Science，284479-482，1999)。這些報告的共同點是CNTF、LIF等都屬于IL-6亞家族。即，認為是通過細胞因子受體亞單位gp130的信號將神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞進行分化誘導(dǎo)。
不過，未見有證明通過細胞因子分化誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞可以恢復(fù)脊髓損傷的文獻。
IL-6是B細胞刺激因子2(BSF2)或又稱之為β2干擾素的細胞因子。IL-6是作為和B淋巴細胞的激活相關(guān)的分化因子被人發(fā)現(xiàn)的(Hirano，T.等人，Nature(1986)324，73-76)。之后又被證明是對多種細胞功能產(chǎn)生影響的有功能性細胞因子(Akira，S.等人，Adv.in Immunology(1993)54，1-78)。據(jù)報道IL-6能夠誘導(dǎo)T淋巴細胞的成熟(Lotz，M.等人，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258)。
IL-6在細胞上通過兩種蛋白質(zhì)傳遞其生物學活性。一種是IL-6結(jié)合的分子量大約80kD的配體結(jié)合性蛋白質(zhì)的IL-6受體(Taga，T.等人，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.等人，Science(1987)241，825-828)。IL-6受體除了貫通細胞膜，表達在細胞膜上以膜結(jié)合型存在之外，主要以由細胞外區(qū)域構(gòu)成的可溶性IL-6受體的形式存在。
另外一種是非配體結(jié)合性的信號傳導(dǎo)中的分子量約130kD的膜蛋白質(zhì)gp130。IL-6和IL-6受體形成IL-6/IL-6受體復(fù)合物，然后通過和gp130結(jié)合，將IL-6的生物學活性傳遞到細胞內(nèi)(Taga，T.等人，Cell(1989)58，573-581)。
IL-6拮抗劑是能夠阻礙IL-6的生物學活性傳遞的物質(zhì)。至今已知有針對IL-6的抗體(抗IL-6抗體)、針對IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、針對gp130的抗體(抗gp130抗體)、IL-6突變體、IL-6或IL-6受體的部分肽等。
關(guān)于抗IL-6受體抗體有幾篇報道(Novick，D.等人，Hybridoma(1991)10，137-146、Huang Y.W.等人，Hybridoma(1993)12，621-630，國際專利申請公開號WO 95/09873、法國專利申請公開號FR 2694767、美國專利號US 521628)。已知通過向其中之一的小鼠抗體PM-1(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互補性決定區(qū)域(CDR，complementarity determining region)移植人抗體得到的人源化的PM-1抗體(國際專利申請公開號WO 92/19759)。
專利文獻1WO 95/09873專利文獻2FR 2694767
專利文獻3USP 0521628非專利文獻1A.Aguayo等人，J.Exp.Bilo.95231-240，1981非專利文獻2Bregman B.S.，Dev.Brain Res.，34265-279，1987非專利文獻3Cai，D.等人，Neuron，2289-101，1999非專利文獻4Chen，D.等人，Nature，403434-439，2000非專利文獻5Ahmed，S.等人，J.Neurosci.，1505765-5778，1995非專利文獻6Ghosh，A.等人，Neuron 1589-103，1995非專利文獻7Jone，K等人，Gene&Dev.103129-3140，1996非專利文獻8Nakashima，K.等人，Science，284479-482，1999非專利文獻9Hirano，T.等人，Nature(1986)324，73-76非專利文獻10Akira，S.等人，Adv.in Immunology(1993)54，1-78非專利文獻11Lotz，M.等人，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258非專利文獻12Taga，T.等人，Cell(1989)58，573-581非專利文獻13Yamasaki，K.等人，Science(1987)241，825-828非專利文獻14Novick，D.等人，Hybridoma(1991)10，137-146非專利文獻15Huang，Y.等人，Hybridoma(1993)12，621-630非專利文獻16Hirata，Y.等人，J.Immunol(1989)143，2900-2906發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明不僅預(yù)防脊髓損傷其癥狀的惡化，還希望獲得使之恢復(fù)的治療手段，本發(fā)明提供有用的藥物組成物作為該手段。
本發(fā)明人等為了解決上述課題，進行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對IL-6的拮抗劑，例如針對IL-6受體的抗體具有恢復(fù)脊髓損傷的作用。所以，本發(fā)明提供了含有以白介素6(IL-6)拮抗劑為有效成分的脊髓損傷治療劑。
本發(fā)明還提供了含有以白介素6(IL-6)拮抗劑為有效成分的神經(jīng)干細胞分化調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明另外提供了含有以白介素6(IL-6)拮抗劑為有效成分的抑制向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的分化抑制劑。
作為上述的IL-6拮抗劑，優(yōu)選針對IL-6受體的抗體，特別優(yōu)選單克隆抗體。該單克隆抗體，可列舉針對人IL-6受體的單克隆抗體以及針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。上述針對人IL-6受體的單克隆抗體的具體例子，可列舉PM-1抗體，作為針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體，可列舉MR16-1抗體。作為針對IL-6受體的抗體，還可以列舉從產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤中克隆的基因人為地操作得到的重組型抗體，例如嵌和抗體、人源化抗體等。


圖1表示在下肢運動功能評價中，與未給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的小鼠(對照)相比，在給予上述抗體的脊髓損傷的小鼠中，脊髓損傷后運動的恢復(fù)很大。
圖2表示在轉(zhuǎn)棒儀旋轉(zhuǎn)試驗中，與未給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的小鼠(對照)相比，在給予上述抗體的脊髓損傷的小鼠中，脊髓損傷后運動強度的恢復(fù)很大。
圖3表示與未給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的小鼠(對照)相比，給予上述抗體的脊髓損傷的小鼠脊髓損傷部位的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的形成受到抑制。
圖4表示與脊髓未損傷(シヤム)的小鼠相比，在脊髓受到損傷的小鼠的脊髓損傷部位，IL-6受體進行表達。
圖5表示通過給予抗IL-6受體抗體(MRA)，實際上使脊髓損傷部位的IL-6信號級聯(lián)受到抑制的磷酸化STAT3的western blot圖。
具體實施例方式
在本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑不論其來源、種類和形狀，只要能表現(xiàn)出脊髓損傷的治療效果即可。
IL-6拮抗劑是通過阻斷經(jīng)由IL-6的信號傳遞，阻礙IL-6的生物學活性的物質(zhì)。IL-6拮抗劑優(yōu)選對IL-6、IL-6受體以及gp130中任何一個的結(jié)合具有阻礙作用的物質(zhì)。作為IL-6拮抗劑，可列舉抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gp130抗體、IL-6突變體、可溶性IL-6受體突變體或IL-6或IL-6受體的部分肽以及具有和這些物質(zhì)同樣活性的低分子物質(zhì)。
可以用公知的手段作為多克隆抗體或單克隆抗體得到本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體。本發(fā)明所使用的抗IL-6抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體包括雜交瘤產(chǎn)生的抗體以及用基因工程方法將含抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化到宿主中產(chǎn)生的抗體。這種抗體通過和IL-6結(jié)合，阻礙IL-6向IL-6受體結(jié)合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可列舉MH166(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)或SK2抗體(Sato，K.等人，第21次日本免疫學會總會、學術(shù)記錄(1991)21，166)等。
