專利名稱：粘液瘤病毒在治療癌癥和慢性病毒感染中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及粘液瘤病毒在治療上的用途。
背景技術(shù)：
目前用于各種癌癥的治療方法經(jīng)常通過毒害或殺死癌細(xì)胞而起作用。不幸的是，對(duì)癌細(xì)胞具有毒性的治療方法一般對(duì)健康細(xì)胞也具有毒性。而且，有效治療癌癥的主要原因之一——腫瘤的異源性尚不清楚。目前的主流療法(如化學(xué)療法和放射療法)傾向于在狹窄的毒力治療范圍內(nèi)使用。由于腫瘤細(xì)胞各異和這些治療方法的應(yīng)用范圍有限，據(jù)認(rèn)為這些類型的治療方法并不是有力的工具。
目前正在開發(fā)的現(xiàn)代抗癌療法試圖選擇性地靶向腫瘤細(xì)胞，而對(duì)健康細(xì)胞具有更低毒性，據(jù)此更有可能使健康細(xì)胞不受到影響。
溶瘤療法旨在利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間的細(xì)胞差異而實(shí)現(xiàn)治療的一種方法。這種方法使用有復(fù)制能力、對(duì)腫瘤具有選擇性的病毒載體作為抗癌劑。溶瘤病毒要么特異地靶向癌細(xì)胞而進(jìn)行感染，要么與在健康細(xì)胞中復(fù)制相比，更適合在癌細(xì)胞中進(jìn)行有效復(fù)制。這些有復(fù)制能力的溶瘤病毒是天然存在的，或者是經(jīng)過基因工程改造而成為靶向異源腫瘤群的高選擇性和高效性的工具。由于具有復(fù)制選擇性的溶瘤病毒在正常細(xì)胞中不進(jìn)行有效復(fù)制，所以特別是相對(duì)于傳統(tǒng)療法如放射療法或化學(xué)療法，對(duì)患者的毒性小。
大量研究已報(bào)道了各種病毒株的溶瘤活性，最有前景的溶瘤病毒是天然存在的或經(jīng)基因修飾的腺病毒、單純皰疹病毒1(“HSV1”)、呼腸孤病毒、痘苗病毒、水泡性口炎病毒(“VSV”)或脊髓灰質(zhì)炎病毒。目前正在研究的作為抗癌劑的經(jīng)修飾的溶瘤病毒包括HSV(單純皰疹病毒)、腺病毒、新城疫病毒(“NDV”)、呼腸孤病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、VSV和脊髓灰質(zhì)炎病毒。各種溶瘤病毒處于臨床試驗(yàn)的第一或第二階段，其中一些病毒顯示出了穩(wěn)定的功效。但是，不知道哪些病毒最符合持續(xù)復(fù)制、具有特異性和強(qiáng)溶解活性的溶瘤目的。完全有效的溶瘤病毒候選載體應(yīng)該生命周期短、形成成熟病毒體快、能夠在細(xì)胞間進(jìn)行有效傳播，并且具有便于插入的較大的基因組。同時(shí)，有證據(jù)表明，抑制早期先天性免疫應(yīng)答和延緩Th1(輔助T細(xì)胞1)應(yīng)答的發(fā)展對(duì)溶瘤療法的效力至關(guān)重要。對(duì)于打算用于開發(fā)溶瘤病毒的許多病毒來說，從正常群體中所觀測到的高水平的抗體和T細(xì)胞應(yīng)答來測量，人類病毒顯然是具有高度免疫原性的。
臨床工作表明，目前的溶瘤病毒確實(shí)是安全的，但作為單一療法的療效還不足以具有完全的臨床效果。由于經(jīng)常觀察到腫瘤細(xì)胞沒有充分或有效受到感染，目前的動(dòng)向是通過對(duì)候選病毒進(jìn)行基因工程改造，以使其表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因，從而提高它們的效力。同時(shí)還正在結(jié)合其它常見的溶瘤療法對(duì)大部分以上提到的溶瘤病毒進(jìn)行測試。
腺病毒可以容易地進(jìn)行基因操作，并且具有眾所周知的與病毒蛋白相關(guān)的功能。另外，它與相當(dāng)輕微的疾病有關(guān)。ONYX-015人類腺病毒(Onyx制藥公司(Onyx Pharmaceuticals Inc.))是受試最廣泛的針對(duì)臨床應(yīng)用進(jìn)行了優(yōu)化的溶瘤病毒之一。據(jù)信它優(yōu)選在p53陰性腫瘤中復(fù)制，并且在頭頸癌癥患者的臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出潛力。但是，有報(bào)道表明，ONYX-015只在14％的治療患者中產(chǎn)生了客觀性臨床反應(yīng)(Nemunaitis J、Khuri F、Ganly I、Arseneau J、Posner M、Vokes E、Kuhn J、McCarty T、Landers S、Blackburn A、Romel L、Randlev B、Kaye S、Kirn D。臨床腫瘤學(xué)報(bào)(J.Clin.Oncol.)。2001年1月15日；19(2)289～298)。
WO96/03997和WO97/26904描述了可以抑制腫瘤細(xì)胞生長并對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞具有特異性的突變的溶瘤HSV。所述HSV的其它優(yōu)點(diǎn)是其可以輕而易舉地進(jìn)行基因修飾，而且存在可以關(guān)閉任何不需要的病毒復(fù)制的藥物。但是，這種共同的人類病原體的應(yīng)用有限，這是因?yàn)楹芸赡艽罅咳巳阂呀?jīng)接觸過該病毒，并獲得了針對(duì)該病毒的免疫應(yīng)答，這將削弱所述病毒的溶解效果。HSV還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用或潛在的致命疾病。
III型呼腸孤病毒與相對(duì)輕微的疾病有關(guān)，并且它的病毒基因功能也已了解得相當(dāng)清楚。溶瘤生物技術(shù)公司(Oncolytic Biotech)目前正在開發(fā)III型呼腸孤病毒由作為癌癥治療劑，該病毒在表達(dá)突變的ras癌基因的細(xì)胞中具有增強(qiáng)的復(fù)制特性，而且優(yōu)先在PKR-/-細(xì)胞中生長(Strong J.E.和P.W.Lee。病毒學(xué)報(bào)(J.Virology)，1996，70612～616)。但是，難以對(duì)呼腸孤病毒進(jìn)行基因操作，而且其病毒復(fù)制不易關(guān)閉。
VSV與相對(duì)輕微疾病有關(guān)，病毒基因功能也很清楚。WO99/04026披露了VSV在基因療法中作為載體的用途，以表達(dá)治療各種障礙的很多藥物。但是，VSV存在與呼腸孤病毒同樣的問題難以進(jìn)行基因操作，病毒復(fù)制不易關(guān)閉。
痘苗病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒是本領(lǐng)域描述的其它候選的溶瘤病毒，但與嚴(yán)重的或潛在致命疾病有關(guān)。
US4,806,347披露了干擾素γ和IFNγ片段對(duì)抗人類腫瘤細(xì)胞的用途。WO99/18799披露了在哺乳動(dòng)物中治療疾病的方法，在所述的哺乳動(dòng)物中，病細(xì)胞具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療上有效量的干擾素敏感的有復(fù)制能力的克隆病毒。其具體披露了在干擾素存在的情況下，VSV病毒顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性，但是VSV在正常細(xì)胞中的毒性降低。WO99/18799還披露，用干擾素處理腫瘤細(xì)胞，觀察到了NDV誘導(dǎo)的敏感性，而將干擾素加到正常細(xì)胞，會(huì)使這些細(xì)胞抗NDV。這種方法的目的是通過用干擾素敏感病毒來感染細(xì)胞，使該細(xì)胞對(duì)干擾素敏感。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)所述細(xì)胞施用有效量的粘液瘤病毒。
一方面，本發(fā)明提供治療一種疾病狀態(tài)的方法，該疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，所述方法包括對(duì)需要的患者施用有效量的粘液瘤病毒。
本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的粘液瘤病毒在抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的用途，以及在制備用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的藥物中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量粘液病毒在治療患者的疾病狀態(tài)中的用途，其中，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，以及在制備用于治療患者所述疾病狀態(tài)的藥物中的用途。
另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物含有粘液瘤病毒和藥學(xué)上可接受的載體，該藥物用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，和用于治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。
另一方面，本發(fā)明提供含有粘液瘤病毒和說明書的試劑盒，該試劑盒用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，或用于治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述疾病狀態(tài)包括癌癥和慢性病毒感染。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在患者中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)患者施用經(jīng)修飾以表達(dá)可檢測標(biāo)記的粘液瘤病毒；在患者中使所述病毒感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞；和在患者中檢測表達(dá)可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在樣品中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括培養(yǎng)細(xì)胞；將所培養(yǎng)的細(xì)胞與粘液瘤病毒接觸；和確定細(xì)胞受到對(duì)粘液瘤病毒感染的感染性。