基本上可以使用公知技術(shù)，按照下述方法制備產(chǎn)生抗IL-6抗體的雜交瘤。即，用IL-6作為致敏原，將其按照通常的免疫方法進行免疫，將得到的免疫細胞通過常規(guī)的細胞融合方法和公知的親本細胞融合，按照通常的篩選方法，通過篩選制備產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
具體而言，可按照下面方法制備抗IL-6抗體。例如可以用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550，J.Immunol(1998)140，1534-1541或Agi.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公開的IL-6基因/氨基酸序列得到作為獲得抗體的致敏原而使用的人的IL-6。
將IL-6基因序列插入到公知的表達載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化到適當?shù)乃拗骷毎泻?，用公知的方法純化該宿主細胞中的或培養(yǎng)上清中的IL-6蛋白質(zhì)，可將該純化的IL-6蛋白質(zhì)作為致敏原使用。還有，也可以將IL-6蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致敏原使用。
可以用公知的手段得到作為多克隆抗體或單克隆抗體的在本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體。本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體是由雜交瘤產(chǎn)生的，以及用基因工程方法將含有抗體基因的載體轉(zhuǎn)化到宿主中產(chǎn)生的。該抗體通過和IL-6受體結(jié)合，阻礙IL-6向IL-6受體結(jié)合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可列舉MR16-1抗體(Tamura，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗體(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請公開號WO92/19759)等。這些抗體中，特別優(yōu)選用PM-1作為抗體。
還有，產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤細胞株作為PM-1，按照布達佩斯條約在1989年7月12日，作為FERM BP-2998向獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物寄存中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)進行國際寄存。Rat-mouse hybridoma MR16-1，按照布達佩斯條約在1997年3月13日，作為FERM BP-5875向獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物寄存中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)進行國際寄存。
基本上使用公知的技術(shù)按照下述方法制備產(chǎn)生抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤。即，用IL-6受體作為致敏原，將其按照通常的免疫方法進行免疫，將得到的免疫細胞按照常規(guī)的細胞融合方法和公知的親本細胞融合，用通常的篩選方法，通過篩選制備得到產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
具體而言，可以按照下述方法制備抗IL-6受體抗體。例如用歐洲專利申請公開號EP 325474中公布的IL-6受體基因/氨基酸序列可以得到作為獲得抗體的致敏原使用的人IL-6受體抗體，用日本專利申請公開號特開平3-155795中公布的IL-6受體基因/氨基酸序列可以得到小鼠抗IL-6受體抗體。
IL-6受體蛋白質(zhì)有在細胞膜上表達的和從膜上脫落的(可溶性IL-6受體)(Yasukawa，K.等人，J.Biochem.(1990)108，673-676)2種。可溶性IL-6受體實質(zhì)上是由結(jié)合在細胞膜上的IL-6受體的細胞外區(qū)域構(gòu)成的，從缺失細胞膜貫通區(qū)域或缺失細胞膜貫通區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域這點出發(fā)，它和膜結(jié)合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白質(zhì)，在本發(fā)明中只要能作為制備抗IL-6受體抗體的致敏原使用，可以使用任何一種IL-6受體。
將IL-6受體的基因序列插入到公知的表達載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化到適當?shù)乃拗骷毎泻?，用公知的方法純化該宿主細胞中的或培養(yǎng)上清中的IL-6受體蛋白質(zhì)，可將該純化的IL-6蛋白質(zhì)作為致敏原使用。還有，也可將IL-6受體蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致敏原使用。
在平成元年(1989年)1月9日，將含有包含編碼人IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pIBIBSF2R的大腸桿菌(E.coli)按照布達佩斯條約作為HB101-pIBIBSF2R，寄存編號FERM BP-2232向獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物寄存中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)進行國際寄存。
可以用公知的手段作為多克隆抗體或單克隆抗體得到本發(fā)明中使用的gp130抗體。本發(fā)明中使用的抗gp130抗體特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體是由雜交瘤產(chǎn)生的，以及通過基因工程方法將含有抗體基因的載體轉(zhuǎn)化到宿主中產(chǎn)生的。該抗體通過和gp130結(jié)合，阻礙IL-6/IL-6受體復(fù)合物向gp130的結(jié)合，阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可列舉AM64抗體(特開平3-219894)、4B11抗體以及2H4抗體(US 5571513)、B-S12抗體以及B-P8(特開平8-291199)等。
基本上使用公知的技術(shù)按照下述方法制備產(chǎn)生抗gp130單克隆抗體的雜交瘤。即，用gp130作為致敏原，將其按照通常的免疫方法進行免疫，將得到的免疫細胞用常規(guī)的細胞融合方法和公知的親本細胞融合，根據(jù)通常的篩選方法，通過篩選制備產(chǎn)生單克隆抗體的細胞。
具體而言，可以按照下述方法制備單克隆抗體。例如用歐洲專利申請公開號EP 411946中公布的gp130基因/氨基酸序列可以得到作為獲得抗體的致敏原使用的gp130。
將gp130的基因序列插入到公知的表達載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化到適當?shù)乃拗骷毎泻?，用公知的方法純化該宿主細胞中的或培養(yǎng)上清中的gp130蛋白質(zhì)，可以將該純化的gp130蛋白質(zhì)作為致敏原使用。還有，也可以將表達gp130的細胞或者gp130蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白作為致敏原使用。
作為用致敏原免疫的哺乳動物，沒有特定的限制，優(yōu)選選擇考慮到和細胞融合中使用的親本細胞的適合性，一般使用嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠等。
可以按照公知的方法用致敏原免疫動物。例如可以用將致敏原注射到哺乳動物的腹腔中或皮下的一般性方法。具體而言，用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或者生理鹽水等將致敏原稀釋到適當量，按照希望優(yōu)選將懸濁物和通常的佐劑，例如弗氏完全佐劑適量混合，乳化后，每4-12天對哺乳動物數(shù)次給藥，還有，可以在致敏原免役時，使用適當?shù)妮d體。
經(jīng)過如此免疫，確認血清中希望的抗體水平上升后，從哺乳動物中取出免疫細胞，進行細胞融合。進行細胞融合的特別優(yōu)選的免疫細胞是脾細胞。
和上述免疫細胞融合的另外的親本細胞是哺乳動物的骨髓瘤細胞，已有公知的多種細胞株，例如適于使用P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等人，J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、F0(de St.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)等。
可以基本上按照公知的方法，如按照Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等進行上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。