本發(fā)明基于這樣的意外發(fā)現(xiàn)兔粘液瘤病毒能夠選擇性地感染包括人類腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷，并包括對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞。在該上下文中使用的術(shù)語“先天性”描述了非抗原特異性免疫應(yīng)答。由于粘液瘤病毒在人類正常細(xì)胞中不進(jìn)行有效復(fù)制，所以所述病毒可用作各種病癥和不適的治療藥物，例如，作為癌癥的溶瘤治療藥物，所述病癥和不適的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，包括對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞。所述病毒還可以用于鑒定具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，以及用于在體內(nèi)顯示這些細(xì)胞。
對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，通過閱讀以下對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方案的描述，并結(jié)合附圖，本發(fā)明的其它方面和特征將變得顯而易見。但應(yīng)理解，說明本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例只為闡明而提供，原因在于從這些詳細(xì)描述中，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。


闡明本發(fā)明的實(shí)施方案的附圖只是用于舉例，其中圖1是病毒感染細(xì)胞后誘導(dǎo)的干擾素介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的示意圖；圖2是非允許的WT鼠胚胎成纖維細(xì)胞(“MEFs”)在接觸粘液瘤病毒后的相差顯微照片，該照片顯示在用中和抗體抑制干擾素α/β后MEFs變得允許；圖3是顯示在粘液瘤病毒感染后STAT1和STAT2的磷酸化狀態(tài)(激活)的Western印跡，該Western印跡顯示MEF細(xì)胞的非允許感染與STAT1和STAT2的激活相關(guān)聯(lián)；圖4是顯示在粘液瘤病毒感染后STAT3、STAT4、STAT5和STAT6的磷酸化狀態(tài)(非激活)的Western印跡，該Western印跡顯示MEF細(xì)胞的非允許感染不會(huì)激活這些類型中的任何一種；圖5是在粘液瘤病毒感染后，IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs以及JAK1-/-MEFs和JAK2-/-MEFs的相差顯微照片，該照片顯示IFN/STAT/JAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的失活使得允許粘液瘤病毒對(duì)細(xì)胞的感染；圖6是顯示在粘液瘤病毒感染后在非允許野生型MEFs中PKR的磷酸化狀態(tài)的Western印跡，該Western印跡顯示PKR未被粘液瘤病毒感染激活；圖7是顯示PKR在模擬感染的或用粘液瘤病毒預(yù)感染的野生型MEFs中的磷酸化狀態(tài)的Western印跡，該Western印跡顯示粘液瘤病毒在MEF細(xì)胞中阻斷了PKR的激活；圖8是顯示在粘液瘤病毒感染后PERK在野生型MEFs中的磷酸化狀態(tài)的Western印跡，該Western印跡顯示粘液瘤病毒在MEF細(xì)胞中阻斷了PERK的激活；圖9是顯示在接觸粘液瘤病毒后PKR-/-、RNase L(核糖核酸酶L)-/-或Mx1-/-敲除的相差顯微照片，該照片顯示在MEF細(xì)胞中通過不同途徑介導(dǎo)抗病毒狀態(tài)；圖10是顯示在接觸粘液瘤病毒后PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-三重敲除的相差顯微照片；圖11是顯示用抗IFNα/β的中和抗體處理并接觸粘液瘤病毒后PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-三重敲除的相差顯微照片；圖12是顯示用抗IFNα/β的中和抗體處理并接觸粘液瘤病毒后，eIF2α和PKR在非允許MEFs中的磷酸化水平的Western印跡，該Western印跡顯示eIF2α在非允許細(xì)胞中的磷酸化由獨(dú)立于PKR的途徑進(jìn)行催化；圖13是顯示粘液瘤病毒感染后STAT1在PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-三重敲除中的磷酸化狀態(tài)的Western印跡，該Western印跡顯示正常的IFN誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答；圖14是闡明感染后(P.I.)12小時(shí)酪氨酸磷酸化的STAT1在非允許的PKR-/-、RNase L-/-或Mx1-/-細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的相差顯微照片，該圖像表明，正如對(duì)正常IFN/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答所進(jìn)行的預(yù)測那樣，STAT定位于細(xì)胞核；圖15是模擬感染的或用表達(dá)GFP的死粘液瘤病毒或活粘液瘤病毒感染的患有顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠大腦的熒光圖片，該圖片表明粘液瘤病毒靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；圖16是用表達(dá)GFP的粘液瘤病毒(MV GFP)感染的鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的薄切片的熒光圖像和照片，該圖像和照片顯示粘液瘤病毒只在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制；圖17是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的HT29人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示在人類細(xì)胞中非允許感染的一個(gè)例子；圖18是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的HOP92人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類細(xì)胞的允許感染的一個(gè)例子；
圖19是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的OVCAR4人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類細(xì)胞的允許感染的一個(gè)例子；圖20是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的SK-MEL3人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類細(xì)胞的允許感染的一個(gè)例子；圖21是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色的SK-MEL28人類腫瘤細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示人類腫瘤細(xì)胞的半允許感染的一個(gè)例子；圖22是粘液瘤病毒感染后，用X-Gal或結(jié)晶紫染色后的BGMK細(xì)胞的相差顯微照片，該照片顯示典型的作為對(duì)照的允許感染的一個(gè)例子；圖23是用濃度升高的表達(dá)LacZ蛋白的粘液瘤病毒感染后，用X-Gal染色的陽性對(duì)照BGMK細(xì)胞和人類腫瘤細(xì)胞系U87、A172和U373的相差顯微照片，該照片顯示這些人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)粘液瘤病毒復(fù)制都是允許的；圖24是描述用濃度升高的粘液瘤病毒感染后72小時(shí)，BGMK、U87、A172和U373細(xì)胞的存活率的圖示，該圖示證明了粘液瘤病毒殺死所有這些細(xì)胞的能力；圖25是用MV GFP感染的SF041 585星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的相差顯微照片和熒光顯微照片，該相差顯微照片和熒光顯微照片顯示了在原發(fā)性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的感染；圖26是用表達(dá)LacZ蛋白的粘液瘤病毒感染的U373神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)X-Gal染色的相差顯微照片，該相差顯微照片顯示了這些人類腫瘤細(xì)胞的感染；圖27是描述用MV GFP感染后48小時(shí)，SF04 1585細(xì)胞的存活率的圖示，該圖示顯示了對(duì)這些受感染的人類腫瘤細(xì)胞的殺死情況；圖28是用表達(dá)GFP的粘液瘤病毒感染的Daoy和D384髓母細(xì)胞瘤系的熒光顯微照片，該照片顯示了這些人類腫瘤細(xì)胞的感染。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通常感染兔的粘液瘤病毒能夠選擇地感染和殺死具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞(包括人類細(xì)胞)，例如，對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞。另一方面，粘液瘤病毒在人類正常細(xì)胞中不能進(jìn)行有效復(fù)制。因?yàn)橹T如癌癥等很多疾病或不適的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，包括對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞，所以粘液瘤病毒可以用于治療包括癌癥在內(nèi)的所述疾病和不適，并且對(duì)正常的健康細(xì)胞毒性低。粘液瘤病毒還可用于治療慢性感染的細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷。例如，很多病毒編碼基因產(chǎn)物，該產(chǎn)物的功能是抑制細(xì)胞的抗病毒性干擾素應(yīng)答。粘液瘤病毒可以選擇性地感染這些細(xì)胞。
粘液瘤病毒(“MV”)是在兔中引起粘液瘤病的病原體。MV屬于DNA病毒中最大的痘病毒科的野兔痘病毒(Leporipoxvirus)屬。MV在其天然宿主美洲棉尾兔中引起良性疾病。但是，它是烈性的且宿主特異性痘病毒，在歐洲兔中引起致命疾病，其特征是全身性病變，尤其是粘膜區(qū)域附近(Cameron C，Hota-Mitchell S、Chen L、Barrett J、Cao JX、Macaulay C、Willer D、Evans D、McFadden G，病毒學(xué)(Virology)，1999，264(2)298～318；Kerr P & McFadden G，病毒免疫學(xué)(ViralImmunology)，2002，15(2)229～246)。
MV病毒是一種具有163kb的雙鏈DNA基因組的大病毒，該基因組在受感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制(B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley編，病毒學(xué)，Lippincott Raven出版社，紐約，第二版，1996)。已知MV編碼許多與細(xì)胞有關(guān)的分泌蛋白，該蛋白參與宿主免疫和炎性反應(yīng)的下調(diào)以及對(duì)病毒感染細(xì)胞凋亡的抑制。MV可以被所有的人類體細(xì)胞吸收。但是，除了正常的兔體細(xì)胞外，如果所述細(xì)胞具有正常先天性抗病毒應(yīng)答，所述病毒就不能有效感染所述細(xì)胞，意味著所述病毒不能復(fù)制和導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
干擾素(“IFN”)是為應(yīng)答各種刺激而分泌的細(xì)胞因子家族。干擾素結(jié)合到細(xì)胞表面受體，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)導(dǎo)致眾多的細(xì)胞應(yīng)答，包括抗病毒應(yīng)答和生長抑制和/或凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)。干擾素分為I型或II型。I型干擾素包括α干擾素、β干擾素、τ干擾素和ω干擾素，所有的都是單體；II型IFN只有IFNγ一種，為二聚體。IFNα的12種不同亞型由14個(gè)基因產(chǎn)生，但所有其它的干擾素都是單基因性的(Arduini等，1999)。干擾素通過調(diào)節(jié)癌基因表達(dá)來發(fā)揮直接的抗腫瘤活性。生長刺激性癌基因的過表達(dá)或腫瘤抑制物癌基因的喪失會(huì)導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。p53、Rb、PC、NF1、WT1和DCC是涉及癌癥發(fā)生的一些基因。
粘液瘤病毒和其它溶瘤病毒如呼腸孤病毒和VSV一樣，都需要穿過正常健康細(xì)胞中所存在的抗病毒防護(hù)，才能在細(xì)胞中復(fù)制。MV和其它溶瘤病毒誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，一般對(duì)IFN途徑的抗病毒作用敏感。由IFN抗病毒應(yīng)答誘導(dǎo)的相關(guān)蛋白和主要影響病毒增殖的相關(guān)蛋白包括PKR、OAS合成酶和RNase L核酸酶。PKR激活eIF2α，導(dǎo)致抑制翻譯和誘導(dǎo)凋亡。在圖1中描述的是IFN應(yīng)答途徑的示意圖。在正常細(xì)胞中，MV受到PKR和eIF2α的直接影響。
抗病毒應(yīng)答途徑在癌細(xì)胞中經(jīng)常受到破壞。例如，對(duì)IFN應(yīng)答的減弱或無效是在轉(zhuǎn)化過程中或腫瘤發(fā)展中經(jīng)常出現(xiàn)的遺傳性缺陷。超過80％的腫瘤細(xì)胞系對(duì)干擾素不產(chǎn)生應(yīng)答或應(yīng)答受損(Stojdl等，癌細(xì)胞(Cancer Cell)，(2003)4263～275和其中所引用的參考文獻(xiàn)；Wong等，生物化學(xué)學(xué)報(bào)(J.Biol Chem)(1997)272(45)28779～28785；Sun等，血液(blood)，(1998)91(2)570～576；Main等，癌癥研究(CancerRes.)(2001)61(5)2261～2266；Balachandran等，癌細(xì)胞(2004)5(1)51～65)。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)MV能夠感染和殺死癌細(xì)胞，包括人類腫瘤細(xì)胞，并且不受到任何特定理論的限制，據(jù)信MV能夠感染這些細(xì)胞是因?yàn)檫@些細(xì)胞存在先天性抗病毒應(yīng)答缺陷。
有證據(jù)表明，抑制早期先天性免疫應(yīng)答和延緩Th1應(yīng)答的發(fā)展對(duì)溶瘤治療的效率是重要的。雖然粘液瘤病毒是一種烈性病毒，但是它具有宿主特異性，并且具有非常窄的宿主范圍；它不感染人或鼠。不受任何具體理論的限制，據(jù)信因?yàn)檎骋毫霾《臼欠侨祟惒《?，在人類中它?yīng)該沒有遇到預(yù)先存在的免疫識(shí)別。因此，它作為溶瘤病毒的潛力將受到較少的損害；對(duì)允許性腫瘤細(xì)胞，粘液瘤病毒將提供比天然的人類病毒更有效的感染，據(jù)此可以為癌癥提供有效的溶瘤治療。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供對(duì)具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞進(jìn)行抑制的方法，該方法包括對(duì)所述細(xì)胞施用有效量的粘液瘤病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞對(duì)干擾素不產(chǎn)生應(yīng)答。
在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人類癌細(xì)胞，包括人類實(shí)體瘤細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述細(xì)胞用病毒慢性感染。
在這里使用的術(shù)語“具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞”是指這樣的細(xì)胞當(dāng)接觸病毒或被病毒侵入后，該細(xì)胞不誘導(dǎo)抗病毒防御機(jī)制(包括抑制病毒復(fù)制、產(chǎn)生干擾素、誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答途徑和由或不由干擾素介導(dǎo)的凋亡)，并且因此所述細(xì)胞可以受到MV病毒的侵染。所述術(shù)語包括，相對(duì)于正常細(xì)胞(如沒有受到感染的細(xì)胞或非癌細(xì)胞)，當(dāng)與病毒接觸或受病毒感染時(shí)具有減弱的或無效的先天性抗病毒應(yīng)答的細(xì)胞。這包括對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞，和凋亡反應(yīng)或誘導(dǎo)凋亡途徑減弱或無效的細(xì)胞。所述缺陷可能由多種原因引起，包括感染、遺傳缺陷或環(huán)境影響。但應(yīng)理解，當(dāng)缺陷是由預(yù)先存在的感染引起時(shí)，可以不包括由MV引起的超感染，技術(shù)人員能夠容易地鑒別這種情況。技術(shù)人員能夠容易地利用適當(dāng)實(shí)驗(yàn)檢測任何特定細(xì)胞類型是否具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷因而能夠被粘液瘤病毒所感染。例如，VSV經(jīng)常被用于檢測細(xì)胞的抗病毒應(yīng)答。
為了確定特定的細(xì)胞類型(如特定的癌細(xì)胞類型)是否具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷，技術(shù)人員可以獲取外植塊，使其一些細(xì)胞在體外生長，并確定被VSV或替換性地，被粘液瘤病毒感染的感染性。
在整個(gè)說明書中所使用的術(shù)語“對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞”意思是指這樣的細(xì)胞，該細(xì)胞對(duì)干擾素活性如干擾素的抗病毒或抗腫瘤活性不產(chǎn)生應(yīng)答，或者，該細(xì)胞不具有正常的干擾素應(yīng)答，例如，減弱的或無效的干擾素應(yīng)答，或者，該細(xì)胞例如用信號(hào)分子如轉(zhuǎn)錄因子(如STAT1)的磷酸化或激活進(jìn)行檢測具有不正常的干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如包括但不限于，沒有經(jīng)受增殖抑制的細(xì)胞，或當(dāng)接觸干擾素而沒有被殺死的細(xì)胞，而所述干擾素的水平在可以對(duì)干擾素產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞中足以引起所述反應(yīng)。對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞可能在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或在應(yīng)答細(xì)胞中被正常激活的途徑中存在缺陷。一般地，對(duì)VSV感染的易感性表明對(duì)干擾素非應(yīng)答，技術(shù)人員可以容易檢測特定細(xì)胞是有能力還是沒有能力對(duì)干擾素產(chǎn)生應(yīng)答，以在干擾素存在下抑制VSV感染，或者用本領(lǐng)域已知的其它干擾素活性標(biāo)記，例如，表達(dá)水平的IFN刺激的基因如PKR、STAT、OAS、MX。