更具體而言，例如，可以在細胞融合促進劑存在的情況下，在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行上述細胞融合。作為融合促進劑，例如使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，如果希望提高融合效率可以添加使用二甲亞砜等輔助劑。
免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例，例如相對骨髓瘤細胞，優(yōu)選免疫細胞達到1～10倍。作為上述細胞融合所用的培養(yǎng)液，例如適合上述骨髓瘤的增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，此外，可以使用培養(yǎng)這種細胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)液，還有，還可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加劑。
細胞融合可將特定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液混合，將預(yù)先加熱到37℃的PEG溶液，例如通常為平均分子量1000～6000左右的PEG溶液，按照30～60％(w/v)的濃度添加、混合，形成目的的融合細胞(雜交瘤)。然后，依次添加適當?shù)呐囵B(yǎng)液、重復(fù)離心、去除上清操作，去除對雜交瘤生長不利的細胞融合劑等。
該雜交瘤用通常的選擇培養(yǎng)液，例如用HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)進行選擇。在該HAT培養(yǎng)液中培養(yǎng)為了達到使雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的目的，持續(xù)進行充分長的時間，通常為數(shù)天～數(shù)周。然后，實施常規(guī)的極限稀釋法，篩選和克隆產(chǎn)生目的的抗體的雜交瘤。
還有，除了用抗原免疫人以外的動物得到上述雜交瘤之外，在體外用目的的抗原蛋白質(zhì)或抗原表達細胞致敏人淋巴細胞，將致敏的B淋巴細胞和人骨髓瘤細胞如U266融合，得到對目的的抗原或抗原表達細胞具有結(jié)合活性的目的的人抗體(參見特公平1-59878)。還有，將抗原或抗原表達細胞給予具有人抗體基因文庫(レパ一トリ一)的轉(zhuǎn)基因動物，按照上述的方法也可以得到目的的人抗體(參見國際專利申請?zhí)朩O 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
這樣制備得到的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在常規(guī)的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，或在液氮中長期保存。
為了從該雜交瘤得到單克隆抗體，按照常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤，采用得到其上清的方法，或?qū)⒃撾s交瘤給予到與之相適應(yīng)的哺乳動物中，使之增殖，得到其腹水的方法等。前種方法適于得到高純度的抗體，另外后面的方法適合于抗體的大量生產(chǎn)。
例如可以按照特開平3-139293所公開的方法制備產(chǎn)生抗IL-6受體抗體的雜交瘤。
可以用下述方法制備抗體，將在平成元年(1989年)7月12日按照布達佩斯條約作為FERM BP-2998國際寄存在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物寄存中心(茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)的PM-1產(chǎn)生抗體雜交瘤注入到BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，得到腹水，從該腹水中純化PM-1的方法，或者用下述方法，將該雜交瘤在適當?shù)呐囵B(yǎng)基，例如含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(BoehringerMannheim制造)的RPMI1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制造)等中培養(yǎng)，從其上清中純化PM-1抗體。
在本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用從雜交瘤中克隆抗體基因，重組到適當?shù)妮d體中，將其導(dǎo)入到宿主中，用基因重組技術(shù)產(chǎn)生的重組型抗體(例如參見Borrebaeck C.A.K.and LarrickJ.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the UnitedKingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具體而言，從產(chǎn)生目的的抗體的細胞，例如雜交瘤細胞中分離編碼抗體可變(V)區(qū)域的mRNA。用公知的方法分離mRNA，如用胍超速離心法(Chirgwin，J.M等人，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC 法(Chomczynski.P.等人，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制備總RNA，使用mRNAPurification Kit(Pharmacia制造)等制備mRNA。還有，可以用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia制造)直接制備mRNA。
用逆轉(zhuǎn)錄酶從得到的mRNA合成抗體V區(qū)域的cDNA。可以用AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等合成cDNA。還有，可以使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech制造)以及采用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2929-2932)進行cDNA的合成和擴增。從得到的PCR產(chǎn)物中純化目的的DNA片斷，與載體DNA連接。還有，由此制備重組載體，導(dǎo)入到大腸桿菌等中，選擇克隆，制備目的的重組載體。用公知的方法如雙脫氧法確認目的的DNA的堿基序列。
如果得到編碼目的的抗體V區(qū)域的DNA，將其與編碼目的抗體恒定區(qū)域(C區(qū)域)的DNA連接，重組到表達載體中。另外也可以將編碼抗體V區(qū)域的DNA和含有抗體C區(qū)域的表達載體重組。
在本發(fā)明中使用的抗體制造中，為了表達后述的抗體基因，將表達控制區(qū)域，例如啟動子、增強子的控制元件重組到表達載體中。然后，將該表達載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，使抗體表達。
在本發(fā)明中，可以使用以降低其對人的異種抗原性為目的的人為地改變的基因重組型抗體，例如嵌和(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體、人抗體?？梢杂靡阎姆椒ㄖ圃爝@些改型抗體。
將如前述所示得到的編碼抗體V區(qū)域的DNA和編碼人抗體C區(qū)域的DNA連接，將其重組到表達載體中，導(dǎo)入到宿主中，使之產(chǎn)生得到嵌和抗體(參見歐洲專利申請公開號EP 125023、國際專利申請公開號WO 92/19759)。用該已知的方法，可以得到本發(fā)明中有用的嵌和抗體。
例如含有編碼嵌和抗體PM-1抗體的L鏈以及H鏈的V區(qū)載的DNA的質(zhì)粒，分別命名為pPM-k3和pPM-h1，將具有該質(zhì)粒的大腸桿菌在1991年2月12日根據(jù)布達佩斯條約分別作為NCIMB40366和NCIMB40362在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(大不列顛和北愛爾蘭聯(lián)合王國Scotland Aberdeen AB2 1RY Macher Drive大街23)進行國際寄存。
人源化抗體又稱為重構(gòu)(reshaped)人抗體，是將人以外的哺乳動物，例如小鼠抗體的互補決定區(qū)域(CDR)移植到人抗體的互補決定區(qū)域中。其常規(guī)的基因重組方法也是已知的(參見歐洲專利申請公開號EP 125023、國際專利申請公開號WO 92/19759)。
具體而言，為了使小鼠抗體的CDR和人抗體的框架區(qū)域(FRFramework region)連接，使所設(shè)計的DNA序列的末端部分含有交疊(overlap)，以PCR法用制備成這樣的多個寡核苷酸進行合成，將得到的DNA和編碼人抗體C區(qū)域的DNA連接，然后，重組到表達載體中，將其導(dǎo)入到宿主中使之產(chǎn)生目的的抗體(參見歐洲專利申請公開號EP239400，國際專利申請公開號WO 92/19759)。
需要選擇互補決定區(qū)域能形成良好的抗原結(jié)合部位的通過CDR連接的人抗體的FR。根據(jù)需要，為了使重構(gòu)人抗體的互補決定區(qū)域形成適合的抗原結(jié)合部位，也可以置換抗體可變區(qū)域的框架區(qū)域的氨基酸(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌和抗體、人源化抗體使用人抗體C區(qū)域。作為人抗體C區(qū)域，舉例如Cγ，可以使用如Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。還有，為了改善抗體或其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，也可以修飾人抗體C區(qū)域。