在整個(gè)說明書中所使用的術(shù)語“有復(fù)制能力”是指病毒能夠在特定宿主細(xì)胞中感染和復(fù)制。
在這里使用的術(shù)語“細(xì)胞”包括單細(xì)胞，也包括多細(xì)胞或細(xì)胞群。對(duì)細(xì)胞施用藥劑包括體外施用和體內(nèi)施用。
在這里使用的術(shù)語“有效量”意思是以一定的劑量在一定時(shí)期內(nèi)能有效獲得所需結(jié)果所必需的量。
在這里使用的術(shù)語“動(dòng)物”包括動(dòng)物界的所有成員，包括人類。
術(shù)語“抑制”具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞包括通過溶解作用或凋亡引起的細(xì)胞死亡，或其它機(jī)制的細(xì)胞死亡，另外還包括使得所述細(xì)胞不能生長或分裂。
粘液瘤病毒可以是屬于有復(fù)制能力的痘病毒的野兔病毒種的任何任何病毒。所述粘液瘤病毒可以是粘液瘤病毒的野生株系，或粘液瘤病毒的基因修飾株系。
使用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，可以容易地對(duì)粘液瘤病毒基因組進(jìn)行修飾以表達(dá)一種或更多種的治療性轉(zhuǎn)基因，例如Sambrook等((2001)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloninga LaboratoryManual)，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbour LaboratoryPress))中所述的技術(shù)。技術(shù)人員能夠容易地確定粘液瘤病毒基因組的哪些部分可以刪除，使得該病毒仍然可以進(jìn)行有效感染。例如，通過將已公布的病毒基因組序列與其它已被充分表征的病毒基因組進(jìn)行比較，可以推測出可切除的病毒基因組的非必要部分(例如參見C.Cameron，S.Hota-Mitchell，L.Chen，J.Barrett，J.-X.Cao，C.Macaulay，D.Willer，D.Evans和G.McFadden，病毒學(xué)(1999)264298～318)。
在這里使用的術(shù)語“治療性基因”或“治療性轉(zhuǎn)基因”意欲廣泛地描述任何基因，其表達(dá)可以影響所需的結(jié)果，例如，抗病毒效果。例如，對(duì)病毒進(jìn)行修飾使其攜帶可以提高用該病毒治療的抗癌效果的基因。這種基因可以是參與引發(fā)凋亡的基因，或參與靶向受感染細(xì)胞以進(jìn)行免疫破壞，如修復(fù)干擾素應(yīng)答缺陷的基因，或結(jié)果導(dǎo)致表達(dá)刺激抗體應(yīng)答的細(xì)胞表面標(biāo)記(例如細(xì)菌細(xì)胞表面抗原)的基因。所述病毒還可以被修飾，以表達(dá)參與關(guān)閉成瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖和生長的基因，據(jù)此阻止所述細(xì)胞的分裂。同時(shí)，所述病毒還可以被修飾以包括治療性基因，如參與化學(xué)治療劑合成的基因，或者，所述病毒可以被修飾以在特定類型細(xì)胞如人類細(xì)胞中具有提高的復(fù)制水平，從所述類型細(xì)胞中衍生出欲抑制或殺死的細(xì)胞?？杀徊迦胝骋毫霾《局幸蕴岣呖拱┬Ч幕虻木唧w例子包括編碼TRAK蛋白的人類基因或編碼E4或f4多肽的腺病毒基因，兩類基因的蛋白都參與殺死人類腫瘤細(xì)胞。
應(yīng)該理解，粘液瘤病毒的治療效果可以通過病毒對(duì)細(xì)胞的溶解或遞送治療性產(chǎn)物而獲得。
可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備病毒。例如，病毒可以用欲使用的粘液瘤病毒株感染所培養(yǎng)的兔細(xì)胞、使感染繼續(xù)發(fā)展以使所述病毒在所培養(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制而獲得，并可用本領(lǐng)域已知的破壞細(xì)胞表面的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行釋放，從而釋放用于采集的病毒顆粒。一旦采集之后，即通過感染兔細(xì)胞的匯合坪測定病毒的滴度，并進(jìn)行噬菌斑檢驗(yàn)(見Mossman等(1996)，病毒學(xué)21517～30)。
在一個(gè)方案中，提供了在需要治療的患者中治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用有效量的粘液瘤病毒。所述患者可以是任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，其中包括人類。
在這里使用的“特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)”是指任何與具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞有關(guān)的、涉及該細(xì)胞的或以具有該細(xì)胞為特征的疾病、障礙或不適，并且可以通過殺死這些細(xì)胞而治療所述疾病、障礙、不適或者其癥狀。例如，所述疾病狀態(tài)可以是癌癥。所述疾病狀態(tài)也可以包括病毒慢性感染。
“治療”疾病狀態(tài)是指用于獲得有益的或所需的結(jié)果，包括臨床結(jié)果的方法。有益的或所需的結(jié)果可以包括但不限于，減輕或改善一種或更多種癥狀或不適、減小病癥程度、穩(wěn)定疾病狀態(tài)、防止疾病發(fā)展、防止疾病傳播、推遲或減緩疾病進(jìn)程、推遲或減緩疾病的發(fā)作、改善或減輕疾病狀態(tài)、以及(部分或完全)恢復(fù)，而無論該有益的或所需的結(jié)果是否可以檢測得到?！爸委煛边€可以指延長患者的生存時(shí)間，該生存時(shí)間長于所預(yù)測的不經(jīng)治療的生存時(shí)間。“治療”還可以指抑制疾病進(jìn)程、暫時(shí)減緩疾病進(jìn)程，盡管更優(yōu)選地，包括持久地中止疾病進(jìn)程。正如技術(shù)人員所理解的，如果一種治療改善了特定的疾病狀態(tài)，但這種治療對(duì)治療的患者產(chǎn)生的不利效果要?jiǎng)龠^該治療所獲得的任何益處，則結(jié)果可能不是有益的或所需的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病狀態(tài)是癌癥。所述癌癥可以是任何類型的癌癥，其中，盡管不必是全部細(xì)胞，但至少有一些細(xì)胞具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥可以是其中至少有一些細(xì)胞是對(duì)干擾素非應(yīng)答的癌癥。在這里使用的術(shù)語“腫瘤”、“腫瘤細(xì)胞”、“癌癥”和“癌細(xì)胞”(可以互換使用)是指表現(xiàn)出不正常生長的細(xì)胞，其特征為細(xì)胞增殖明顯失去控制，或已經(jīng)被無限增殖化的細(xì)胞。術(shù)語“癌癥”或“腫瘤”包括轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌癥或腫瘤。在這里使用的“成瘤的”或“瘤”泛指增殖不具有正常生長抑制機(jī)制的一個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞，因此包括良性腫瘤，還包括癌細(xì)胞和發(fā)育異常細(xì)胞或增生細(xì)胞。
癌癥，包括惡性腫瘤的存在，可以用本領(lǐng)域普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。
可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的癌癥類型包括但不限于，包括白血病和淋巴瘤在內(nèi)的造血細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤和其它任何腫瘤。實(shí)體瘤如肉瘤和癌包括但不限于，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴樣惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳突樣腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎臟細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、膀胱癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤(craniopharyogioma)、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽覺神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。
在另一個(gè)方案中，所述疾病狀態(tài)是慢性病毒感染。
所述慢性感染病毒可以是任何在動(dòng)物細(xì)胞中以持續(xù)方式長期進(jìn)行感染和復(fù)制從而導(dǎo)致病理狀態(tài)的病毒。所述慢性感染病毒可以是與癌的發(fā)展有關(guān)或相關(guān)的病毒。
病毒慢性感染可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行診斷。例如，慢性病毒感染可以通過患者中抗病毒抗體的存在來檢測，或者通過對(duì)患者細(xì)胞中病毒RNA或DNA的存在檢測呈陽性來檢測。
可使用標(biāo)準(zhǔn)的給藥方法對(duì)患者施用所述病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒的施用是系統(tǒng)給藥。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，通過在患處注射來施用病毒。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述疾病狀態(tài)是實(shí)體瘤，并且通過在腫瘤部位注射而施用病毒。在許多實(shí)施方案中，病毒的施用是通過口服或胃腸外給藥進(jìn)行，或者采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