嵌和抗體由來自人以外的哺乳動物的抗體可變區(qū)域和來自人抗體的C區(qū)域構(gòu)成，人源化抗體由來自人以外哺乳動物的抗體的互補決定區(qū)域和來自人抗體的框架區(qū)域以及C區(qū)域構(gòu)成，因為在人體中抗原性低，所以作為本發(fā)明中使用的抗體。
作為在本發(fā)明中使用的人源化抗體的優(yōu)選例，可舉人源化PM-1抗體(參見國際專利申請公開號WO 92/19759)。
還有，作為人抗體的的取得方法，除了前面所述的方法之外，已知有用人抗體庫，通過篩選得到人抗體的技術(shù)。例如人抗體的可變區(qū)域作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展示法，使之表達在噬菌體的表面，選擇和抗原結(jié)合的噬菌體。解析選擇得到的噬菌體的基因，確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)域的DNA序列。如果明確了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，將該序列制備成適當?shù)谋磉_載體，可以得到人抗體。這種方法是公知的方法，可以參見WO 92/01047、WO92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388。
如上所述構(gòu)建的抗體基因，可以通過公知的方法使之表達，得到抗體。當是哺乳類細胞時，可以用功能性地結(jié)合了常用的有用的啟動子、要表達的抗體基因、其3’側(cè)下游的polyA信號的DNA或含有上述序列的載體進行表達。例如作為啟動子/增強子，可以列舉人巨細胞病毒近早期啟動子/增強子(human cytomegalovirus immediateearly promoter/enhancer)。
此外，在本發(fā)明中使用的其它抗體表達中能夠使用的啟動子/增強子可以是反轉(zhuǎn)錄病毒、多面體病毒、腺病毒、猴空泡病毒40(SV40)等病毒啟動子/增強子或人延長因子1α(HEF1α)等來自哺乳類動物的啟動子/增強子。
例如使用SV40啟動子/增強子時，按照Mulligan等人的方法(Mulligan.R.C.等人，Nature(1979)277，108-114)，還有，在使用HEF1α啟動子/增強子時，按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322容易實施。
大腸桿菌時，可將常用的有用的啟動子、使抗體分泌的信號序列、所表達的抗體基因功能性地結(jié)合，并使之表達。例如作為啟動子，可以使用LacZ啟動子、araB啟動子。使用lacZ啟動子時，按照Ward等人的方法(Ward，E.S。等人，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等人，F(xiàn)ASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用araB啟動子時，按照Better等人的方法(Better，M.等人，Science(1988)240，1041-1043)。
作為用于抗體分泌的信號序列，在大腸桿菌的周質(zhì)腔中產(chǎn)生時，可以使用pelB信號序列(Lei，S.P.等人，J.Bacterilol.(1987)169，4379-4383)。分離在周質(zhì)腔中產(chǎn)生的抗體后，可以適當?shù)厥箍贵w的結(jié)構(gòu)折疊(refold)(例如參見WO96/30394)。
作為復(fù)制起點，可以使用SV40、多面體病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等來源的物質(zhì)。還有，為了使在宿主細胞系中的基因拷貝數(shù)擴增，表達載體可以含有磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇性標記。
為了制造在本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的生產(chǎn)系統(tǒng)。用于抗體制造的生產(chǎn)系統(tǒng)有體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)生產(chǎn)系統(tǒng)。作為體外的生產(chǎn)系統(tǒng)，可以使用真核細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)或使用原核細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。
使用真核細胞時，可用動物細胞、植物細胞或真菌細胞作為生產(chǎn)系統(tǒng)。作為動物細胞已知有(1)哺乳類細胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等，(2)兩棲類細胞，例如非洲爪蟾卵母細胞或(3)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作為植物細胞已知有來自煙草(Nicotiana tabacum)來源的細胞，可以將其カルス培養(yǎng)。作為真菌細胞，酵母，已知啤酒酵母(Saccharomyces)屬，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、絲狀菌，例如曲霉(Aspergillus)屬、例如黑曲霉(Aspergillusniger)等。
使用原核細胞時，有細菌細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)。作為細菌細胞，已知有大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
將目的的抗體基因通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到這些細胞中，通過在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞得到抗體。按照公知的方法進行培養(yǎng)。例如可以用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為培養(yǎng)液，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加液。還有，也可以通過將導(dǎo)入抗體基因的細胞轉(zhuǎn)移到動物的腹腔中，在體內(nèi)生產(chǎn)抗體。
一方面，作為體內(nèi)生產(chǎn)系統(tǒng)，例如使用動物細胞的生產(chǎn)系統(tǒng)或使用植物的生產(chǎn)系統(tǒng)。使用動物時，可使用哺乳類動物、昆蟲的生產(chǎn)系統(tǒng)等。
作為哺乳類動物，可以使用山羊、豬、羊、小鼠、牛等(VickiGlaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。還有，作為昆蟲，可以使用蠶。使用植物時，例如可以使用煙草。
將抗體基因?qū)氲竭@些動物或植物中，使之在動物或植物的體內(nèi)產(chǎn)生抗體，回收。例如將抗體基因插入到編碼如山羊β酪蛋白這種在乳汁中固有性產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中，作為融合基因進行制備。將含有插入的抗體基因的融合基因DNA片斷注入到山羊的胚中，將該胚導(dǎo)入到雌性山羊體內(nèi)。從接受胚的山羊生出的轉(zhuǎn)基因山羊或其后代所產(chǎn)生的乳汁得到目的的抗體。為了增加轉(zhuǎn)基因山羊所產(chǎn)生的含抗體的乳汁量，也可以對轉(zhuǎn)基因山羊使用適當?shù)募に?Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
此外，使用蠶時，將插入目的的抗體基因的核型多角體病毒來感染蠶，從該蠶的體液中得到希望的抗體(Maeda，S.等人，Nature(1985)315，592-594)。還有，使用煙草時，將目的的抗體基因插入到用于植物表達的載體如pMON 530中，將該載體導(dǎo)入如Agrobacteriumtumefaciens的農(nóng)桿菌中。用該農(nóng)桿菌感染煙草，如Nicotianatabacum，從該煙草的葉子得到希望的抗體(Julian，K.-C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
在如上所述的體外或體內(nèi)的生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)抗體時，也可以將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別重組到表達載體中，使之同時轉(zhuǎn)化到宿主中，或?qū)⒕幋aH鏈和L鏈的DNA重組到單獨的表達載體中，使之轉(zhuǎn)化到宿主中(參見國際專利申請公開號WO 94/11523)。
在本發(fā)明中使用的抗體，只要適合本發(fā)明，也可以是抗體的片斷或其修飾物。例如作為抗體片斷，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv或H鏈和L鏈的Fv用適當?shù)倪B接鏈(linker)連接的單鏈Fv(scFv)。