當(dāng)給患者施用時(shí)，病毒的有效量是以一定的劑量在足夠長的期間內(nèi)，減輕、改善、緩和、改進(jìn)、穩(wěn)定、防止傳播、延緩或推遲進(jìn)程或治愈疾病所需要的量。例如，有效量可以是足以獲得以下效果的量降低癌細(xì)胞或成瘤細(xì)胞的數(shù)目或?qū)⑵淦茐?；或者降低病毒慢性感染?xì)胞的數(shù)目或?qū)⑵淦茐模换蛘咭种扑黾?xì)胞的生長和/或增殖。
對(duì)患者施用的有效量可以根據(jù)許多因素而變化，所述因素例如病毒的藥效特性；給藥方式；患者的年齡、健康狀況和體重；疾病狀態(tài)的性質(zhì)和程度、治療的頻度、同時(shí)進(jìn)行的治療的類型(如果有的話)，以及病毒的毒性和滴度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于上述因素決定適當(dāng)?shù)挠昧?。根?jù)患者的臨床反應(yīng)，病毒最初施用的適當(dāng)數(shù)量可以按需進(jìn)行調(diào)整?？梢愿鶕?jù)安全施用的最大病毒量和產(chǎn)生所需結(jié)果的最小病毒量，憑借經(jīng)驗(yàn)決定病毒的有效量。
當(dāng)對(duì)病毒進(jìn)行系統(tǒng)給藥時(shí)，為了使其臨床效果與在患處注射病毒所獲得的臨床效果相同，需要施用明顯更多的病毒量。但是，適當(dāng)?shù)膭┝克綉?yīng)該是能夠獲得所需結(jié)果的最小量。
待施用的病毒的濃度決定于欲施用的粘液瘤病毒特定株的毒性和目標(biāo)細(xì)胞的性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)人類患者施用低于約109個(gè)空斑形成單位(“pfu”)的劑量。在各種實(shí)施方案中，可以施用約102pfu～約109pfu、約102pfu～約107pfu、約103pfu～約106pfu或約104pfu～約105pfu的單劑量。
根據(jù)最初治療方式的效果，可以重復(fù)提供有效量的病毒。一般是周期性給藥，同時(shí)監(jiān)視所產(chǎn)生的任何反應(yīng)。根據(jù)給藥的時(shí)間表和所選擇的給藥途徑，技術(shù)人員可以施用低于或高于如上所示的劑量。
所述病毒可以單獨(dú)給藥，或者結(jié)合其它治療方法(包括化學(xué)療法、放射療法或其它抗病毒療法)進(jìn)行給藥。例如，可以在外科手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤之前或之后施用病毒，或者在放射療法或傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物施用之前施用或同時(shí)施用或之后施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒可以與其它溶瘤病毒同時(shí)或順次施用，所述其它溶瘤病毒可以針對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞類型顯示出特異性。
為了有助于給藥，可以將所述病毒可以制成藥物組合物的一個(gè)組分。因此，在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有粘液瘤病毒和藥學(xué)上可接受的稀釋劑的藥物組合物。因此，本發(fā)明一方面還包括所述藥物組合物，該藥物組合物用于抑制具有先天性抗病應(yīng)答缺陷的細(xì)胞或治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述藥物組合物通常含有藥學(xué)上可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑和各種可兼容的載體。對(duì)于所有形式的遞送，可以將所述重組病毒制備成生理鹽溶液。
所述藥物組合物可以還含有其它治療劑，如抗癌劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含化學(xué)治療劑。例如，所述化學(xué)治療劑實(shí)質(zhì)上可以是針對(duì)患者的癌細(xì)胞或成瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的溶瘤效果的任何藥劑和不抑制或不降低所述病毒殺死腫瘤效果的任何藥劑。例如化學(xué)治療劑可以是但不限于，蒽環(huán)霉素、烷化劑、烷基磺酸鹽、吖丙啶、氮丙啶、甲基蜜胺、氮芥、亞硝基脲、抗生素、抗代謝物、葉酸類似物、嘌呤類似物、嘧啶類似物、酶、鬼臼毒素、含鉑劑或細(xì)胞因子。優(yōu)選地，所述化學(xué)治療劑是已知的有效對(duì)抗癌細(xì)胞或成瘤細(xì)胞這些特定細(xì)胞類型的化學(xué)治療劑。
藥學(xué)上可接受稀釋劑的比例和種類取決于所選擇的給藥途徑、與活病毒的相容性和標(biāo)準(zhǔn)的制藥慣例。一般地，藥物組合物采用不顯著影響所述活病毒生物特性的組分進(jìn)行配制。
藥物組合物可以通過已知制備方法進(jìn)行制備，該已知制備方法適合制備給患者施用的藥學(xué)上可接受的組合物，使得可以將有效量的活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合成混合物。適合的載體，例如，在Remington的制藥科學(xué)中進(jìn)行了描述(Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)?；诖耍鼋M合物包括，但不限于，與一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑結(jié)合的病毒溶液，并含在具有適當(dāng)pH的并與生理性液體等滲的緩沖液中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，根據(jù)所選擇的給藥途徑，藥物組合物可以以各種形式對(duì)患者施用。本發(fā)明所述組合物可以通過口服或胃腸外給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、穿過上皮、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、鞘內(nèi)、直腸和局部方式給藥?？梢酝ㄟ^在選定的一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸入進(jìn)行胃腸外給藥。
所述藥物組合物可以與惰性稀釋劑或與可同化的載體一起口服施用，或者，其可以被包裹在硬的或軟的殼狀明膠膠囊中施用，或者壓成片劑施用。對(duì)于口服治療給藥，所述病毒可以與賦形劑混合，并以可吸收片劑、含服片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑和薄片劑(wafers)等形式使用。
所述病毒溶液可以在生理學(xué)上適宜的緩沖液中制備。在普通的貯藏和使用條件下，這些制備物含有防腐劑，以防止微生物的生長，但所述防腐劑不能使所述活病毒失活。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道如何制備適當(dāng)?shù)闹苿?。選擇和制備適當(dāng)制劑的傳統(tǒng)工藝和組分在例如，在Remington的制藥科學(xué)中和1999年出版的美國藥典國家處方集(The United StatesPharmacopeiaThe National Formulary，USP 24 NF19)中進(jìn)行了描述。
在不同實(shí)施方案中，所述組合物通過在諸如腫瘤部位等患處直接注射(皮下(subcuteanously)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等)進(jìn)行施用，或者口服施用，作為選擇的，經(jīng)皮施用。
適合注射使用的藥物組合物劑型包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌的可注射溶液或分散液的的無菌粉劑，其中，術(shù)語無菌不延及欲施用的活粘液瘤病毒本身。在所有的情況下，所述劑型必須無菌，并且流動(dòng)性必須達(dá)到使其容易注射的程度。
欲使用的藥物組合物的劑量取決于被治療的特定疾病、疾病的嚴(yán)重性、患者的個(gè)體參數(shù)(包括年齡、身體條件、身高和體重)、療程、同時(shí)進(jìn)行的療法的特性(如果有的話)、具體的給藥途徑，以及在保健人員的知識(shí)和專業(yè)技能范圍內(nèi)的其它類似因素。這些因素對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且可以通過少量常規(guī)實(shí)驗(yàn)獲得。
所述粘液瘤病毒或含有粘液瘤病毒的藥物組合物也可以包裝成試劑盒，該試劑盒含有所述病毒的使用說明書，所述的使用包括，使用粘液瘤病毒來抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，或者，在需要的患者中，使用粘液瘤病毒來治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。所述疾病狀態(tài)可以是癌癥，或者可以是慢性病毒感染。
本發(fā)明還考慮了粘液瘤病毒在抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞對(duì)干擾素非應(yīng)答。本發(fā)明還提供，在需要的患者中，粘液瘤病毒在治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病狀態(tài)是癌癥。本發(fā)明還提供粘液瘤病毒在藥物制備中的用途，所述藥物用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞或在需要的患者中，治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。