具體而言，將抗體用酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理產(chǎn)生抗體片斷，或構(gòu)建編碼這些抗體片斷的基因，將其導(dǎo)入的到表達載體后，在適當?shù)乃拗髦斜磉_(參見例如Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Pluekthun，A.&Skerra，A.Methods inEnzymology (1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods inenzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-66、Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
可以通過連接抗體的H鏈的V區(qū)域和L鏈的V區(qū)域得到scFv。在該scFv中，H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域的連接鏈優(yōu)選通過連接肽鏈連接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中的H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域可以使用任何來源的上述記載的抗體。作為V區(qū)域的連接肽，例如用有12-19個氨基酸殘基組成的任意的單鏈肽。
以編碼上述抗體的H鏈、或H鏈V區(qū)域的DNA以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)域的DNA為模板，用特定的兩端的引物對通過PCR法擴增這些序列中編碼希望的氨基酸序列的DNA部分，然后，組合特定的能將編碼連接肽部分的DNA和其兩端的H鏈、L鏈連接的引物對，通過擴增得到編碼scFv的DNA。
還有，一旦制備編碼scFv的DNA，可以按照常規(guī)方法制備含有該DNA的表達載體以及轉(zhuǎn)化該表達載體的宿主，按照常規(guī)方法用該宿主得到scFv。
可以用和上述同樣的方法得到這些抗體片斷的基因，并使之表達，在宿主中生產(chǎn)。本發(fā)明中所說的“抗體”包括這些抗體的片斷。
作為抗體的修飾物，可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。本發(fā)明中所說的“抗體”中包括這些抗體修飾物?？梢詫Φ玫降目贵w實施化學性修飾，由此得到這種抗體修飾物。這些方法是在該領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)建立的方法。
可以從細胞內(nèi)外、宿主中分離直至純化到均勻為止上述產(chǎn)生、表達的抗體。本發(fā)明中所用的抗體的分離、純化可以用親和層析。在親和層析中所用的柱，例如蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱所用的載體，例如HyperD、POROS、Sepharose F.F.等。此外，也可使用常規(guī)蛋白質(zhì)中使用的分離、純化方法，沒有任何限定。
例如也可以適當選擇、組合上述親和層析以外的層析、過濾、超濾、鹽析、透析等，分離、純化本發(fā)明中所使用的抗體。作為層析，例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾等。這些層析還適用HPLC(High performance liquid chromatography)。此外還可以使用逆相HPLC(reverse phase HPLC)。
可以通過吸光度的測定或ELISA等對上述得到的抗體的濃度進行測定。即，用吸光度進行測定時，用PBS(-)適當稀釋后，測定280nm的吸光度，按照1mg/ml為1.35OD進行計算。用ELISA時，可如下測定。即，將以0.1M重碳酸緩沖液(pH9.6)稀釋到1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制造)按照100μl加入96孔板(Nunc制造)中，4℃溫育1夜，固定抗體。封閉后，添加100μl適當稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含抗體樣本或標準品的人IgG(CAPPEL制造)，室溫溫育1小時。
洗滌后，加入5000倍稀釋后的堿性磷酸酶標記的抗人IgG(BIOSOURCE制造)100μl，在室溫溫育1小時。洗滌后，添加基質(zhì)溶液溫育后，用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制造)測定405nm處的吸光度，計算目的的抗體的濃度。
在本發(fā)明中使用的IL-6突變體是具有和IL-6受體的結(jié)合活性，并且不能傳遞IL-6的生物學活性的物質(zhì)。即，IL-6突變體和IL-6競爭性地結(jié)合IL-6受體，因為不傳遞IL-6的生物學活性，所以阻斷了IL-6造成的信號傳遞。
通過置換IL-6的氨基酸序列中的氨基酸殘基，導(dǎo)入變異，制備IL-6突變體。不考慮作為IL-6突變體的最初的IL-6的來源，如果考慮到抗原性等，優(yōu)選人IL-6。
具體而言，IL-6的突變體是用公知的分子建模程序例如WHATIF(Vriend等人，J.Mol.Graphices(1990)8，52-56)對IL-6氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，然后評價所置換氨基酸對整體產(chǎn)生的影響，確定適當?shù)闹脫Q氨基酸殘基后，以含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體為模板，由常規(guī)的PCR法導(dǎo)入可實現(xiàn)氨基酸的置換的突變，得到編碼IL-6突變體的基因。根據(jù)需要，將其重組到適當?shù)谋磉_載體中，按照上述重組抗體的表達、生產(chǎn)以及純化方法，得到IL-6突變體。
IL-6突變體的具體例已經(jīng)公布于Brakenhoff等人，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、以及Savino等人，EMBOJ.(1994)13，1357-1367、WO 96/18648、WO 96/17869。
在本發(fā)明中使用的IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是分別具有和IL-6受體或IL-6的結(jié)合活性，并且不傳遞IL-6的生物學活性的物質(zhì)。即，IL-6部分肽或IL-6受體部分肽可以結(jié)合IL-6受體或IL-6，通過捕捉這些物質(zhì)特異性地阻礙IL-6向IL-6受體的結(jié)合。其結(jié)果，因為不傳遞IL-6的生物學活性，阻斷了IL-6的信號傳遞。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，是由IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中的IL-6和IL-6受體結(jié)合區(qū)域的一部分或全部氨基酸序列所組成的肽。這種肽通常由10～80、優(yōu)選20～50、更優(yōu)選30～40個氨基酸殘基所組成。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽特定在IL-6或IL-6受體氨基酸序列上的IL-6和IL-6受體結(jié)合的區(qū)域，按照通常所知的方法例如基因工程學方法或肽合成法制備該區(qū)域的部分或全部氨基酸序列。
在用基因工程方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以將編碼所望的肽的DNA序列重組到表達載體中，按照表達、生產(chǎn)、純化上述重組抗體的的方法得到。
在用肽合成方法制造IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以在肽合成中，用例如固相合成法或液相合成法。
具體而言，可以按照“續(xù)藥品開發(fā)”第14卷肽合成、監(jiān)修矢島治明，廣川書店1991年記載的方法進行。作為固相合成法，例如在有機溶劑不溶性載體上結(jié)合希望合成的肽的C末端所對應(yīng)的氨基酸，將用適當?shù)谋Ｗo基團保護α-氨基酸基團以及側(cè)鏈官能基團的氨基酸按照從C末端到N末端的方向依次和每一個基酸進行縮合反應(yīng)，該反應(yīng)和使在樹脂上結(jié)合的氨基酸或肽的α-氨基酸基團的該保護基團脫離的反應(yīng)交替反復(fù)進行，使肽鏈延長。固相肽合成法所用的保護基團的種類在Boc法和Fmoc法中有很大不同。
這樣合成目的的肽后，進行脫保護反應(yīng)以及肽鏈從載體上的切斷反應(yīng)。在與肽鏈的切斷反應(yīng)中，通?？梢允褂肂oc法中氟化氫或三氟甲磺酸或Fmoc法中的TFA。在Boc法中，例如在氟化氫中，在甲氧基苯存在的情況下處理上述保護肽樹脂。然后，回收脫去保護基團的并從載體上的切斷的肽。通過將其凍干，得到粗品肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中，用和上述同樣的操作進行脫保護反應(yīng)以及肽鏈與載體的切斷反應(yīng)。
所得到的粗品肽可以通過HPLC進行分離、純化?？梢栽谙疵摃r，使用蛋白質(zhì)純化中通常使用的水-乙腈類溶劑，在最適條件下進行該操作。分別收取相應(yīng)的得到的層析流出峰對應(yīng)的組分，將其凍干。通過質(zhì)譜分析對這樣得到純化的肽組分進行分子量解析、氨基酸組成分析或氨基酸序列分析等。
IL-6部分肽和IL-6受體部分肽的具體例子已經(jīng)公布于特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098以及美國專利公報US5210075。
可以用通常采用的方法評價在本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑的IL-6信號傳導(dǎo)阻斷活性。具體而言，培養(yǎng)IL-6依賴性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)、人T細胞淋巴瘤細胞株KT3或IL-6依賴性細胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6，同時使之與IL-6拮抗劑共存，由此測定IL-6依賴性細胞對3H-胸腺嘧啶的攝取。還有，培養(yǎng)IL-6受體表達細胞U266，添加125I標記的IL-6，同時添加IL-6拮抗劑，由此測定IL-6受體表達細胞上結(jié)合的125I標記IL-6。在上述的分析體系中，在存在IL-6拮抗劑的組中加入不含IL-6拮抗劑的陰性對照組，比較二者得到的結(jié)果，評價IL-6拮抗劑的IL-6阻斷活性。
如后述的實施例所示，通過給予抗IL-6受體抗體，在脊髓損傷患者中確認了治療效果。在本發(fā)明中的治療對象是哺乳動物。治療對象的哺乳動物優(yōu)選是人。
本發(fā)明的脊髓損傷治療劑，可以經(jīng)口或非經(jīng)口、全身或局部給藥。例如可以選擇點滴等靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、栓、腸內(nèi)注射、經(jīng)口性腸溶劑等?？梢愿鶕?jù)患者的年齡、癥狀來選擇適當?shù)慕o藥方法。
每一次對應(yīng)于每1kg體重，從0.01mg～100mg的范圍內(nèi)選擇有效給藥量。或每個患者1～1000mg，優(yōu)選5～50mg的給藥量。優(yōu)選的給藥量、給藥方法，例如用抗IL-6受體抗體時，血中完全存在抗體的程度的量為有效給藥量，作為具體例，每1kg體重1個月(4周)從0.5mg～40mg，優(yōu)選將1mg～20mg分為1次～數(shù)次給藥。例如按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等給藥方案，用靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法作為給藥方法。給藥方案可以邊觀察病情以及觀察血液檢查值的動向，邊將給藥間隔從2次/周或1次/周延長到1次/2周、1次/3周、1次/4周等加以調(diào)整。
本發(fā)明的脊髓損傷治療劑，按照給藥途徑可含有醫(yī)藥上許可的載體或添加物。作為這種載體和添加物的例子，可列舉水、藥物可容許的有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯共聚物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性糊精、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、雙甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫(yī)藥添加物所允許的表面活性劑等。所使用的添加物，相應(yīng)于劑型，可以從上述中適當選擇或組合。添加物不限定于這些物質(zhì)。
實施例下面用實施例和參考例對本發(fā)明進行具體說明，本發(fā)明不限于這些。
實施例1材料和方法動物所有實驗組中都使用成體(18～22g)雌性C57BL/6J小鼠。
脊髓損傷用氯胺酮(100mg/kg)和二甲代苯胺(キシラジン)(10mg/kg)通過腹腔內(nèi)注射，麻醉雌性小鼠。剃除背部的毛，切開20mm的中線皮膚，然后露出脊柱。使背面肌肉向側(cè)面分離，將脊柱胸部區(qū)域露出后，露出T7-T13椎骨的棘突起。在第9胸椎水平切除錐弓，注意不損傷硬膜，同時使脊索露出。在T7和T11棘突起以及韌帶上用鉗子和夾子固定脊柱，然后使沉在底座上的身體挺起來后，用NYU Impactor造成脊髓損傷(SCI)。將3g的重量(直徑1.2mm的端部)從25mm的高度落向T9水平的脊髓。層狀閉合肌肉和切開部分，并且將動物放在溫度調(diào)節(jié)室內(nèi)直至使動物再次建立熱調(diào)節(jié)。由手動膀胱壓出使之排尿直至建立自然排尿為止，每天進行2次。
實驗計劃和大鼠抗小鼠IL-6受體mAb(MR16-1)的注入損傷后，按照每1kg體重100μg的MR16-1劑量進行單次腹腔內(nèi)注入(MR16-1組，n＝15)，對照組腹腔內(nèi)注入等量的大鼠Ig-G(對照組，n＝15)。從為了標記分裂細胞而進行BrdU(50mg/kg體重)腹腔內(nèi)注入手術(shù)之日起進行2周關(guān)于兩組的組織學以及免疫學的分析。
運動功能評價本發(fā)明人用3種不同的實驗，對受到損傷后的運動功能的恢復(fù)性進行評價。功能評價持續(xù)到損傷后的第6周。
下肢運動功能評價為了評價SCI的功能效果，本發(fā)明人用通常廣泛使用的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)分值進行了運動功能評價。3個不同的檢查員經(jīng)過4分鐘對每個動物進行雙盲評價，對于每個動物的下肢功能給予確定的評分(0～21)。所有實驗記錄到錄像帶上。
SCANETSCANET是由配備有紅外線傳感裝置的籠子組成的自動動物移動分析系統(tǒng)，用該系統(tǒng)監(jiān)視小的(M1)和大的(M2)水平移動和垂直移動(RG)，即起立的次數(shù)，對一定時間內(nèi)動物自發(fā)進行的運動量進行定量。特別是據(jù)說RG評分和BBB尺度評分間存在統(tǒng)計學的正的相關(guān)關(guān)系。
轉(zhuǎn)棒儀旋轉(zhuǎn)(Rota rod tredmill)將小鼠置于有塑料棒組成的旋轉(zhuǎn)棒裝置上，通過強制步行對四肢協(xié)調(diào)運動進行評價。在5、10以及15rpm的速度的旋轉(zhuǎn)棒上放置小鼠，在120秒內(nèi)監(jiān)視直至落下的潛伏時間。分別從平均值和最大值對協(xié)調(diào)運動功能進行評價。
免疫組織化學為了組織學的研究，通過吸入二乙醚麻醉小鼠，經(jīng)心臟循環(huán)流動4％的仲甲醛，固定。摘出脊髓，在室溫下，用4％的仲甲醛進行固定數(shù)小時。將組織樣本在10％蔗糖中于4℃下浸泡24小時，置于30％的蔗糖中48小時，在OTC復(fù)合物中進行包埋。將包埋組織在液氮中冷凍，在-80℃下保存。冷凍切片在切片機按照縱向切斷、橫向切斷制成20微米的厚度，用HE染色或免疫熒光進行雙重染色。
在免疫熒光雙重標記實驗中，將脊髓切片在0.01M的PBS(pH7.4)中、0.03％Triton X-100以及10％正常山羊血清封閉30分鐘。用兔抗-GFAP抗體、大鼠抗-Brd-U抗體以及人抗Hu抗體(作為神經(jīng)元標記物)作為一抗，在4℃溫育一晚。使用FITC-conjugated的兔IgG抗體以及Texas Red-conjugated大鼠抗體作為二抗進行雙重染色。洗滌載片，浸潤-固定，在熒光顯微鏡下分析。
Western blot分析自造成損傷12小時后(每組n＝4)，切除8mm的脊髓片斷(從外傷中心開始，向吻側(cè)4mm，向尾側(cè)4mm)，在含有蛋白酶抑制劑的MAPK溶菌緩沖液中均化，并且用超聲波處理后，在15000rpm下離心分離，用SDS-PAGE分離每個樣本上清液的蛋白質(zhì)，然后通過電泳印記到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在含有5％脫脂奶粉、150mM的NaCl以及0.05％Tween 20(pH7.5)的TBST緩沖液中在室溫下封端(blocking)1小時后，用多克隆兔抗stat3抗體或兔抗磷酸化stat3抗體或兔抗IL-6Rα抗體中的任何一個抗體作為一抗，然后用HRP-conjugated抗兔IgG抗體作為二抗，共同溫育。通過自動成像儀，制成像片，用α-imager定量。
結(jié)果
(1)下肢運動功能評價給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的15只小鼠和未給予上述抗體的脊髓損傷的15只小鼠(對照)相比，在圖1中以圖表示BBB分值的平均值?？梢源_定脊髓損傷后，給予MR16抗體的小鼠組在7天后運動的恢復(fù)良好，在5周以及6周時具有有意義的差。
(2)SCANET對于給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的15只小鼠和未給予上述抗體的脊髓損傷的15只小鼠(對照)，水平運動和起立的次數(shù)的比較結(jié)果是水平運動沒有有意義的差，在給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的15只小鼠中有12只有起立運動，另一方面，在未給予抗體的脊髓損傷的15只小鼠(對照)中只有3只。該差在Fisher’s exact probability test中p＜0.05，是有意義的。
(3)轉(zhuǎn)棒儀旋轉(zhuǎn)對于給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的15只小鼠和未給予上述抗體的脊髓損傷的15只小鼠(對照)，用上述方法進行實驗時，在棒的旋轉(zhuǎn)數(shù)為10rpm(每1分鐘旋轉(zhuǎn)數(shù)為10轉(zhuǎn))和15rpm時未看到有意義的差，在5rpm時，如圖2所示，脊髓損傷后35天以后，給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的小鼠的恢復(fù)和未給予上述抗體的脊髓損傷的小鼠(對照)相比，有意義地(p＜0.05)高。