MV在除其天然宿主以外的動(dòng)物中所具有的選擇性感染先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的能力提供了MV在動(dòng)物中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的用途，所述細(xì)胞包括對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞。否則，這些細(xì)胞可能不容易檢測，例如，在動(dòng)物中，還未發(fā)展成可觸知的腫瘤或還未引起可察覺病癥的某些癌細(xì)胞。
因而，在一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了在患者中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用經(jīng)修飾以表達(dá)可檢測標(biāo)記的粘液瘤病毒；在患者中使所述病毒感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞；和在患者中檢測表達(dá)所述可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。
可以使用使診斷圖像可視化的任何傳統(tǒng)方法檢測感染的細(xì)胞。所述檢測方法取決于所使用的特定的可檢測標(biāo)記。例如，可以使用熒光數(shù)字成像顯微鏡檢測被經(jīng)過基因修飾以表達(dá)熒光蛋白的粘液瘤病毒感染的細(xì)胞。其它方法包括計(jì)算機(jī)控制X線斷層攝影術(shù)(CT)、全身掃查如正電子發(fā)射X線斷層攝影術(shù)(PET)、磁共振成像(MRI)和超聲波檢查法。熟練技術(shù)人員能夠決定用于檢測特定可檢測標(biāo)記的適當(dāng)方法。
可檢測標(biāo)記包括但不限于，任何標(biāo)記，其用于表達(dá)或合成的基因可以插入粘液瘤病毒基因組中，以在被經(jīng)修飾的病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)或合成所述標(biāo)記。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測標(biāo)記可以是熒光蛋白。對(duì)患者施用所述修飾病毒后，以適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔檢測被感染的細(xì)胞，以使病毒感染任何具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，并使可檢測標(biāo)記在所述細(xì)胞中的表達(dá)達(dá)到可檢測的水平。例如，可以在對(duì)患者施用經(jīng)基因修飾以表達(dá)熒光蛋白的病毒后2～20天的任何時(shí)候進(jìn)行檢測。
檢測方法可以在患者中間斷性地重復(fù)進(jìn)行，以在所述患者中監(jiān)測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的存在。例如，檢測施用粘液瘤病毒的所述細(xì)胞的方法，如有必要，可以按6個(gè)月、1年或2年的間隔在患者中進(jìn)行，這取決于具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的特性和由所述細(xì)胞在患者中的存在所導(dǎo)致的任何疾病狀態(tài)的特性。重復(fù)所述方法一段時(shí)間，以監(jiān)測疾病狀態(tài)的發(fā)展或緩解，或疾病在患者體內(nèi)的擴(kuò)散。
粘液瘤病毒能夠選擇性感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，并且可以在細(xì)胞中用作所述缺陷的指示物。因此，用本發(fā)明的方法，可以對(duì)從患者中取出的細(xì)胞進(jìn)行先天性抗病毒應(yīng)答缺陷檢測。當(dāng)與其它指示物結(jié)合時(shí)，這種檢測可以指示患者可能患有特定的疾病狀態(tài)，例如，癌癥。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在樣品中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括培養(yǎng)所述細(xì)胞；使所培養(yǎng)的細(xì)胞與粘液瘤病毒接觸；以及檢測細(xì)胞受到粘液瘤病毒感染的感染性。
所述細(xì)胞可以通過已知活組織檢查方法從包括人類在內(nèi)的研究對(duì)象中取得。所述活組織檢查方法決定于待檢細(xì)胞的所在部位和類型。
按照已知培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞，并通過往培養(yǎng)基中加入活病毒而與MV接觸。感染復(fù)數(shù)(“MOI”)可因特定細(xì)胞類型的最佳MOI、密度和培養(yǎng)技術(shù)而異，使用已知的接觸MV后會(huì)被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物作為陽性對(duì)照。
所培養(yǎng)的細(xì)胞被MV感染的感染性可以通過技術(shù)人員已知的各種方法，包括MV對(duì)細(xì)胞的致死能力進(jìn)行檢測。也可以包括將試劑加入所述細(xì)胞培養(yǎng)物，以完成其與病毒表達(dá)產(chǎn)物的酶促或化學(xué)反應(yīng)。所述病毒表達(dá)產(chǎn)物可以由插入到MV基因組中的報(bào)告基因來表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將MV進(jìn)行修飾，以使對(duì)感染狀態(tài)的檢測變得容易。例如，可以對(duì)MV進(jìn)行基因修飾以表達(dá)標(biāo)記，該標(biāo)記可通過相差顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)或放射成像而容易地進(jìn)行檢測。所述標(biāo)記可以是參與比色反應(yīng)或放射標(biāo)記反應(yīng)的表達(dá)后的熒光蛋白或表達(dá)后的酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記是破壞或抑制受檢細(xì)胞特定功能的基因產(chǎn)物。
在這里引用的所有參考文獻(xiàn)以參考的方式完全引入。
實(shí)施例病毒株所使用的病毒株包括野生型MV、經(jīng)修飾以表達(dá)綠色熒光蛋白(“GFP”)或β-半乳糖苷酶(“LacZ”)的MV，以及被殺死(“死”)的MV。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行制備和滴定。
細(xì)胞系利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(“MEFs”)進(jìn)行小鼠試驗(yàn)，所述小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來自野生型小鼠和經(jīng)以下敲除的小鼠IFNα/β受體純合敲除、STAT1純合敲除、PKR雜合敲除、RNase L雜合敲除、Mx1雜合敲除、PKR/RNase L/Mx1三重純合敲除。
以BGMK對(duì)照細(xì)胞和人類腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行人類試驗(yàn)，所述人類腫瘤細(xì)胞系為HT29、HOP92、OVCAR4、OVCAR5、SK-MEL3、SK-MEL28、M14、SKOV3、PC3、DU145、CAKI-1、786-0、T47D、MDAMB 435、SF04、U87、A172、U373、Daoy和D384，如Stojdl等所述(癌細(xì)胞(CancerCell)，(2003)4263～275)。
方法一般地，分析和試驗(yàn)如Lalani等在病毒學(xué)(1999)256233～245和Johnston等在病毒學(xué)報(bào)(2003)77(13)7682～7688中所述進(jìn)行。
對(duì)于體內(nèi)小鼠研究，將人類顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87植入裸鼠。植入后15天，用活的或死的MV GFP對(duì)小鼠進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，滴度為5×106，或進(jìn)行模擬感染。感染后72小時(shí)，殺死動(dòng)物，取出大腦，埋入最佳切溫復(fù)合物(Optimal Cutting Temperature compound，OCT)，切制冷凍切片。通過熒光顯微術(shù)可以看到整個(gè)大腦切片中的粘液瘤病毒-GFP。然后固定切片，并用H&E(蘇木精和曙紅)染色，使腫瘤可視化。
對(duì)于人類腫瘤細(xì)胞分析，手術(shù)一結(jié)束即進(jìn)行腫瘤胰蛋白酶化(trypsonized)并鋪板，第二天，用病毒進(jìn)行感染，MOI為0.1、1.0或10。在感染后24小時(shí)和48小時(shí)，分別用相位顯微鏡術(shù)和熒光顯微術(shù)收集有關(guān)細(xì)胞毒性和病毒表達(dá)的數(shù)據(jù)。利用黃色四唑鹽MTT進(jìn)行檢測，以定量感染后48小時(shí)、72小時(shí)或96小時(shí)的細(xì)胞存活率％(為模擬感染存活的細(xì)胞的百分比)。
用10M.O.I的粘液瘤病毒-GFP感染人類小兒髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Daoy和D384。感染后72小時(shí)，用MTT檢測細(xì)胞的生存能力。
小鼠細(xì)胞系的感染以前研究表明，用趨化因子受體轉(zhuǎn)染的某些小鼠3T3細(xì)胞克隆可以被粘液瘤病毒感染，而其它克隆則不能。為了研究粘液瘤病毒在其它小鼠細(xì)胞中的趨向性是否取決于任何特定受體，發(fā)明人研究來自野生型(WT)小鼠和各種基因敲除小鼠的初級(jí)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)。