(4)免疫組織化學觀察即使在成體脊髓內(nèi)存在內(nèi)源性的神經(jīng)干細胞，也不會產(chǎn)生該細胞分化所形成的骨髓修復(fù)。認為其理由是在損傷脊髓內(nèi)，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞分化成膠質(zhì)細胞，進一步分化成星形膠質(zhì)細胞，所以不能向神經(jīng)元類細胞分化。通過上述的方法，對于給予抗IL-6受體抗體(MR16)的脊髓損傷的4只小鼠的損傷部分的脊髓和未給予上述抗體(MR16)的脊髓損傷的4只小鼠(對照)的損傷部分的脊髓，用抗GFAP抗體和抗BrDU抗體通過免疫熒光法計算反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞的形成，如圖3所示，通過給予上述抗體，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞的形成有意義地(p＜0.01)減少了。
(5)Western blot分析對于脊髓損傷的4只小鼠和脊髓損傷的4只小鼠(對照)在脊髓損傷后第12小時，通過Western blot法調(diào)查IL-6受體的表達。結(jié)果如圖4所示。只有在脊髓損傷的小鼠中，確定IL-6受體的表達。還有，如圖5所示，通過給予MR16抑制了磷酸化STAT3的量，顯示出腹腔內(nèi)給予的MR16在脊髓發(fā)揮了作用。
綜上所述，可以確認IL-6受體的拮抗劑能促進脊髓損傷的修復(fù)。
參考例1.人可溶性IL-6受體的制備用按照Yamasaki等人的方法(Yamasaki，K.等人，Science(1988)241，825-828)得到的含有編碼IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pBSF2R.236，通過PCR法制備可溶性IL-6受體。用限制性酶SphI消化質(zhì)粒pBSF2R.236，得到IL-6受體cDNA，將其插入到mp18(Amersham制造)。為了向IL-6受體cDNA中導(dǎo)入終止密碼子，用設(shè)計合成的寡聚引物，通過突變引入系統(tǒng)(Amersham制造)用PCR向IL-6受體cDNA中導(dǎo)入突變。通過該操作在氨基酸345的位置上導(dǎo)入終止密碼子，得到編碼可溶性IL-6受體的cDNA。
為了在CHO細胞中表達可溶性IL-6受體cDNA，使之和質(zhì)粒pSV(Pharmacia制造)連接，得到質(zhì)粒pSVL344。向含有dfhr的cDNA的質(zhì)粒pECEdhfr中插入用Hind III-Sal I切斷的可溶性IL-6受體cDNA，得到CHO細胞表達質(zhì)粒pECEdhfr344。
將10μg質(zhì)粒pECEdhfr344通過磷酸鈣沉淀法(Chen，C.等人，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)轉(zhuǎn)染到dhfr-CHO細胞mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)使細胞株DXB-11(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的CHO細胞在含有1mM谷胺酰氨、10％透析FCS、100U/ml的青霉素和100μg/ml鏈霉素的不含核苷的αMEM的選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)3周。
用極限稀釋法篩選選擇的CHO細胞，得到單一的CHO細胞克隆。在甲基蝶呤濃度20nM～200nM的條件下擴增該CHO細胞克隆，得到人可溶性IL-6受體產(chǎn)生CHO細胞株5E27。將CHO細胞株5E27在含有FBS的イシコ一ブ改性ダルベコ培養(yǎng)液(IMDM，Gibco制造)中進行培養(yǎng)?；厥张囵B(yǎng)上清，用ELISA測定培養(yǎng)上清中的可溶性IL-6受體的濃度。其結(jié)果，確認在培養(yǎng)上清中存在可溶性IL-6受體。
參考例2.抗人IL-6抗體的制備用10μg的重組型IL-6(Hirano，T.等人，Immunol.Lett.(1988)17，41)和完全弗氏佐劑一起，免疫BALB/c小鼠，直到能在血清中檢測到抗IL-6抗體為止，持續(xù)每周進行一次免疫。從局部淋巴節(jié)摘出免疫細胞，用聚乙二醇1500使之和骨髓瘤細胞株P(guān)3U1融合。用HAT培養(yǎng)液按照Oi等人的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.freeman and Co.San Francisco，351，1980)選擇雜交瘤，建立產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤。
產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤按照下述方法進行IL-6結(jié)合分析。即，向柔軟的聚乙烯制成的96孔微孔板(Dynatech Laboratories公司制造，Alexandria，VA)加入100μl的在0.1M的carbonate-hydrogencarbonate緩沖液(pH9.6)中的山羊抗小鼠Ig(10μl/ml，CooperBiomedical公司制造，Malvern，PA)，4℃包被一晚。然后用100μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室溫下處理平板2小時。
將其用PBS洗滌后，每孔中加入100μl雜交瘤培養(yǎng)上清，在4℃溫育1晚。洗滌平板，向各孔中添加125I標記的重組IL-6，使之達到2000cpm/0.5ng/well。洗滌后，用γ計數(shù)器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)測定各孔的放射活性。通過IL-6結(jié)合分析確定在216個雜交瘤克隆中有32個雜交瘤克隆是陽性的。在這些克隆中，最后得到了穩(wěn)定的MH166.BSF2。該雜交瘤產(chǎn)生的抗IL-6抗體MH166具有IgG1κ的亞型。
然后，用IL-6依賴性的小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2，對MH166抗體造成的和雜交瘤的增殖相關(guān)的中和活性進行調(diào)查。按照1×104/200μl/孔分別注入MH60.BSF2細胞，向其中加入含MH166抗體的樣本，培養(yǎng)48小時，添加0.5μCi/孔的3H-胸腺嘧啶(New EnglandNuclear，Boston，MA)后，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時。將細胞置于感光膠片上，用自動曝光(Labo Mash Sciene Co.Tokyo，Japan)處理，用兔抗IL-6抗體作為對照。
其結(jié)果，MH166抗體以劑量性依賴地阻斷了IL-6所誘導(dǎo)的MH60.BSF2細胞的3H-胸腺嘧啶的攝取。由此，證明MH166抗體能夠中和IL-6的活性。
參考例3.抗人IL-6受體抗體的制備將按照Hirata等人的方法(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)制成的抗IL-6受體抗體MT18和CNBr活化的瓊脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制造)按照添加配方使之結(jié)合，純化IL-6受體(Yamasaki，K.等人，Science(1988)241，825-828)。用1％毛地黃皂苷(ジギトニン)(Wako Chemicals制造)溶化人骨髓瘤細胞株U266，用含有1mMp-パラアミノフエニルメタンスルフオニルオライドハイドロクロリド(Wako Chemicals制)(毛地黃皂苷緩沖液)溶化10mM三乙醇胺(pH7.8)以及0.15M NaCl。使之與和瓊脂糖4B珠結(jié)合的MT18抗體混合，之后，用毛地黃皂苷緩沖液洗滌珠6次，作為用于免疫的部分純化的IL-6受體。
用從3×109個的U266細胞中得到的上述部分純化的IL-6受體每隔10天免疫BALB/c小鼠，共4次，然后按照常規(guī)方法制成雜交瘤。按照下述的方法對成長陽性孔中的雜交瘤培養(yǎng)上清和IL-6受體的結(jié)合活性進行調(diào)查。用35S甲硫氨酸(2.5mCi)標記5×107個的U266細胞，用上述毛地黃皂苷緩沖液溶化。將溶化的U266細胞和與0.04ml容量的瓊脂糖4B珠結(jié)合的MT18抗體混合，然后，用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次，用0.25ml的毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)洗脫35S甲硫氨酸標記的IL-6受體，用0.025ml的1M Tris(pH7.4)中和。
將0.05ml的雜交瘤培養(yǎng)上清和0.01ml的Protein G 瓊脂糖(Pharmacia制造)混合。洗滌后，和用瓊脂糖制備的0.005ml的35S標記的IL-6受體溶液一起溫育。用SDS-PAGE分析免疫沉淀物質(zhì)，對和IL-6受體反應(yīng)的雜交瘤上清進行調(diào)查。其結(jié)果，建立反應(yīng)陽性的雜交瘤PM-1(FERM BP-2998)。由雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體為IgG1κ亞型。