因?yàn)镮FN在準(zhǔn)備進(jìn)行抗病毒應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，所以發(fā)明人假定，限制性表型與IFN介導(dǎo)的“抗病毒狀態(tài)”有關(guān)。用抗體中和循環(huán)的IFN，或者產(chǎn)生IFN受體陰性小鼠或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)途徑基因缺失了的小鼠，而破壞IFN系統(tǒng)的事件鏈，將嚴(yán)重?fù)p害宿主對(duì)粘液瘤病毒的抗性，所述粘液瘤病毒一般不感染正常小鼠細(xì)胞。
為了檢驗(yàn)這種假設(shè)，發(fā)明人需要證明粘液瘤病毒在非允許細(xì)胞中的非感染性是否是因?yàn)镮FN的抗病毒作用。對(duì)敲除了一種或多種參與胞內(nèi)IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答的蛋白的各種MEF細(xì)胞類型進(jìn)行檢驗(yàn)，以了解MV感染對(duì)IFN途徑的影響。
對(duì)初級(jí)MEFs進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明，野生型(“WT”)MEFs沒有被粘液瘤病毒感染。當(dāng)通過用抗IFNα/β的中和抗體阻斷IFN途徑時(shí)，完全可以用粘液瘤病毒感染MEFs(圖2)。但是，與抗IFNγ中和抗體接觸的MEFs仍然保持非允許。這就總體上說明了IFNα/β，而不是IFNγ，在為粘液瘤病毒體外感染MEFs創(chuàng)造允許環(huán)境中的重要性。在文獻(xiàn)中已經(jīng)確定了不同的IFNα/β和IFNγ胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。但是，與所培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞不同，IFNα/β和IFNγ均可能在被感染的宿主中起重要作用。發(fā)明人推測，在IFNα/β和/或IFNγ途徑中存在缺陷的人類腫瘤將對(duì)粘液瘤病毒的體內(nèi)感染是易感性的。
發(fā)明人測定了STAT1和STAT2在MV感染的非允許WT MEFs中的活性。在圖3中顯示的結(jié)果表明，STAT1和STAT2被激活。進(jìn)一步研究表明，STAT3、STAT4和STAT5沒有被激活(圖4)。
為了確定IFNα/β胞內(nèi)途徑在保持MEFs非允許狀態(tài)中的重要性，進(jìn)行基因缺失研究，以使IFNα/β受體和胞內(nèi)級(jí)聯(lián)受到破壞。進(jìn)行IFN受體或JAK1或STAT1的基因缺失。用MV感染W(wǎng)T MEFs、IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs。IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs對(duì)MV是允許的，證明IFNα/β和STAT1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)對(duì)MV感染是關(guān)鍵的(圖5)
蛋白激酶R(PKR)是在眾多細(xì)胞中受到IFNα/β的誘導(dǎo)的酶。這種激酶，在dsRNA(雙鏈RNA)存在時(shí)，經(jīng)受自體磷酸化作用，然后磷酸化多個(gè)細(xì)胞蛋白，包括真核蛋白合成起始因子(eIF-2α)，該真核蛋白合成起始因子的磷酸化可以誘導(dǎo)對(duì)蛋白翻譯的抑制和凋亡。PKR還指示RNase L的激活。發(fā)明人檢測了MV感染后PKR在非允許MEFs中的激活。在建立了良好的抗病毒狀態(tài)的非允許MEFs中，PKR未被磷酸化(圖6)。而且，MV感染抑制了PKR的磷酸化(圖7)。另外，粘液瘤病毒感染后，PERK(與PRK類似，ER激酶)在初級(jí)WT MEFs中未被磷酸化(圖8)。
用MV感染PKR、RNase L或Mx1單基因敲除的MEFs(圖9)。發(fā)現(xiàn)PKR、RNase L或Mx1對(duì)保持對(duì)于粘液瘤病毒感染的非允許性是非必需的。為了進(jìn)一步確認(rèn)PKR、RNase L或Mx1的非必需性，進(jìn)行PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-的三重敲除。PKR-/-、RNase L-/-和Mx1-/-的三重敲除并未有助于粘液瘤病毒的感染(圖10)，但是，用抗干擾素α/β的中和抗體處理PKR、RNase L和Mx1三重KO(三重敲除)的MEFs，對(duì)粘液瘤病毒感染變得允許(對(duì)比圖10和圖11)。這些實(shí)驗(yàn)證明，PKR、RNaseL和Mx1對(duì)于介導(dǎo)MEFs對(duì)MV的允許性不是必需的。
為了檢測MV感染后，eIF-2α和PKR在非允許的野生型MEFs和允許的IFNα/βR-/-MEFs和STAT1-/-MEFs中的激活，進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。MV感染后，盡管PKR在允許的和非允許的MEFs中未被磷酸化，但eIF-2α在兩種情況下均被磷酸化(圖12)。這證明沒有PKR和PERK的參與，抗病毒狀態(tài)由另外導(dǎo)致eIF2α磷酸化的途徑介導(dǎo)。
粘液瘤病毒感染非允許的PKR、RNase L和Mx1三重敲除后的MEFs后，STAT1同時(shí)受到絲氨酸磷酸化和酪氨酸磷酸化(圖13)。還顯示了粘液瘤病毒感染后，酪氨酸磷酸化的STAT1在非允許PKR-/-+RNase L-/-+Mx1-/-MEFs中的亞細(xì)胞定位(圖14)。
總之，這些結(jié)果表明，平行的PKR/PERK獨(dú)立的涉及IFN/STAT1的抗病毒途徑對(duì)痘病毒趨向性是關(guān)鍵的。而且，eIF2α磷酸化是IFN抗病毒作用最好的標(biāo)記。
人類腫瘤研究發(fā)明人在體內(nèi)系統(tǒng)中研究了MV感染人類腫瘤細(xì)胞的能力。用人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞注射裸鼠，隨后形成顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤?；畈《灸軌蚋腥具@些人類腫瘤細(xì)胞，但不感染周圍細(xì)胞(圖15)。在圖16中顯示來自GFP的熒光信號(hào)定位于腫瘤。
假設(shè)許多人類腫瘤對(duì)干擾素非應(yīng)答，并且，與在正常人類細(xì)胞所發(fā)現(xiàn)的IFN信號(hào)級(jí)聯(lián)相比，腫瘤細(xì)胞沒有正常的IFN信號(hào)級(jí)聯(lián)，發(fā)明人進(jìn)行了研究以探索粘液瘤病毒對(duì)人類腫瘤的影響。結(jié)果概括如下。
最初，使用粘液瘤病毒來研究對(duì)各種對(duì)照和人類腫瘤細(xì)胞系BGMK、HT29、HOP92、OVCAR4、SK-MEL3和SK-MEL28的感染性和胞溶作用。MV顯示出各種感染性和胞溶效果HT29(圖17)、HOP92(圖18)、OVCAR4(圖19)、SK-MEL3(圖20)、SK-MEL28(圖21)和BGMK(圖22)。
對(duì)其它腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了檢驗(yàn)，以下表1將所檢驗(yàn)的各種腫瘤類型分為非允許、允許或半允許。半允許表示，相對(duì)于允許細(xì)胞系，粘液瘤病毒是可以中度感染的。
表1粘液瘤病毒對(duì)人類腫瘤細(xì)胞的趨向性

隨著MV-LacZ濃度的上升，各種人類腫瘤系對(duì)感染所顯示出的反應(yīng)也不一樣。例如，U373細(xì)胞需要更高的病毒滴度才能獲得U87在低滴度即獲得的殺死細(xì)胞的水平(圖23和圖24)。粘液瘤病毒有效地感染星形細(xì)胞瘤細(xì)胞(圖25)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(圖26)。粘液瘤病毒在感染后48小可有效殺死人類星形細(xì)胞瘤細(xì)胞和小兒髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞(圖27和圖28)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)這里所描述的示例性實(shí)施方案進(jìn)行許多修改。而本發(fā)明包括如權(quán)利要求書所限定范圍內(nèi)的所有這樣的修改。
權(quán)利要求
1.一種抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)所述細(xì)胞施用有效量的粘液瘤病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞是對(duì)干擾素非應(yīng)答的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述細(xì)胞顯示出不正常的干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述細(xì)胞為人類癌細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒為野生型病毒。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒是經(jīng)過基因修飾的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒經(jīng)過基因修飾以表達(dá)治療性基因。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述細(xì)胞是肺癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞或星形細(xì)胞瘤細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞是受到病毒慢性感染的人類細(xì)胞。
11.一種治療疾病狀態(tài)的方法，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，所述方法包括對(duì)需要的患者施用有效量的粘液瘤病毒。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述疾病狀態(tài)為癌癥。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述癌癥為實(shí)體瘤。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述癌癥為造血細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌或黑素瘤。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述造血細(xì)胞癌為白血病或淋巴瘤。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述癌癥為肺癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、腎臟癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述患者為人類。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒為野生型病毒。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒是經(jīng)過基因修飾的。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述粘液瘤病毒經(jīng)過基因修飾以表達(dá)治療性基因。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述病毒通過注射而施用到癌癥部位。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，對(duì)所述病毒進(jìn)行系統(tǒng)施用。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，施用的所述病毒少于109pfu。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，施用的所述病毒為約102pfu～109pfu。
25.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述疾病狀態(tài)為慢性病毒感染。
26.有效量的粘液瘤病毒在抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞中的用途。
27.有效量的粘液瘤病毒在藥物制備中的用途，所述藥物用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求26或27所述的用途，其中，所述細(xì)胞是對(duì)干擾素非應(yīng)答的。
29.如權(quán)利要求28所述的用途，其中，所述細(xì)胞顯示出不正常的干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
30.如權(quán)利要求26～29任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求30所述的用途，其中，所述細(xì)胞為人類癌細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求31所述的用途，其中，所述細(xì)胞是肺癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞或星形細(xì)胞瘤細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求26～32任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒為野生型病毒。
34.如權(quán)利要求26～32任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒是經(jīng)過基因修飾的。
35.如權(quán)利要求34所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒經(jīng)過基因修飾以表達(dá)治療性基因。
36.如權(quán)利要求26或27所述的用途，其中，所述細(xì)胞受到病毒的慢性感染。
37.有效量的粘液瘤病毒在治療患者的疾病狀態(tài)中的用途，其中，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞。
38.有效量的粘液瘤病毒在藥物制備中的用途，所述藥物用于治療患者的疾病狀態(tài)，其中，所述疾病狀態(tài)的特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞。
39.如權(quán)利要求37或38所述的用途，其中，所述疾病狀態(tài)為癌癥。
40.如權(quán)利要求39所述的用途，其中，所述癌癥為實(shí)體瘤。
41.如權(quán)利要求39所述的用途，其中，所述癌癥為造血細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌或黑素瘤。
42.如權(quán)利要求41所述的用途，其中，所述造血細(xì)胞癌為白血病或淋巴瘤。
43.如權(quán)利要求39所述的用途，其中，所述癌癥為肺癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、腎臟癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤。
44.如權(quán)利要求37或38所述的用途，其中，所述疾病狀態(tài)為慢性病毒感染。
45.如權(quán)利要求37～44任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述患者為人類。
46.如權(quán)利要求37～45任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒為野生型病毒。
47.如權(quán)利要求37～45任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒是經(jīng)過基因修飾的。
48.如權(quán)利要求47所述的用途，其中，所述粘液瘤病毒經(jīng)過基因修飾以表達(dá)治療性基因。
49.一種含有粘液瘤病毒和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，該藥物組合物用于治療特征為存在具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的疾病狀態(tài)。
50.如權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其中，所述疾病狀態(tài)為癌癥。
51.如權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中，所述癌癥為實(shí)體瘤。
52.如權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中，所述癌癥為造血細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、口腔癌、卵巢癌、喉癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌或黑素瘤。
53.如權(quán)利要求52所述的藥物組合物，其中，所述造血細(xì)胞癌為白血病或淋巴瘤。
54.如權(quán)利要求50所述的藥物組合物，其中，所述癌癥為肺癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、腎臟癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤。
55.如權(quán)利要求54所述的藥物組合物，該藥物組合物還含有治療劑。
56.如權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其中，所述治療劑為化學(xué)治療劑。
57.如權(quán)利要求54所述的藥物組合物，該藥物組合物適合于在腫瘤部位注射。
58.如權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其中，所述疾病狀態(tài)為慢性病毒感染。
59.一種含有粘液瘤病毒和說明書的試劑盒，該試劑盒用于抑制具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞。
60.如權(quán)利要求59所述的試劑盒，其中，所述細(xì)胞是對(duì)干擾素非應(yīng)答的。
61.一種含有粘液瘤病毒和說明書的試劑盒，該試劑盒用于在需要的患者中治療癌癥。
62.一種含有粘液瘤病毒和說明書的試劑盒，該試劑盒用于在需要的患者中治療慢性病毒感染。
63.一種在患者中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)患者施用經(jīng)修飾以表達(dá)可檢測標(biāo)記的粘液瘤病毒；在患者中使病毒感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞；以及在患者中檢測表達(dá)可檢測標(biāo)記的細(xì)胞。
64.一種在樣品中檢測具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞的方法，該方法包括培養(yǎng)所述細(xì)胞；將所培養(yǎng)的細(xì)胞與粘液瘤病毒接觸；以及確定細(xì)胞受到粘液瘤病毒感染的感染性。
全文摘要
本發(fā)明涉及粘液瘤病毒的治療用途。粘液瘤病毒可以選擇性地感染具有先天性抗病毒應(yīng)答缺陷的細(xì)胞，包括對(duì)干擾素非應(yīng)答的細(xì)胞，并且粘液瘤病毒可以用于治療特征為存在所述細(xì)胞的疾病，包括癌癥。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1756563SQ200480006172
公開日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月7日
發(fā)明者格蘭特·麥克菲登, 約翰·C·貝爾 申請(qǐng)人:羅巴斯研究機(jī)構(gòu)