用人骨髓瘤細胞株U266調(diào)查雜交瘤PM-1產(chǎn)生抗體的對人IL-6受體的IL-6的結(jié)合阻斷活性。用大腸桿菌制備人重組型IL-6(Hirano，T.等人，Immunol.Lett.(1988)17，41-45)、用ボルトン一ハンタ一試劑(New England Nuclear，Boston，MA)進行125I標記(Taga，T.等人，J.Exp.Med.(1987)166，967-981)。
將4×105個的U266細胞和70％(v/v)雜交瘤PM-1的培養(yǎng)上清以及14000cpm的125I標記的IL-6一起培養(yǎng)1小時。將70μl的樣本置于400μl的マイクロフュ一ジ聚乙烯管的300μl的FCS上、離心后測定細胞上的放射活性。
其結(jié)果，明確了雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體阻斷了IL-6的IL-6受體的結(jié)合。
參考例4.抗小鼠IL-6受體抗體的制備按照Saito，T.等人，J.Immunol.(1991)147，168-173所記載的方法制備針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
將產(chǎn)生小鼠可溶性IL-6受體的CHO細胞在含10％FCS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，從該上清中用固定在Affigel 10凝膠(Biorad制造)上的抗小鼠IL-6受體抗體RS12(參見上述Saito，T.等人)的親和柱，純化小鼠可溶性IL-6受體。
將50μg得到的小鼠可溶性IL-6受體和弗氏完全佐劑混合，注入到Winstar大鼠的腹部中，2周后用弗氏不完全佐劑追加免疫。在第45天摘取大鼠的脾臟細胞，將2×108個細胞和1×107個的小鼠骨髓瘤細胞P3U1、50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制造)按照常規(guī)方法使細胞融合，在HTA培養(yǎng)基中篩選雜交瘤。
向包被了兔抗大鼠IgG抗體(Cappel制造)的平板上添加雜交瘤培養(yǎng)上清后，使之和小鼠可溶性IL-6受體反應(yīng)。然后，用兔抗大鼠IL-6受體抗體和堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG通過ELISA法篩選產(chǎn)生針對可溶性IL-6受體的抗體的雜交瘤。對確認的產(chǎn)生抗體的雜交瘤進行2次亞克隆，得到單一的雜交瘤，將此克隆命名為MR16-1。
用MH60.BSF2細胞(Matsuda，T等人，J.Immunol.(1988)18，951-956)的3H-胸腺嘧啶攝取調(diào)查該雜交瘤產(chǎn)生的抗體的在小鼠IL-6信號傳遞中的中和活性。向96孔板中按照1×104個/200μl/孔加入MH60.BSF2細胞。向該平板中加入10pg/ml的小鼠IL-6和12.3～1000ng/ml的MR16-1抗體或RS12抗體，在37℃，5％CO2中培養(yǎng)44小時后，按照1μCi/孔加入3H-胸腺嘧啶。4小時后，測定3H-胸腺嘧啶的攝取。其結(jié)果MR16-1抗體抑制了MH60.BSF2細胞的3H-胸腺嘧啶攝取。
所以，確認了雜交瘤MR16-1(FERM BP-5875)產(chǎn)生的抗體阻斷了IL-6的IL-6受體的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種脊髓損傷治療劑，含有以白介素6(IL-6)拮抗劑為有效成分而構(gòu)成。
2.權(quán)利要求1記載的脊髓損傷治療劑，其中上述的IL-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
3.權(quán)利要求2記載的脊髓損傷治療劑，其中上述抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求2或3記載的脊髓損傷治療劑，其中上述抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
5.權(quán)利要求2或3記載的脊髓損傷治療劑，其中上述抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
6.權(quán)利要求1～4任何一項記載的脊髓損傷治療劑，其中上述抗體是重組型抗體。
7.權(quán)利要求1～6任何一項記載的脊髓損傷治療劑，其中上述針對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
8.權(quán)利要求5中記載的脊髓損傷治療劑，其中上述針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
9.權(quán)利要求1～8任何一項記載的脊髓損傷治療劑，其中上述抗體是針對IL-6受體的嵌和抗體、人源化抗體或人抗體。
10.權(quán)利要求9中記載的脊髓損傷治療劑，其中上述人源化抗體是人源化PM-1抗體。
11.一種神經(jīng)干細胞的分化調(diào)節(jié)劑，含有以白介素6(IL-6)拮抗劑為有效成分而構(gòu)成。
12.一種向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的分化抑制劑，含有以白介素6(IL-6)拮抗劑為有效成分而構(gòu)成。
13.一種白介素6(IL-6)拮抗劑在制造脊髓損傷治療劑中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求13記載的應(yīng)用，上述IL-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
15.權(quán)利要求14記載的應(yīng)用，上述抗體是單克隆抗體。
16.權(quán)利要求13或14所記載的應(yīng)用，上述抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
17.權(quán)利要求14或15所記載的應(yīng)用，上述抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
18.權(quán)利要求13～16任何一項記載的應(yīng)用，其中上述抗體是重組型抗體。
19.權(quán)利要求13～18任何一項記載的應(yīng)用，其中針對上述IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
20.權(quán)利要求17記載的應(yīng)用，其中針對上述小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
21.權(quán)利要求13～20任何一項記載的應(yīng)用，其中上述抗體是針對IL-6受體的嵌和抗體、人源化抗體或人抗體。
22.權(quán)利要求21中記載的應(yīng)用，其中上述人源化抗體是人源化PM-1抗體。
23.一種白介素6(IL-6)拮抗劑在制造神經(jīng)干細胞的分化調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
24.一種白介素6(IL-6)拮抗劑在制造向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的分化抑制劑中的應(yīng)用。
25.一種脊髓損傷治療方法，包括向?qū)ο蠼o以白介素6(IL-6)拮抗劑。
26.權(quán)利要求25記載的方法，上述IL-6拮抗劑是針對IL-6受體的抗體。
27.權(quán)利要求26記載的方法，上述抗體是單克隆抗體。
28.權(quán)利要求26或27所記載的方法，上述抗體是針對人IL-6受體的單克隆抗體。
29.權(quán)利要求26或27所記載的方法，上述抗體是針對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
30.權(quán)利要求25～28任何一項記載的方法，其中上述抗體是重組型抗體。
31.權(quán)利要求25～30任何一項記載的方法，其中針對上述IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
32.權(quán)利要求29記載的方法，其中針對上述小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
33.權(quán)利要求25～32任何一項記載的方法，其中上述抗體是針對IL-6受體的嵌和抗體、人源化抗體或人抗體。
34.權(quán)利要求33中記載的方法，其中上述人源化抗體是人源化PM-1抗體。
35.一種神經(jīng)干細胞的分化調(diào)節(jié)方法，包括向?qū)ο蠼o予白介素6(IL-6)拮抗劑。
36.一種向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的分化抑制方法，包括向?qū)ο蠼o予白介素6(IL-6)拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以白介素6拮抗劑為有效成分的脊髓損傷治療劑、神經(jīng)干細胞的分化調(diào)節(jié)劑和向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的分化抑制劑。
文檔編號A61K39/395GK1753694SQ20048000501
公開日2006年3月29日 申請日期2004年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月24日
發(fā)明者岡野榮之, 岡田誠司, 中村雅也, 吉崎和幸 申請人:中外制藥株式會社, 學校法人慶應(yīng)義塾